CN101638673A - 一种利用植物秸秆发酵生产酒精的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用植物秸秆发酵生产乙醇的方法,包括如下步骤:平板培养:将酿酒酵母接种到含葡萄糖和木糖的平板培养基中培养;种子培养:将平板培养的酿酒酵母接种到以植物秸秆水解糖为碳源的种子培养基中培养;发酵培养:将种子培养基培养的酒精酵母液体菌种接种到装有发酵培养基的发酵罐中培养,发酵温度控制在30℃~36℃,pH控制在4.4~6.0,发酵周期55~65小时,乙醇产率5%~7%,糖醇转化率大于41%。该方法利用植物秸秆做发酵原料,变废为宝,降低了环境污染,对保证粮食安全具有积极意义。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵领域,具体地说,涉及一种利用植物秸秆发酵生产酒精的方法。
背景技术
地球上每年大约形成1000亿吨植物有机物,是自然界分布最广、含量最多、价格低廉而又可再生的资源。20世纪70年代初以来,人类开始把目光转移到利用可再生的植物纤维资源生产乙醇上来,同时,日益恶化的大气状况也是采用乙醇作为替代能源的另一重要原因。随着汽车工业的迅猛发展,汽车的不完全燃烧向大气中排入了越来越多的二氧化碳及其他的有毒物质,严重污染了环境。国际环境组织呼吁,从长远利益出发,建议采用“乙醇汽油”或乙醇作为未来的汽车燃料,开发以植物纤维原料发酵生产乙醇的生物技术。开发农作物秸秆生产燃料乙醇,对于缓解能源危机,保障粮食安全,具有非常重要的现实意义和深远的历史意义。
目前秸秆发酵酒精有以下几种发酵方式:①分步水解糖化发酵法:纤维素酶水解与乙醇发酵分步进行,优点是酶解和发酵都在各自最适条件下进行,缺点是不能消除酶解过程中生成的葡萄糖和纤维二糖对纤维素酶的反馈抑制作用;②同步糖化发酵法:纤维素酶解与葡萄糖的乙醇发酵在同一个反应器中进行,提高了酶解效率,缺点是酶解与乙醇发酵最适温度不一致;③同步糖化共发酵法:纤维素酶解、己糖发酵和戊糖发酵同时进行,可采用混菌发酵或木糖代谢工程菌发酵;④直接微生物转化法:纤维素酶的生产、纤维素酶解糖化、葡萄糖乙醇发酵三个过程耦合成一步,减少了反应器,降低了设备费用,缺点是副产物多,乙醇浓度和得率低。
我们采用的发酵工艺为:用碱法工艺将植物秸秆在115℃~125℃条件下水解成含有葡萄糖和木糖的混合糖液,接入酿酒热带假丝酵母菌种,加入发酵所需的氮源和微量元素,在好氧和厌氧条件下将混合糖代谢为乙醇,提高了酶解得率,提高了乙醇浓度和糖醇转化率,发酵终点残糖很低,减轻了废水处理负荷,提高了总的经济效益。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用秸秆发酵生产酒精的方法。
本发明提供的利用植物秸秆发酵生产酒精的方法,包括如下步骤:
1、平板培养:采用葡萄糖和木糖加氮源为培养基,将酿酒酵母菌种接种到培养基中,温度30℃~33℃下培养20h~28h;
2、摇瓶种子培养:将平板培养的酒精酵母菌种接种到以植物秸秆水解糖为碳源的培养基中,接种量10%,温度30℃~33℃、pH4.5~6.0、摇床转速200rpm下,培养25h~30h;
3、种子罐种子培养:将摇瓶培养的酒精酵母菌种接种到以植物秸秆水解糖为碳源的种子培养基中,接种量为10%(v/v),温度30℃~33℃、通风比1∶(0.3~0.6),pH值4.5~6.0、搅拌转速120rpm~250rpm下,培养25h~30h;
4、发酵罐培养:将种子罐培养的酒精酵母菌种接种到发酵罐的以植物秸秆水解糖为碳源的发酵培养基中,根据该菌株在生长、代谢的不同阶段对氧气及不同碳源需求量的差异,进行有氧、厌氧两段组合发酵,第一阶段为有氧发酵阶段,无菌空气以通风比为1∶(0.3~0.6)的通风速率流入,在搅拌转速为100rpm~300rpm下,维持溶氧浓度为60%~80%,温度控制在30℃~31℃,好氧培养6h~10h,当细胞浓度达到25~30时,转入第二阶段厌氧发酵,直至发酵结束,温度控制在30℃~38℃,发酵55h~75h,即得乙醇。
所述植物秸秆水解糖是采用废弃的植物性纤维素类原料,如玉米芯、玉米秸秆、甘蔗渣等,经常规的酶解技术将其所含的纤维素类物质水解成单糖或双糖类物质,以提供给发酵菌株作为碳源,除此之外,其他一些工业废弃物如造纸厂废母液、木糖加工母液也可直接作为碳源使用。秸秆水解糖液的一种制备过程可以如下:
植物秸秆→粉碎→水洗→酸洗→水洗→碱煮→酶解→过滤→脱色→膜处理→热力浓缩→秸秆水解糖液;其中,酶解过程最好采用组合酶解工艺,同时利用纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶来进行。
所述培养基中的氮源可以为酵母膏、蛋白胨、玉米浆、尿素、硫酸铵、麸皮水解液、豆粕水解液中的一种或几种。
所述酿酒酵母菌种为工业酿酒酵母【编号为:S.cerevisiaeZU-10】,购自浙江大学。本酿酒酵母带有木糖还原酶、木糖醇脱氢酶及木酮糖激酶等基因,可在厌氧条件下同时代谢葡萄糖和木糖生成酒精。该菌种保存在以木糖为唯一碳源的斜面培养基上。
上述方法中的pH值是通过选自氨水、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸钙、氢氧化钙中的一种或几种的pH调节剂来控制的。
平板培养基的重量百分比为:葡萄糖1%~2%、木糖1%~2%、酵母膏0.2%~0.4%、蛋白胨0.1%~0.3%、琼脂1.5%~2.0%,其余为水;
摇瓶种子培养基、种子罐培养基重量百分比为:植物秸秆水解糖以总糖计3.0%~6.0%、酵母膏0.2%~0.4%、蛋白胨0.1%~0.3%、玉米浆0.5%~1.0%、磷酸二氢钾0.03%~0.06%、硫酸镁0.01%~0.04%,其余为水;
发酵摇瓶、发酵罐培养基重量百分比为:植物秸秆水解糖以总糖计13%~15%、酵母膏0.1%~0.4%、玉米浆0.5%~1.0%、磷酸二氢钾0.03%~0.06%、硫酸铵0.01%~0.05%、磷酸氢二铵0.05%~0.2%,其余为水。
用植物秸秆酸法或碱法处理得到的含有葡萄糖和木糖的水解液进行混合发酵生产乙醇。发酵菌种经过基因工程手段处理同时加以诱变和驯化,能够同时利用水解糖液中的葡萄糖和木糖,克服水解糖液中醋酸根、硫酸根、糠醛及酚类物质等抑制物的阻碍作用而生长和代谢。发酵结束后,酵母可以重复利用,部分酵母经酸化、活化后接入一级种子罐重复利用,且首罐发酵可以连续活化酵母6~10批次。
本发明的利用秸秆发酵生产酒精的方法,具有如下有益效果:
1、本工艺采用纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶对植物性纤维素类原料进行水解得到糖液作为碳源,使生产成本大为降低。
2、针对植物秸秆原料结构紧密的特点,采用高效预处理技术,为纤维素、半纤维素和木质素的综合利用提供最有力保障。
3、采用组合酶解工艺,改善纤维素酶各组分之间的协同降解作用,提高秸秆的糖化得率。
4、基因重组酵母能够将木糖转化为乙醇,发酵终了残留木糖浓度较低。
5、针对高浓度乙醇和底物对酿酒酵母在生长、代谢过程的抑制作用,在实验过程中利用在线控制手段,建立酒精酵母生长代谢过程与发酵过程模型化及控制技术,提高了酒精代谢速率,缩短了发酵周期,发酵液中五、六碳糖混合发酵乙醇浓度达到6.5%以上(v/v),糖醇转化率41%以上,发酵周期65小时以内。利用酵母回用技术,使生产成本有大幅度降低。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。
实施例1秸秆水解糖液的制备
在一个适当的反应釜内,加入一定量切碎后的风干玉米秸秆,然后按固液比1∶4(重量比)的比例加入热的氢氧化钠溶液,碱液浓度2.0%,封好口后,在120℃条件下加热60分钟进行预处理,得到的浆液在2000rpm离心机内离心,离心后的黑液经膜处理以回收其中的碱;所得固相加入容器中,加水调节浓度到15%,用酸调节pH到4.8,调节温度到50℃,向料液中加入20U/g纤维素的纤维素酶、30U/g纤维素的木聚糖酶,搅拌转速100rpm/min,酶解时间控制在72小时,酶解终点后,将料液离心过滤,液相为酶解糖液,利用DNS法测酶解液的总糖浓度,利用高效液相色谱法测酶解液中的葡萄糖及木糖浓度。
实施例2
将工业酿酒斜面菌种,接一环到含有葡萄糖1%、木糖1%、酵母膏0.5%、蛋白胨1%、琼脂1.5%的平板培养基中培养,温度31℃,培养30小时。
采用平板培养的酿酒酵母菌种,以10%(v/v)接种量接种到含实施例1制得的秸秆水解糖液,以总糖计4.0%、酵母膏0.2%、蛋白胨0.1%、玉米浆0.5%、磷酸二氢钾0.03%、硫酸镁0.01%,其余为水的500ml液体摇瓶种子培养基中培养,温度33℃,摇床转速200rpm,培养30h。
待摇瓶种子培养好后,以10%(v/v)接种量接种到含实施例1制得的秸秆水解糖液,以总糖计4%,酵母膏0.2%,蛋白胨0.1%,玉米浆0.5%,磷酸二氢钾0.03%,硫酸镁0.01%,其余为水的5L种子罐液体种子培养基中培养,温度33℃,无菌空气通风比1∶0.5(v/v),搅拌转速400rpm,培养28h。
种子罐种子培养好后,按10%(v/v)的接种量接种于含实施例1制得的秸秆水解糖液,以总糖计13%,酵母膏0.1%,玉米浆0.5%、磷酸二氢钾0.03%,硫酸铵0.01%,磷酸氢二铵0.05%,自来水配制的5L发酵罐培养基中,搅拌转速400rpm,在发酵第一阶段,以1∶0.6的流速比通入无菌空气,培养温度33℃,培养约6小时,当细胞浓度光密度(OD)值达到28时,转入厌氧培养阶段,温度34℃,搅拌转速200rpm,继续发酵至发酵结束,采用气相色谱测定,发酵液中酒精浓度达到5.58%(v/v)。
实施例3
将工业酿酒斜面菌种,接一环到含有葡萄糖1.5%、木糖1.5%、酵母膏0.6%、蛋白胨1.2%、琼脂1.6%的平板培养基中培养,温度31℃,培养29小时。
采用平板培养的酿酒酵母菌种,以10%(v/v)接种量接种到含实施例1制得的秸秆水解糖液,以总糖计4.5%、酵母膏0.25%、蛋白胨0.15%、玉米浆0.6%、磷酸二氢钾0.04%、硫酸镁0.02%,其余为水的500ml液体摇瓶种子培养基中培养,温度32℃,摇床转速200rpm,培养28h。
待摇瓶种子培养好后,以10%(v/v)接种量接种到含实施例1制得的秸秆水解糖液,以总糖计4.5%,酵母膏0.25%,蛋白胨0.15%,玉米浆0.6%,磷酸二氢钾0.04%,硫酸镁0.02%,其余为水的5L种子罐液体种子培养基中培养,温度33℃,无菌空气通风比1∶0.5(v/v),搅拌转速400rpm,培养26h。
种子罐种子培养好后,按10%(v/v)的接种量接种于含实施例1制得的秸秆水解糖液,以总糖计13.5%,酵母膏0.15%,玉米浆0.6%、磷酸二氢钾0.04%,硫酸铵0.02%,磷酸氢二铵0.06%,自来水配制的5L发酵罐培养基中,搅拌转速400rpm,在发酵第一阶段,以1∶0.6的流速比通入无菌空气,培养温度33℃,培养约7小时,当细胞浓度光密度(OD)值达到27时,转入厌氧培养阶段,温度35℃,搅拌转速200rpm,继续发酵至发酵结束,采用气相色谱测定,发酵液中酒精浓度达到5.86%(v/v)。
实施例4
将工业酿酒斜面菌种,接一环到含有葡萄糖2%、木糖2%、酵母膏0.7%、蛋白胨1.5%、琼脂1.8%的平板培养基中培养,温度31℃,培养25小时。
采用平板培养的酿酒酵母菌种,以10%(v/v)接种量接种到含实施例1制得的秸秆水解糖液,以总糖计5.0%、酵母膏0.4%、蛋白胨0.3%、玉米浆0.9%、磷酸二氢钾0.04%、硫酸镁0.03%,其余为水的500ml液体摇瓶种子培养基中培养,温度32℃,摇床转速200rpm,培养30h。
待摇瓶种子培养好后,以10%(v/v)接种量接种到含实施例1制得的秸秆水解糖液,以总糖计5%,酵母膏0.4%,蛋白胨0.3%,玉米浆0.9%,磷酸二氢钾0.04%,硫酸镁0.03%,其余为水的5L种子罐液体种子培养基中培养,温度33℃,无菌空气通风比1∶0.5(v/v),搅拌转速400rpm,培养26h。
种子罐种子培养好后,按10%(v/v)的接种量接种于含实施例1制得的秸秆水解糖液,以总糖计14%,酵母膏0.3%,玉米浆0.8%、磷酸二氢钾0.04%,硫酸铵0.03%,磷酸氢二铵0.07%,自来水配制的5L发酵罐培养基中,搅拌转速400rpm,在发酵第一阶段,以1∶0.6的流速比通入无菌空气,培养温度33℃,培养约9小时,当细胞浓度光密度(OD)值达到30时,转入厌氧培养阶段,温度34℃,搅拌转速200rpm,继续发酵至发酵结束,采用气相色谱测定,发酵液中酒精浓度达到6.18%(v/v)。
实施例5
将工业酿酒斜面菌种,接一环到含有葡萄糖1.6%、木糖1.6%、酵母膏1.8%、蛋白胨1.4%、琼脂2%的平板培养基中培养,温度31℃,培养27小时。
采用平板培养的酿酒酵母菌种,以10%(v/v)接种量接种到含实施例1制得的秸秆水解糖液,以总糖计5.0%、酵母膏0.3%、蛋白胨0.4%、玉米浆0.6%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸镁0.03%,其余为水的500ml液体摇瓶种子培养基中培养,温度33℃,摇床转速200rpm,培养25h。
待摇瓶种子培养好后,以10%(v/v)接种量接种到含实施例1制得的秸秆水解糖液,以总糖计5%,酵母膏0.3%,蛋白胨0.4%,玉米浆0.6%,磷酸二氢钾0.05%,硫酸镁0.03%,其余为水的5L种子罐液体种子培养基中培养,温度31.5℃,无菌空气通风比1∶0.4(v/v),搅拌转速400rpm,培养26h。
种子罐种子培养好后,按10%(v/v)的接种量接种于含实施例1制得的秸秆水解糖液,以总糖计15%,酵母膏0.2%,玉米浆0.8%、磷酸二氢钾0.03%,硫酸铵0.02%,磷酸氢二铵0.05%,自来水配制的50L发酵罐培养基中,搅拌转速350rpm,在发酵第一阶段,以1∶0.5的流速比通入无菌空气,培养温度31.5℃,培养约8小时,当细胞浓度光密度(OD)值达到29时,转入厌氧培养阶段,温度33℃,搅拌转速200rpm,继续发酵至发酵结束,采用气相色谱测定,发酵液中酒精浓度达到6.35%(v/v)。
实施例6
将工业酿酒斜面菌种,接一环到含有葡萄糖1.8%、木糖1.8%、酵母膏1.9%、蛋白胨1.6%、琼脂2%的平板培养基中培养,温度31℃,培养28小时。
采用平板培养的酿酒酵母菌种,以10%(v/v)接种量接种到含实施例1制得的秸秆水解糖液,以总糖计6.0%、酵母膏0.3%、蛋白胨0.4%、玉米浆1%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸镁0.03%,其余为水的500ml液体摇瓶种子培养基中培养,温度31℃,摇床转速200rpm,培养25h。
待摇瓶种子培养好后,以10%(v/v)接种量接种到含实施例1制得的秸秆水解糖液,以总糖计6%,酵母膏0.3%,蛋白胨0.4%,玉米浆1%,磷酸二氢钾0.05%,硫酸镁0.03%,其余为水的5L种子罐液体种子培养基中培养,温度33℃,无菌空气通风比1∶0.4(v/v),搅拌转速400rpm,培养28h。
种子罐种子培养好后,按10%(v/v)的接种量接种于含实施例1制得的秸秆水解糖液,以总糖计15%,酵母膏0.4%,玉米浆1%、磷酸二氢钾0.06%,硫酸铵0.05%,磷酸氢二铵0.2%,自来水配制的50L发酵罐培养基中,搅拌转速350rpm,在发酵第一阶段,以1∶0.5的流速比通入无菌空气,培养温度33℃,培养约7小时,当细胞浓度光密度(OD)值达到26时,转入厌氧培养阶段,温度35℃,搅拌转速200rpm,继续发酵至发酵结束,采用气相色谱测定,发酵液中酒精浓度达到6.46%(v/v)。
实施例7
将工业酿酒斜面菌种,接一环到含有葡萄糖1.5%、木糖1.5%、酵母膏1.7%、蛋白胨1.5%、琼脂2%的平板培养基中培养,温度31℃,培养28小时。
采用平板培养的酿酒酵母菌种,以10%(v/v)接种量接种到含实施例1制得的秸秆水解糖液,以总糖计5.5%、酵母膏0.3%、蛋白胨0.3%、玉米浆0.9%、磷酸二氢钾0.04%、硫酸镁0.03%,其余为水的500ml液体摇瓶种子培养基中培养,温度32℃,摇床转速200rpm,培养27h。
待摇瓶种子培养好后,以10%(v/v)接种量接种到含实施例1制得的秸秆水解糖液,以总糖计5.5%,酵母膏0.3%,蛋白胨0.3%,玉米浆0.9%,磷酸二氢钾0.04%,硫酸镁0.03%,其余为水的50L种子罐液体种子培养基中培养,温度33℃,无菌空气通风比1∶0.4(v/v),搅拌转速400rpm,培养26h。
种子罐种子培养好后,按10%(v/v)的接种量接种于含实施例1制得的秸秆水解糖液,以总糖计14%,酵母膏0.3%,玉米浆0.8%、磷酸二氢钾0.04%,硫酸铵0.03%,磷酸氢二铵0.05%,自来水配制的500L发酵罐培养基中,搅拌转速350rpm,在发酵第一阶段,以1∶0.5的流速比通入无菌空气,培养温度33℃,培养约9小时,当细胞浓度光密度(OD)值达到28时,转入厌氧培养阶段,温度34℃,搅拌转速200rpm,继续发酵至发酵结束,采用气相色谱测定,发酵液中酒精浓度达到6.5%(v/v)。
实施例8
将工业酿酒斜面菌种,接一环到含有葡萄糖2%、木糖2%、酵母膏1.5%、蛋白胨1.5%、琼脂1.8%的平板培养基中培养,温度31℃,培养25小时。
采用平板培养的酿酒酵母菌种,以10%(v/v)接种量接种到含实施例1制得的秸秆水解糖液,以总糖计6.0%、酵母膏0.25%、蛋白胨0.35%、玉米浆1%、磷酸二氢钾0.04%、硫酸镁0.04%,其余为水的500ml液体摇瓶种子培养基中培养,温度32℃,摇床转速200rpm,培养25h。
待摇瓶种子培养好后,以10%(v/v)接种量接种到含实施例1制得的秸秆水解糖液,以总糖计6%,酵母膏0.25%,蛋白胨0.35%,玉米浆1%,磷酸二氢钾0.04%,硫酸镁0.04%,其余为水的50L种子罐液体种子培养基中培养,温度32℃,无菌空气通风比1∶0.4(v/v),搅拌转速400rpm,培养26h。
种子罐种子培养好后,按10%(v/v)的接种量接种于含实施例1制得的秸秆水解糖液,以总糖计15%,酵母膏0.4%,玉米浆1%、磷酸二氢钾0.05%,硫酸铵0.04%,磷酸氢二铵0.08%,自来水配制的500L发酵罐培养基中,搅拌转速350rpm,在发酵第一阶段,以1∶0.5的流速比通入无菌空气,培养温度33℃,培养约6小时,当细胞浓度光密度(OD)值达到27时,转入厌氧培养阶段,温度35℃,搅拌转速200rpm,继续发酵至发酵结束,采用气相色谱测定,发酵液中酒精浓度达到6.59%(v/v)。
Claims (8)
1、一种利用植物秸秆发酵生产酒精的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)平板培养:采用葡萄糖和木糖加氮源为培养基,将酿酒酵母菌种接种到培养基中,在温度30℃~33℃下培养24h~30h;
(2)摇瓶种子培养:将平板培养的酿酒酵母菌种接种到以植物秸秆水解糖为碳源的种子培养基中,接种量5~10%(v/v),在温度30℃~33℃、pH4.5~6.0、摇床转速200rpm下,培养25h~30h;
(3)种子罐种子培养:将摇瓶培养的酿酒酵母菌种接种到以植物秸秆水解糖为碳源的种子罐培养基中,接种量为10%(v/v),温度30℃~33℃,通风比1∶(0.3~0.6),pH值4.5~6.0,搅拌转速120rpm~250rpm下,培养24h~30h;
(4)发酵罐培养:将种子罐种子培养的酿酒酵母菌种接种到发酵罐的以植物秸秆水解糖为碳源的发酵培养基中,进行有氧、厌氧两段组合发酵,第一阶段为有氧发酵阶段,无菌空气以通风比为1∶(0.3~0.6)的通风速率流入,在搅拌转速为100rpm~300rpm下,维持溶氧浓度为60%~80%,温度控制在30℃~31℃,好氧培养3h~10h,当细胞浓度达到20~25时,转入第二阶段厌氧发酵,直至发酵结束,温度控制在30℃~38℃,发酵55h~75h,即得乙醇。
2、如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述碳源为玉米芯水解糖、玉米秸秆水解糖、甘蔗渣水解糖、造纸厂废母液、木糖加工母液中的一种或几种。
3、如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述培养基中还含有氮源,为酵母膏、蛋白胨、玉米浆、尿素、硫酸铵、麸皮水解液、豆粕水解液中的一种或几种。
4、如权利要求1所述的方法,其特征在于,pH值是通过选自氨水、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸钙、氢氧化钙中的一种或几种的pH调节剂来控制的。
5、如权利要求1-4任一项所述的方法,其特征在于,平板培养基的重量百分比为:葡萄糖1.0%~2.0%、木糖1.0%~2.0%、酵母膏0.5%~1.0%、蛋白胨1.0%~2.0%、琼脂1.5%~2.0%,其余为水。
6、如权利要求1-4任一项所述的方法,其特征在于,摇瓶种子培养基重量百分比为:植物秸秆水解糖以总糖计3%~6%、酵母膏0.2%~0.4%、蛋白胨0.1%~0.3%、玉米浆0.5%~1.0%、磷酸二氢钾0.03%~0.06%、硫酸镁0.01%~0.04%,其余为水。
7、如权利要求1-4任一项所述的方法,其特征在于,种子罐培养基重量百分比为:植物秸秆水解糖以总糖计3%~6%、酵母膏0.2%~0.4%、蛋白胨0.1%~0.3%、玉米浆0.5%~1.0%、磷酸二氢钾0.03%~0.06%、硫酸镁0.01%~0.04%,其余为水。
8、如权利要求1-4任一项所述的方法,其特征在于,发酵培养基中包括如下重量百分比的组分:植物秸秆水解糖以总糖计13%~15%、酵母膏0.2%~0.4%、玉米浆0.5%~1.0%、磷酸二氢钾0.03%~0.06%、硫酸铵0.01%~0.05%、磷酸氢二铵0.05~0.2%,其余为水。
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