CN109762794B

CN109762794B - 一种葡萄糖基转移酶在生产乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷中的应用

Info

Publication number: CN109762794B
Application number: CN201811653240.6A
Authority: CN
Inventors: 陆跃乐; 徐安杰; 陈小龙; 朱林江; 陈翰驰; 范永仙
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Shenzhen Shanhai Innovation Technology Co ltd
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2020-12-25
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN109762794A

Abstract

本发明公开了一种葡萄糖基转移酶在生产乙基香兰素‑α‑D‑葡萄糖苷中的应用，所述葡萄糖基转移酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。所述的应用以含葡萄糖基转移酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的发酵液为菌剂，以麦芽糖和乙基香兰素为底物，在pH值6.0‑8.5、20‑40℃条件下进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得乙基香兰素‑α‑D‑葡萄糖苷。本发明的菌剂生物催化生产乙基香兰素‑α‑D‑葡萄糖苷，底物转化率大于80％，乙基香兰素‑α‑D‑葡萄糖苷的产物浓度高，转化率高，有利于生物法制备乙基香兰素‑α‑D‑葡萄糖苷回收纯化。

Description

一种葡萄糖基转移酶在生产乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷中的应用

(一)技术领域

本发明涉及一种葡萄糖基转移酶在生产乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷中的应用。

(二)背景技术

乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷化学结构式如图1所示。乙基香兰素由邻乙氧基苯酚或黄樟脑油制得，属广谱型香料，是当今世界上最重要的合成香料之一，是食品添加剂行业中不可缺少的重要原料，其香气是香兰素的3-4倍，具有浓郁的香荚兰豆香气，且留香持久。广泛用于食品、巧克力、冰淇淋、饮料以及日用化妆品中起增香和定香作用。另外乙基香兰素还可做饲料的添加剂、电镀行业的增亮剂，制药行业的中间体。但香兰素及乙基香兰素，不管是合成的还是天然的自身均有难以克服的缺点，即稳定性差，使用上稍有不当就会失去发香能力，使被加香物产生会人厌恶的气味。在香烟中使用常常会压香，造成滞留。

为了克服这些弱点，本发明通过转糖苷酶催化转化制备乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷的绿色生物法合成工艺，其稳定性比之乙基香兰素更强，避免了在使用上出现的问题。且采用了生物酶法催化，避免了化学合成带来的严重环境污染和巨大生产安全隐患。采用安全绿色环保的方法生产乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种葡萄糖基转移酶在生产乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷中的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种源自树蕨黄单胞菌(Xanthomonas arboricola)的葡萄糖基转移酶在生产乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷中的应用，所述葡萄糖基转移酶氨基酸序列为SEQ IDNO.2所示，所述酶编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

进一步，所述的应用以含葡萄糖基转移酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的发酵液为菌剂，以麦芽糖和乙基香兰素为底物，在pH值6.0-8.5、20-40℃条件下进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷。所述麦芽糖加入的质量浓度以发酵液体积计为200-500g/L(优选350g/L)，所述乙基香兰素加入的质量浓度以发酵液体积计为5-50g/L(优选15g/L)，所述发酵液中湿菌体含量为5-30g/L(优选10g/L)。

进一步，本发明所述菌剂按如下方法制备：将含葡萄糖基转移酶编码基因的工程菌接种到含卡那霉素50μg/L发酵培养基中，30-37℃培养4-6h(优选35℃，5h)；再加入终浓度为5.6-7.0mM(优选7.0mM)的α-乳糖，22-25℃继续发酵12-18h(优选24℃，16h)，取发酵液，即得到生产乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷的菌剂；所述发酵培养基组成：10g/L的蛋白胨、5g/L的酵母粉、54mM甘油、2.8mM葡萄糖、25mM Na₂HPO₄、25mM KH₂PO₄、50mM NH₄Cl、5mMNa₂SO₄、2mM MgSO₄，溶剂为去离子水，pH7.0。

进一步，所述工程菌在发酵前先进行种子活化培养，再将种子液以体积浓度1-5％的接种量接种至发酵培养基，所述种子活化培养为：将含葡萄糖基转移酶编码基因的工程菌(优选大肠杆菌IFE-xar-agl)接种在含有35μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的种子培养基中，37℃培养至对数生长中期，获得种子液；所述种子培养基组成：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaHPO₄·12H₂O 8.9g/L、KH₂PO₄ 3.4g/L、NH₄Cl 2.67g/L、Na₂SO₄ 0.71g/L、MgSO₄·7H₂O 0.49g/L，溶剂为去离子水，pH7.0。

进一步，本发明所述含葡萄糖基转移酶编码基因的工程菌按如下方法构建：将SEQID NO.1所示葡萄糖基转移酶编码基因xar-agl克隆至质粒pET28a，构建重组表达质粒pET28a-agl，导入E.coli Rosetta^TM(DE3)感受态细胞，筛选获得含重组质粒pET28a-xar-agl的阳性克隆子E.coli Rosetta^TM(DE3)(pET28a-xar-agl)，记为大肠杆菌(Escherichiacoli)IFE-xar-agl。

进一步，本发明所述转化反应是在发酵罐中进行连续补料反应：将发酵液加入发酵罐中，加入质量终浓度0.05％消泡剂，在pH值6.0-8.5、20-40℃条件下进行催化转化反应；在反应开始30min后，每隔30min补料乙基香兰素，每次加入量为总添加质量的0.3-0.7％；反应完全后，将反应液分离纯化，获得乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷。

与现有化学合成技术相比，本发明有益效果主要体现在：

(1)新的生物法一步绿色合成工艺，即本发明利用葡萄糖基转移酶构建的大肠杆菌(Escherichia coli)IFE-xar-agl，能够在胞内高效合成葡萄糖基转移酶，以麦芽糖为底物，高效催化乙基香兰素的一步糖基化反应，实现生物法的绿色合成；(2)葡萄糖基转移酶具有较高的催化转化效率，即本发明的菌剂生物催化生产乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷，底物转化率大于80％，乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷的产物浓度高，转化率高，有利于生物法制备乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷回收纯化。

(四)附图说明

图1乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷的结构示意图。

图2为pET28a-xar-agl载体的结构示意图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。

LB液体培养基：酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。

LB培养基：酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L，琼脂20g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。

种子培养基：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaHPO₄·12H₂O 8.9g/L、KH₂PO₄ 3.4g/L、NH₄Cl 2.67g/L、Na₂SO₄ 0.71g/L、MgSO₄·7H₂O 0.49g/L、溶剂为去离子水，pH7.0。

发酵培养基：10g/L的蛋白胨、5g/L的酵母粉、54mM甘油、2.8mM葡萄糖、25mMNa₂HPO₄、25mM KH₂PO₄、50mM NH₄Cl、5mM Na₂SO₄、2mM MgSO₄，溶剂为去离子水，pH值自然。

实施例1、制备生产乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷的菌剂

一、构建高效表达树蕨黄单胞菌的葡萄糖基转移酶的大肠杆菌

参考NCBI数据库报道的树蕨黄单胞菌的葡萄糖基转移酶氨基酸序列(NCBINO.AKU48857)，将序列发给基因合成公司(无锡青兰生物科技有限公司)，要求经过密码子优化后的基因序列xar-agl(核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，编码蛋白(即葡萄糖基转移酶)的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示)人工合成，并克隆到表达载体pET28a的EcoRI/HindIII之间，获得重组质粒pET28a-xar-agl。

重组质粒pET28a-xar-agl的转化E.coli Rosetta^TM(DE3)细胞方法如下：取5μL重组质粒pET28a-xar-agl，加入到100μL的E.coli Rosetta^TM(DE3)感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰水浴中放置30min。42℃热激90s，冰水孵育3min。加入800μL LB培养基，37℃孵育45min使其抗性复苏。9000rpm离心2min，将菌体浓缩至100μL，均匀涂布在含有35μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的LB平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。

阳性克隆转化子的鉴定。在长有重组子的平板上，直接挑取6个单菌落接种至含有35μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基里，在37℃培养过夜。利用生工生物工程(上海)有限公司的SanPrep柱式质粒提取试剂盒，提取质粒，并酶切验证和测序验证，最终得到阳性克隆子含有的重组表达载体命名为pET28a-xar-agl(图2)。

含重组质粒pET28a-xar-agl的阳性克隆子E.coli Rosetta^TM(DE3)(pET28a-xar-agl)命名为大肠杆菌(Escherichia coli)IFE-xar-agl，即得到高效表达树蕨黄单胞菌的葡萄糖基转移酶的大肠杆菌。

二、制备生产乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷的菌剂

大肠杆菌IFE-xar-agl接种在含有35μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的种子培养基中，37℃培养至对数生长中期，获得种子液。

将新鲜培养的种子液以体积浓度5％接种到含卡那霉素50μg/L发酵培养基中，35℃，培养5h；加入终浓度为7.0mM的α-乳糖，控制发酵温度24℃，继续发酵12h，取发酵液，得到生产乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷的菌剂。

实施例2菌剂在生产乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷中的应用

一、菌剂的活性检测

取实施例1培养好的菌剂10mL，5000×g离心收集细胞，将0.1g细胞重新悬浮于10mL的pH7.0的50mM磷酸缓冲液中；加入终浓度8.3g/L的乙基香兰素和终浓度400g/L的麦芽糖，在30℃、150rpm条件下水浴摇床催化30min。反应液用于HPLC分析。

液相色谱检测条件。样品前处理：100μL反应液，加入到900μL的0.01mol/L稀盐酸中；12000×g离心5min，用0.22μm滤膜过滤，将滤液加入液相样品瓶中；色谱柱：C_l8柱，250×4.6mm；柱温：25℃；流动相：CH₃OH(甲醇)：H₂O＝45:55(体积比)；流速：1.0mL·min^-1；检测器：紫外检测器；检测波长：272nm；进样量：10μL。底物乙基香兰素的出峰时间为10min，产物乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷的出峰时间为4min。

经过30min转化反应，取转化液用于HPLC分析，测得残留的底物为乙基香兰素浓度为34mmol/L，形成的产物乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷浓度为10mmol/L，转化率为25％。

二、2L发酵罐中的菌剂制备及其在1L反应体系中连续补料转化的应用

1、菌种活化：大肠杆菌IFE-xar-agl在含有35μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的种子培养基中，37℃培养至对数生长中期，获得种子液。

2、2L发酵罐中的菌剂制备：将新鲜培养的种子液按照体积浓度5％的接种量，接种到含50μg/L卡那霉素和质量浓度0.05％消泡剂的1.5L的发酵培养基中，35℃，培养5h；加入终浓度为7.0mM的α-乳糖，控制发酵温度24℃，继续发酵16h，制得细胞密度为20g/L的发酵液，用于生产乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷的大肠杆菌IFE-xar-agl发酵液。

3、1L发酵液中的连续补料转化：取步骤2制备的1L大肠杆菌IFE-xar-agl发酵液，用1mol/L NaOH调节pH7.0。加入200g麦芽糖和5g乙基香兰素，放在30℃水浴锅上，安装全自动机械搅拌器，100rpm进行催化反应。反应开始30min后，每隔30min，添加1.0-2.0g乙基香兰素(每次添加的乙基香兰素的质量是变化的，在1.0-2.0g之间)。在4h的转化时间内，连续累计投入乙基香兰素底物17g，乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷的生产量为13g/L，乙基香兰素的转化率为38％。

4、1L发酵液中的连续补料转化：取步骤2制备的1L大肠杆菌IFE-xar-agl发酵液，用2mol/L NaOH调节pH7.0。加入400g麦芽糖和5.5g乙基香兰素，放在30℃水浴锅上，安装全自动机械搅拌器，100rpm进行催化反应。反应开始30min后，每隔15-20min，添加1.0-2.0g乙基香兰素。在4h的转化时间内，连续累计投入乙基香兰素底物20g。乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷的生产量为21g/L，乙基香兰素的转化率为64％。

乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷产物浓度检测。样品前处理：取100μL反应液，加入到900μL的0.01mol/L稀盐酸中；12000×g离心5min，用0.22μm滤膜过滤，将滤液加入液相样品瓶中；色谱柱：C_l8柱，250×4.6mm；柱温：25℃；流动相：CH₃OH(甲醇)：H₂O＝45:55；流速：1.0mL·min^-1；检测器：紫外检测器；检测波长：272nm；进样量：10μL。底物乙基香兰素的出峰时间为10min，产物乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷的出峰时间为4min。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种葡萄糖基转移酶在生产乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1617

<212> DNA

<213> 树蕨黄单胞菌(Xanthomonas arboricola)

<400> 1

atgtctcaga ccccgtggtg gcgtggtgct gttatctacc agatctaccc gcgttctttc 60

ctggactcta acggtgacgg tgttggtgac ctgccgggta tcatcgctaa actggactac 120

atcgctggtc tgggtgttga cgctatctgg atctctccgt tcttcaaatc tccgatggct 180

gacttcggtt acgacatcgc tgactaccgt gctgttgacc cgctgttcgg taccctggac 240

gacttcgacc gtctgctgga caaagctcac ggtctgggtc tgaaagttat gatcgaccag 300

gttctgtctc acacctctat cgctcacacc tggttccagg aatctcgtca ggaccgtacc 360

aacgctaaag ctgactggta cgtttgggct gacccgcgtg acgacggtac cccgccgaac 420

aactggctgt ctctgttcgg tggtgttgct tggcagtggg aaccgcgtcg tgaacagtac 480

tacctgcaca acttcctggt tgaccagccg gacctgaact tccacaactc tgaagttcag 540

caggctaccc tggacatagt taggttctgg ctggaccgtg gtgttgatgg cttccgtctg 600

gacgcgatca acttctgctt ccacgacgct cagctgcgtg acaacccggc taaaccggct 660

gacaaacgtg ttgggagggg cttctctgct gacaatccgt acgcttacca gtaccactac 720

ttcaacaaca cccagccgga aaatctcgcg ttcctggaac gtctccgtgg tctgctggac 780

ctgtacccga acgctgtttc tctgggtgaa atctcttctg aagactctct ggctaccacc 840

gctgaataca ccgctcacgg tcgtctgcac atgggttact ctttcgaact gctggttcag 900

gactactctg ctgcttacat ccgtgaaacc gtttctcgtc tggaagctac catgctggaa 960

ggttggccgt gctgggctat ctctaaccac gacgttgttc gtgctgttac ccgttggggt 1020

ggtgctcacg cttctccggc tttcgctcgt atggttgttg ctatgctgtg ctctctgcgt 1080

ggttctatct gcctgtacca gggtgaagaa ctgggtctgg gtgaagctga agttgctttc 1140

gaagacctgc gtgacccgta cggtatcacc ttctggccga ccttcaaagg tcgtgacggt 1200

tgccgtaccc cgatgccgtg gaccgacgct ccatctgctg gcttctcttc tggtaagccg 1260

tggctgccgc tggctgaaga acaccgtgct gctgctgttt ctgttcagca ggacgacccg 1320

ctgtctgttc tgtctgctgt tcgtcagttc ctggcttggc gtaaaggtga accggctctg 1380

cgtgaaggtg ctatcacctt ctacgacacc gctgaaccgg ttctgatgtt ccgtcgtggt 1440

cacgctggtc gtgttatgct gctggctttc aacctgtctg cttacgctgc tgaactgggt 1500

ctgccggctg gtgcttggaa acaggttgac gttccgggtg ttgaacgtgg tgctatcgaa 1560

cacggttacc tgcgtctggc tggttacgct gttgtttgcg ctatcgaagg tggttga 1617

<210> 2

<211> 541

<212> PRT

<213> 树蕨黄单胞菌(Xanthomonas arboricola)

<400> 2

Met Ser Gln Thr Pro Trp Trp Arg Gly Ala Val Ile Tyr Gln Ile Tyr

1 5 10 15

Pro Arg Ser Phe Leu Asp Ser Asn Gly Asp Gly Val Gly Asp Leu Pro

20 25 30

Gly Ile Ile Ala Lys Leu Asp Tyr Ile Xaa Ala Arg Ala Gly Leu Gly

35 40 45

Val Asp Ala Ile Trp Ile Ser Pro Phe Phe Lys Ser Pro Met Ala Asp

50 55 60

Phe Gly Tyr Asp Ile Ala Asp Tyr Arg Ala Val Asp Pro Leu Phe Gly

65 70 75 80

Thr Leu Asp Asp Phe Asp Arg Leu Leu Asp Lys Ala His Gly Leu Gly

85 90 95

Leu Lys Val Met Ile Asp Gln Val Leu Ser His Thr Ser Ile Ala His

100 105 110

Thr Trp Phe Gln Glu Ser Arg Gln Asp Arg Thr Asn Ala Lys Ala Asp

115 120 125

Trp Tyr Val Trp Ala Asp Pro Arg Asp Asp Gly Thr Pro Pro Asn Asn

130 135 140

Trp Leu Ser Leu Phe Gly Gly Val Ala Trp Gln Trp Glu Pro Arg Arg

145 150 155 160

Glu Gln Tyr Tyr Leu His Asn Phe Leu Val Asp Gln Pro Asp Leu Asn

165 170 175

Phe His Asn Ser Glu Val Gln Gln Ala Thr Leu Asp Ile Val Arg Phe

180 185 190

Trp Leu Asp Arg Gly Val Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Ile Asn Phe

195 200 205

Cys Phe His Asp Ala Gln Leu Arg Asp Asn Pro Ala Lys Pro Ala Asp

210 215 220

Lys Arg Val Gly Arg Gly Phe Ser Ala Asp Asn Pro Tyr Ala Tyr Gln

225 230 235 240

Tyr His Tyr Phe Asn Asn Thr Gln Pro Glu Asn Leu Ala Phe Leu Glu

245 250 255

Arg Leu Arg Gly Leu Leu Asp Leu Tyr Pro Asn Ala Val Ser Leu Gly

260 265 270

Glu Ile Ser Ser Glu Asp Ser Leu Ala Thr Thr Ala Glu Tyr Thr Ala

275 280 285

His Gly Arg Leu His Met Gly Tyr Ser Phe Glu Leu Leu Val Gln Asp

290 295 300

Tyr Ser Ala Ala Tyr Ile Arg Glu Thr Val Ser Arg Leu Glu Ala Thr

305 310 315 320

Met Leu Glu Gly Trp Pro Cys Trp Ala Ile Ser Asn His Asp Val Val

325 330 335

Arg Ala Val Thr Arg Trp Gly Gly Ala His Ala Ser Pro Ala Phe Ala

340 345 350

Arg Met Val Val Ala Met Leu Cys Ser Leu Arg Gly Ser Ile Cys Leu

355 360 365

Tyr Gln Gly Glu Glu Leu Gly Leu Gly Glu Ala Glu Val Ala Phe Glu

370 375 380

Asp Leu Arg Asp Pro Tyr Gly Ile Thr Phe Trp Pro Thr Phe Lys Gly

385 390 395 400

Arg Asp Gly Cys Arg Thr Pro Met Pro Trp Thr Asp Ala Pro Ser Ala

405 410 415

Gly Phe Ser Ser Gly Lys Pro Trp Leu Pro Leu Ala Glu Glu His Arg

420 425 430

Ala Ala Ala Val Ser Val Gln Gln Asp Asp Pro Leu Ser Val Leu Ser

435 440 445

Ala Val Arg Gln Phe Leu Ala Trp Arg Lys Gly Glu Pro Ala Leu Arg

450 455 460

Glu Gly Ala Ile Thr Phe Tyr Asp Thr Ala Glu Pro Val Leu Met Phe

465 470 475 480

Arg Arg Gly His Ala Gly Arg Val Met Leu Leu Ala Phe Asn Leu Ser

485 490 495

Ala Tyr Ala Ala Glu Leu Gly Leu Pro Ala Gly Ala Trp Lys Gln Val

500 505 510

Asp Val Pro Gly Val Glu Arg Gly Ala Ile Glu His Gly Tyr Leu Arg

515 520 525

Leu Ala Gly Tyr Ala Val Val Cys Ala Ile Glu Gly Gly

530 535 540

Claims

1.一种源自树蕨黄单胞菌(Xanthomonas arboricola)的葡萄糖基转移酶在生产乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷中的应用，其特征在于所述的应用以含葡萄糖基转移酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的发酵液为菌剂，以麦芽糖和乙基香兰素为底物，在pH值6.0-8.5、20-40℃条件下进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷；所述葡萄糖基转移酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述麦芽糖质量浓度加入量以发酵液体积计为200-500g/L，所述乙基香兰素质量浓度加入量以发酵液体积计为5-50g/L，所述发酵液中湿菌体含量为5-30g/L。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述菌剂按如下方法制备：将含葡萄糖基转移酶编码基因的工程菌接种到含卡那霉素50μg/L发酵培养基中，30-37℃培养4-6h；再加入终浓度为5.6-7.0mM的α-乳糖，22-25℃继续发酵12-18h，取发酵液，即得到生产乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷的菌剂；所述发酵培养基组成：10g/L的蛋白胨、5g/L的酵母粉、54mM甘油、2.8mM葡萄糖、25mM Na₂HPO₄、25mM KH₂PO₄、50mM NH₄Cl、5mM Na₂SO₄、2mM MgSO₄，溶剂为去离子水，pH7.0。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述工程菌在发酵前先进行种子活化培养，再将种子液以体积浓度1-5％的接种量接种至发酵培养基，所述种子活化培养为：将含葡萄糖基转移酶编码基因的工程菌接种在含有35μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的种子培养基中，37℃培养至对数生长中期，获得种子液；所述种子培养基组成：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaHPO₄·12H₂O 8.9g/L、KH₂PO₄ 3.4g/L、NH₄Cl 2.67g/L、Na₂SO₄ 0.71g/L、MgSO₄·7H₂O0.49g/L，溶剂为去离子水，pH7.0。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述转化反应是在发酵罐中进行连续补料反应：将发酵液加入发酵罐中，加入质量终浓度0.05％消泡剂，在pH值6～8.5、20-40℃条件下进行催化转化反应；在反应开始30min后，每隔20min补料乙基香兰素；反应完全后，将反应液分离纯化，获得乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述乙基香兰素每次加入量为总添加质量的0.3-0.7％。