CN110343653B

CN110343653B - 一种敲除大肠杆菌醛脱氢酶基因提高1,2,4-丁三醇产量的方法

Info

Publication number: CN110343653B
Application number: CN201910696030.3A
Authority: CN
Inventors: 诸葛斌; 杜宣慧; 狄莹莹; 陆信曜; 宗红
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-07-30
Filing date: 2019-07-30
Publication date: 2021-06-25
Anticipated expiration: 2039-07-30
Also published as: CN110343653A

Abstract

本发明涉及一种敲除大肠杆菌醛脱氢酶基因提高1,2,4‑丁三醇产量的方法，属于基因工程技术领域。本方法利用的CRISPR‑Cas9的方法敲除产1,2,4‑丁三醇大肠杆菌副产物途径的醛脱氢酶基因(feaB、aldB、ydcW)提高了1,2,4‑丁三醇的产量。敲除菌E.coli W1、E.coli W2、E.coli W3好氧条件下发酵木糖合成1,2,4‑丁三醇，3,4‑二羟基丁酸分别减少了68.13％、60.94％、76.56％，BT的产量达到了16.50g/L、15.50g/L、16.00g/L，有效提高了1,2,4‑丁三醇的产量。

Description

一种敲除大肠杆菌醛脱氢酶基因提高1,2,4-丁三醇产量的方法

技术领域

本发明涉及一种敲除大肠杆菌醛脱氢酶基因提高1,2,4-丁三醇产量的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

1,2,4-丁三醇(简称BT)是一种重要的化工原料，广泛应用于军工、医药、烟草等领域。目前，1,2,4-丁三醇的生产方法主要是化学合成法，由于化学法存在反应条件严苛、催化剂昂贵、环境污染严重、副产物复杂、提纯难度大等显著缺点，人们将目光转移到具有绿色生产优势的生物法上。BT为非天然化合物，2003年美国Frost研究发现(引用自文献：NiuW,Molefe,Mapitso N,Frost,J.W.Microbial Synthesis of the Energetic MaterialPrecursor 1,2,4-Butanetriol[J].Journal of the American Chemical Society,2003,125(43):12998-9.)，大肠杆菌E.coli W3110在好氧条件下发酵木糖合成BT具有较高的摩尔转化率、开发价值及应用前景等优势。

目前，BT的生产利用的是化学合成法，但是化学法合成BT存在反应条件苛刻，环境污染严重等缺点。因此反应条件温和、对环境友好的生物法得到了广泛关注。BT是一种非天然化合物，自然界中不存在任何一种生物可以天然合成BT，因此BT的合成是通过人工构建合成途径来完成。Frost等的研究发现，以大肠杆菌为宿主菌，由木糖变成木糖酸再经过脱水、脱羧、醇脱氢四步反应，可以得到BT。但在宿主大肠杆菌中，缺乏木糖脱氢酶和催化脱羧反应的酶，目前的研究主要集中在两个酶的筛选上，以及对其分支代谢路径的敲除上，在分支代谢路径敲除的研究中，主要集中于底物木糖和中间代谢产物D-3-脱氧-甘油戊酮酸的其他代谢路径，但是对D-3,4-二羟基丁醛的代谢途径的敲除却没有报道。因此，提供一种提高木糖转运率、降低副产物积累的方法，对1,2,4-丁三醇的工业生产有重要的应用价值。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种重组大肠杆菌，是以E.coli KXW3009为出发菌株，敲除了大肠杆菌醛脱氢酶基因feaB、aldB和/或ydcW，所述feaB编码的氨基酸序列如SEQID NO.2所示，所述aldB编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述ydcW编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

所述E.coli KXW3009的具体构建方法见景培源.多策略强化1,2,4-丁三醇的生物合成[D].江南大学,2018。

所述feaB的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述aldB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述ydcW的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明的第二个目的是提供一种生产1,2,4-丁三醇的方法，应用上述重组大肠杆菌进行发酵。

所述发酵条件为：(1)挑取重组大肠杆菌单菌落接种到于液体LB培养基，35-39℃、200-220rpm培养10-20h；

(2)以1-5％(V/V)的接种量接种到新的液体LB培养基中，35-39℃、200-220rpm，摇瓶培养8-14h；

(3)以10-15％(V/V)的接种量，接种到装液量为30-50％的发酵罐中，发酵温度35-39℃，转速400-450rpm，通气量1.5-2vvm，pH＝6.0-7.0，培养50-80h。

进一步地，所述发酵条件为：(1)挑取重组大肠杆菌单菌落接种到于液体LB培养基，37℃、200rpm培养12h；

(2)以1％(V/V)的接种量，接种到装有250mL液体LB培养基的500mL摇瓶中，37℃，200rpm，培养过夜；

(3)以10％(V/V)的接种量，接种到装有2.5L发酵培养基的5L发酵罐中，发酵温度37℃，转速400r/min,通气量2vvm，pH＝6.5，培养66h。

所述的一种生产1,2,4-丁三醇的方法用于医药或化工领域。如制备溶剂、润湿剂、医药和炸药的中间体。

本发明的第三个目的是提供上述重组大肠杆菌的构建方法，利用CRISPR-Cas9系统敲除了对于1,2,4-丁三醇合成有竞争作用的大肠杆菌醛脱氢酶基因feaB、aldB、ydcW，分别得到重组大肠杆菌E.coli W1、E.coli W2、E.coli W3，包括以下步骤：

A.以pTargetF质粒的基因为模板，设计sgRNA引物，以大肠杆菌醛脱氢酶基因序列为模板，设计引物，利用融合PCR将片段融合；

B.用电转法将融合片段转入大肠杆菌中，并筛选出阳性菌。

C.消除pTargetF质粒，得到大肠杆菌醛脱氢酶基因缺失的重组大肠杆菌。

所述的发酵培养基组成及质量含量为：葡萄糖10g/L,木糖30g/L,酵母粉7.5g/L,蛋白胨15g/L,NaCl 15g/L。

本发明的第四个目的是提供上述的重组大肠杆菌在医药或化工领域中的应用。如制备溶剂、润湿剂、医药和炸药的中间体。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种能提高1,2,4-丁三醇产量的方法。该方法是在E.coli KXW3009中敲除了feaB、aldB和/或ydcW。构建E.coli W1、E.coli W2、E.coli W3具有更高的1,2,4-丁三醇合成能力，产量分别提高了27％、19％、23％，3,4-二羟基丁酸分别减少了68％、61％、76％。

附图说明

图1：1,2,4-丁三醇合成流程图。

图2：野生菌生物量、产物、副产物变化示意图。

图3：feaB基因敲除突变株菌落PCR示意图。

图4：E.coliW1的生物量、产物、副产物变化示意图。

图5：aldB基因敲除突变株菌落PCR示意图。

图6：E.coliW2的生物量、产物、副产物变化示意图。

图7：ydcW基因敲除突变株菌落PCR示意图。

图8：E.coliW3的生物量、产物、副产物变化示意图。

具体实施方式

菌株E.coli KXW3009、E.coli KXW3110具体构建方法见景培源.多策略强化1,2,4-丁三醇的生物合成[D].江南大学,2018。

1,2,4-丁三醇合成流程图如图1所示。

下面通过实施例对本发明进一步说明。

feaB编码基因如NCBI-Gene ID:945933。

aldB编码基因如NCBI-Gene ID:948104。

ycdW编码基因如NCBI-Gene ID:946431。

实施例1利用CRISPR-Cas9系统敲除大肠杆菌中feaB基因

在壮观霉素抗性板上划线pTargetF后，37℃培养，待长出单菌落，挑取单菌落于30mL LB(壮观霉素抗性)培养基中过夜培养，用试剂盒提取pTargetF质粒；此外，在卡那霉素抗性板上划线pCas9，30℃培养，待长出单菌落后，挑取单菌落于30mL LB(卡那霉素抗性)培养基中过夜培养，用试剂盒提取pCas9质粒；另外，在无抗板上划线E.coli W3110，37℃培养，待长出单菌落后，挑取单菌落于30mL LB培养基中培养，用基因组提取试剂盒提取基因组。

PCR扩增含N20的定位序列，在紫外灯下进行切胶回收，引物序列为：

上游：TTGTCGATTCCCTTACCCCA

下游：GGTAAGGGAATCGACAA

将胶回收产物进行DpnI酶进行消化，消化产物用柱回收试剂盒进行产物回收。

将柱回收产物进行磷酸化，磷酸化产物进行环化连接，取上述反应产物，加入5μlSolution I，在16℃过夜连接(避光)，大概8h。

将连接产物全部转化导入大肠杆菌BL21感受态细胞中，涂板(壮观霉素抗性)，将长出的重组单菌落BL21/pTarF-feaB进行培养后送去测序，检测N20是否发生突变

扩增上下游融合片段，在紫外灯下进行切胶回收(不宜在紫外灯下暴露太久)，

引物序列为：

PB14：TCCTTTGGCAAAATGCGT

PB15：TTACTTATGAGCGAACCAGACACTTTTCCTTATTATTTACCCAGT

PB17：TCTGGTTCGCTCATAAGTAAAA

PB16：GTGGATCTATCATCGTTTAAGC

将胶回收的上下游片段用融合PCR进行融合，引物为PB14和PB17。

融合产物跑核酸胶验证，成功后将BL21/pTarF-feaB菌液划线壮观霉素板，待长出单菌落后，挑取单菌落于30mL LB(壮观霉素抗性)培养基中过夜培养，第二天提取pTargetF+N20的质粒

划线E.coli KXW3009于无抗板上，待长出单菌落后，挑取单菌落于4mL试管中培养，之后转接300μL于30mL LB培养基中，培养至OD₆₀₀＝0.3左右，制备感受态细胞，并转入pCas9质粒，涂kana板；

挑取上述kana板上长出的重组单菌落E.coli KXW3009/pCas9进行菌落PCR验证，并挑取相应重组成功的菌落于4mL LB(kana抗性)培养基中进行过夜培养，第二天以3:4的比例分别转接过夜培养液于30mL LB(kana抗性)培养基中，培养到OD₆₀₀＝0.2左右时，加入终浓度为60mM的阿拉伯糖分别诱导至OD₆₀₀＝0.45和OD₆₀₀＝0.6左右，制备E.coli KXW3009/pCas9电转感受态细胞

将pTargetF+N20质粒和上下游融合片段电转导入E.coli KXW3009/pCas9感受态细胞中

挑取上述单菌落进行菌落PCR验证，确定基因是否被成功敲除，验证体系如下：

挑取验证成功敲除基因的菌落E.coli KXW3009于1.5mL离心管中培养，之后取300μL转接于30mL LB(kana抗性)中培养至OD₆₀₀＝0.4时，加入IPTG，30℃，过夜诱导12h；将诱导菌液进行划线kana板，30℃培养，将长出的单菌落点板于壮观霉素板上，挑出在壮观霉素板上不长的菌落于30mL LB(无抗)培养基中，42℃培养10h，将该菌液划线无抗板，长出的单菌落，分别点在kana板、壮观霉素板、无抗板上，只在无抗板上长的菌落即为成功敲除的E.coli W1菌落。

实施例2利用构建的E.coli W1发酵产1,2,4-丁三醇

种子(LB)培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，余量为水；

5L发酵罐发酵培养基：蛋白胨15g/L，酵母粉7.5g/L，氯化钠15g/L，木糖30g/L，葡萄糖10g/L，余量为水；

将E.coli KXW3009与上述所得突变株接种于液体LB培养基，37℃，200r/min振荡培养，按10％(V/V)的接种量转接到5L发酵罐发酵培养基中，5L发酵罐装液量为2.5L，并添加终浓度为50μg/mL卡那霉素，发酵温度37℃，转速设定400r/min,通气量为2vvm，用10mol·L^-1NaOH控制pH＝6.5,培养OD₆₀₀＝0.6～0.8，加入0.5mmol/L IPTG，继续诱导培养，培养到12h时，一次性补加终浓度为30g/L木糖，10g/L葡萄糖，继续发酵至66h，发酵结束。

发酵液中1,2,4-丁三醇的含量采用高效液相色谱进行检测。仪器：Agilent高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差检测器和工作站)；色谱柱：Bio-RAD Aminex HPX-87Hcolumn300mm×7.8mm，流动相：5mmol/L硫酸，流速：0.6mL·min^-1，柱温：60℃，示差检测器进行检测，进样10μL。

E.coli KXW3009及突变株E.coli W1发酵结果见表1。

表1 E.coli KXW3009及突变株E.coli W1发酵结果

菌株	OD<sub>600</sub>	BT(g/L)
			E.coli KXW3009	20.00	13.00
E.coli W1	17.50	16.50

E.coli W2、E.coli W3基因的敲除技术同上，发酵结果见表2。

表2突变株E.coli W2、E.coli W3发酵结果

菌株	OD<sub>600</sub>	BT(g/L)
			E.coli KXW3009	20.00	13.00
E.coliW2	19.00	15.50
			E.coliW3	17.00	16.00

从图3、图5、图7可知，敲除成功。从图2、图4、图6、图8发酵结果可知，与对照菌相比E.coli W1、E.coli W2、E.coli W3的BT产量分别增加到16.50g/L、15.50g/L、16.00g/L。3,4-二羟基丁酸从6.40g/L分别减少到1.50g/L、2.04g/L、2.50g/L，从发酵结果可知，代谢途径中的碳通量往1,2,4-丁三醇偏转，减少了3,4-二羟基丁酸的合成，增加了BT产量，同时也有利于下游分离提取。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种敲除大肠杆菌醛脱氢酶基因提高1,2,4-丁三醇产量的方法

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1500

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgacagagc cgcatgtagc agtattaagc caggtccaac agtttctcga tcgtcaacac 60

ggtctttata ttgatggtcg tcctggcccc gcacaaagtg aaaaacggtt ggcgatcttt 120

gatccggcca ccgggcaaga aattgcgtct actgctgatg ccaacgaagc ggatgtagat 180

aacgcagtca tgtctgcctg gcgggccttt gtctcgcgtc gctgggccgg gcgattaccc 240

gcagagcgtg aacgtattct gctacgtttt gctgatctgg tggagcagca cagtgaggag 300

ctggcgcaac tggaaaccct ggagcaaggc aagtcaattg ccatttcccg tgcttttgaa 360

gtgggctgta cgctgaactg gatgcgttat accgccgggt taacgaccaa aatcgcgggt 420

aaaacgctgg acttgtcgat tcccttaccc cagggggcgc gttatcaggc ctggacgcgt 480

aaagagccgg ttggcgtagt ggcgggaatt gtgccatgga actttccgtt gatgattggt 540

atgtggaagg tgatgccagc actggcagca ggctgttcaa tcgtgattaa gccttcggaa 600

accacgccac tgacgatgtt gcgcgtggcg gaactggcca gcgaggctgg tatccctgat 660

ggcgttttta atgtcgtcac cgggtcaggt gctgtatgcg gcgcggccct gacgtcacat 720

cctcatgttg cgaaaatcag ttttaccggt tcaaccgcga cgggaaaagg tattgccaga 780

actgctgctg atcacttaac gcgtgtaacg ctggaactgg gcggtaaaaa cccggcaatt 840

gtattaaaag atgctgatcc gcaatgggtt attgaaggct tgatgaccgg aagcttcctg 900

aatcaagggc aagtatgcgc cgccagttcg cgaatttata ttgaagcgcc gttgtttgac 960

acgctggtta gtggatttga gcaggcggta aaatcgttgc aagtgggacc ggggatgtca 1020

cctgttgcac agattaaccc tttggtttct cgtgcgcact gcgacaaagt gtgttcattc 1080

ctcgacgatg cgcaggcaca gcaagcagag ctgattcgcg ggtcgaatgg accagccgga 1140

gaggggtatt atgttgcgcc aacgctggtg gtaaatcccg atgctaaatt gcgcttaact 1200

cgtgaagagg tgtttggtcc ggtggtaaac ctggtgcgag tagcggatgg agaagaggcg 1260

ttacaactgg caaacgacac ggaatatggc ttaactgcca gtgtctggac gcaaaatctc 1320

tcccaggctc tggaatatag cgatcgctta caggcaggga cggtgtgggt aaacagccat 1380

accttaattg acgctaactt accgtttggt gggatgaagc agtcaggaac gggccgtgat 1440

tttggccccg actggctgga cggttggtgt gaaactaagt cggtgtgtgt acggtattaa 1500

<210> 2

<211> 499

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Thr Glu Pro His Val Ala Val Leu Ser Gln Val Gln Gln Phe Leu

1 5 10 15

Asp Arg Gln His Gly Leu Tyr Ile Asp Gly Arg Pro Gly Pro Ala Gln

20 25 30

Ser Glu Lys Arg Leu Ala Ile Phe Asp Pro Ala Thr Gly Gln Glu Ile

35 40 45

Ala Ser Thr Ala Asp Ala Asn Glu Ala Asp Val Asp Asn Ala Val Met

50 55 60

Ser Ala Trp Arg Ala Phe Val Ser Arg Arg Trp Ala Gly Arg Leu Pro

65 70 75 80

Ala Glu Arg Glu Arg Ile Leu Leu Arg Phe Ala Asp Leu Val Glu Gln

85 90 95

His Ser Glu Glu Leu Ala Gln Leu Glu Thr Leu Glu Gln Gly Lys Ser

100 105 110

Ile Ala Ile Ser Arg Ala Phe Glu Val Gly Cys Thr Leu Asn Trp Met

115 120 125

Arg Tyr Thr Ala Gly Leu Thr Thr Lys Ile Ala Gly Lys Thr Leu Asp

130 135 140

Leu Ser Ile Pro Leu Pro Gln Gly Ala Arg Tyr Gln Ala Trp Thr Arg

145 150 155 160

Lys Glu Pro Val Gly Val Val Ala Gly Ile Val Pro Trp Asn Phe Pro

165 170 175

Leu Met Ile Gly Met Trp Lys Val Met Pro Ala Leu Ala Ala Gly Cys

180 185 190

Ser Ile Val Ile Lys Pro Ser Glu Thr Thr Pro Leu Thr Met Leu Arg

195 200 205

Val Ala Glu Leu Ala Ser Glu Ala Gly Ile Pro Asp Gly Val Phe Asn

210 215 220

Val Val Thr Gly Ser Gly Ala Val Cys Gly Ala Ala Leu Thr Ser His

225 230 235 240

Pro His Val Ala Lys Ile Ser Phe Thr Gly Ser Thr Ala Thr Gly Lys

245 250 255

Gly Ile Ala Arg Thr Ala Ala Asp His Leu Thr Arg Val Thr Leu Glu

260 265 270

Leu Gly Gly Lys Asn Pro Ala Ile Val Leu Lys Asp Ala Asp Pro Gln

275 280 285

Trp Val Ile Glu Gly Leu Met Thr Gly Ser Phe Leu Asn Gln Gly Gln

290 295 300

Val Cys Ala Ala Ser Ser Arg Ile Tyr Ile Glu Ala Pro Leu Phe Asp

305 310 315 320

Thr Leu Val Ser Gly Phe Glu Gln Ala Val Lys Ser Leu Gln Val Gly

325 330 335

Pro Gly Met Ser Pro Val Ala Gln Ile Asn Pro Leu Val Ser Arg Ala

340 345 350

His Cys Asp Lys Val Cys Ser Phe Leu Asp Asp Ala Gln Ala Gln Gln

355 360 365

Ala Glu Leu Ile Arg Gly Ser Asn Gly Pro Ala Gly Glu Gly Tyr Tyr

370 375 380

Val Ala Pro Thr Leu Val Val Asn Pro Asp Ala Lys Leu Arg Leu Thr

385 390 395 400

Arg Glu Glu Val Phe Gly Pro Val Val Asn Leu Val Arg Val Ala Asp

405 410 415

Gly Glu Glu Ala Leu Gln Leu Ala Asn Asp Thr Glu Tyr Gly Leu Thr

420 425 430

Ala Ser Val Trp Thr Gln Asn Leu Ser Gln Ala Leu Glu Tyr Ser Asp

435 440 445

Arg Leu Gln Ala Gly Thr Val Trp Val Asn Ser His Thr Leu Ile Asp

450 455 460

Ala Asn Leu Pro Phe Gly Gly Met Lys Gln Ser Gly Thr Gly Arg Asp

465 470 475 480

Phe Gly Pro Asp Trp Leu Asp Gly Trp Cys Glu Thr Lys Ser Val Cys

485 490 495

Val Arg Tyr

<210> 3

<211> 1539

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgaccaata atcccccttc agcacagatt aagcccggcg agtatggttt ccccctcaag 60

ttaaaagccc gctatgacaa ctttattggc ggcgaatggg tagcccctgc cgacggcgag 120

tattaccaga atctgacgcc ggtgaccggg cagctgctgt gcgaagtggc gtcttcgggc 180

aaacgagaca tcgatctggc gctggatgct gcgcacaaag tgaaagataa atgggcgcac 240

acctcggtgc aggatcgtgc ggcgattctg tttaagattg ccgatcgaat ggaacaaaac 300

ctcgagctgt tagcgacagc tgaaacctgg gataacggca aacccattcg cgaaaccagt 360

gctgcggatg taccgctggc gattgaccat ttccgctatt tcgcctcgtg tattcgggcg 420

caggaaggtg ggatcagtga agttgatagc gaaaccgtgg cctatcattt ccatgaaccg 480

ttaggcgtgg tggggcagat tatcccgtgg aacttcccgc tgctgatggc gagctggaaa 540

atggctcccg cgctggcggc gggcaactgt gtggtgctga aacccgcacg tcttaccccg 600

ctttctgtac tgctgctaat ggaaattgtc ggtgatttac tgccgccggg cgtggtgaac 660

gtggtcaatg gcgcaggtgg ggtaattggc gaatatctgg cgacctcgaa acgcatcgcc 720

aaagtggcgt ttaccggctc aacggaagtg ggccaacaaa ttatgcaata cgcaacgcaa 780

aacattattc cggtgacgct ggagttgggc ggtaagtcgc caaatatctt ctttgctgat 840

gtgatggatg aagaagatgc ctttttcgat aaagcgctgg aaggctttgc actgtttgcc 900

tttaaccagg gcgaagtttg cacctgtccg agtcgtgctt tagtgcagga atctatctac 960

gaacgcttta tggaacgcgc catccgccgt gtcgaaagca ttcgtagcgg taacccgctc 1020

gacagcgtga cgcaaatggg cgcgcaggtt tctcacgggc aactggaaac catcctcaac 1080

tacattgata tcggtaaaaa agagggcgct gacgtgctca caggcgggcg gcgcaagctg 1140

ctggaaggtg aactgaaaga cggctactac ctcgaaccga cgattctgtt tggtcagaac 1200

aatatgcggg tgttccagga ggagattttt ggcccggtgc tggcggtgac caccttcaaa 1260

acgatggaag aagcgctgga gctggcgaac gatacgcaat atggcctggg cgcgggcgtc 1320

tggagccgca acggtaatct ggcctataag atggggcgcg gcatacaggc tgggcgcgtg 1380

tggaccaact gttatcacgc ttacccggca catgcggcgt ttggtggcta caaacaatca 1440

ggtatcggtc gcgaaaccca caagatgatg ctggagcatt accagcaaac caagtgcctg 1500

ctggtgagct actcggataa accgttgggg ctgttctga 1539

<210> 4

<211> 512

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Thr Asn Asn Pro Pro Ser Ala Gln Ile Lys Pro Gly Glu Tyr Gly

1 5 10 15

Phe Pro Leu Lys Leu Lys Ala Arg Tyr Asp Asn Phe Ile Gly Gly Glu

20 25 30

Trp Val Ala Pro Ala Asp Gly Glu Tyr Tyr Gln Asn Leu Thr Pro Val

35 40 45

Thr Gly Gln Leu Leu Cys Glu Val Ala Ser Ser Gly Lys Arg Asp Ile

50 55 60

Asp Leu Ala Leu Asp Ala Ala His Lys Val Lys Asp Lys Trp Ala His

65 70 75 80

Thr Ser Val Gln Asp Arg Ala Ala Ile Leu Phe Lys Ile Ala Asp Arg

85 90 95

Met Glu Gln Asn Leu Glu Leu Leu Ala Thr Ala Glu Thr Trp Asp Asn

100 105 110

Gly Lys Pro Ile Arg Glu Thr Ser Ala Ala Asp Val Pro Leu Ala Ile

115 120 125

Asp His Phe Arg Tyr Phe Ala Ser Cys Ile Arg Ala Gln Glu Gly Gly

130 135 140

Ile Ser Glu Val Asp Ser Glu Thr Val Ala Tyr His Phe His Glu Pro

145 150 155 160

Leu Gly Val Val Gly Gln Ile Ile Pro Trp Asn Phe Pro Leu Leu Met

165 170 175

Ala Ser Trp Lys Met Ala Pro Ala Leu Ala Ala Gly Asn Cys Val Val

180 185 190

Leu Lys Pro Ala Arg Leu Thr Pro Leu Ser Val Leu Leu Leu Met Glu

195 200 205

Ile Val Gly Asp Leu Leu Pro Pro Gly Val Val Asn Val Val Asn Gly

210 215 220

Ala Gly Gly Val Ile Gly Glu Tyr Leu Ala Thr Ser Lys Arg Ile Ala

225 230 235 240

Lys Val Ala Phe Thr Gly Ser Thr Glu Val Gly Gln Gln Ile Met Gln

245 250 255

Tyr Ala Thr Gln Asn Ile Ile Pro Val Thr Leu Glu Leu Gly Gly Lys

260 265 270

Ser Pro Asn Ile Phe Phe Ala Asp Val Met Asp Glu Glu Asp Ala Phe

275 280 285

Phe Asp Lys Ala Leu Glu Gly Phe Ala Leu Phe Ala Phe Asn Gln Gly

290 295 300

Glu Val Cys Thr Cys Pro Ser Arg Ala Leu Val Gln Glu Ser Ile Tyr

305 310 315 320

Glu Arg Phe Met Glu Arg Ala Ile Arg Arg Val Glu Ser Ile Arg Ser

325 330 335

Gly Asn Pro Leu Asp Ser Val Thr Gln Met Gly Ala Gln Val Ser His

340 345 350

Gly Gln Leu Glu Thr Ile Leu Asn Tyr Ile Asp Ile Gly Lys Lys Glu

355 360 365

Gly Ala Asp Val Leu Thr Gly Gly Arg Arg Lys Leu Leu Glu Gly Glu

370 375 380

Leu Lys Asp Gly Tyr Tyr Leu Glu Pro Thr Ile Leu Phe Gly Gln Asn

385 390 395 400

Asn Met Arg Val Phe Gln Glu Glu Ile Phe Gly Pro Val Leu Ala Val

405 410 415

Thr Thr Phe Lys Thr Met Glu Glu Ala Leu Glu Leu Ala Asn Asp Thr

420 425 430

Gln Tyr Gly Leu Gly Ala Gly Val Trp Ser Arg Asn Gly Asn Leu Ala

435 440 445

Tyr Lys Met Gly Arg Gly Ile Gln Ala Gly Arg Val Trp Thr Asn Cys

450 455 460

Tyr His Ala Tyr Pro Ala His Ala Ala Phe Gly Gly Tyr Lys Gln Ser

465 470 475 480

Gly Ile Gly Arg Glu Thr His Lys Met Met Leu Glu His Tyr Gln Gln

485 490 495

Thr Lys Cys Leu Leu Val Ser Tyr Ser Asp Lys Pro Leu Gly Leu Phe

500 505 510

<210> 5

<211> 1425

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgcaacata agttactgat taacggagaa ctggttagcg gcgaagggga aaaacagcct 60

gtctataatc cggcaacggg ggacgtttta ctggaaattg ccgaggcatc cgcagagcag 120

gtcgatgctg ctgtgcgcgc ggcagatgca gcatttgccg aatgggggca aaccacgccg 180

aaagtgcgtg cggaatgtct gctgaaactg gctgatgtta tcgaagaaaa tggtcaggtt 240

tttgccgaac tggagtcccg taattgtggc aaaccgctgc atagtgcgtt caatgatgaa 300

atcccggcga ttgtcgatgt ttttcgcttt ttcgcgggtg cggcgcgctg tctgaatggt 360

ctggcggcag gtgaatatct tgaaggtcat acttcgatga tccgtcgcga tccgttgggg 420

gtcgtggctt ctatcgcacc gtggaattat ccgctgatga tggccgcgtg gaaacttgct 480

ccggcgctgg cggcagggaa ctgcgtagtg cttaaaccat cagaaattac cccgctgacc 540

gcgttgaagt tggcagagct ggcgaaagat atcttcccgg caggcgtgat taacatactg 600

tttggcagag gcaaaacggt gggtgatccg ctgaccggtc atcccaaagt gcggatggtg 660

tcgctgacgg gctctatcgc caccggcgag cacatcatca gccataccgc gtcgtccatt 720

aagcgtactc atatggaact tggtggcaaa gcgccagtga ttgtttttga tgatgcggat 780

attgaagcag tggtcgaagg tgtacgtaca tttggctatt acaatgctgg acaggattgt 840

actgcggctt gtcggatcta cgcgcaaaaa ggcatttacg atacgctggt ggaaaaactg 900

ggtgctgcgg tggcaacgtt aaaatctggt gcgccagatg acgagtctac ggagcttgga 960

cctttaagct cgctggcgca tctcgaacgc gtcggcaagg cagtagaaga ggcgaaagcg 1020

acagggcaca tcaaagtgat cactggcggt gaaaagcgca agggtaatgg ctattactat 1080

gcgccgacgc tgctggctgg cgcattacag gacgatgcca tcgtgcaaaa agaggtattt 1140

ggtccagtag tgagtgttac gcccttcgac aacgaagaac aggtggtgaa ctgggcgaat 1200

gacagccagt acggacttgc atcttcggta tggacgaaag atgtgggcag ggcgcatcgc 1260

gtcagcgcac ggctgcaata tggttgtacc tgggtcaata cccatttcat gctggtaagt 1320

gaaatgccgc acggtgggca gaaactttct ggttacggca aggatatgtc actttatggg 1380

ctggaggatt acaccgtcgt ccgccacgtc atggttaaac attaa 1425

<210> 6

<211> 474

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Gln His Lys Leu Leu Ile Asn Gly Glu Leu Val Ser Gly Glu Gly

1 5 10 15

Glu Lys Gln Pro Val Tyr Asn Pro Ala Thr Gly Asp Val Leu Leu Glu

20 25 30

Ile Ala Glu Ala Ser Ala Glu Gln Val Asp Ala Ala Val Arg Ala Ala

35 40 45

Asp Ala Ala Phe Ala Glu Trp Gly Gln Thr Thr Pro Lys Val Arg Ala

50 55 60

Glu Cys Leu Leu Lys Leu Ala Asp Val Ile Glu Glu Asn Gly Gln Val

65 70 75 80

Phe Ala Glu Leu Glu Ser Arg Asn Cys Gly Lys Pro Leu His Ser Ala

85 90 95

Phe Asn Asp Glu Ile Pro Ala Ile Val Asp Val Phe Arg Phe Phe Ala

100 105 110

Gly Ala Ala Arg Cys Leu Asn Gly Leu Ala Ala Gly Glu Tyr Leu Glu

115 120 125

Gly His Thr Ser Met Ile Arg Arg Asp Pro Leu Gly Val Val Ala Ser

130 135 140

Ile Ala Pro Trp Asn Tyr Pro Leu Met Met Ala Ala Trp Lys Leu Ala

145 150 155 160

Pro Ala Leu Ala Ala Gly Asn Cys Val Val Leu Lys Pro Ser Glu Ile

165 170 175

Thr Pro Leu Thr Ala Leu Lys Leu Ala Glu Leu Ala Lys Asp Ile Phe

180 185 190

Pro Ala Gly Val Ile Asn Ile Leu Phe Gly Arg Gly Lys Thr Val Gly

195 200 205

Asp Pro Leu Thr Gly His Pro Lys Val Arg Met Val Ser Leu Thr Gly

210 215 220

Ser Ile Ala Thr Gly Glu His Ile Ile Ser His Thr Ala Ser Ser Ile

225 230 235 240

Lys Arg Thr His Met Glu Leu Gly Gly Lys Ala Pro Val Ile Val Phe

245 250 255

Asp Asp Ala Asp Ile Glu Ala Val Val Glu Gly Val Arg Thr Phe Gly

260 265 270

Tyr Tyr Asn Ala Gly Gln Asp Cys Thr Ala Ala Cys Arg Ile Tyr Ala

275 280 285

Gln Lys Gly Ile Tyr Asp Thr Leu Val Glu Lys Leu Gly Ala Ala Val

290 295 300

Ala Thr Leu Lys Ser Gly Ala Pro Asp Asp Glu Ser Thr Glu Leu Gly

305 310 315 320

Pro Leu Ser Ser Leu Ala His Leu Glu Arg Val Gly Lys Ala Val Glu

325 330 335

Glu Ala Lys Ala Thr Gly His Ile Lys Val Ile Thr Gly Gly Glu Lys

340 345 350

Arg Lys Gly Asn Gly Tyr Tyr Tyr Ala Pro Thr Leu Leu Ala Gly Ala

355 360 365

Leu Gln Asp Asp Ala Ile Val Gln Lys Glu Val Phe Gly Pro Val Val

370 375 380

Ser Val Thr Pro Phe Asp Asn Glu Glu Gln Val Val Asn Trp Ala Asn

385 390 395 400

Asp Ser Gln Tyr Gly Leu Ala Ser Ser Val Trp Thr Lys Asp Val Gly

405 410 415

Arg Ala His Arg Val Ser Ala Arg Leu Gln Tyr Gly Cys Thr Trp Val

420 425 430

Asn Thr His Phe Met Leu Val Ser Glu Met Pro His Gly Gly Gln Lys

435 440 445

Leu Ser Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ser Leu Tyr Gly Leu Glu Asp Tyr

450 455 460

Thr Val Val Arg His Val Met Val Lys His

465 470

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttgtcgattc ccttacccca 20

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggtaagggaa tcgacaa 17

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tcctttggca aaatgcgt 18

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttacttatga gcgaaccaga cacttttcct tattatttac ccagt 45

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tctggttcgc tcataagtaa aa 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gtggatctat catcgtttaa gc 22

Claims

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，是以E. coli KXW3009为出发菌株，敲除了大肠杆菌醛脱氢酶基因feaB、aldB或ydcW，所述feaB编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述aldB编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述ydcW编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述feaB的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述aldB的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述ydcW的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。

3.一种生产1,2,4-丁三醇的方法，其特征在于，应用权利要求1-2任一所述的重组大肠杆菌进行发酵。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵条件为：

（1）挑取重组大肠杆菌单菌落接种到液体LB培养基，35-39℃、200-220 rpm培养10-20h，获得种子液；

（2）以体积比1-5%的接种量将步骤（1）的种子液接种到新的液体LB培养基中，35-39℃、200-220 rpm，摇瓶培养8-14 h，获得发酵液；

（3）以体积比10-15%的接种量将步骤（2）的发酵液接种到装液量为30-50%的发酵罐中，发酵温度35-39℃，转速400-450 rpm，通气量1.5-2 vvm，pH=6.0-7.0，培养50-80 h。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述方法用于医药或化工领域。

6.权利要求1-2任一所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，在E. coliKXW3009中利用CRISPR-Cas9系统敲除了大肠杆菌醛脱氢酶基因feaB、aldB或ydcW。

7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

B.用电转法将融合片段转入大肠杆菌中，并筛选出阳性菌；

8.权利要求1-2任一所述的重组大肠杆菌在制备1,2,4-丁三醇中的应用。