CN103014076B - 一种利用棘孢曲霉制备甜菊醇和纯化莱鲍迪苷a的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及利用棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus ZJ，保藏号CCTCC No.M2011264）菌及其酶转化甜菊糖苷或悬钩子苷原料为甜菊醇并纯化莱鲍迪苷A（RA）的方法。具体是将棘孢曲霉或其发酵液或提取的酶液作用于甜菊糖苷或者是甜叶菊浸提液，使甜菊糖中除RA之外的成份经转化生成甜菊醇从溶液中沉淀分离，经常规结晶等纯化方法纯化分离，体系中的RA未被转化而保留在溶液中，经后续常规提取分离与纯化方法提纯。本发明提供了一种利用棘孢曲霉及其酶液转化甜菊糖生成甜菊醇并纯化莱鲍迪苷A的方法，条件温和，环境相容性好，工艺设备简单，有极高的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种同时制备甜菊醇和纯化莱鲍迪苷A（RA）的最有效的新方法，特别是用微生物发酵产生的酶液来转化甜菊糖或悬钩子苷原料或其衍生物为甜菊醇的方法，属于天然产物的生物转化领域。
背景技术
甜菊醇(steviol)
分子式：C20H30O3
分子结构：
甜菊醇（ent-13-hydroxykaur-16-en-19-oic acid，steviol）是甜菊苷的苷元，分子具有对映贝壳杉烯型四环二萜骨架结构，对映贝壳杉烯型二萜类化合物大多具有广泛的生理活性，如清热解毒、抗菌消炎、抗肿瘤等作用（胡艳秋，石浩.甜菊醇及其衍生物的研究进展.浙江化工，2011,42(1):10-14）。
甜菊醇与甜菊糖苷有类似的作用，即抗高血糖等功能，因为它们能够促进胰岛素分泌。甜菊醇生物活性与赤霉素也有相似之处，可促进赤霉素的生物合成（Kyowa Hakka Kogyo CoLtd.Jpn Kokai Tokyo Koho,80,120,794）.甜菊醇对种子的发芽和芽的生长有促进作用，这与赤霉素的生理功效相似。Bearder等发现甜菊醇在赤霉菌突变体BI-41a的作用下，转变为赤霉素GA1HA19等（JohnR,Beader J,Colin M W. Phytochemistry，1975,14(8):1741）。
甜菊醇和赤霉素在植物体内的生物合成过程中有相同的前体，及贝壳杉烯和贝壳杉烯酸，故它们是同源的。所以，甜菊醇对植物生长的促进作用可能是通过转化为赤霉素而实现，以赤霉素的生理机能表现出来（柏正武，刘秀芳，徐汉生.甜菊醇衍生物的合成及其生物活性.应用化学.1993,10(4):35-38）。
甜菊醇在酸性条件下不稳定，容易发生重排从而变成其同分异构体异甜菊醇，所以不能通过酸解甜菊苷的方法制备甜菊醇。
20世纪80年代Ogawa等报道了甜菊醇的化学合成方法。甜菊苷（stevioside）经过高碘酸钠或四醋酸铅氧化后再经过碱水解可以得到甜菊醇。该方法中用到的高碘酸钠和四醋酸铅价格昂贵，得到的甜菊醇的产量也很低，并且需要经过多次重结晶才可以得到较纯的产物（Ogawa T,Nozaki M,Matsui M.Total synthesis stevioside.Terrahedron,1980,36(18):2641-2648）。刘铸晋等人利用蜗牛酶和甲苯处理甜菊糖苷可以得到甜菊醇，蜗牛酶可以降解甜菊糖苷的β1-4糖苷键，反应在48h达到完全，经分离纯化可得到甜菊醇（刘铸晋，周文华，高峰等.甜叶悬钩子叶的甜味成分研究.植物学通报，1983,(1):33-37）。该实验中用到的蜗牛酶价格高且来源有限，所用的甲苯是有毒的有机溶剂。
甜菊糖在含有赤霉菌(Gibberellafujikuroi)的培养基中经pH4.0，室温的条件培养，7天后可得到甜菊醇（Heleno de liveira,Bras,Ferreira da Trindade,Jose Luiz.Production of hydroxystevioand its application as a plant growth regulator:Brazil,2004006278[P].2006-08-22.），此方法所需时间过长，效率低。
利用巴氏微杆菌转化甜菊糖得到甜菊醇，效率比用上述赤霉菌高，但因巴氏微杆菌所用酶是胞内酶，不破壁时要用全细胞转化的方法，因此需时仍然较多，且菌将甜菊糖中的甜菊苷(SS)、莱鲍迪苷A(RA)、莱鲍迪苷C(RC)全都转化为甜菊醇，因此RA也被消耗，且甜菊醇沉淀与菌体混合在一起不易分离（陈育如，玄燕，赵乙萱等.巴氏微杆菌XJ及应用该菌制备甜菊醇的方法.CN201110159563.1）。
采用破壁处理巴氏微杆后转化效率将大大提高，但细菌的破壁处理将带来较高的处理成本。
在纯化RA方面，巨大芽孢杆菌J2对甜菊糖一定条件下进行转化，也可将莱鲍迪苷A(RA)中所含的其他苷类成份选择性地转化为甜菊双糖苷从而有利于进一步的分离（陈育如，刘虎，姜中玉，一种提高甜菊糖糖质的方法CN200910036066.5）。但因巨大芽孢杆菌转化甜菊糖生成的甜菊双糖苷仍是水溶性的，而甜菊双糖苷和RA都在转化液中，这两种成分的分离成本仍然较高。
中国专利《一株棘孢曲霉菌株及用该菌株制备5,7,8,4’-四羟基异黄酮的方法》（专利号ZL2011102258550）公开了一株棘孢曲霉(Asperillus acculeatus)ZJ菌株，保藏号为CCTCCNo.M2011264。以及用该菌株制备5,7,8,4’-四羟基异黄酮的方法，但是未提及该菌株的其他用途。
发明内容
本发明旨在提供一种利用棘孢曲霉(Asperillus acculeatus)制备甜菊醇和纯化RA的方法。
本发明公开了棘孢曲霉CCTCC No:M2011264在制备甜菊醇和纯化莱鲍迪苷A中的应用。
一种制备甜菊醇和莱鲍迪苷的方法，其特征是：将棘孢曲霉CCTCC No:M2011264接种到常规固体培养基或液体产酶培养基中，进行产酶发酵，用其菌或酶液转化甜菊糖苷或悬钩子苷，转化液经分离纯化分别得到甜菊醇和莱鲍迪苷A。
上述方法具体是将棘孢曲霉CCTCC No:M2011264接种到固体曲培养基中，培养至孢子长满培养基表面，以水：曲以10-100:1(v/v)体积比，浸提酶液1小时，抽滤，得到酶液；酶液放在恒温水浴中，加入适量甜菊糖苷或悬钩子苷溶解，静态或动态转化。转化完全后甜菊醇以沉淀形式析出，莱鲍迪苷A留在上清液中。甜菊醇用常规方法纯化，上清液中的RA用常规方法纯化。
本发明所述的制备甜菊醇的方法是将甜菊糖苷或悬钩子苷等加入到棘孢曲霉酶液中或者是直接用棘孢曲霉游离菌进行生物转化，转化完全后经过离心或过滤，得到沉淀和上清液，沉淀物质经过质谱仪器检测得到与甜菊醇相同的分子量，再通过高效液相色谱检测根据出峰时间与甜菊醇的标准品对比得出沉淀物质是甜菊醇。上清液中经过高效液相色谱检测得出主要物质是RA。
上述方法所提到的转化底物甜菊糖粉末，是由甜菊糖苷的不同组分组成的原料。甜茶苷来自甜茶的提取物或经甜菊苷转化而来。
本发明的优点：
将来源丰富、成分复杂、口味苦涩的甜菊糖苷或悬钩子苷经过棘孢曲霉酶液转化后得到甜菊醇和品质更好的莱鲍迪苷A。转化产物甜菊醇是以沉淀的形式析出，转化后的清液中只有莱鲍迪苷A，通过本发明的转化方法可同时得到了两种更有价值的产物甜菊醇和RA，工艺简便。
本发明采用的棘孢曲霉转化，能将除RA之外的甜菊糖(SS)和莱鲍迪苷C(RC)等均转化成甜菊醇形成沉淀析出，转化液中只留下RA，因而分离成本极低，得到的RA品质更好。解决了以往制备甜菊醇和纯化RA时效率较低、分离较难、成本相对高等问题。且通过一次转化可以同时低成本地得到甜菊醇和RA两个产品。
附图说明
图1转化前甜菊糖原液的HPLC分析。
图2棘孢曲霉酶液转化甜菊糖所得甜菊醇的HPLC分析图。
图3棘孢曲霉酶液转化甜菊糖后的转化液HPLC图。
图4棘孢曲霉酶液转化甜菊糖分离沉淀后的上清液HPLC分析。
具体实施方式
下面本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。
固体培养基（固体曲培养基）为常规，例如可参见以下文献：姜绪林，孙瑶，杨毅，杜大庆，张星元.绿色木霉固态发酵纤维素酶生物量的测定及发酵培养基的初步优化[J].食品与生物技术学报，2005,24(3):101-105；靖德兵，李培军等.黑曲霉固体发酵生产纤维素酶培养基构成优化研究[J].中国生态农业学报.2004,12(3):172-174。
液体产酶培养基即产酶培养基可参见文献：许晓鹏，袁士芳，刘立明.黑曲霉高产β-葡萄糖苷酶的培养基优化[J].食品与生物技术学报.2008,27(5):124-127；王茜，孙海彦，彭明.黑曲霉β-葡萄糖苷酶产酶条件的优化[J].工业微生物.2012,42(3):68-71。
实施例1：
用常规的棘孢曲霉固体曲培养基，发酵后经加水浸提得到棘孢曲霉酶液，每次30ml加入
底物为1.0%(w/v)甜菊糖苷，45℃水浴中转化24h，分离纯化得到甜菊醇和RA。
实施例2：
用常规的棘孢曲霉固体曲培养基，发酵后经加水浸提得到棘孢曲霉酶液，100ml加入底物为15%(w/v)甜菊糖苷，50℃水浴中转化48h，分离纯化得到甜菊醇和RA。
实施例3：
用常规的棘孢曲霉固体曲培养基，发酵后经加水浸提得到棘孢曲霉酶液，100ml加入底物为7%(w/v)甜菊糖苷，50℃水浴中转化40h，分离纯化得到甜菊醇和RA。
实施例4：
用常规产酶培养基，液体培养棘孢曲霉，100ml培养基中加入底物为1.0%甜菊糖苷，30℃恒温摇床中转化24h，分离纯化得到甜菊醇和RA。
实施例5：
用常规产酶培养基液体培养棘孢曲霉，100ml培养基中加入底物为15%甜菊糖苷，45℃恒温摇床中转化24h，分离纯化得到甜菊醇和RA。
实施例6：
用常规产酶培养基液体培养棘孢曲霉，100ml培养基中加入底物为7%甜菊糖苷，50℃恒温摇床中转化24h，分离纯化得到甜菊醇和RA。
实施例7：
用常规的棘孢曲霉固体曲培养基，发酵后经加水浸提得到棘孢曲霉酶液，100ml加入适量甜菊糖苷（溶液的HPLC分析结果见图1)，合适温度水浴中转化24h(见图3)，离心后可得到甜菊醇沉淀(溶解后的HPLC分析见图2)和RA(提取后的分析结果见图4)。甜菊醇沉淀经重结晶得到纯度为98%的甜菊醇。RA经纯化处理得到纯度为98%的RA。
实施例8：
用常规的棘孢曲霉固体曲培养基，发酵得到酶粉，30ml转化液中添加1.0%(w/v)的甜菊糖苷，5%酶粉，45℃恒温摇床中转化24h，分离纯化得到甜菊醇和RA。
实施例9：
与实施例1基本相同，所不同的是底物是悬钩子苷。
实施例10：
与实施例4基本相同，所不同的是底物是悬钩子苷。
Claims (3)
1.棘孢曲霉(Asperillus acculeatus) CCTCC No:M 2011264在制备甜菊醇和纯化莱鲍迪苷A中的应用。
2.一种制备甜菊醇和纯化莱鲍迪苷A的方法，其特征是：将棘孢曲霉CCTCC No:M 2011264接种到常规固体曲培养基或液体产酶培养基中，进行产酶发酵，用其菌或酶液在30℃-60℃下转化甜菊糖苷或悬钩子苷，转化完全后甜菊醇以沉淀形式析出，莱鲍迪苷A留在上清液中；沉淀中的甜菊醇用乙醇或者正丁醇纯化得到高纯度的甜菊醇；上清液经过树脂吸附层析和50%-90%的乙醇洗脱得到纯化的莱鲍迪苷A。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是：将棘孢曲霉CCTCC No:M 2011264接种到固体曲培养基中，培养至孢子长满培养基表面，以水：曲以10-100:1 v/v体积比，浸提酶液1小时，抽滤，得到酶液；酶液放在恒温水浴中，加入适量甜菊糖溶解，30℃-60℃下静态或动态转化；转化完全后甜菊醇以沉淀形式析出，莱鲍迪苷A留在上清液中；沉淀中的甜菊醇用乙醇或者正丁醇纯化得到高纯度的甜菊醇；上清液经过树脂吸附层析和50%-90%的乙醇洗脱得到纯化的莱鲍迪苷A。
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