CN110592166A - 一种基于树脂添加的乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于树脂添加的乙基香兰素‑α‑D‑葡萄糖苷合成方法，属于乙基香兰素‑α‑D‑葡萄糖苷合成技术领域。该方法步骤为：每100ml水中加入70g麦芽糖和5g乙基香兰素配制麦芽糖/乙基香兰素底物体系，然后向得到的麦芽糖/乙基香兰素底物体系中加入5g树脂，在40℃下混合6‑16h得到溶液‑树脂两相底物体系，最后向得到的溶液‑树脂两相底物体系中加入α‑糖苷酶酶液，在40℃下反应6‑16h，反应过程中控制体系pH 8.0。该方法可以简化生物合成过程，并能显著提高乙基香兰素的一次性添加量及乙基香兰素α‑D‑葡萄糖苷的的生产效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷合成方法，具体涉及一种基于树脂添加的乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷合成方法，属于乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷合成技术领域。
背景技术
乙基香兰素由邻乙氧基苯酚或黄樟脑油制得，属广谱型香料，是当今世界上最重要的合成香料之一，是食品添加剂行业中不可缺少的重要原料，其香气是香兰素的3-4倍，具有浓郁的香荚兰豆香气，可广泛用于食品、巧克力、冰淇淋、饮料以及日用化妆品中起增香和定香作用。然而在烟草产品中的应用发现，乙基香兰素的热稳定性较差，在高温下香味保持时间较短，且长时间加热易产生臭味。对比之下，乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷(化学结构如式Ⅰ所示)的热稳定性更为出色，可作为潜香型物质在高温下进行持续性发香，在烟草产品中有较大的应用潜力。
公开号为CN106397498的中国发明专利公开了一种乙基香兰素葡萄糖苷的生产方法，该方法以溴代四乙酰基葡萄糖与乙基香兰素作为原料，在中极性有机溶剂中加入碱性催化剂进行反应(反应方程式如式Ⅱ所示)得到乙基香兰素四乙酰基葡萄糖苷，然后向乙基香兰素四乙酰基葡萄糖苷中加入甲醇进行升温醇解，得到乙基香兰素葡萄糖苷。虽然采用该方法在72℃下恒温反应4h后乙基香兰素葡萄糖苷的收率可达62％，但是采用该化学方法合成的乙基香兰素葡萄糖苷为β构型，即乙基香兰素-β-D-葡萄糖苷，在人体内难以代谢降解。此外，该方法所用原料溴代四乙酰基葡萄糖的制备工艺复杂，市场价格偏高(约2000元/kg)，且制备过程中需要使用溴水，对环境影响较大。
相比化学合成方法，以乙基香兰素为反应底物，在α-糖苷酶的催化作用下合成乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷的生物法，其可得到α构型的乙基香兰素-D-葡萄糖苷，且该方法使用的反应底物廉价，过程绿色环保。但由于乙基香兰素的水溶性较差，且当反应液中的乙基香兰素达到一定浓度时会对α-糖苷酶造成抑制作用，从而导致采用生物法合成乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷时，乙基香兰素作为反应底物的添加量受限，乙基香兰素无法一次性大量投加，加料麻烦，且影响乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷的生产效率。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明提供了一种基于树脂添加的乙基香兰素 -α-D-葡萄糖苷合成方法，该方法可以简化生物合成过程，并能显著提高乙基香兰素的一次性添加量及乙基香兰素α-D-葡萄糖苷的生产效率。
为实现以上技术目的，本发明的技术方案是：
一种基于树脂添加的乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷合成方法，步骤为：每100ml 水中加入70g麦芽糖和5g乙基香兰素配制麦芽糖/乙基香兰素底物体系，然后向得到的麦芽糖/乙基香兰素底物体系中加入5g树脂，在40℃下混合6-16h得到溶液-树脂两相底物体系，最后向溶液-树脂两相底物体系中加入α-糖苷酶酶液，在40℃下反应6-16h，反应过程中控制体系pH 8.0。
优选地，所述树脂为XR15C。
优选地，所述反应时间为8h。
优选地，所述α-糖苷酶酶液与水的体积比为1:1。
本发明的有益效果在于：
本发明以麦芽糖和乙基香兰素为反应底物，首先通过中等极性树脂吸附乙基香兰素，形成树脂-溶液两相体系，随后加入α-糖苷酶进行反应，整个反应过程中被吸附的乙基香兰素由树脂相逐渐转移至溶液相中完成转化。本发明可以实现乙基香兰素的一次性大量投料，避免流加带来的工艺操作难度，同时还可以控制溶液中的乙基香兰素浓度，避免高浓度乙基香兰素对α-糖苷酶产生的底物抑制，提高乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷的生物转化效率和生产效率。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进行具体描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1
α-糖苷酶酶液的制备：
含α-糖苷酶编码基因构建的大肠杆菌工程菌(Escherichia coli)IFE-xar-agl(菌种保存号CGMCC No.13991)在含有35μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的种子培养基中，37℃培养至对数生长中期，获得种子液。将新鲜培养的种子液按照体积浓度5％的接种量，接种到含50μg/L卡那霉素和质量浓度0.05％消泡剂的 1.5L的发酵培养基中，35℃培养5h；加入终浓度为7.0mM的α-乳糖，控制发酵温度24℃，继续发酵16h，制得细胞密度为20g/L的发酵液，即为用于生产乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷的大肠杆菌IFE-xar-agl菌液。将所得菌液通过高压匀浆机进行破碎得到α-糖苷酶酶液，破碎过程在10℃冷却水冷却下进行。
酶活的测定：向10ml水中加入7g麦芽糖和0.01g乙基香兰素配制麦芽糖/ 乙基香兰素溶液；取10mLα-糖苷酶酶液加入上述麦芽糖/乙基香兰素溶液中，在 40℃摇床内反应10min；之后通过HPLC检测溶液体系中乙基香兰素浓度变化，并根据式(Ⅲ)计算酶活，其中c为反应10min后乙基香兰素浓度(g/L)。
乙基香兰素与乙基香兰素α-D-葡萄糖苷的液相色谱检测：将100μL反应液加入到900μL的0.01mol/L稀盐酸中，12000×g离心5min后用0.22μm滤膜过滤，将滤液加入液相样品瓶中；色谱柱：C18柱，250×4.6mm；柱温：25℃；流动相：CH3OH(甲醇)：H2O＝45:55(体积比)；流速：1.0mL·min-1；检测器：紫外检测器；检测波长：272nm；进样量：10μL。底物乙基香兰素的出峰时间为 10min，产物乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷的出峰时间为4min。
实施例2
在50mL水中加入35g麦芽糖和2.5g乙基香兰素配制麦芽糖/乙基香兰素底物体系；然后向得到的麦芽糖/乙基香兰素底物体系中加入2.5g XR15C树脂，并将体系置于40℃水浴中混合6h得到溶液-树脂两相底物体系；按照实施例1所述方法制备α-糖苷酶酶液，然后向得到的溶液-树脂两相底物体系中加入50mL α-糖苷酶酶液，反应过程中通过氨水滴加控制体系pH 8.0，在40℃下反应6h后取样并按照实施例1所述方法对样品进行液相分析。乙基香兰素转化率如表1 所示。
实施例3
在50mL水中加入35g麦芽糖和2.5g乙基香兰素配制麦芽糖/乙基香兰素底物体系；然后向得到的麦芽糖/乙基香兰素底物体系中加入2.5g XR15C树脂，并将体系置于40℃水浴中混合6h得到溶液-树脂两相底物体系；按照实施例1所述方法制备α-糖苷酶酶液，然后向得到的溶液-树脂两相底物体系中加入50mL α-糖苷酶酶液，反应过程中通过氨水滴加控制体系pH 8.0，在40℃下反应8h后取样并按照实施例1所述方法对样品进行液相分析。乙基香兰素转化率如表1 所示。
实施例4
在50mL水中加入35g麦芽糖和2.5g乙基香兰素配制麦芽糖/乙基香兰素底物体系；然后向得到的麦芽糖/乙基香兰素底物体系中加入2.5g XR15C树脂，并将体系置于40℃水浴中混合6h得到溶液-树脂两相底物体系；按照实施例1所述方法制备α-糖苷酶酶液，然后向得到的溶液-树脂两相底物体系中加入50mLα- 糖苷酶酶液，反应过程中通过氨水滴加控制体系pH 8.0，在40℃下反应10h后取样并按照实施例1所述方法对样品进行液相分析。乙基香兰素转化率如表1 所示。
实施例5
在50mL水中加入35g麦芽糖和2.5g乙基香兰素配制麦芽糖/乙基香兰素底物体系；然后向得到的麦芽糖/乙基香兰素底物体系中加入2.5g XR15C树脂，并将体系置于40℃水浴中混合6h得到溶液-树脂两相底物体系；按照实施例1所述方法制备α-糖苷酶酶液，然后向得到的溶液-树脂两相底物体系中加入50mLα- 糖苷酶酶液，反应过程中通过氨水滴加控制体系pH 8.0，在40℃下反应12h后取样并按照实施例1所述方法对样品进行液相分析。乙基香兰素转化率如表1 所示。
实施例6
在50mL水中加入35g麦芽糖和2.5g乙基香兰素配制麦芽糖/乙基香兰素底物体系；然后向得到的麦芽糖/乙基香兰素底物体系中加入2.5g XR15C树脂，并将体系置于40℃水浴中混合6h得到溶液-树脂两相底物体系；按照实施例1所述方法制备α-糖苷酶酶液，然后向得到的溶液-树脂两相底物体系中加入50mLα- 糖苷酶酶液，反应过程中通过氨水滴加控制体系pH 8.0，在40℃下反应14h后取样并按照实施例1所述方法对样品进行液相分析。乙基香兰素转化率如表1 所示。
实施例7
在50mL水中加入35g麦芽糖和2.5g乙基香兰素配制麦芽糖/乙基香兰素底物体系；然后向得到的麦芽糖/乙基香兰素底物体系中加入2.5g XR15C树脂，并将体系置于40℃水浴中混合6h得到溶液-树脂两相底物体系；按照实施例1所述方法制备α-糖苷酶酶液，然后向得到的溶液-树脂两相底物体系中加入50mLα- 糖苷酶酶液，反应过程中通过氨水滴加控制体系pH 8.0，在40℃下反应16h后取样并按照实施例1所述方法对样品进行液相分析。乙基香兰素转化率如表1 所示。
对比例1
在50mL水中加入35g麦芽糖和2.5g乙基香兰素配制麦芽糖/乙基香兰素底物体系；然后向得到的麦芽糖/乙基香兰素底物体系中加入2.5g LYL-C树脂，并将体系置于40℃水浴中混合6h得到溶液-树脂两相底物体系；按照实施例1所述方法制备α-糖苷酶酶液，然后向得到的溶液-树脂两相底物体系中加入50mLα- 糖苷酶酶液，反应过程中通过氨水滴加控制体系pH 8.0，在40℃下反应6h后取样并按照实施例1所述方法对样品进行液相分析。乙基香兰素转化率如表2所示。
对比例2
在50mL水中加入35g麦芽糖和2.5g乙基香兰素配制麦芽糖/乙基香兰素底物体系；然后向得到的麦芽糖/乙基香兰素底物体系中加入2.5g XR9711树脂，并将体系置于40℃水浴中混合6h得到溶液-树脂两相底物体系；按照实施例1 所述方法制备α-糖苷酶酶液，然后向得到的溶液-树脂两相底物体系中加入 50mLα-糖苷酶酶液，反应过程中通过氨水滴加控制体系pH 8.0，在40℃下反应 6h后取样并按照实施例1所述方法对样品进行液相分析。乙基香兰素转化率如表2所示。
对比例3
在50mL水中加入35g麦芽糖和2.5g乙基香兰素配制麦芽糖/乙基香兰素底物体系；然后向得到的麦芽糖/乙基香兰素底物体系中加入2.5g XR9712树脂，并将体系置于40℃水浴中混合6h得到溶液-树脂两相底物体系；按照实施例1 所述方法制备α-糖苷酶酶液，然后向得到的溶液-树脂两相底物体系中加入 50mLα-糖苷酶酶液，反应过程中通过氨水滴加控制体系pH 8.0，在40℃下反应 6h后取样并按照实施例1所述方法对样品进行液相分析。乙基香兰素转化率如表2所示。
对比例4
在50mL水中加入35g麦芽糖和2.5g乙基香兰素配制麦芽糖/乙基香兰素底物体系；然后向得到的麦芽糖/乙基香兰素底物体系中加入2.5g LYL-A树脂，并将体系置于40℃水浴中混合6h得到溶液-树脂两相底物体系；按照实施例1所述方法制备α-糖苷酶酶液，然后向得到的溶液-树脂两相底物体系中加入50mLα- 糖苷酶酶液，反应过程中通过氨水滴加控制体系pH 8.0，在40℃下反应6h后取样并按照实施例1所述方法对样品进行液相分析。乙基香兰素转化率如表2所示。
对比例5
在50mL水中加入35g麦芽糖和2.5g乙基香兰素配制麦芽糖/乙基香兰素底物体系；然后向得到的麦芽糖/乙基香兰素底物体系中加入2.5g XR920C树脂，并将体系置于40℃水浴中混合6h得到溶液-树脂两相底物体系；按照实施例1 所述方法制备α-糖苷酶酶液，然后向得到的溶液-树脂两相底物体系中加入 50mLα-糖苷酶酶液，反应过程中通过氨水滴加控制体系pH 8.0，在40℃下反应6h后取样并按照实施例1所述方法对样品进行液相分析。乙基香兰素转化率如表2所示。
表1
表2
由表1和表2可以看出，相比其他树脂，在基于XR15C树脂添加的两相反应体系中，乙基香兰素在α-糖苷酶的催化作用下转化效率大大提高，当基于 XR15C树脂添加的两相反应体系与α-糖苷酶酶液反应时间为8h时，单位时间乙基香兰素α-D-葡萄糖苷产量可达最高，反应时间过长或过短都会影响生产效率。
可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案。本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种基于树脂添加的乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷合成方法，其特征在于，步骤为：每100ml水中加入70g麦芽糖和5g乙基香兰素配制麦芽糖/乙基香兰素底物体系，然后向麦芽糖/乙基香兰素底物体系中加入5g树脂，在40℃下混合6-16h得到溶液-树脂两相底物体系，最后向溶液-树脂两相底物体系中加入α-糖苷酶酶液，在40℃下反应6-16h，反应过程中控制体系pH 8.0。
2.如权利要求1所述的基于树脂添加的乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷合成方法，其特征在于，所述树脂为XR15C。
3.如权利要求1所述的基于树脂添加的乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷合成方法，其特征在于，所述反应时间为8h。
4.如权利要求1所述的基于树脂添加的乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷合成方法，其特征在于，所述α-糖苷酶酶液与水的体积比为1:1。
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| CN109762794A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-05-17 | 浙江工业大学 | 一种葡萄糖基转移酶在生产乙基香兰素-α-D-葡萄糖苷中的应用 |
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2019
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