CN107201374B - 光学纯meso-2,3-丁二醇高产工程菌株的构建方法及应用 - Google Patents

光学纯meso-2,3-丁二醇高产工程菌株的构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种光学纯meso‑2,3‑丁二醇高产工程菌株的构建，该构建方法是将α‑乙酰乳酸合成酶基因、α‑乙酰乳酸脱羧酶基因和meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶基因的核苷酸序列进行密码子优化，然后拼接获得包含该三个基因的基因簇，再将基因簇导入表达载体中获得多顺反子重组质粒，最后将重组质粒再导入宿主菌E.coli即得所述高产工程菌，该菌所用的合成原料来源广泛、成本低，菌株无致病性，菌株产量高、生产效率高、稳定性好，最高产量可达到91.5 g/L，光学纯度可达99%以上。本发明同时公开了上述高产工程菌株利用廉价木薯粉为碳源，利用棉籽蛋白粉、豆粕粉、豆饼粉或花生蛋白粉为氮源在生产光学纯meso‑2,3‑丁二醇中的应用，降低了生产成本。

Description

光学纯meso-2,3-丁二醇高产工程菌株的构建方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体是一种光学纯meso-2,3-丁二醇高产工程菌株的构建方法，及其在利用廉价原料生产光学纯meso-2,3-丁二醇中的应用。
背景技术
2,3-丁二醇(2,3-butanediol)是一种平台化合物，在化工、食品、能源、医药等领域具有广泛的应用价值，其微生物发酵生产是现代生物化工的重要课题。2,3-丁二醇分子中含有两个手性碳原子，因此存在三种光学异构体，分别是(2R,3R)-2,3-丁二醇、(2S,3S)-2,3-丁二醇和meso-2,3-丁二醇。单一构型的meso-2,3-丁二醇不仅具有混旋型2,3-丁二醇的基本功能，而且在不对称合成高附加值化学品和药物方面具有巨大的潜在优势，例如用于合成可再生聚酯或者光学纯卤代醇，具有广阔的应用前景。传统化学合成法获得的2,3-丁二醇是三种光学异构体的混合物，不但存在过程繁琐、产率低、环境污染严重等问题，而且由于不同立体构型2,3-丁二醇的物理化学性质相近，手性拆分成本十分高昂，难以实现大规模低成本生产。因此，开展微生物高效合成单一构型meso-2,3-丁二醇的研究具有重要的意义。
与传统化学合成法相比，2,3-丁二醇的微生物发酵法对环境友好，工艺简单，符合绿色化工的要求。目前2,3-丁二醇的高产菌种大多属于致病微生物，如Klebsiellapneumoniae、Klebsiella oxytoca、Enterobacter aerogenes、Serratia marcescens、Enterobacter cloaca，因此限制了这些菌株的产业化应用。另外，目前已报道的2,3-丁二醇发酵菌株所产的2,3-丁二醇多为两种或三种光学异构体的混合物【Biotechnol Adv,2011,29:351-364】，同样存在手性拆分、成本高昂的问题。目前尚未发现能够发酵生产光学纯meso-2,3-丁二醇的天然微生物。因此，迫切需要开发出meso-2,3-丁二醇的产量、转化率以及光学纯度高并且安全可靠的代谢工程菌株。
中国专利201410051821.8公开了克隆E.cloacae subsp.dissolvens的2,3-丁二醇合成基因簇，该基因簇包括四个基因，其中lysR编码2,3-丁二醇合成调控因子，budA、budB、budC编码α-乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶、meso-2,3-丁二醇脱氢酶。将该基因簇插入表达载体pET-28a(+)获得重组质粒pETRABC，导入E.coli获得工程菌株。该工程菌株meso-2,3-丁二醇最高产量为85g/L，但光学纯度太低，仅为96％，而且为达到高产需要使用高价原料酵母粉和葡萄糖。此外，pET-28a(+)是高拷贝表达载体，而且该法需要诱导表达数量较多的基因(lysR、budA、budB和budC)，加大了宿主的代谢负荷，会增加大规模工业生产的不稳定性。而目前使用廉价碳源发酵生产meso-2,3-丁二醇的方法，则由于菌株的生产能力不足导致meso-2,3-丁二醇产量偏低，或者光学纯度达不到要求。综上所示，meso-2,3-丁二醇现有合成技术中存在原料成本过高、光学纯度太低，产量太低，或者菌株不稳定等问题。
发明内容
本发明针对meso-2,3-丁二醇现有合成技术存在的问题，提供一种光学纯meso-2,3-丁二醇高产工程菌株的构建及应用。本发明通过对编码α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脱羧酶基因和meso-2,3-丁二醇脱氢酶基因进行密码子优化及人工合成，利用表达载体构建多顺反子表达质粒，利用合成生物学技术在安全模式微生物E.coli中构建meso-2,3-丁二醇的人工合成途径，使用代谢工程技术对代谢网络进行优化，敲除主要副产物合成途径的关键基因，提高meso-2,3-丁二醇的光学纯度、产量与转化率。本发明所获得的工程菌株能够有效利用非粮木薯和廉价氮源作为发酵原料代替高纯糖(葡萄糖)及高价氮源(酵母粉、蛋白胨)。本发明的方法能够提高meso-2,3-丁二醇光学纯度和产量，同时大幅度降低发酵原料的成本。
为了实现以上目的，本发明采用的技术方案如下：
一种光学纯meso-2,3-丁二醇高产工程菌株的构建方法，包括以下步骤：
(1)将α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脱羧酶基因和meso-2,3-丁二醇脱氢酶基因的核苷酸序列进行密码子优化；(2)将经密码子优化的α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脱羧酶基因和meso-2,3-丁二醇脱氢酶基因拼接获得包含该三个基因的基因簇；(3)将基因簇插入表达载体中，获得多顺反子重组质粒；(4)将多顺反子重组质粒导入宿主菌E.coli，即获得光学纯meso-2,3-丁二醇高产工程菌株。
进一步地，所述密码子优化的具体操作是在α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脱羧酶基因和meso-2,3-丁二醇脱氢酶基因每个基因前面添加含核糖体结合位点的核苷酸序列TAAGGAGGATATACA。
在细胞内，核糖体负责将mRNA翻译成蛋白质，16S rRNA是核糖体的一个亚基，它可与TAAGGAGGATATACA序列通过碱基互补原则精确识别，在基因前面添加核糖体结合位点序列，可以增强核糖体与mRNA的识别与结合能力，提高目标基因的表达效率，相应的α-乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶和meso-2,3-丁二醇脱氢酶活力升高，酶促反应加快，最终提高meso-2,3-丁二醇的合成能力。
进一步地，所述宿主菌E.coli为多基因缺失的突变菌株，其通过叠加敲除菌株中合成副产物的关键基因而获得；所述副产物包括(2R,3R)-2,3-丁二醇、(2S,3S)-2,3-丁二醇、丁二酸、乳酸、乙酸、乙醇和甲酸；所述合成副产物的关键基因包括gldA、dar、frdABCD、ldhA、pta、adhE和pflB。
进一步地，所述的α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脱羧酶基因和meso-2,3-丁二醇脱氢酶基因的来源菌株选自Klebsiella pneumoniae、Enterobacter cloacae、Klebsiella oxytoca、Enterobacter aerogenes、Serratia marcescens、Paenibacilluspolymyxa、Bacillus subtilis和Bacillus licheniformis。
所述的α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脱羧酶基因和meso-2,3-丁二醇脱氢酶基因的来源菌株优选Klebsiella pneumoniae、Enterobacter cloacae。
本发明还提供以上所述基因工程菌株在生产meso-2,3-丁二醇的应用，包括以下步骤：
(1)发酵培养基的制备：取木薯粉、氮源原料，再加入水、液化酶和氯化钙，在80-100℃液化0.5-5h，静置冷却；当温度降低至55℃时，加入糖化酶和蛋白酶，在50-60℃糖化5-20h，调节pH 6.5-7.5，离心或过滤收集上清液，稀释上清液后在115℃条件下灭菌15min，即得；按1000mL水计，所述发酵培养基各原料组分分别用量为：木薯粉100-200g，氮源原料40-80g，液化酶0.5-2mL，氯化钙0.01-0.5g，糖化酶0.2-1mL，蛋白酶0.05-0.5g；所述木薯粉是将木薯去皮晒干后经粉碎过50-200目筛制备而得；所述氮源原料为棉籽蛋白粉、豆粕粉、豆饼粉、花生蛋白粉中的一种或一种以上组合；
(2)将发酵培养基转移至发酵罐，然后添加50-100μg/mL氨苄青霉素，在无菌条件下，将经活化的基因工程菌菌液以体积比为2-10％的接种量接种至发酵培养基中，在温度35-40℃、搅拌转速200-600rpm、通气量0.2-1.5vvm条件下培养24-72h，当检测发酵液中meso-2,3-丁二醇的浓度不再增加时，发酵结束。
进一步地，所述基因工程菌菌株的活化方法包括以下步骤：将光学纯meso-2,3-丁二醇高产工程菌株划线到含有质量体积比为1.5-1.8％琼脂和含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养10-15h；在无菌的条件下，用牙签挑取LB平板上的一个单菌落，然后接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养10-15h；所述的LB培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠。
进一步地，在发酵过程中检测发酵液中葡萄糖的浓度，待葡萄糖浓度降至10-30g/L时，补加木薯还原糖母液使发酵液中葡萄糖浓度为40-80g/L。
进一步地，所述木薯还原糖母液的葡萄糖浓度为500-800g/L。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明提供的光学纯meso-2,3-丁二醇高产工程菌株所用的合成原料来源广泛、成本低廉，菌株无致病性，菌株产量高、生产效率高、稳定性好，最高产量可达到91.5g/L，光学纯度可达99％以上，克服了现有菌株存在的问题。
2、本发明菌株的构建方法具有操作方便简单、生产效率高、成本低廉等优点，容易实现工业化生产。
3、本发明利用代谢工程敲除宿主菌合成主要副产物的关键基因，不需要表达转录调控因子，因此培养基中无需添加乙酸(盐)解除转录抑制，简化操作和降低成本。
4、本发明无需添加具有毒性并且成本较高的诱导剂IPTG，工程菌株的外源基因表达水平即可满足高效合成meso-2,3-丁二醇的需要，降低了生产成本，同时避免基因过量表达产生的代谢负荷，工程菌株性质稳定。
5、本发明利用非粮木薯粉为碳源，棉籽蛋白粉、豆粕粉、豆饼粉或花生蛋白粉为氮源用于发酵meso-2,3-丁二醇，替代已有报道使用的高纯糖、酵母粉，不仅可以提高这些廉价原料的综合利用价值，还为meso-2,3-丁二醇发酵提供了更加廉价的原料，可大幅降低meso-2,3-丁二醇发酵的原料成本。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明进一步详细说明，但不限于本发明的保护范围。
下述实施例中所涉及的材料：(1)液化酶、糖化酶、蛋白酶为商业化产品，可购于诺维信(中国)生物技术有限公司等公司；(2)棉籽蛋白粉、豆粕粉、豆饼粉、花生蛋白粉为商业化产品，可购于青岛科瑞培养基有限公司等公司。
下述实施例在发酵生产meso-2,3-丁二醇过程中，采用SBA-40C分析仪检测发酵液中葡萄糖浓度，利用液相色谱测定主要副产物的浓度，利用气相色谱测定2,3-丁二醇各种立体异构体的浓度并计算光学纯度。
实施例1
生产meso-2,3-丁二醇基因工程菌株GXASM1的构建：
将来源于K.pneumoniae菌株的α-乙酰乳酸合成酶基因KpbudB、α-乙酰乳酸脱羧酶基因KpbudA和来源于E.cloacae菌株的meso-2,3-丁二醇脱氢酶基因EcbudC的核苷酸序列进行密码子优化，在每个基因前面添加含有核糖体结合位点的核苷酸系列TAAGGAGGATATACA；将经过密码子优化的α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脱羧酶基因和meso-2,3-丁二醇脱氢酶基因利用人工合成的方法进行拼接，获得包含三个基因的基因簇KpbudB-KpbudA-EcbudC，其核苷酸序列长度为3292个碱基，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述；利用双酶切与连接方法，将KpbudB-KpbudA-EcbudC基因簇插入表达载体pTrc99A中，获得pTrc99A-KpbudB-KpbudA-EcbudC多顺反子重组质粒；将多顺反子重组质粒导入宿主菌E.coli MG1655，即获得光学纯meso-2,3-丁二醇高产工程菌株GXASM1。
实施例2
生产meso-2,3-丁二醇基因工程菌株GXASM2的构建：
通过分析工程菌株GXASM1发酵的主要副产物为(2R,3R)-2,3-丁二醇、(2S,3S)-2,3-丁二醇、丁二酸、乳酸、乙酸、乙醇和甲酸，其合成途径的关键基因是gldA、dar、frdABCD、ldhA、pta、adhE和pflB。利用大肠杆菌噬菌体来源的Red重组系统可在细菌内高效介导同源重组的原理，先用两侧带有FRT位点的抗性基因取代上述目标基因，再通过诱导外源性温敏质粒表达FLP重组酶删除抗性基因达到敲除目标基因的目的，具体步骤如下：
将pKD46质粒转化入宿主细胞，制备电转化感受态细胞；利用引物进行PCR构建打靶序列(含氯霉素抗性基因)，并将其直接转化含pKD46的宿主细胞；氯霉素平板筛选发生同源重组的克隆；利用测序技术验证、挑选目标基因被氯霉素抗性基因取代的克隆，制备电转化感受态细胞；电转导入pCP20质粒删除氯霉素抗性基因；氯霉素抗性基因删除的克隆连续划线传代三次，制备甘油管-20℃保存。通过叠加敲除，可获得多基因缺失的突变株E.coliMG1655/ΔgldA ΔdarΔfrdABCDΔldhA ΔadhEΔpflB，制备电转化感受态细胞，将实施例1构建的多顺反子重组质粒pTrc99A-KpbudB-KpbudA-EcbudC电转导入多基因缺失突变株，获得工程菌株GXASM2。
所述的引物序列分别为：
gldA-F:ATGGACCGCATTATTCAATCACCGGGTAAATACATCCAGGGCGCTGATGTTCCTGGTGTCCCTGTTGATA。
gldA-R:CAGGCAATTTTGCGTTCAAACTCCCGGACAAGCCGGGAGTTTGGAGTAGGAATTGCTCCTTTAGAGATGAGTAGTGCCAAATGCGGCATTCCAGTCGTGTATAGATACATCAGAGCTTTTACGAG。
dar-F:TCATGCCGACCAAAATATTACCCAATGAAATATCCACGCACCTCACTGCGCATATGAATATCCTCCTTAGTTCCTATTC。
dar-R:ATATGCGCCTTCTATACTTAACGTTTATTCAGCGTTAAGTGGAGAACTCGGAGCTGCTTCGAAGTTCCTA。
frdABCD-F:CTTACCCTGAAGTACGTGGCTGTGGGATAAAAACAATCTGGAGGAATGTCCATATGAATATCCTCCTTAGTTCCTATTC。
frdABCD-R:CGCCATAGGCGGGCCGGATTTACATTGGCGATGCGTTAGATTGTAACGACGAGCTGCTTCGAAGTTCCTA。
ldhA-F:CTTACCCTGAAGTACGTGGCTGTGGGATAAAAACAATCTGGAGGAATGTCCATATGAATATCCTCCTTAGTTCCTATTC。
ldhA-R:ATTGGGGATTATCTGAATCAGCTCCCCTGGAATGCAGGGGAGCGGCAAGAGAGCTGCTTCGAAGTTCCTA。
pta-F:GTAACGAAAGAGGATAAACCGTGTCCCGTATTATTATGCTGATCCCTACCCATATGAATATCCTCCTTAGTTCCTATTC
pta-R:TTATTTCCGGTTCAGATATCCGCAGCGCAAAGCTGCGGATGATGACGAGAGAGCTGCTTCGAAGTTCCTA
adhE-F:ATTCGAGCAGATGATTTACTAAAAAAGTTTAACATTATCAGGAGAGCATTCATATGAATATCCTCCTTAGTTCCTATTC
adhE-R:TCGGCATTGCCCAGAAGGGGCCGTTTATGTTGCCAGACAGCGCTACTGAGAGCTGCTTCGAAGTTCCTA
pflB-F:GTGGAGCCTTTATTGTACGCTTTTTACTGTACGATTTCAGTCAAATCTAACATATGAATATCCTCCTTAGTTCCTATTC
pflB-R:AAATAAAAAATCCACTTAAGAAGGTAGGTGTTACATGTCCGAGCTTAATGAGCTGCTTCGAAGTTCCTA
实施例3
生产meso-2,3-丁二醇基因工程菌株GXASM3的构建：
本实施例与实施例1的不同之处是：α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脱羧酶基因的来源菌株为Enterobacter cloacae，meso-2,3-丁二醇脱氢酶基因的来源菌株为Klebsiella oxytoca。
实施例4
生产meso-2,3-丁二醇基因工程菌株GXASM4的构建：
本实施例与实施例2的不同之处是：将实施例3构建的多顺反子重组质粒电转导入多基因缺失突变株，获得工程菌株GXASM4。
实施例5
生产meso-2,3-丁二醇基因工程菌株GXASM5的构建：
本实施例与实施例1的不同之处是：α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脱羧酶基因的来源菌株为Serratia marcescens。
实施例6
生产meso-2,3-丁二醇基因工程菌株GXASM6的构建：
本实施例与实施例2的不同之处是：将实施例5构建的多顺反子重组质粒电转导入多基因缺失突变株，获得工程菌株GXASM6。
实施例7
生产meso-2,3-丁二醇基因工程菌株GXASM7的构建：
本实施例与实施例1的不同之处是：α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脱羧酶基因的来源菌株为Enterobacter aerogenes。
实施例8
生产meso-2,3-丁二醇基因工程菌株GXASM8的构建：
本实施例与实施例1的不同之处是：α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脱羧酶基因的来源菌株为Paenibacillus polymyxa。
实施例9
生产meso-2,3-丁二醇基因工程菌株GXASM9的构建：
本实施例与实施例1的不同之处是：α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脱羧酶基因的来源菌株为Bacillus subtilis。
实施例10
生产meso-2,3-丁二醇基因工程菌株GXASM10的构建：
本实施例与实施例1的不同之处是：α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脱羧酶基因的来源菌株为Bacillus licheniformis。
实施例2-10合成基因簇的方法与实施例1相同，或为现有常规技术方法，本领域技术人员能够通过本申请公开的内容获悉该基因簇的核苷酸序列，对此不再累述实施例2-10对应合成的基因簇的核苷酸序列。
应用实施例1
工程GXASM1、GXASM2、GXASM3、GXASM4、GXASM5、GXASM6、GXASM7、GXASM8、GXASM9、GXASM10在生产meso-2,3-丁二醇的应用，包括以下步骤：
(1)木薯去皮晒干后，粉碎至粒径为150目；分别称取十份木薯粉160g，棉籽蛋白粉50g，分别加入1000mL自来水、0.5mL液化酶和0.1g氯化钙，在90℃液化2h，静置冷却；当温度降低至55℃时，加入0.5mL糖化酶和0.2g蛋白酶，在55℃糖化15h，调节pH至7.5，过滤收集上清液，用自来水稀释使还原糖浓度为100g/L，在115℃条件下灭菌15min，即得发酵培养基；
(2)分别取500mL发酵培养基转移至上海百仑六联发酵罐，然后添加100μg/mL氨苄青霉，在无菌条件下，将经活化的基因工程菌GXASM1、GXASM2、GXASM3、GXASM4、GXASM5、GXASM6、GXASM7、GXASM8、GXASM9、GXASM10菌液以体积比为5％的接种量接种至发酵培养基中，在温度37℃、搅拌转速300rpm、通气量0.5vvm条件下培养28h后，利用气相色谱和液相色谱测定产物meso-2,3-丁二醇及主要副产物的浓度，发酵液中meso-2,3-丁二醇的浓度不再增加，发酵结束，并计算meso-2,3-丁二醇的光学纯度，测定结果如表1所示。
所述基因工程菌菌液的活化方法：将生产meso-2,3-丁二醇的工程菌株GXASM1至GXASM10分别划线到含有质量体积比为1.5％琼脂的并含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养3h；在无菌的条件下，用牙签挑取LB平板上的一个单菌落，然后接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养10h；所述的LB培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠。
表1不同工程菌株的发酵产物
Figure BDA0001335334090000081
从表中可以得知，敲除副产物合成途径的关键基因gldA、dar、frdABCD、ldhA、pta、adhE和pflB，工程菌株GXASM2、GXASM4、GXASM6的meso-2,3-丁二醇产量和光学纯度与未经过敲除处理的工程菌株(分别对应于GXASM1、GXASM3、GXASM5)相比显著提高，主要副产物的浓度大大降低，因此经过副产物的敲除不但提高了转化率，而且有利于下游的产物提取，能够降低生产成本并提高产品的质量(光学纯度高)。
应用实施例2
工程菌株GXASM2在生产meso-2,3-丁二醇的应用，包括以下步骤：
(1)木薯去皮晒干后，粉碎至粒径为100目的木薯粉；称取木薯粉200g，豆粕粉30g，加入1000mL自来水、1.0mL液化酶和0.5g氯化钙，在80℃液化2h，静置冷却；当温度降低至55℃时，加入1.5mL糖化酶和0.5g蛋白酶，在50℃糖化20h，调节pH至7.0，离心分离收集上清液，用自来水稀释使还原糖浓度为100g/L，在115℃条件下灭菌15min，即得发酵培养基；
(2)分别取500mL发酵培养基转移至上海百仑六联发酵罐，然后添加80μg/mL氨苄青霉素，在无菌条件下，将经活化的基因工程菌GXASM2菌液以体积比为2％的接种量接种至发酵培养基中，在温度37℃、搅拌转速600rpm、通气量1.2vvm条件下发酵培养18h后，发酵液中葡萄糖浓度下降为25.7g/L，补加木薯还原糖母液使葡萄糖浓度提高到70g/L，发酵30h、48h再补加等量木薯还原糖母液，还原糖母液的葡萄糖浓度为500g/L，总共补料3次。发酵72h后，发酵结束。
所述基因工程菌GXASM2菌液的活化方法：将生产meso-2,3-丁二醇的工程菌株GXASM2划线到含有质量体积比为1.8％琼脂的并含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养15h；在无菌的条件下，用牙签挑取LB平板上的一个单菌落，然后接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养12h；所述的LB培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠。
本实施例中meso-2,3-丁二醇产量为91.5g/L，光学纯度达到99.3％，主要副产物浓度为：乙酸2.1g/L、丁二酸0.3g/L、乳酸0.4g/L、甲酸0.2g/L、乙醇0.1g/L。
应用实施例3
工程GXASM3在生产meso-2,3-丁二醇的应用，包括以下步骤：
(1)木薯去皮晒干后，粉碎至粒径为200目；称取木薯粉100g，花生蛋白粉80g，加入1000mL自来水、1.5mL液化酶和0.1g氯化钙，在100℃液化0.5h，静置冷却；当温度降低至55℃时，加入2.0mL糖化酶和0.05g蛋白酶，在60℃糖化10h，调节pH至6.5，离心分离收集上清液，用自来水稀释使还原糖浓度为100g/L，在115℃条件下灭菌15min，即得发酵培养基；
(2)分别取500mL发酵培养基转移至上海百仑六联发酵罐，然后添加50μg/mL氨苄青霉，在无菌条件下，将经活化的基因工程菌GXASM3菌液以体积比为10％的接种量接种至发酵培养基中，在温度40℃、搅拌转速200rpm、通气量0.2vvm条件下发酵培养24h后，发酵液中葡萄糖浓度下降为23.4g/L，补加木薯粉还原糖母液使葡萄糖浓度提高到60g/L，发酵36h、50h再补加等量木薯粉还原糖母液，总共补料3次。发酵72h后，发酵结束。
利用气相色谱和液相色谱测定产物meso-2,3-丁二醇及主要副产物的浓度，发酵液中meso-2,3-丁二醇的浓度不再增加，发酵结束，并计算meso-2,3-丁二醇的光学纯度。
所述基因工程菌GXASM3菌液的活化方法：将生产meso-2,3-丁二醇的工程菌株GXASM3划线到含有质量体积比为1.8％琼脂的并含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养13h；在无菌的条件下，用牙签挑取LB平板上的一个单菌落，然后接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养15h；所述的LB培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠。
本实施中meso-2,3-丁二醇产量为71.6g/L，光学纯度为96.5％。主要副产物浓度为：乙酸6.3g/L、丁二酸3.1g/L、乳酸2.6g/L、甲酸2.1g/L、乙醇1.5g/L。
应用实施例4
工程GXASM4在生产meso-2,3-丁二醇的应用，包括以下步骤：
(1)木薯去皮晒干后，粉碎至粒径为150目；称取木薯粉160g，豆饼粉65g，加入1000mL自来水、1.0mL液化酶和0.2g氯化钙，在90℃液化1.5h，静置冷却；当温度降低至55℃时，加入0.5mL糖化酶和0.2g蛋白酶，在60℃糖化5h，调节pH至7.5，离心分离收集上清液，用自来水稀释使还原糖浓度为100g/L，在115℃条件下灭菌15min，即得发酵培养基；
(2)分别取500mL发酵培养基转移至上海百仑六联发酵罐，然后添加80μg/mL氨苄青霉，在无菌条件下，将经活化的基因工程菌GXASM4菌液以体积比为5％的接种量接种至发酵培养基中，在温度40℃、搅拌转速300rpm、通气量1.5vvm条件下发酵培养22h后，发酵液中葡萄糖浓度下降为23.4g/L，补加木薯粉还原糖母液使葡萄糖浓度提高到60g/L，发酵40h、60h再补加等量木薯粉还原糖母液，总共补料3次。发酵72后，发酵结束。
所述基因工程菌GXASM4菌液的活化方法：将生产meso-2,3-丁二醇的工程菌株GXASM4划线到含有质量体积比为1.6％琼脂的并含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养11h；在无菌的条件下，用牙签挑取LB平板上的一个单菌落，然后接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养15h；所述的LB培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠。
本实施中meso-2,3-丁二醇产量为80.8g/L，光学纯度为99.2％。主要副产物浓度为：乙酸1.4g/L、丁二酸0.3g/L、乳酸0.4g/L、甲酸0.1g/L、乙醇0.3g/L。
应用实施例5
工程GXASM7在生产meso-2,3-丁二醇的应用，包括以下步骤：
(1)木薯去皮晒干后，粉碎至粒径为60目；称取木薯粉100g，豆饼粉30g，花生蛋白粉30g，加入1000mL自来水、2.0mL液化酶和0.05g氯化钙，在80℃液化4h，静置冷却；当温度降低至55℃时，加入0.3mL糖化酶和0.3g蛋白酶，在50℃糖化18h，调节pH至7.5，离心分离收集上清液，用自来水稀释使还原糖浓度为100g/L，在115℃条件下灭菌15min，即得发酵培养基；
(2)分别取500mL发酵培养基转移至上海百仑六联发酵罐，然后添加90μg/mL氨苄青霉，在无菌条件下，将经活化的基因工程菌GXASM7菌液以体积比为6％的接种量接种至发酵培养基中，在温度37℃、搅拌转速400rpm、通气量1.2vvm条件下发酵培养24h后，发酵液中葡萄糖浓度下降为21.9g/L，补加木薯粉还原糖母液使葡萄糖浓度提高到70g/L，发酵36h再补加等量木薯粉还原糖母液，发酵54h后，发酵结束。
所述基因工程菌GXASM7菌液的活化方法：将生产meso-2,3-丁二醇的工程菌株GXASM7划线到含有质量体积比为1.6％琼脂的并含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养10h；在无菌的条件下，用牙签挑取LB平板上的一个单菌落，然后接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养12h；所述的LB培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠。
本实施中meso-2,3-丁二醇产量为58.6g/L，光学纯度为96.1％。
应用实施例6
工程GXASM8在生产meso-2,3-丁二醇的应用，包括以下步骤：
(1)木薯去皮晒干后，粉碎至粒径为100目；称取木薯粉150g，棉籽蛋白粉35g，花生蛋白粉15g，豆饼粉15g，加入1000mL自来水、1.1mL液化酶和0.5g氯化钙，在95℃液化2h，静置冷却；当温度降低至55℃时，加入0.6mL糖化酶和1.0g蛋白酶，在65℃糖化4h，调节pH至7.0，离心分离收集上清液，用自来水稀释使还原糖浓度为100g/L，在115℃条件下灭菌15min，即得发酵培养基；
(2)分别取500mL发酵培养基转移至上海百仑六联发酵罐，然后添加100μg/mL氨苄青霉，在无菌条件下，将经活化的基因工程菌GXASM8菌液以体积比为8％的接种量接种至发酵培养基中，在温度42℃、搅拌转速200rpm、通气量1.8vvm条件下发酵培养20h后，发酵液中葡萄糖浓度下降为22.6g/L，补加木薯粉还原糖母液使葡萄糖浓度提高到60g/L，发酵30h再补加等量木薯粉还原糖母液，发酵54h后，发酵结束。
所述基因工程菌GXASM8菌液的活化方法：将生产meso-2,3-丁二醇的工程菌株GXASM4划线到含有质量体积比为1.6％琼脂的并含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养11h；在无菌的条件下，用牙签挑取LB平板上的一个单菌落，然后接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养15h；所述的LB培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠。
本实施中meso-2,3-丁二醇产量为60.2g/L，光学纯度为96.2％。
SEQUENCE LISTING
<110> 广西科学院
<120> 光学纯meso-2,3-丁二醇高产工程菌株的构建方法及应用
<130> 3292
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3292
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gagctctaag gaggatatac atatggacaa acaatatccg gtgcgtcagt gggctcatgg 60
cgcggatctg gttgttagtc agctggaagc ccaaggtgtg cgccagattt ttggcatccc 120
gggtgcaaaa atcgataaag ttttcgactc cctgctggat agctctattc gtattattcc 180
ggtgcgtcat gaagcaaatg ccgcatttat ggcagctgcg gttggtcgta tcaccggcaa 240
agcgggtgtt gcactggtga ccagtggtcc gggttgctcc aacctgatta ccggcatggc 300
cacggcaaat agcgaaggtg atccggttgt ggctctgggc ggtgcggtca aacgtgctga 360
caaagcgaaa caggtgcatc aatcaatgga taccgttgcg atgttctcgc cggtcaccaa 420
atatgctgtg gaagttacgg cgccggatgc tctggcggaa gttgtctcaa atgcctttcg 480
tgccgcagaa cagggccgtc cgggtagcgc cttcgtgtct ctgccgcagg atgtggttga 540
cggccctgtg agtggtaaag ttctgccggc ctcccgtgca ccgcagatgg gtgctgcccc 600
ggatgatgcc attgatcaag ttgcaaaact gatcgcccag gcaaaaaacc cgatttttct 660
gctgggcctg atggcctcac agccggaaaa ttcggccgca ctgcgtcgcc tgctggaagc 720
gagccatatt ccggtgacct ctacgtacca agctgcgggc gcagttaacc aggataattt 780
tagccgtttc gcgggccgcg tgggtctgtt caacaatcaa gctggcgacc gtctgctgca 840
actggcggat ctggtgattt gtatcggtta tagcccggtt gaatacgaac cggctatgtg 900
gaactctggc aatgcgaccc tggtccacat cgacgtgctg ccggcgtatg aagaacgcaa 960
ctacaccccg gacgttgaac tggtcggcga tatcgccggt acgctgaaca aactggcaca 1020
gaatattgat catcgtctgg tgctgagccc gcaggccgca gaaattctgc gtgaccgcca 1080
gcaccaacgc gaactgctgg atcgtcgcgg tgcccagctg aaccaatttg cactgcatcc 1140
gctgcgtatc gttcgcgcca tgcaggacat tgttaatagt gatgtcaccc tgacggtgga 1200
tatgggctcc tttcacattt ggatcgcgcg ttatctgtac agcttccgtg cccgccaggt 1260
tatgatctct aatggtcagc agacgatggg cgttgccctg ccgtgggcta ttggtgcgtg 1320
gctggttaat ccggaacgta aagtcgtgtc agtctcgggc gatggcggct ttctgcaaag 1380
cagcatggaa ctggaaacgg ctgtgcgcct gaaagcgaac gttctgcatc tgatctgggt 1440
ggataacggt tataatatgg tggcgattca ggaagagaaa aaataccagc gcctgagtgg 1500
cgttgaattt ggtccgatgg atttcaaagc gtatgcggaa tcatttggcg ccaaaggttt 1560
cgcagtggaa tcggccgaag cactggaacc gaccctgcgt gctgcgatgg atgtggatgg 1620
tccggccgtt gtcgcaatcc cggtggatta ccgcgacaat ccgctgctga tgggccaact 1680
gcacctgtct cagattctgt aataaggagg atatacatat gaaccattca gccgaatgca 1740
cctgtgaaga atcgctgtgc gaaacgctgc gtgcatttag cgctcagcac ccggaatctg 1800
tgctgtatca gaccagtctg atgtccgcgc tgctgagtgg tgtttacgaa ggctccacca 1860
cgattgccga tctgctgaaa catggtgact ttggtctggg cacgttcaat gaactggatg 1920
gcgaactgat cgcgtttagc tctcaggtct atcaactgcg tgccgatggt tcagcgcgca 1980
aagcccagcc ggaacaaaaa accccgtttg cggtgatgac gtggttccag ccgcaatacc 2040
gtaaaacctt cgatcatccg gttagccgcc agcaactgca cgatgtcatt gaccagcaaa 2100
tcccgtctga taacctgttt tgtgcactgc gtattgacgg ccattttcgc catgctcata 2160
cccgtacggt gccgcgccag accccgccgt atcgtgcaat gacggatgtc ctggatgacc 2220
agccggtgtt tcgtttcaac caacgcgaag gtgtgctggt tggctttcgt accccgcagc 2280
acatgcaagg tattaatgtt gctggctatc atgaacactt catcacggat gaccgcaaag 2340
gcggtggcca tctgctggat taccagctgg accacggtgt cctgaccttt ggcgaaattc 2400
ataaactgat gatcgatctg ccggcagact ccgcgtttct gcaagcgaac ctgcacccgg 2460
ataatctgga cgcggccatc cgctcagttg aatcgtaata aggaggatat acatatgcag 2520
aaagtggcgt tagtgaccgg cagcggccag ggtattggca aggcgattgc gctgcgcctg 2580
gtgaaagatg gctttgcggt ggccattgcg gattataacg acgaaaccgc gcgcgcggtg 2640
gcggatgaaa tcattcgcaa cggcggcaat gcggttgccg tgaaagtgga tgttagcgat 2700
cgcgatcagg tgtttgcggc ggtggaaaaa gcgcgtaccg cgctgggcgg ctttaacgtg 2760
attgtgaaca acgcgggcat tgcgccgagc accccgatcg aaagcattac cccggaaatc 2820
gtggacaagg tgtacaacat caacgtgaag ggcgtgatct ggggtatgca agccgccatt 2880
gacgcgtttc gcaaggaggg ccacggcggc aaaattatca acgcctgctc gcaagcgggt 2940
cataccggca acccggagct ggccgtgtat agcagcagca aattcgcggt gcgcggcctg 3000
acgcaaaccg cggcccgtga tttagcgccg ctgggtatca ccgtgaacgc gtattgcccg 3060
ggcattgtga agaccccgat gtgggccgaa atcgatcgtc aggttagcga agcggcgggc 3120
aaaccgttag gctatggcac cgagaccttt gccaaacgta tcaccctggg ccgtctgagc 3180
gaaccggaag atgtggcggc gtgcgttagc tatctggccg gtccggactc ggattatatg 3240
accggccaga gcctgctgat tgatggcggc atggttttca actaaggatc cc 3292

Claims (5)

1.一种光学纯meso-2,3-丁二醇高产工程菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脱羧酶基因和meso-2,3-丁二醇脱氢酶基因的核苷酸序列进行密码子优化；（2）将经密码子优化的α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脱羧酶基因和meso-2,3-丁二醇脱氢酶基因拼接获得包含该三个基因的基因簇，所述基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；（3）将基因簇插入表达载体中，获得多顺反子重组质粒；（4）将多顺反子重组质粒导入宿主菌E. coli，即获得光学纯meso-2,3-丁二醇高产工程菌株；
所述宿主菌E. coli为多基因缺失的突变菌株，其通过叠加敲除菌株中合成副产物的关键基因而获得；所述副产物包括(2R,3R)-2,3-丁二醇、(2S,3S)-2,3-丁二醇、丁二酸、乳酸、乙酸、乙醇和甲酸；所述合成副产物的关键基因包括gldA、dar、frdABCD、ldhA、pta、adhE和pflB。
2.如权利要求1所述构建方法构建而得的基因工程菌株在生产meso-2,3-丁二醇的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）发酵培养基的制备：取木薯粉、氮源原料，再加入水、液化酶和氯化钙，在80-100°C液化0.5-5 h，静置冷却；当温度降低至55°C时，加入糖化酶和蛋白酶，在50-60°C糖化5-20h，调节pH 6.5-7.5，离心或过滤收集上清液，稀释上清液后在115°C条件下灭菌15min，即得；按1000mL水计，所述发酵培养基各原料组分分别用量为：木薯粉100-200 g，氮源原料40-80 g，液化酶0.5-2 mL，氯化钙0.01-0.5 g，糖化酶0.2-1 mL，蛋白酶0.05-0.5 g；所述木薯粉是将木薯去皮晒干后经粉碎过50-200目筛制备而得；所述氮源原料为棉籽蛋白粉、豆粕粉、豆饼粉、花生蛋白粉中的一种或两种以上组合；
（2）将发酵培养基转移至发酵罐，然后添加50-100 μg/mL氨苄青霉素，在无菌条件下，将经活化的基因工程菌菌液以体积比为2-10%的接种量接种至发酵培养基中，在温度35-40°C、搅拌转速200-600 rpm、通气量0.2-1.5 vvm条件下培养24-72 h，当检测发酵液中meso-2,3-丁二醇的浓度不再增加时，发酵结束。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述基因工程菌菌株的活化方法包括以下步骤：将光学纯meso-2,3-丁二醇高产工程菌株划线到含有质量体积比为1.5-1.8%琼脂和含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37°C培养10-15 h；在无菌的条件下，用牙签挑取LB平板上的一个单菌落，然后接种到含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C摇床震荡培养10-15 h；所述的LB培养基配方为：10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母粉，10 g/L氯化钠。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：在发酵过程中检测发酵液中葡萄糖的浓度，待葡萄糖浓度降至10-30 g/L时，补加木薯还原糖母液使发酵液中葡萄糖浓度为40-80g/L。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述木薯还原糖母液的葡萄糖浓度为500-800 g/L。
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CN104894171A (zh) * 2014-03-06 2015-09-09 广西科学院 以木薯淀粉为原料发酵生产(r,r)-2,3-丁二醇的方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Non-Patent Citations (1)

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Title
Increased 2,3-butanediol production by changing codon usages in Escherichia coli;SY Park等;《Biotechnology and Applied Biochemistry》;20140215;第61卷(第5期);摘要、第2.2节、图1、图2 *

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