CN102352381B - 以木糖生产废液制造丙酮、丁醇的方法 - Google Patents
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Abstract
一种以木糖生产废液制造丙酮、丁醇的方法，属于生物化工技术领域，该方法利用木糖生产废液为原料，利用微生物发酵技术生物转化糖源生产化工产品丙酮、丁醇；其具体工艺步骤包括：培养基制备、菌株活化、接种、发酵工艺步骤，获得产物乙醇、丙酮、丁醇。本发明工艺先进、设备投入成本低；解决了木糖生产废液利用难题，产品附加值高；相比化工合成又节约了化石资源；同时，相比粮食作物为发酵原料的生产方法原料价格低廉，且不与人争粮，不与粮林争地；实现了木糖生产废液的综合利用，降低了木糖生产的综合成本费用，提高了生物质资源的利用效率，实现了工业副产物的再利用，环境污染少，能耗低，社会效益显著。
Description
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，涉及一种利用利用木糖生产废液为原料利用微生物发酵制备丙酮、丁醇的生产方法。
背景技术
丙酮是优良的有机溶剂和重要的化工原料，广泛应用于化工、塑料、有机合成、油漆等工业，目前，丙酮消费量最大的为溶剂，占其消费总量28%，其次是甲基丙烯酸甲酯MMA 和双酚A，分别占其消费总量的23%和21%，其他还用于生产丙酮氰醇和异丙醇等。丁醇（butanol, butyl alcohol and 1-butanol）是四碳醇，分子式为C4H9OH，其分子量为74.12Da。丁醇是无色液体，具有独特的气味，误吸丁醇蒸气容易导致黏液组织疼痛，高浓度的丁醇具有麻醉作用。丁醇与有机溶剂完全互溶，但与水溶液部分互溶。据估计每年丁醇产量可达100-120亿镑，以目前的价格计算在市场销售额占70-84亿美元。目前丁醇作为汽油的替代品或者添加型燃料的可再生能源功能逐渐被人们所认识。丁醇和乙醇均可作为替代性燃料，然而丁醇具有比乙醇更多的优势，因为丁醇具有较高的能量值，与汽油的混合比更高。
最近几年，原有价格的增长和全球气候变暖现象，导致人们开发生产新型可再生能源。中国也是少有的将丙酮-丁醇发酵法一直保存至今的国家。我国70~80年代主要以玉米为原料辅以糖蜜发酵进行丙酮、丁醇生产，存在与人争粮的现象，在世界粮食危机日益显著的情况下，全世界掀起了开展利用可再生资源或者生产废弃物进行生物燃料的生产。2007年，河南天之冠可再生能源有限公司提出了采用小麦B淀粉替代玉米发酵生产丙酮丁醇的方法（专利公开号CN101161818A），但其本质还是采用粮食作原料。2008年该公司联合上海工业生物技术研发中心申请了将玉米皮高压蒸煮、酶解直接发酵生产丙酮、丁醇的方法（CN101363031），首次采用低成本原料、可再生资源进行丙酮丁醇的生产方法，以玉米皮为原料，该方法需要经过高压蒸煮、酶解糖化等过程，需要能耗高，酶解效率直接影响了丙酮、丁醇的得率。同年，王建设提出了利用秸秆联产木糖生产丙酮丁醇的方法，该方法主要利用木糖渣在纤维素酶作用下水解为葡萄糖，利用葡萄糖发酵生产丙酮、丁醇，同样面临木糖渣利用纤维素酶酶解的高成本步骤。以上两种发明均是利用可再生资源玉米皮和木糖渣进行生产丙酮、丁醇，具有切实的可行性和发展意义，但鉴于纤维素类物质酶解效率及酶解成本一向为制约木质纤维素类能源发展的主要因素。
木糖生产废液中通产含有木糖、L-阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖等杂糖，一般总糖含量在60-75%（W/W）之间。木糖占总糖的50-70%（W/W）之间。木糖生产废液虽然杂糖含量高，采用色谱分离的技术由于设备投资高、运行成本太高而无法广泛推广。所以目前木糖生产废液基本上只能低价卖给酱色厂作为食品上色使用。部分发明者用木糖母液提取糠醛（专利CN 1763024A），但其对环境污染较为严重。
发明内容
本发明旨在提供一种以木糖生产废液制造丙酮、丁醇的方法，以解决现有技术工艺复杂，丙酮、丁醇收率低、质量不稳定、生产成本高等问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是利用木糖生产废液——木糖生产过程中木糖结晶分离后的颜色较深的粘稠液体作为原料，利用微生物发酵技术生物转化糖源生产化工产品乙醇、丙酮、丁醇，属于利用工业生产副产物或废弃物生产高附加值的可再生能源的清洁生产技术。其具体工艺步骤如下：
（1）将玉米秸、玉米芯、棉籽壳、甘蔗渣、稻草、小麦秸秆等植物原料进行加压加热预处理以及酸水解后，再对水解液进行木糖浓缩结晶，在结晶分离后得到的废液——木糖母液；木糖母液采用菲林法测定其还原糖含量为3%~80%的生产废弃糖液；通常采用高效液相色谱法（HPLC）测定其可溶性糖为木糖、葡萄糖、阿拉伯糖各种糖的浓度，该废液的木糖含量为25~70%，葡萄糖含量为5~25%，阿拉伯糖含量为5-25%。
（2）以木糖母液为发酵底物，复配氮源、磷源以及微量元素等配制成发酵培养基。将木糖母液适当稀释（一般按照4%~12%的稀释度进行稀释），使发酵培养基中可溶性糖含量为2%~10%，主要涉及以下二种工艺：
工艺一：以木糖母液按照4%~12%的浓度稀释，经过阳离子、阴离子树脂进行脱色、脱毒，以此作为发酵碳源，酵母粉0.05%~5%，磷酸二氢钾0.01~1%，磷酸氢二钾0.01~1%，乙酸铵0.05~0.4%，pH5.0~7.0，115℃灭菌20min。
工艺二：直接将木糖母液进行稀释，稀释浓度4%~12%，添加0.05%~5%酵母粉或蛋白胨，或添加2%~4%的玉米浆，调节pH至5.0~7.0，115℃灭菌20min。
（3）将活化菌株接种量按照2~10%体积比转接入步骤（2）所述的发酵培养基中进行发酵。以ATCC55025或者CICC8016可以发酵生产丙酮丁醇的任意一种或几种作为发酵出发菌株，其菌株活化采用葡萄糖培养基或者玉米醪培养基。
（4）上述发酵条件为温度为34~40℃，在厌氧管、厌氧瓶、厌氧罐等设备中静置或轻微震荡条件下进行发酵，发酵时间为48~120h，发酵完成后，采用气相色谱法测定产物乙醇、丙酮、丁醇含量。
附图说明
图1以木糖生产废弃液为原料制造丙酮、丁醇的技术路线图；
图2 葡萄糖和木糖生产废液发酵结果图；
采用本发明的积极效果是：
1、工艺先进、经济效益显著；本发明利用木糖母液为唯一碳源发酵生产丙酮、丁醇，实现了木糖生产副产物——木糖母液的开发利用，为丙酮、丁醇的工业化生产提供了一种新的原料和生产方法。本发明实施例中约5%的可溶性糖（木糖33g/L、葡萄糖8g/L、阿拉伯糖8g/L）为碳源的液体培养基中发酵生产丙酮、丁醇，其丁醇含量可达9.1g/L，丙酮含量可达4.2g/L，而单独以5%的葡萄糖作为唯一碳源的培养基发酵进行丙酮、丁醇生产，其丁醇含量为6.4g/L，丙酮含量为3.0g/L。本发明的生产方法以木糖生产废液作为碳源进行丙酮、丁醇发酵，其生产的转化率明显优于以葡萄糖作为碳源进行丙酮、丁醇生产。该方法为化学品丙酮、丁醇生产提供了以一种新型、可再生的生物质为原料，利用现代微生物发酵技术为工业下脚料或废弃物的高效利用提供了途径和方法，提高了木糖生产废液的综合利用价值，将产生巨大的经济效益。
2、降低了设备投入技术生产成本；目前，木糖生产废液主要作为小型食品加工厂对产品上酱色使用。还有一部分作为原料利用模拟移动床进行色谱分离提取阿拉伯糖等，但是都面临设备投资费用大，提取率低，提取成本高以及不能对原料进行全部利用等问题。本发明较同比例葡萄糖为原料的转化率更高，大大降低了设备投入技术生产成本。
3、社会效益显著；本发明独辟蹊径，解决了木糖生产废液利用难题，生产高附加值的化工产品；相比化工合成又节约了化石资源；同时，相比以玉米等粮食作物为发酵原料的生产方法，相对来说原料又价格低廉，且不与人争粮，不与粮林争地；另外，实现了木糖生产废液的综合利用以及降低了木糖生产的综合成本费用。
本发明所述原料通常用于生产色素等低附加值的产品，而本发明却利用其发酵生产丙酮、丁醇，不仅提高了该副产品的附加值，而且成为开发可再生能源，实现生物燃料发展的有效方法之一；同时解决了传统丙酮、丁醇发酵所面临的“与人争粮”的状况，是利用现有农副产品——玉米芯、秸秆等农业废弃物进行木糖、木糖醇产品生产的废弃产物联产丙酮、丁醇，一方面提高了农业废弃物的产能附加值，另一方面为缓解国际大形势下的“能源危机”和“粮食危机”之间的矛盾提供了一条切实可行的途径。本发明利用生产木糖后的副产物木糖母液进行简单的加工生产高附加值的能源产品——丙酮、丁醇，减少了木糖母液以低价卖出的运输费用，生产过程属于厌氧发酵成本设备投资少，可控性大，能耗低，与木糖或木糖醇等公开生产方法一起进行捆绑生产，可行性高，从现实意义上可以提高生物质资源的利用效率，实现工业副产物的再利用。
实施例1：
ATCC55025菌株和CICC8016利用木糖母液培养基生产丙酮丁醇：
制备拜氏梭菌Clostridium beijerinckii ATCC55025。将上述菌株接种转接至葡萄糖种子培养基的厌氧管中，转接后，将厌氧管放入100℃水浴锅中煮沸，立即冷却至室温，充氮气，37℃静置厌氧培养16~18h即为发酵种子液。
上述葡萄糖种子培养基是指：1L中含有酵母浸膏 3 g，牛肉浸膏 10 g，胰蛋白胨 10 g，葡萄糖 5 g，可溶性淀粉 1 g ,氯化钠 5 g、三水乙酸钠 3 g, L-半胱氨酸 0.5 g，115℃灭菌15min。
制备丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum CICC8016。将上述菌株接种转接至5%的玉米醪种子培养基的厌氧管中，转接后，将厌氧管放入100℃水浴锅中煮沸，立即冷却至室温，充氮气，37℃静置厌氧培养16~18h即为发酵种子液。
上述5%玉米醪培养基是指： 50g玉米面加入900mL水中煮沸30min，然后冷却至室温定容至1L，121℃灭菌20min。
采用菲林试剂法测定木糖母液中还原糖含量为60.7%，将10mL木糖母液稀释至100mL，依次通过阳离子交换树脂001×7，阴离子交换树脂D301进行脱盐、脱色预处理。
按照1:10比例稀释的脱毒后木糖母液80mL，加入酵母粉0.1g，KH2PO4 0.05g，K2HPO4 0.05g，乙酸铵0.22g， MgSO4·7H2O 0.02g，MnSO4·7H2O 0.001g，NaCl 0.001g，FeSO4·7H2O 0.001g，加水定容至100mL，115℃灭菌15min，制备成木糖母液培养基。
按照5%的接种量接入ATCC55025活化种子于木糖母液培养基中；转接后，充氮气，37℃静置厌氧培养72h以上，即为乙醇、丙酮、丁醇发酵产物，乙醇含量为0.7g/L，丙酮含量为3.5g/L，丁醇含量8.7g/L。
木糖母液培养基，按照5%的接种量接入CICC8016活化种子于木糖母液培养基中，转接后，充氮气，37℃静置厌氧培养72h以上，即为丙酮、丁醇发酵产物，乙醇含量为0.9g/L，丙酮含量为2.5g/L，丁醇含量6.3g/L。
实施例2：
ATCC55025菌株利用木糖母液与葡萄糖发酵生产丙酮、丁醇：
利用拜氏梭菌Clostridium beijerinckii ATCC55025在厌氧瓶中，木糖母液发酵培养基与以葡萄糖发酵培养基进行丙酮丁醇发酵比较。
采用实施例1中制备的种子液，按照5%的接种量，转接入含有50g/L葡萄糖发酵培养基中，转接后，充氮气，37℃静置厌氧培养72h以上，即为丙酮、丁醇发酵产物。
上述所述葡萄糖发酵培养基，其成分为：葡萄糖5g（灭菌后培养基HPLC测定其中含葡萄糖48.3g/L），酵母粉0.1g，KH2PO4 0.05g，K2HPO4 0.05g，乙酸铵0.22g，MgSO4·7H2O 0.02g，MnSO4·7H2O 0.001g，NaCl 0.001g，FeSO4·7H2O 0.001g，定容至100mL，115℃灭菌15min。
以上所述木糖生产废液发酵培养基，其成分为：1:10稀释后的脱毒木糖母液90mL，酵母粉0.1g，KH2PO4 0.05g，K2HPO4 0.05g，乙酸铵0.22g， MgSO4·7H2O 0.02g，MnSO4·7H2O 0.001g，NaCl 0.001g，FeSO4·7H2O 0.001g，加水定容至100mL，115℃灭菌15min，灭菌结束后冷却至室温测定HPLC测定其中含木糖33.1g/L，葡萄糖8.3g/L，阿拉伯糖7.1g/L；
采用木糖生产废液发酵培养基所述方法测定整个发酵过程中可溶性糖利用率，为33.7g/L（其中木糖20.7g/L，葡萄糖8.3g/L，阿拉伯糖4.7g/L）；测定产物含量丁醇含量为9.2g/L，丙酮含量为4.1g/L；其中丙酮、丁醇得率为0.39，转化率为0.18g/L·h。
采用葡萄糖发酵培养基所述方法整个发酵过程中葡萄糖利用率为29.4g/L；测定产物含量丁醇含量为6.4g/L，丙酮含量为3.0g/L；其中丙酮、丁醇得率为0.31，转化率为0.13g/L·h。
木糖生产废液发酵培养基和葡萄糖发酵培养基发酵结果优略比较如图2所示。
实施例3：
不同浓度木糖母液直接添加0.2%的酵母粉发酵生产丙酮、丁醇：
按照实施例1所述制备拜氏梭菌Clostridium beijerinckii ATCC55025种子液。即，将上述菌株接种转接至葡萄糖种子培养基的厌氧管中，转接后，将厌氧管放入100℃水浴锅中煮沸，立即冷却至室温，充氮气，37℃静置厌氧培养16h即为发酵种子液。
木糖母液优化优化培养基：配置100mL培养基5瓶，其中将木糖母液直接按照6%（v/v）的浓度梯度进行稀释，分别加入酵母粉0.2g酵母粉，pH自然，接入ATCC55025发酵种子液发酵72h，测定丙酮、丁醇含量，见表一：
表一：不同浓度木糖母液发酵生产丙酮丁醇的能力
| 木糖母液浓度(v/v) | 5% | 6% | 7% | 8% | 9% |
| 丁醇含量(g/L) | 6.9 | 8.4 | 9.1 | 10.3 | 8.3 |
| 丙酮含量(g/L) | 3.1 | 3.6 | 4.0 | 4.5 | 3.6 |
实施例4：
玉米浆替代酵母粉与木糖母液共同发酵生产丙酮丁醇：
按照实施例1所述制备拜氏梭菌Clostridium beijerinckii ATCC55025种子液。即，将上述菌株接种转接至葡萄糖种子培养基的厌氧管中，转接后，将厌氧管放入100℃水浴锅中煮沸，立即冷却至室温，充氮气，37℃静置厌氧培养16~18h即为发酵种子液。
木糖母液-玉米浆培养基：配置100mL培养基2瓶，其中将木糖母液直接按照7%（v/v）的浓度梯度进行稀释，分别加入2mL和4mL玉米浆，pH5.0~pH7.0，115℃灭菌20min，按照5%的接种量，转接后，充氮气，37℃静置厌氧培养72h以上，即为丙酮、丁醇发酵产物。气相法测定2%玉米浆生产丙酮、丁醇能力为丁醇含量为10.8g/L，丙酮含量为4.6g/L；4%玉米浆生产丙酮含量为5.6g/L，丁醇含量为12.7g/L。
Claims (1)
1.一种以木糖生产废液制造丙酮、丁醇的方法，其特征是利用木糖生产废液——木糖生产过程中木糖结晶分离后的颜色较深的粘稠液体作为原料，利用微生物发酵技术生物转化糖源生产化工产品丙酮、丁醇，属于利用工业生产副产物或废弃物生产高附加值的可再生能源的清洁生产技术；其具体工艺步骤如下：
（1）将玉米秸、玉米芯、棉籽壳、甘蔗渣、稻草或小麦秸秆进行加压加热预处理以及酸水解后，再对水解液进行木糖浓缩结晶，在结晶分离后得到的废液——木糖母液；木糖母液是生产废弃糖液，采用菲林法测定其还原糖含量为3%~80%；采用高效液相色谱法测定其可溶性糖为木糖、葡萄糖、阿拉伯糖，其浓度分别是木糖含量25~70%，葡萄糖含量5~25%，阿拉伯糖含量5-25%；
（2）以木糖母液为发酵底物，复配氮源、磷源以及微量元素配制成发酵培养基；将木糖母液按照4%~12%的稀释度进行稀释，使发酵培养基中可溶性糖含量为2%~10%，涉及以下二种工艺：
工艺一：以木糖母液按照4%~12%的浓度稀释，经过阳离子、阴离子树脂进行脱色、脱毒，以此作为发酵碳源，酵母粉0.05%~5%，磷酸二氢钾0.01~1%，磷酸氢二钾0.01~1%，乙酸铵0.05~0.4%，pH5.0~7.0，115℃灭菌20min；
工艺二：直接将木糖母液进行稀释，稀释浓度4%~12%，添加0.05%~5%酵母粉或蛋白胨，或添加2%~4%的玉米浆，调节pH至5.0~7.0，115℃灭菌20min；
（3）将活化菌株接种量按照2~10%体积比转接入步骤（2）所述的发酵培养基中进行发酵；以可以发酵生产丙酮丁醇的拜氏梭菌ATCC55025和/或丙酮丁醇梭菌CICC8016作为发酵出发菌株，其菌株活化采用葡萄糖培养基或者玉米醪培养基；
（4）上述发酵条件为温度为34~40℃，在厌氧管、厌氧瓶或厌氧罐中静置或轻微震荡条件下进行发酵，发酵时间为48~120h，发酵完成后，采用气相色谱法测定产物乙醇、丙酮、丁醇含量。
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PP01 | Preservation of patent right |
Effective date of registration: 20180312 Granted publication date: 20140611 |
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| PP01 | Preservation of patent right | ||
| PD01 | Discharge of preservation of patent | ||
| PD01 | Discharge of preservation of patent |
Date of cancellation: 20210312 Granted publication date: 20140611 |
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| PP01 | Preservation of patent right | ||
| PP01 | Preservation of patent right |
Effective date of registration: 20210312 Granted publication date: 20140611 |
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| PD01 | Discharge of preservation of patent | ||
| PD01 | Discharge of preservation of patent |
Date of cancellation: 20230307 Granted publication date: 20140611 |