CN105861573B - 一种双酶法制备甜菊醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于天然化合物的生物合成技术领域，具体涉及一种双酶法制备甜菊醇的方法。一种双酶法制备甜菊醇的方法，以甜菊糖苷为底物，将其用水或者缓冲液配制成溶液，按照顺序加入β‑葡萄糖苷酶S‑bgl4和Sbgl，反应1‑12h，即可获得甜菊醇。本发明的方法用来制备甜菊醇具有高的选择性、转化率和产率，条件温和、环境友好、操作简单等优点。
Description
技术领域
本发明属于天然化合物的生物合成技术领域，具体涉及利用一种使用两种β-葡萄糖苷酶协同催化甜菊苷水解制备甜菊醇的方法。
背景技术
甜菊醇是甜菊糖苷类化合物的苷元部分，具有四环二萜骨架结构。甜菊糖苷是从植物甜叶菊Stevia rebaudiana Bertoni叶片中提取获得的具有高甜味的一类糖苷化合物。甜菊糖苷可作为食品添加剂使用，目前已实现工业化生产。我国的食品安全国家标准公布了甜菊糖苷中常见的9种糖苷化合物，分别是甜菊苷、瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C、瑞鲍迪苷D、瑞鲍迪苷F、杜克苷A、甜茶苷及甜菊双糖苷(食品添加剂甜菊糖苷GB 8270-2014)。
甜菊醇具有广泛的生理活性。研究发现甜菊醇具有改善认知功能的作用，可以帮助改善学习、记忆、警觉以及精神病患者的稳定性等(Ko J A,Ryu Y B,Kwon H J,etal.Characterization of a novel steviol-producingβ-glucosidase fromPenicillium decumbens and optimal production of the steviol.Appl MicrobiolBiotechnol,2013,97(18):8151-8161.)。另外，还有研究报道甜菊醇在降血糖、降血压、抗炎、抗肿瘤、抗腹泻、抗菌和免疫调节等方面均具有良好活性(余双双,张大永.甜菊苷及其衍生物的生物活性研究进展.药学进展,2014,(08):577-584.)，以及可以作为植物的生长因子(De Oliveira B H,Stiirmer J C,De Souza Filho J D,et al.Plant growthregulation activity of steviol and derivatives.Phytochemistry,2008,69(7):1528-1533.)。对甜菊醇进行分子修饰还可以得到多种具有特定药理活性的衍生物(胡艳秋,石浩.甜菊醇及其衍生物的研究进展.浙江化工,2011,(01):10-14.)。
目前，仍然缺乏一种高效、经济、环保、可扩大化的生产甜菊醇的方法。已报道的甜菊醇的生产方法包括以下3种。
第一种是从天然植物中提取分离。但是，由于甜菊醇在天然植物如甜叶菊或甜茶中含量极低，经过多个步骤提取后只能得到少量的甜菊醇(马迎迎,陈育如,张伟娜,等.棘孢曲霉转化甜菊糖为甜菊醇及纯化莱鲍迪苷A.微生物学报,2014,(01):62-68.)。
第二种是化学法合成。有报道使用强酸处理的方法水解甜菊糖苷类化合物可以生产得到甜菊醇，但是在强酸条件下产物甜菊醇不稳定，往往发生重排生成异甜菊醇(Avent,A.G.；Hanson,J.R.；De Oliveira,B.H.Hydrolysis of the diterpenoid glycoside,stevioside.Phytochemistry 1990,29:2712-2715)。也有报道使用高碘酸钠或四醋酸铅，再配合氢氧化钠的方法水解甜菊苷得到甜菊醇，但是此法需要耗费大量价格昂贵的高碘酸钠或者有毒的重金属盐，且甜菊醇产率较低(Ogawa T,Nozaki M,Matsui M(1980)Totalsynthesis of stevioside.Tetrahedron 36:2642-2648)。
第三种是生物法转化，包括微生物法转化和酶法转化。Oliveira等人利用赤霉菌在室温下经过7天发酵转化甜菊糖苷得到了甜菊醇，且转化效率低于20％(Heleno deOliveira,Bras,Ferreira da Trindade,Jose Luiz.Production of hydroxysteviol andits application as a plant growth regulator:Brazil,2004006278[P].2006-08-22.)。中国专利公开了一种利用巴氏微杆菌制备甜菊醇的方法(专利号：ZL201110159563.1)，使用全细胞转化时获得的转化效率低，且产物甜菊醇和菌体混合在一起不易分离纯化。使用破壁处理后的巴氏微杆菌粗酶液可提高转化效率，但是细胞破壁处理增加了生产成本。文献报道的利用棘孢曲霉转化甜菊糖制备甜菊醇的方法，由于所用的是胞外酶，与巴氏微杆菌相比具有更短的转化时间和分离成本，但是棘孢曲霉发酵产酶所需时间为3天(马迎迎,陈育如,张伟娜,等.棘孢曲霉转化甜菊糖为甜菊醇及纯化莱鲍迪苷A.微生物学报,2014,(01):62-68.)。与化学法和微生物法相比，酶法彻底水解甜菊糖苷类化合物中的糖基部分来生产甜菊醇具有反应快速、条件温和、选择性好、环境友好等优点，但是，获得适用于水解甜菊糖苷类化合物生产甜菊醇的高活性的酶仍然是一个困难。中国专利公开了一种利用商业化黑曲霉β-葡萄糖苷酶催化水解甜菊苷制备甜菊醇的方法(专利号：ZL 201210352461.6)，但是反应温度为70-75℃，维持较高的反应温度增加了生产的成本，且反应中需要使用程序升温，操作相对繁琐。另一份中国专利公开了一种利用商业化的酶混合物Cytolase PCL5水解甜菊苷制备甜菊醇的方法(专利号：CN201180006633.8)，该方法使用的酶是混合物，没有给出酶的进一步特征，而且该酶在反应过程中受到产物葡萄糖的显著抑制，需要配合使用酵母去除反应液中产生的葡萄糖，整个酶反应过程耗时较长。
以甜菊醇为发明名称查找国家知识产权局专利检索数据库，共出现44条检索结果，涉及到甜菊醇的专利有9项。其中，关于甜菊醇制备方法的专利有5项，关于甜菊醇应用的专利有4项。而其他检索结果都是与甜菊醇糖苷类化合物或甜菊醇衍生物及它们的应用相关。
发明人在之前申请的2项中国专利《编码糖基水解酶家族1的β-葡萄糖苷酶基因及其应用》(专利号：ZL201310049608.9)和中国专利《编码糖基水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶基因及其应用》(专利号：ZL201210387271.8)分别公开了一个来自于链霉菌的糖基水解酶家族1的β-葡萄糖苷酶S-bgl4和一个来自于新鞘氨醇菌的糖基水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶Sbgl，以及这两个酶在分解纤维二糖中的应用，但均未提及这两个酶的其它用途。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了提供一种双酶法制备甜菊醇的方法，还具有高效、高的选择性、转化率和产率，条件温和、环境友好、操作简单、经济等优点。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种双酶法制备甜菊醇的方法，包括以下步骤：
(1)以甜菊糖苷为底物，将其用水或者缓冲液配制成甜菊糖苷溶液；
(2)先加入β-葡萄糖苷酶S-bgl4，反应1-6h；
(3)沸水浴加热5min灭活酶后，用浓盐酸调节pH值；
(4)再加入β-葡萄糖苷酶Sbgl，反应1-6h；
(5)沸水浴加热5min灭活酶后，得到水解产物。
作为优选，步骤(1)中所述的甜菊糖苷为甜菊苷或含有甜菊苷的甜叶菊提取物。
作为优选，步骤(1)中所述的甜菊糖苷溶液的浓度为1-20g/L。
作为优选，步骤(1)中所述的缓冲液为Teorell and Stenhagen缓冲液。
作为优选，所述的Teorell and Stenhagen缓冲液中含有50mM磷酸氢二钠、33mM柠檬酸和50.7mM硼酸。
作为优选，步骤(2)中所述的β-葡萄糖苷酶S-bgl4的终浓度为50-100μg/mL。
作为优选，步骤(2)中反应的pH值为5.0-10.0。
作为优选，步骤(4)中所述的β-葡萄糖苷酶Sbgl的终浓度为50-100μg/mL。
作为优选，步骤(3)中反应的pH值为3.0-8.0。
作为优选，所述的方法中各步骤的反应温度控制在25-60℃。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明首次提供一种利用两种β-葡萄糖苷酶协同作用来制备甜菊醇的新方法。
2.本发明的方法所使用的两种酶的生化特性明确，通过基因重组表达技术快速获得大量的重组酶。所获得的酶在制备甜菊醇过程中还具有高效、高的选择性、转化率和产率，条件温和、环境友好、操作简单、经济的优点。
附图说明
图1为本发明的双酶法水解甜菊苷制备甜菊醇HPLC图；
其中，图1-a中保留时间1.182min为甜菊苷，保留时间12.392min为甜茶苷，保留时间15.633min为甜菊双糖苷，保留时间21.193min为甜菊醇；保留时间20.237min为杂质；
图2为本发明制备的甜菊醇质谱图(317.21，[M-H]-)；
有关附图标记的说明：
a为甜菊苷、甜茶苷、甜菊双糖苷和甜菊醇的标准品；b为S-bgl4水解反应液HPLC图；c为Sbgl水解反应液HPLC图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
β-葡萄糖苷酶S-bgl4的制备按照专利ZL201310049608.9所述的方法执行，β-葡萄糖苷酶Sbgl的制备按照专利ZL201210387271.8所述的方法执行。
HPLC分析水解产物条件：
仪器设备：Waters公司的e2695分离单元和2998PDA检测器。
色谱柱：C18柱(Alltima，250×4.6mm，5μm)。
色谱条件：流动相由乙腈(A)和磷酸盐缓冲液(B，10mM的NaH2PO4溶液用磷酸调节pH至2.6)组成，使用梯度洗脱程序：68％B(0-10min)，68到20％B(10-20min)，20％B(20-21min)，20到68％B(21-28min)，最后68％B(28-30min)。柱温40℃，流速1mL/min，检测波长210nm。
UPLC-MS分析水解产物条件：
仪器设备：Waters公司的ACQUITY UPLCTM系统，配备有PDA检测器和四级杆飞行时间质谱检测器(QTOF)及电喷雾离子源(ESI)。
色谱柱：Waters公司的ACQUITY
BEH C18柱(1.7μm，2.1×100mm)。
色谱条件：流动相由水(A，含0.1％甲酸，v/v)和乙腈(B)组成，使用梯度洗脱程序：30到40％B(0-4min)，40到80％B(4-7min)，80％B(7-8min)，80到30％B(8-8.1min)，最后30％B(8.1-10min)。柱温40℃，流速0.4mL/min，检测波长190-400nm。
质谱条件：使用负离子模式。ESI条件：毛细管电压2600V、锥孔电压40V、源温100℃、脱溶剂温度400℃。脱溶剂气和锥孔气使用高纯氮气，流速分别为700和20L/h。使用MSE实验同时采集母离子和子离子信息，设置低碰撞能量6V，高碰撞能量30-40V。仪器的校准使用亮氨酸-脑啡肽做标准物。
实施例1：
一种双酶法制备甜菊醇的方法，包括以下步骤：
(1)以甜菊糖苷为底物，将其用水或者缓冲液配制成甜菊糖苷溶液；所述的甜菊糖苷为甜菊苷(纯度为98％)；所述的缓冲液为Teorell and Stenhagen缓冲液；所述的Teorell and Stenhagen缓冲液中含有50mM磷酸氢二钠、33mM柠檬酸和50.7mM硼酸；
(2)先加入β-葡萄糖苷酶S-bgl4，反应1h；所述的β-葡萄糖苷酶S-bgl4的终浓度为50μg/mL；反应的pH值为5.0；
(3)沸水浴加热5min灭活酶后，用浓盐酸调节pH至3.0；
(4)再加入β-葡萄糖苷酶Sbgl，反应1h；所述的β-葡萄糖苷酶Sbgl的终浓度为50μg/mL；反应的pH值为3.0；
(5)沸水浴加热5min灭活酶后，得到水解产物。
上述方法中各步骤的反应温度控制在25℃。
实施例2：
一种双酶法制备甜菊醇的方法，包括以下步骤：
(1)以甜菊糖苷为底物，将其用水或者缓冲液配制成甜菊糖苷溶液；所述的甜菊糖苷为含有甜菊苷的甜叶菊提取物(甜菊苷含量为80％)；所述的缓冲液为Teorell andStenhagen缓冲液；所述的Teorell and Stenhagen缓冲液中含有50mM磷酸氢二钠、33mM柠檬酸和50.7mM硼酸；
(2)先加入β-葡萄糖苷酶S-bgl4，反应6h；所述的β-葡萄糖苷酶S-bgl4的终浓度为100μg/mL；反应的pH值为10.0；
(3)沸水浴加热5min灭活酶后，用浓盐酸调节pH至8.0；
(4)再加入β-葡萄糖苷酶Sbgl，反应6h；所述的β-葡萄糖苷酶Sbgl的终浓度为100μg/mL；反应的pH值为8.0；
(5)沸水浴加热5min灭活酶后，得到水解产物。
上述方法中各步骤的反应温度控制在60℃。
实施例3：
一种双酶法制备甜菊醇的方法，包括以下步骤：
(1)以甜菊糖苷为底物，将其用水或者缓冲液配制成甜菊糖苷溶液；所述的甜菊糖苷为甜菊苷(纯度为98％)；所述的缓冲液为Teorell and Stenhagen缓冲液；所述的Teorell and Stenhagen缓冲液中含有50mM磷酸氢二钠、33mM柠檬酸和50.7mM硼酸；
(2)先加入β-葡萄糖苷酶S-bgl4，反应3h；所述的β-葡萄糖苷酶S-bgl4的终浓度为80μg/mL；反应的pH值为8.0；
(3)沸水浴加热5min灭活酶后，用浓盐酸调节pH至5.0；
(4)再加入β-葡萄糖苷酶Sbgl，反应3h；所述的β-葡萄糖苷酶Sbgl的终浓度为80μg/mL；反应的pH值为5.0；
(5)沸水浴加热5min灭活酶后，得到水解产物。
上述方法中各步骤的反应温度控制在50℃。
使用HPLC对上述实施例1-3得到的水解产物进行分析，结果如图1-2所示：从图1中的b可以了解到，经过S-bgl4的作用，甜菊苷被转化为甜茶苷。从图1中的c可以了解到，经过Sbgl的作用后，反应液中的甜茶苷又被迅速转化为甜菊醇；图2显示的是反应生成的甜菊醇在负离子模式下测得的分子量为317.21，与理论分子量相符；并对实施例1-3中甜菊苷转化率及甜菊醇的产率进行分析、统计，详见表1。
表1本发明的双酶法制备甜菊醇的方法的甜菊苷转化率及甜菊醇的产率分析
| 处理 | 甜菊苷转化率(％) | 甜菊醇的产率(％) |
| 实施例1 | 66.7 | 57.0 |
| 实施例2 | 68.3 | 58.4 |
| 实施例3 | 84.7 | 72.4 |
由表1可知，本发明实施例1-3中所述的双酶法制备甜菊醇的方法的甜菊苷转化率均在66.7％以上，甜菊醇的产率均在57％以上。
综上所述，本发明首次提供一种利用两种β-葡萄糖苷酶协同作用来制备甜菊醇的新方法具有高效、高的选择性、转化率和产率，条件温和、环境友好、操作简单、经济的优点。
Claims (5)
1.一种双酶法制备甜菊醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以甜菊糖苷为底物，将其用水或者缓冲液配制成甜菊糖苷溶液；所述的甜菊糖苷为甜菊苷或含有甜菊苷的甜叶菊提取物；
(2)先加入β-葡萄糖苷酶S-bgl4，反应1-6h；所述β-葡萄糖苷酶S-bgl4是来自中国专利《编码糖基水解酶家族1的β-葡萄糖苷酶基因及其应用》，专利号：ZL201310049608.9的β-葡萄糖苷酶S-bgl4；(3)沸水浴加热5min灭活酶后，用浓盐酸调节pH值；
(4)再加入β-葡萄糖苷酶Sbgl，反应1-6h；所述β-葡萄糖苷酶Sbgl是来自中国专利《编码糖基水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶基因及其应用》，专利号：ZL201210387271.8的β-葡萄糖苷酶Sbgl；
(5)沸水浴加热5min灭活酶后，得到水解产物。
2.根据权利要求1所述的双酶法制备甜菊醇的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的甜菊糖苷溶液的浓度为1-20g/L。
3.根据权利要求1所述的双酶法制备甜菊醇的方法，其特征在于，步骤(2)中反应的pH值为5.0-10.0。
4.根据权利要求1所述的双酶法制备甜菊醇的方法，其特征在于，步骤(3)中pH值为3.0-8.0。
5.根据权利要求1所述的双酶法制备甜菊醇的方法，其特征在于，所述的方法中各步骤的反应温度控制在25-60℃。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |