CN104046658A - 一种乙醇发酵培养基及其应用 - Google Patents

一种乙醇发酵培养基及其应用 Download PDF

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章隆泉
过俊宏
肖运根
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Abstract

本发明公开了一种乙醇发酵培养基及其应用，培养基中组分及含量如下：木糖28~35g/L，葡萄糖10~17g/L，黄豆粉1~4g/L，氯化钙0.4~1.2g/L，硫酸铵0.2~0.4g/L，碳酸钙2.5~3.5g/L，磷酸二氢钾0.2~0.4g/L，其余为水。本发明发酵培养基中配方简单，木糖廉价易得，操作简便，培养基成本低廉，以毕氏酵母NRRL.7124在本发明的培养基上发酵生产乙醇，得到的乙醇含量达到9.5g/L，以毕赤酵母CBS5776在本发明的培养基上发酵生产乙醇，得到的乙醇含量达到7.8g/L，高于文献报道的平均水平。本发明降低了乙醇的发酵成本，提高了碳源的利用率。

Description

一种乙醇发酵培养基及其应用
技术领域
本发明涉及一种乙醇发酵培养基及其应用，属于生物化工技术领域。
背景技术
乙醇是一种重要的有机溶剂和化工原料，广泛应用于化工、塑料、有机合成、油漆等行业。乙醇还是一种极具潜力的新型生物燃料，在资源日益紧张的今天，乙醇可以作为燃料替代传统的石油资源，而受到世界各国的广泛关注。
目前乙醇的生成方法主要有合成法和发酵法。合成法是以乙烯为原料生产乙醇。1825年俄国人发现乙烯和硫酸经酯化、水解可合成乙醇，1930年该法首次在美国实现工业化。随着石油化工的迅速发展，合成法生产的乙醇产量越来越大，但该法生产的乙醇中夹杂着异构高碳醇，对人有麻痹作用，不宜作食品、饮料、医药和香料等。所以，即使在石油化工发达的国家，发酵法乙醇仍占有一定比例。工业上采用的合成法主要是乙烯直接水合法，即将乙烯在浸渍有磷酸的固体催化剂上进行水合反应。所得稀乙醇溶液需经过精馏提纯以除去部分水和副产物。用普通的精馏法得到的乙醇浓度最高只有95.6%，工业上可进一步加工最后制得纯度为99.5%的无水乙醇。发酵法可采用各种含糖、淀粉或纤维素的农产品、林产品、工业副产、农业副产及野生植物为原料，整个生产过程分为原料蒸煮、糖化剂制备、糖化(水解)、酵母制备、发酵及蒸馏等工序。每吨乙醇需消耗3吨多粮食或5吨多白薯干。在一些农副产品丰富的国家，发酵法至今仍是生产乙醇的主要方法。
发明内容
技术问题：本发明所要解决的技术问题是提供一种乙醇发酵培养基及利用该培养基发酵产乙醇的方法。
技术方案：一种乙醇发酵培养基，培养基中组分及含量如下：木糖28~35 g/L，葡萄糖 10~17 g/L，黄豆粉 1~4 g/L，氯化钙0.4~1.2 g/L，硫酸铵0.2~0.4 g/L，碳酸钙 2.5~3.5 g/L，磷酸二氢钾0.2~0.4 g/L，其余为水。
培养基中组分及含量优选如下：木糖 30 g/L，葡萄糖 15 g/L，黄豆粉 2 g/L，氯化钙 0.8 g/L，硫酸铵0.3 g/L，碳酸钙 3 g/L，磷酸二氢钾 0.3 g/L，其余为水。
所述的乙醇发酵培养基在发酵生产乙醇中的应用。
所述的乙醇发酵培养基在发酵生产乙醇中的应用，包括菌种活化、种子培养、厌氧发酵三步骤，其特征在于：所述厌氧发酵步骤中，接种量为8～15%（v/v），温度为30～40℃，发酵罐在接种后通入纯N2，10～20min后停止通气，搅拌速度在100～300 rpm，发酵时间在48～72 h。其中接种量优选为10%（v/v），温度优选为35℃。
其中，所述菌种为任意乙醇生产菌，优选为酵母菌。
菌种活化步骤中，将50mL的培养瓶中加入培养基20～30mL，所述的培养基为含有淀粉或者糖类等能提供碳源、氮源以及无机盐的液体培养基，接入1mL甘油管中冻存的菌种，静置于恒温培养箱中，培养温度为30～40℃，活化时间为12～14h，得到活化的种子液。
种子培养步骤中，培养时将500mL培养瓶中加入培养基100～400mL，所述的培养基为含有淀粉或者糖类等能提供碳源、氮源以及无机盐的液体培养基，接入活化的种子液，培养温度为30～40℃，在恒温培养箱中培养，培养时间为8～12h，用于发酵罐接种。
有益效果：本发明发酵培养基中配方简单，木糖廉价易得，操作简便，培养基成本低廉，以毕氏酵母NRRL.7124在本发明的培养基上发酵生产乙醇，得到的乙醇含量达到9.5g/L，以毕赤酵母CBS5776（来自美国标准菌库）在本发明的培养基上发酵生产乙醇，得到的乙醇含量达到7.8g/L，高于文献报道的平均水平。本发明降低了乙醇的发酵成本，提高了碳源的利用率。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例中使用的种子培养基为：葡萄糖 25g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，硫酸铵0.5 g/L，碳酸钙 2.5 g/L，磷酸二氢钾0.2 g/L，其余为水。
实施例1发酵培养基影响因素选择
     菌种：毕氏酵母NRRL.7124
将50mL的培养瓶中加入培养基30mL，所述的培养基为葡萄糖 25g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，硫酸铵0.5 g/L，碳酸钙 2.5 g/L，磷酸二氢钾0.2 g/L，其余为水；接入1mL甘油管中冻存的菌种，静置于恒温培养箱中，培养温度为35℃，活化时间为13h，得到活化的种子液。
种子培养步骤中，培养时将500mL培养瓶中加入培养基300mL，所述的培养基为葡萄糖 25g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，硫酸铵0.5 g/L，碳酸钙 2.5 g/L，磷酸二氢钾0.2 g/L，其余为水，培养温度为35℃，在恒温培养箱中培养，培养时间为10h，用于发酵罐接种；
所述厌氧发酵步骤中，接种量为10%（v/v），温度为35℃，发酵罐在接种后通入纯N2，10～20min后停止通气，搅拌速度在300 rpm，发酵时间在48 h。
通过单因素分析法确定与Xyn-1产酶的培养基相关7因素。采用Plackett-Burman设计筛选产乙醇的重要影响因子，选用试验次数N=10的设计，对培养基中的木糖，葡萄糖，黄豆粉，氯化钙，硫酸铵，碳酸钙，磷酸二氢钾，等7个因素进行考察，结果见表1，对乙醇产量影响的顺序为：葡萄糖>木糖>硫酸铵>磷酸二氢钾。
表1
  实施例 2
菌种：毕氏酵母NRRL.7124 
发酵培养基：木糖28 g/L，葡萄糖17 g/L，黄豆粉 1 g/L，氯化钙0.4 g/L，硫酸铵0.2 g/L，碳酸钙 2.5 g/L，磷酸二氢钾0.2 g/L，其余为水。
5L发酵罐发酵时培养基装液量为3L。 将冻存的甘油管中的菌种接入50mL装入量为30mL的种子培养基中，通入N2，在恒温培养箱中培养，温度为35℃，活化培养。培养12h后，用无菌的移液枪将活化的菌种按5%的比例接入含有300mL种子培养基的500mL瓶中，扩大培养，12h后用于上述发酵培养基接种（5L发酵罐），接种量为10%（v/v），搅拌转速在120rpm，35℃发酵培养。接种后通入N2，通气量为0.25vvm，15min后停止通气，关闭通气口，保证发酵的厌氧环境。发酵时间为60h。
采用FULI 9710气相色谱仪测定溶剂含量，FID检测器，色谱柱：石英毛细管柱，固定相：SE-30，规格：30 m x 0.32 mm x 1 μm，类型：交联，最高使用温度290℃。柱箱温度90℃，检测器温度180℃，进样器180℃，载气为N2，流速30 mL/min，以异丁醇为内标物，进样量0.4 μL。测得本实施例中的乙醇含量为8.8g/L。
实施例3
菌种：毕赤酵母CBS5776 
发酵培养基：木糖35 g/L，葡萄糖17 g/L，黄豆粉4 g/L，氯化钙1.2 g/L，硫酸铵0.4 g/L，碳酸钙3.5 g/L，磷酸二氢钾0.4 g/L，其余为水。
5L发酵罐发酵时培养基装液量为3L。 将冻存的甘油管中的菌种接入50mL装入量为30mL的种子培养基中，通入N2，在恒温培养箱中培养，温度为35℃，活化培养。培养12h后，用无菌的移液枪将活化的菌种按5%的比例接入含有300mL种子培养基的500mL瓶中，扩大培养，12h后用于上述发酵培养基接种（5L发酵罐），接种量为10%（v/v），搅拌转速在120rpm，35℃发酵培养。接种后通入N2，通气量为0.25vvm，15min后停止通气，关闭通气口，保证发酵的厌氧环境。发酵时间为60h。
采用FULI 9710气相色谱仪测定溶剂含量，FID检测器，色谱柱：石英毛细管柱，固定相：SE-30，规格：30 m x 0.32 mm x 1 μm，类型：交联，最高使用温度290℃。柱箱温度90℃，检测器温度180℃，进样器180℃，载气为N2，流速30 mL/min，以异丁醇为内标物，进样量0.4 μL。测得本实施例中的乙醇含量为7.0g/L。
实施例4
菌种：毕氏酵母NRRL.7124 
发酵培养基：木糖 30 g/L，葡萄糖 15 g/L，黄豆粉 2 g/L，氯化钙 0.8 g/L，硫酸铵0.3 g/L，碳酸钙 3 g/L，磷酸二氢钾 0.3 g/L，其余为水。
5L发酵罐发酵时培养基装液量为3L。 将冻存的甘油管中的菌种接入50mL装入量为30mL的种子培养基中，通入N2，在恒温培养箱中培养，温度为35℃，活化培养。培养12h后，用无菌的移液枪将活化的菌种按5%的比例接入含有300mL种子培养基的500mL瓶中，扩大培养，12h后用于上述发酵培养基接种（5L发酵罐），接种量为10%（v/v），搅拌转速在120rpm，35℃发酵培养。接种后通入N2，通气量为0.25vvm，15min后停止通气，关闭通气口，保证发酵的厌氧环境。发酵时间为60h。
采用FULI 9710气相色谱仪测定溶剂含量，FID检测器，色谱柱：石英毛细管柱，固定相：SE-30，规格：30 m x 0.32 mm x 1 μm，类型：交联，最高使用温度290℃。柱箱温度90℃，检测器温度180℃，进样器180℃，载气为N2，流速30 mL/min，以异丁醇为内标物，进样量0.4 μL。测得本实施例中的乙醇含量为9.5g/L。
实施例5
菌种：毕赤酵母CBS5776 
发酵培养基：木糖 30 g/L，葡萄糖 15 g/L，黄豆粉 2 g/L，氯化钙 0.8 g/L，硫酸铵0.3 g/L，碳酸钙 3 g/L，磷酸二氢钾 0.3 g/L，其余为水。
5L发酵罐发酵时培养基装液量为3L。 将冻存的甘油管中的菌种接入50mL装入量为30mL的种子培养基中，通入N2，在恒温培养箱中培养，温度为35℃，活化培养。培养12h后，用无菌的移液枪将活化的菌种按5%的比例接入含有300mL种子培养基的500mL瓶中，扩大培养，12h后用于上述发酵培养基接种（5L发酵罐），接种量为10%（v/v），搅拌转速在120rpm，35℃发酵培养。接种后通入N2，通气量为0.25vvm，15min后停止通气，关闭通气口，保证发酵的厌氧环境。发酵时间为60h。
采用FULI 9710气相色谱仪测定溶剂含量，FID检测器，色谱柱：石英毛细管柱，固定相：SE-30，规格：30 m x 0.32 mm x 1 μm，类型：交联，最高使用温度290℃。柱箱温度90℃，检测器温度180℃，进样器180℃，载气为N2，流速30 mL/min，以异丁醇为内标物，进样量0.4 μL。测得本实施例中的乙醇含量为7.8g/L。

Claims (5)

1.一种乙醇发酵培养基，其特征在于培养基中组分及含量如下：木糖28~35 g/L，葡萄糖 10~17 g/L，黄豆粉 1~4 g/L，氯化钙0.4~1.2 g/L，硫酸铵0.2~0.4 g/L，碳酸钙 2.5~3.5 g/L，磷酸二氢钾0.2~0.4 g/L，其余为水。
2.根据权利要求1所述的乙醇发酵培养基，其特征在于：培养基中组分及含量如下：木糖 30 g/L，葡萄糖 15 g/L，黄豆粉 2 g/L，氯化钙 0.8 g/L，硫酸铵0.3 g/L，碳酸钙 3 g/L，磷酸二氢钾 0.3 g/L，其余为水。
3.权利要求1或2所述的乙醇发酵培养基在发酵生产乙醇中的应用。
4.根据权利要求3所述的乙醇发酵培养基在发酵生产乙醇中的应用，包括菌种活化、种子培养、厌氧发酵三步骤，其特征在于：所述厌氧发酵步骤中，接种量为8～15%（v/v），温度为30～40℃，发酵罐在接种后通入纯N2，10～20min后停止通气，搅拌速度在100～300 rpm，发酵时间在48～72 h。
5.根据权利要求4所述的乙醇发酵培养基在发酵生产乙醇中的应用，其特征在于：接种量为10%（v/v），温度为35℃。
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