CN104894171A - 以木薯淀粉为原料发酵生产(r,r)-2,3-丁二醇的方法 - Google Patents

以木薯淀粉为原料发酵生产(r,r)-2,3-丁二醇的方法 Download PDF

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Abstract

一种以木薯淀粉为原料发酵生产(R,R)-2,3-丁二醇的方法，包括如下步骤：以木薯淀粉或者木薯淀粉水解液为原料，与氮源、无机盐、酶混合后接入产(R,R)-2,3-丁二醇的菌种，以同步液化糖化发酵或者同步糖化发酵的方式，进行摇瓶批式发酵或者3L发酵罐批式发酵。其中150g/L木薯淀粉摇瓶批式同步糖化发酵，得到(R,R)-2,3-丁二醇的最大产量为64.3g/L，光学纯度98.3%；3L发酵罐批式发酵，同步糖化发酵20-25h，可得到(R,R)-2,3-丁二醇的产量为54.57-57.81g/L，平均产率为2.31-2.73g·L-1·h-1，最大光学纯度达98.5%。本发明能够有效降低生物法生产(R,R)-2,3-丁二醇的成本，同时获得较高浓度的(R,R)-2,3-丁二醇，对于提高非粮木薯的附加值也有积极的意义，具有很强的实用价值和工业价值。

Description

以木薯淀粉为原料发酵生产(R,R)-2,3-丁二醇的方法
技术领域
本发明涉及生物化工技术领域，具体是一种以木薯淀粉为原料发酵生产(R,R)-2,3-丁二醇的方法。
背景技术
2,3-丁二醇作为一种大宗的平台化合物具有广泛的应用价值，尤其在化工、食品、燃料及航空航天领域。其中，2,3-丁二醇氧化脱氢可生成高价值食品风味剂2,3-丁二酮，或者选择性氧化获得3-羟基-2-丁酮，后者可用于医药中间体和食用香料，目前市场化前景较好，市场价格在25万元/吨左右；与乙酸反应生成的二乙酸-2,3-丁二醇酯是水果香气物质的重要成分；脱水生成的甲乙酮可作为一种高价值的液体燃料添加剂，亦是重要的低沸点溶剂；脱水生成的1,3-丁二烯可用于合成橡胶、ABS树脂及SBS弹性体；此外，2,3-丁二醇可作为液体燃料、辛烷值提升剂，或用于合成高附加值产品如聚酯、聚氨酯和航空用油。
(R,R)-2,3-丁二醇是2,3-丁二醇的一种旋光异构体，属于新兴的四碳手性醇，高光学纯度的该产品除了应用于上述领域外，还是合成手性电子材料、医药中间体的重要原料，或者作为一种优良的高级抗冻剂，近年来受到了化工、材料界的广泛关注，开发可再生资源高效转化光学纯(R,R)-2,3-丁二醇关键技术研究对我国具有重要的意义。目前，(R,R)-2,3-丁二醇的生产主要采用化学合成法，以1-丁醇经过多步反应得到2,3-丁二醇的旋光异构体混合物（包括(R,R)-2,3-丁二醇、(S,S)-2,3-丁二醇和meso-2,3-丁二醇），最后通过外消旋体的拆分得到(R,R)-2,3-丁二醇。化学合成法过程繁琐，而且手性拆分成本高，难以实现大规模生产。因此，实现单一立体构型2,3-丁二醇的研究很有必要。
目前国内外公开的微生物发酵生产(R,R)-2,3-丁二醇的文献，均需使用价格较高的葡萄糖或蔗糖为原料发酵生产才能获得较高浓度的(R,R)-2,3-丁二醇（50-111g/L），造成其生产成本过高而制约(R,R)-2,3-丁二醇的应用。此外，玉米淀粉是醇类发酵最常用的原料之一，但鉴于大量使用玉米淀粉发酵对我国粮食供给是一个很大的挑战。近年来，国家已经开始限制使用玉米淀粉作为发酵原料，因此尽快找到一种替代品成为当务之急。木薯广泛种植于热带和部分亚热带地区，其含有亚麻仁苦苷，水解后会产生游离氢氰酸，若生食或食品加工过程处理不当易引起中毒，因此被认为是一种非粮食类经济作物。因此，作为一种资源丰富、淀粉含量高（木薯干淀粉含量在71%以上）的作物，非粮作物木薯被用作工业发酵原料对缓解全球粮食压力、降低发酵产物生产成本有重要意义。
通过检索专利，木薯原料可用于生产丙酮、乙醇、丁醇、L-乳酸、柠檬酸，但未见有关采用木薯淀粉作为原料生产(R,R)-2,3-丁二醇的专利报道。目前与(R,R)-2,3-丁二醇制备相关的专利公开文献如下：
1、中国专利申请号为201210505523.2，公开了一株高产高纯度的(R,R)-2,3-丁二醇的基因工程菌及其构建方法和应用。该发明所述的发酵培养基使用高价的葡萄糖为碳源，未使用木薯淀粉。
2、中国专利申请号为200910026807.1，公开了一种多粘类芽孢杆菌及利用其制备光学纯R,R型2,3-丁二醇的方法，该发明所述的发酵培养基使用菊芋菊粉为碳源，最高产量为41.8g/L，未使用木薯淀粉为碳源。
3、中国专利申请号为201310346580.5，公开了利用枯草芽孢杆菌的改造及制备D-(-)-2,3-丁二醇的方法。该发明所述的发酵培养基使用高价的葡萄糖为碳源，最高产量为48.3g/L，未使用木薯淀粉为碳源。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种以木薯淀粉为原料发酵生产(R,R)-2,3-丁二醇的方法，以廉价木薯淀粉为原料，即以木薯淀粉或木薯淀粉水解液为原料发酵生产(R,R)-2,3-丁二醇，能够有效降低生物法生产(R,R)-2,3-丁二醇的成本，同时获得较高浓度的(R,R)-2,3-丁二醇。
本发明的技术方案为：一种以木薯淀粉为原料发酵生产(R,R)-2,3-丁二醇的方法，包括如下步骤：
（1）菌种：采用的菌种为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）；
（2）同步液化糖化发酵：木薯淀粉按w/w料水比1：2-1：5进行调浆，调节pH6-7，加入α-淀粉酶0.1-0.35KNU/g木薯淀粉，在115-121℃条件下灭菌15-20min，冷却后与同样条件下灭菌的氮源、无机盐混合作为发酵培养基，加入0.45μm滤膜过滤除菌的α-淀粉酶0.1-0.35KNU/g木薯淀粉、糖化酶2-14AGU/g木薯淀粉，以及0.1-0.8g/L中性蛋白酶，按5-10%体积百分比接种量接种，同时进行木薯淀粉液化、糖化和(R,R)-2,3-丁二醇发酵，即以同步液化糖化发酵方式发酵得到(R,R)-2,3-丁二醇。
同步糖化发酵：木薯淀粉按w/w料水比1：2-1：5进行调浆，调节pH6-7，加入α-淀粉酶0.1-0.35KNU/g木薯淀粉，温度控制在90-100℃，液化20-50min，然后在115-121℃条件下灭菌15-20min，冷却后与同样条件下灭菌的氮源、无机盐混合作为发酵培养基，加入0.45μm滤膜过滤除菌的糖化酶2-14AGU/g木薯淀粉、0.1-0.8g/L中性蛋白酶，按5-10%体积百分比接种量接种，同时进行糖化和(R,R)-2,3-丁二醇发酵，即以同步糖化发酵方式发酵得到(R,R)-2,3-丁二醇。
上述的同步液化糖化发酵和同步糖化发酵采用的发酵工艺是摇瓶批式发酵或3L发酵罐批式发酵，发酵温度为40℃。150g/L木薯淀粉同步糖化摇瓶批式发酵，得到(R,R)-2,3-丁二醇的最高产量为64.3g/L；3L发酵罐批式发酵，150-175g/L木薯淀粉同步糖化发酵20-25h，得到(R,R)-2,3-丁二醇的产量为54.57-57.81g/L，平均产率为2.31-2.73g·L-1·h-1，最大光学纯度为98.5%。
本发明的有益效果：
所用的非粮木薯原料易于取材，价格低廉，不存在与人争粮的问题，且酶解、糖化与发酵同步进行，简化了操作步骤，能够有效降低生物法生产(R,R)-2,3-丁二醇的成本，同时获得较高浓度的(R,R)-2,3-丁二醇，对于提高非粮木薯的附加值、缓解全球粮食压力也有积极的意义，具有很强的实用价值和工业价值。
附图说明
图1是多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）在3L发酵罐批式同步糖化发酵150g/L木薯淀粉生产(R,R)-2,3-丁二醇的曲线。其中，●—(R,R)-2,3-丁二醇变化曲线。
具体实施方式
本发明使用的菌种可以从菌种保藏中心购买，也可以通过野外采集、基因工程改造或者其他途径获得。涉及的专业术语是本领域中常见的专业术语，实施例是说明性的，而不是限定性的，不能被解释为限定本发明的保护范围。
下述实施例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面结合实施例对本发明的技术内容作进一步说明。
实施例1
本发明所述的以木薯淀粉为原料发酵生产(R,R)-2,3-丁二醇的方法，包括如下步骤：
本实施例为以木薯淀粉为原料进行摇瓶同步液化糖化发酵。
发酵菌株：多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）为多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa DSM365，该菌株购于德国菌种保藏保中心DSMZ。
种子培养基及种子培养：葡萄糖50g/L，酵母粉30g/L，(NH4)2SO43g/L，MgSO4·7H2O0.3g/L，Na2HPO4·12H2O4g/L，KH2PO49g/L，pH为6.0。115℃高压灭菌20min。将保存在超低温冰箱的多粘类芽孢杆菌P.polymyxa DSM365接到种子培养基中，37℃摇床培养得到新鲜种子液。
同步液化糖化发酵：木薯淀粉按w/w料水比1：2-1：5进行调浆，调节pH6-7，加入α-淀粉酶0.2KNU/g木薯淀粉，然后在115℃条件下灭菌20min，冷却后与同样条件下灭菌的氮源、无机盐混合作为发酵培养基。发酵培养基木薯淀粉浓度配制成80g/L、120g/L、150g/L；氮源、无机盐包括：豆粕粉60g/L，(NH4)2SO42g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，Na2HPO4·12H2O4g/L，KH2PO49g/L，Tween-802ml/L，乙酸钠8g/L。加入0.45μm滤膜过滤除菌的α-淀粉酶0.2KNU/g木薯淀粉、糖化酶3AGU/g木薯淀粉和中性蛋白酶0.6g/L后，按10%体积百分比接种量接种进行同步液化糖化发酵。发酵温度40℃，摇床转速250rpm。气相测定(R,R)-2,3-丁二醇、(S,S)-2,3-丁二醇和meso-2,3-丁二醇的浓度，结果如表1所示。
表1不同浓度木薯淀粉为原料的同步液化糖化发酵结果
木薯淀粉浓度 (R,R)-2,3-丁二醇浓度 光学纯度
80g/L 28.7g/L 98.3%
120g/L 50.24g/L 98.6%
150g/L 51.76g/L 98.5%
实施例2
本实施例为以木薯淀粉水解液为原料进行摇瓶同步糖化发酵。
发酵菌株：同实施例1。
种子培养基及种子培养：同实施例1。
同步糖化发酵：木薯淀粉按w/w料水比1：2-1：5进行调浆，调节pH6-7，加入α-淀粉酶0.2KNU/g木薯淀粉，90-100℃液化20-50min，然后在115℃条件下灭菌20min，冷却后与同样条件下灭菌的氮源、无机盐混合作为发酵培养基。培养基木薯淀粉浓度配制成80g/L、120g/L、150g/L；氮源、无机盐包括：豆粕粉60g/L，(NH4)2SO42g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，Na2HPO4·12H2O4g/L，KH2PO49g/L，Tween-802ml/L，乙酸钠8g/L。加入0.45μm滤膜过滤除菌的糖化酶3AGU/g木薯淀粉和中性蛋白酶0.6g/L后，按10%体积百分比接种量接种进行同步糖化发酵。发酵温度40℃，摇床转速250rpm。气相测定(R,R)-2,3-丁二醇、(S,S)-2,3-丁二醇和meso-2,3-丁二醇的浓度，结果如表2所示。
表2不同浓度木薯淀粉为原料的同步糖化发酵结果
木薯淀粉浓度 (R,R)-2,3-丁二醇浓度 光学纯度
80g/L 32.5g/L 98.2%
120g/L 53.78g/L 98.5%
150g/L 64.3g/L 98.3%
实施例3
本实施例为以木薯淀粉水解液为原料进行批式同步糖化发酵。
发酵菌株：同实施例1。
种子培养基及种子培养：同实施例1。
3L发酵罐批式同步糖化发酵：木薯淀粉按w/w料水比1：2-1：5进行调浆，调节pH6-7，加入α-淀粉酶0.2KNU/g木薯淀粉，90-100℃液化20-50min，然后在115℃条件下灭菌20min，冷却后与同样条件下灭菌的氮源、无机盐混合作为发酵培养基。培养基木薯淀粉浓度配制成150g/L、160g/L、175g/L；氮源、无机盐包括：豆粕粉60g/L，(NH4)2SO42g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，Na2HPO4·12H2O4g/L，KH2PO49g/L，Tween-802ml/L，乙酸钠8g/L。加入0.45μm滤膜过滤除菌的糖化酶3AGU/g木薯淀粉和中性蛋白酶0.6g/L，种子液按照10%体积百分比接种量接入进行同步糖化发酵。发酵温度40℃，0-5h搅拌速度为500rpm、通气为2vvm，5h后搅拌速度为300rpm、通气为0.2vvm。发酵20-25h，(R,R)-2,3-丁二醇浓度为54.57-57.81g/L，平均生产速率为2.31-2.73g·L-1·h-1，最大光学纯度为98.5%。DNS法测定残糖含量，气相测定(R,R)-2,3-丁二醇、(S,S)-2,3-丁二醇和meso-2,3-丁二醇的浓度，结果如表3、图1所示。
表3不同浓度木薯淀粉为原料的3L发酵罐批式同步糖化发酵结果
木薯淀粉浓度 发酵时间 (R,R)-2,3-丁二醇浓度 光学纯度
150g/L 20h 54.57g/L 98.2%
160g/L 24h 57.7g/L 98.5%
175g/L 25h 57.81g/L 98.3%
这一结果表明多粘类芽孢杆菌P.polymyxa DSM365在以非粮木薯淀粉为原料发酵生产(R,R)-2,3-丁二醇中，显示出了非常好的工业应用前景。应该理解的是，对本领域技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，例如，所述的菌株除了多粘类芽孢杆菌P.polymyxaDSM365之外，还可以是多粘类芽孢杆菌P.polymyxa其它菌株，或者其它能够利用木薯淀粉产生高纯度(R,R)-2,3-丁二醇的微生物，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (4)

1.一种以木薯淀粉为原料发酵生产(R,R)-2,3-丁二醇的方法，其特征在于，以木薯淀粉或者木薯淀粉水解液为原料，与氮源、无机盐混合后接入产(R,R)-2,3-丁二醇的菌种，发酵得到含(R,R)-2,3-丁二醇的发酵液，具体步骤如下：
（1）菌种：采用的菌种为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）；
（2）同步液化糖化发酵：木薯淀粉按w/w料水比为1：2-1：5进行调浆，调节pH6-7，加入α-淀粉酶0.1-0.35KNU/g木薯淀粉，在115-121℃条件下灭菌15-20min，冷却后与同样条件下灭菌的氮源、无机盐混合作为发酵培养基，加入0.45μm滤膜过滤除菌的α-淀粉酶0.1-0.35KNU/g木薯淀粉、糖化酶2-14AGU/g木薯淀粉，按5-10%体积百分比接种量接种，同时进行液化、糖化和(R,R)-2,3-丁二醇发酵，即以同步液化糖化发酵方式发酵得到(R,R)-2,3-丁二醇；同步糖化发酵：木薯淀粉按w/w料水比1：2-1：5进行调浆，调节pH6-7，加入α-淀粉酶0.1-0.35KNU/g木薯淀粉，温度控制在90-100℃，液化20-50min，然后在115-121℃条件下灭菌15-20min，冷却后与同样条件下灭菌的氮源、无机盐混合作为发酵培养基，加入0.45μm滤膜过滤除菌的糖化酶2-14AGU/g木薯淀粉，按5-10%体积百分比接种量接种，同时进行糖化和(R,R)-2,3-丁二醇发酵，即以同步糖化发酵方式发酵得到(R,R)-2,3-丁二醇。
2.根据权利要求1所述的以木薯淀粉为原料发酵生产(R,R)-2,3-丁二醇的方法，其特征在于，所述发酵是摇瓶批式发酵或3L发酵罐批式发酵；150g/L木薯淀粉摇瓶批式同步糖化发酵，得到(R,R)-2,3-丁二醇的最大产量为64.3g/L；3L发酵罐批式发酵，150-175g/L木薯淀粉同步糖化发酵20-25h，得到(R,R)-2,3-丁二醇的产量为54.57-57.81g/L，平均产率为2.31-2.73g·L-1·h-1，最大光学纯度达98.5%。
3.根据权利要求1和/或2所述的以木薯淀粉为原料发酵生产(R,R)-2,3-丁二醇的方法，其特征在于，所述氮源是豆粕粉，添加0.1-0.8g/L中性蛋白酶酶解。
4.根据权利要求1和/或2所述的以木薯淀粉为原料发酵生产(R,R)-2,3-丁二醇的方法，其特征在于，所述无机盐是(NH4)2SO42g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L，Na2HPO4·12H2O4g/L，KH2PO49g/L，Tween-802ml/L，乙酸钠8g/L的混合物。
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