CN109651453A - 一种高值化甜菊糖母液糖的方法 - Google Patents

一种高值化甜菊糖母液糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高值化甜菊糖母液糖的方法，属于天然化合物的改性和提取领域。本发明采用乳糖酶来高度专一性催化水解斯替夫苷，使斯替夫苷转化为通常只能从甜茶叶中获得的甜茶苷；同时，将母液糖中的斯替夫苷转化后，由于甜茶苷和莱鲍迪苷A的极性差异远远超过斯替夫苷和莱鲍迪苷A的极性差异，从而更易于从母液糖中分离莱鲍迪苷A。本发明提供的技术同样适用于含有斯替夫苷的混合甜菊糖苷的高值化，并有助于从中分离莱鲍迪苷A。

Description

一种高值化甜菊糖母液糖的方法
技术领域
本发明涉及一种高值化甜菊糖母液糖的方法，涉及甜菊糖苷提取纯化后产生的母液糖和混合甜菊糖苷的高值化利用，属于天然化合物的改性和分离领域。
背景技术
甜菊糖是各种甜菊糖苷的混合物，也叫甜菊糖苷，是从甜叶菊叶子中提取出的一类理想的替代蔗糖的甜味剂。未经精制分离的甜菊糖苷在工业上一般被称为混合甜菊糖苷，或者简称甜菊糖，总苷一般在80％以上；含有50％以上的莱鲍迪苷A和25％-30％的斯替夫苷(Stevioside，St)，其中莱鲍迪苷A的口感相对较好、价格较高。甜菊糖母液糖为甜菊糖提取加工过程中的副产品，口感很差，其中仍然有总量为50％以上的斯替夫苷和莱鲍迪苷A，而斯替夫苷和莱鲍迪苷A两者极性差异小，进一步分离从中得到高值的莱鲍迪苷A比较困难；因此甜菊糖母液糖只能以RA四分之一的价格出售。
甜菊糖的生产工艺路线是：叶子粉碎—浸泡提取—絮凝—前脱色—吸附—膜过滤—结晶精制—浓缩—干燥—重结晶—干燥。第一次结晶干燥后得到各种成分不一的甜菊糖，在工业上被称为混合糖；混合糖再通过大孔树脂吸附分离或重结晶分离可以得到相对较纯的甜菊糖苷，如60％-97％的RA。经过重结晶分离后，结晶出来的甜菊糖苷中RA等单组分的相对含量较高，而留在母液中的混合糖苷经干燥后得到组分复杂的糖苷，在工业上被称为母液糖。
母液糖中一半左右的甜菊糖苷还是莱鲍迪苷A和斯替夫苷；但再通过重结晶或色谱分离进一步分离提纯母液糖去制备莱鲍迪苷A或斯替夫苷已经较为困难。
母液糖中几种主要甜菊糖苷的极性正丁醇/水分配系数如表1所示。由表1可看出，莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷C与甜茶苷的极性差异，远大于它们与斯替夫苷的极性差异；因此将斯替夫苷转化成甜茶苷后，莱鲍迪苷A和莱鲍迪苷C会比之前容易从混合物中分离出来。
表1几种主要甜菊糖苷的正丁醇/水分配系数
另一方面，甜茶苷(悬钩子苷，Rubusoside，Ru)是我国广西特有的珍稀植物甜茶中主要的甜味成分，但甜茶的种植区域范围小、产量低，产品成分复杂，含有少量单宁等物质。与斯替夫苷相比，甜茶苷仅在C13位少一个β1-2葡萄糖基，其结构如下式：
表2斯替夫苷与甜茶苷的结构的区别
目前报道的获取甜茶苷的方法以及工业上通行的获取甜茶苷的方法，主要是用溶剂从甜茶叶中提取甜茶苷并用树脂或重结晶手段分离纯化甜茶苷产品，所得甜茶苷的纯度在70％-85％。因甜茶中所含成分众多，溶剂提取后的溶液需要经过滤、柱吸附、水洗、醇洗、洗脱液干燥等一系列过程才能得到较高纯度的甜茶苷(闫志刚，2017)。这不仅导致成本的提升，更会因收率过低造成资源的浪费。
基于斯替夫苷与甜茶苷在结构上的相似性，若能特异性水解掉斯替夫苷C13位的葡萄糖，即可实现甜茶苷的高效生产。目前被报道可用作催化斯替夫苷水解制备甜茶苷的酶主要有两种，分别是β-葡萄糖苷酶和β-半乳糖苷酶。Ko等发现了来自Penicilliumdecumbens(Ko,2013)和Aspergillus aculeatus(Ko,2012)的β-葡萄糖苷酶能水解斯替夫苷生成甜茶苷，但是这两种β-葡萄糖苷酶对于斯替夫苷的活性很小，这两种酶的适宜底物可能是其它糖苷。Wan发现了来自Aspergillus sp.的β-半乳糖苷酶(Wan,2012)，Chen发现了来自Sulfolobus solfataricus的β-半乳糖苷酶(Chen,2014)，Nguyen发现来自Thermusthermophilus的β-半乳糖苷酶(Nguyen,2014)，这三种酶都具有水解斯替夫苷生成甜茶苷的能力；但是这些酶或者没有显示出对斯替夫苷具有特异性，或者需要在很高加酶量(2000-14000U/g斯替夫苷)的情况下才能得到较高的甜茶苷产率，而且反应后将酶制剂留在产品中，这样会引入大量未知蛋白质，不利于食品安全的掌控。
发明内容
本发明的目的在于针对目前甜菊糖苷提取纯化后产生的母液糖的价值较低的问题，以及再继续从母液糖中分离莱鲍迪苷A成本会较高的问题，提供一种高值化母液糖的方法，这种方法是以母液糖中的斯替夫苷为底物，通过乳糖酶(EC3.2.1.23.)高效专一地将母液糖中的斯替夫苷转化为甜茶苷。如此，既可以将价值较低的母液糖转化价值(价格)较高的甜茶苷，又方便在转化了母液糖中的斯替夫苷后，将价格高的莱鲍迪苷A从母液糖中分离出来。同时，本发明的方法相比现有的制备甜茶苷的方法，还够避免用溶剂法从甜茶树叶中提取甜茶苷时成本高、效率低的问题。所述甜菊糖母液糖是指甜菊糖苷生产工艺过程中甜菊糖苷提取纯化后产生的母液或母液的干燥产品，其中含有斯替夫苷。
具体地，本发明在反应器中加入一定量的甜菊糖母液糖，加入脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)的乳糖酶，加酶量为10-100U/g斯替夫苷，并且所添加的乳糖酶的质量不超过所用甜菊糖母液糖的质量的1％，然后在25-45℃的温度条件下反应1-3h。
所述甜菊糖母液糖还可以用含有斯替夫苷的混合甜菊糖苷来替代。所述混合甜菊糖苷，是指其中含有斯替夫苷的甜叶菊提取物、或者斯替夫苷的质量百分含量在1％-99.5％的甜菊糖苷混合物。
在本发明的一种实施方式中，先将甜菊糖母液糖加水配置成一定浓度的溶液，再加入乳糖酶催化斯替夫苷生成甜茶苷。
在本发明的一种实施方式中，所述乳糖酶来自脆壁克鲁维酵母Kluyveromycesfragilis。例如，来自脆壁克鲁维酵母(8554)的乳糖酶。
在本发明的一种实施方式中，乳糖酶的酶活测定底物为邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)。
在本发明的一种实施方式中，乳糖酶的加酶量为10-100U/g斯替夫苷。
在本发明的一种实施方式中，乳糖酶的加酶量为60U/g斯替夫苷。
在本发明的一种实施方式中，反应温度为室温，例如25℃。
本发明提供的从母液糖中直接制备甜茶苷的方法可以实现高值化利用甜菊糖母液糖，具体地，以廉价的母液糖中的斯替夫苷为原料，获得更高价格的甜茶苷；斯替夫苷水解成甜茶苷后，母液糖中的原来和莱鲍迪苷A极性差异小的斯替夫苷变成了和莱鲍迪苷A极性差异大很多的甜茶苷，从而又易于得到莱鲍迪苷A；如此提升了甜菊糖母液糖的价值。
本发明还提供了一种高效催化转化斯替夫苷合成甜茶苷的方法，利用乳糖酶专一地催化水解斯替夫苷，将斯替夫苷水解成甜茶苷。所述乳糖酶来自脆壁克鲁维酵母Kluyveromyces fragilis。例如，来自脆壁克鲁维酵母(8554)的乳糖酶。
[有益效果]
(1)工业上采用重结晶的方法提取母液糖中的莱鲍迪苷A，重结晶后的母液糖成分复杂，其中大量存在的斯替夫苷与莱鲍迪苷A因极性差异小，分离提纯较为困难，很大程度上造成了浪费。本发明提供的从母液糖中直接制备甜茶苷的方法是利用乳糖酶专一地催化水解甜菊糖母液糖中的斯替夫苷，将甜菊糖母液糖中的斯替夫苷转化为通常只能从甜茶叶中获得的甜茶苷；同时，将母液糖中的斯替夫苷转化后，由于甜茶苷和莱鲍迪苷A的极性差异远远超过斯替夫苷和莱鲍迪苷A的极性差异，从而更易于从母液糖中分离得到高品质甜味剂莱鲍迪苷A。
一般而言，经过以上酶促处理后，沿用现有的从母液糖中分离提取莱鲍迪苷A的工艺来提取酶促反应液中的莱鲍迪苷A，不仅莱鲍迪苷A的纯度提高，它的绝对收率可以提高25％以上，相对收率可以提高40％以上。
(2)本发明使用的乳糖酶具有高效专一水解斯替夫苷的能力，在斯替夫苷的转化率达到98.5％以后，只要酶活不过剩，就不会使莱鲍迪苷A和莱鲍迪苷C发生反应。
(3)本发明采用来自脆壁克鲁维酵母Kluyveromyces fragilis的乳糖酶，脆壁克鲁维酵母是目前已经批准使用在食品添加剂中的微生物。使用这种乳糖酶的好处是：一方面，这种酶的用量很少，这不但可以减少成本，还可以减少反应产物中酶蛋白的含量，以便获得杂质更少的产品，避免杂蛋白可能带来的食品安全风险；另一方面，该酶所需要的反应温度是常温、反应时间短，减少了温度控制所带来的成本负担。
总的来说，本发明可以高效地从甜菊糖母液糖中将低值甜味剂斯替夫苷转化为甜茶苷，经过处理的甜菊糖母液糖更容易分离得到高纯度的莱鲍迪苷A与甜茶苷，从而实现甜菊糖母液糖的高值化应用。
附图说明
图1经酶促反应后的甜菊糖的HPLC图，(a)向甜菊糖溶液中添加60U/g斯替夫苷的乳糖酶，反应2h；(b)向甜菊糖溶液中添加150U/g斯替夫苷的乳糖酶，反应2h。
图2向母液糖溶液中添加30U/g斯替夫苷的乳糖酶，反应2h得到的反应液的HPLC图。
图3斯替夫苷经乳糖酶催化反应2h后的反应液的HPLC图。
图4莱鲍迪苷A单独存在或者与斯替夫苷共混时，经乳糖酶催化反应后的HPLC图谱；(a)50wt％莱鲍迪苷A+50wt％斯替夫苷经乳糖酶催化反应后的HPLC图(加酶量200U/g斯替夫苷，反应2h)，莱鲍迪苷A没有反应；(b)莱鲍迪苷A的HPLC图，(c)50wt％莱鲍迪苷A+50wt％斯替夫苷的HPLC图。
图5莱鲍迪苷A与乳糖酶共存2h后的HPLC图。
具体实施方式
测定方法：
1.乳糖酶酶活定义：以ONPG为底物，乳糖酶在35℃下保温酶解ONPG，每分钟释放出1μmol/L邻硝基酚所需要的酶量，定义为一个酶活力单位。
乳糖酶酶活的测定：在比色管中加入500μL pH6.5的磷酸缓冲液和200μL 0.25％的ONPG溶液，在35℃下温浴5min，加入适当稀释的酶液500μL，反应10min，加入800μL 5％的Na2CO3溶液终止反应，蒸馏水定容至10mL，采用紫外分光光度计测定溶液在420nm下的吸光度，根据硝基酚的标准曲线计算酶活。
2.甜菊糖苷的定性分析
采用液相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪定性水解及转苷产物，检测条件如下：Kromasil 100-5-C18色谱柱(4.6×250mm)，柱温为40℃，乙腈：水＝32：68(v/v)下等度洗脱，进样量10μL，进样浓度为10mg/mL，流速为1mL/min；质谱条件为碰撞电压为6eV；离子化方式电喷雾电离(ESI)，负离子检测模式，分子量范围：200-2000。
3.甜菊糖苷的定量分析
采用莱鲍迪苷A(HPLC 99％)为标样绘制标准曲线，莱鲍迪苷A、斯替夫苷及甜茶苷的浓度依据JECFA2016中甜菊糖苷的分析检测方法，通过莱鲍迪苷A标准曲线进行换算。
斯替夫苷转化率计算公式为：
α＝[(C0-Ct)/C0]×100％ (1)
其中，α表示斯替夫苷转化率，C0表示溶液未反应时斯替夫苷的浓度，Ct表示t时刻反应液中斯替夫苷的浓度。
甜茶苷产率计算公式为：
β＝(Cm/Cn)×100％ (2)
其中，β表示甜茶苷的产率，Cm表示反应结束时甜茶苷的浓度，Cn表示理论上可以生成的甜茶苷的浓度。Cm与Cn均通过JECFA2016中公开的方法进行换算。
甜茶苷收率＝(每克原料分离纯化后得到的甜茶苷质量/每克原料理论上可以生成的甜茶苷质量)×100％
实施例1来自脆壁克鲁维酵母Kluyveromyces fragilis(8554)的乳糖酶的制备方法
将脆壁克鲁维酵母(8554)菌种接种到YPD斜面培养基上，30℃摇床培养；将培养好的种子培养液按10％量接种于液态发酵培养基(含有乳糖和酵母粉)中，28℃摇床培养，转速180rpm，培养36h。发酵培养物经4000r/min离心15min，倾倒上清液，向沉积的酵母细胞加入一定量的pH7.0磷酸盐缓冲液，搅拌均匀后，用球磨机180r/min作用60min，再加入一定倍数的pH 7.0磷酸盐缓冲液，搅拌均匀后离心弃去酵母细胞残片，即可得到粗酶液。选用截留分子量为30kDa的膜，70kpa下将酶液进行超滤浓缩，得到浓缩液，用缓冲液洗超滤膜收集洗涤液，合并浓缩液与洗涤液，得到浓缩的酶液，将浓缩的酶液冻干后得到比酶活40000U/g的冻干粉。
实施例2由甜菊糖母液糖制备甜茶苷并进一步分离莱鲍迪苷A
将重结晶提取莱鲍迪苷A后的甜菊糖母液糖溶液(莱鲍迪苷A 19％，斯替夫苷66％，莱鲍迪苷C 9％)浓缩至固含量300g/L后于30℃下加入实施例1中所得的乳糖酶，加酶量为100U/g斯替夫苷，反应2h。反应液干燥后以95％乙醇为重结晶溶剂进行重结晶操作，分离得甜茶苷，甜茶苷纯度为97.1％，甜茶苷收率为88.9％；分离莱鲍迪苷A，纯度为95.8％，收率为86％。
对比例1：将重结晶提取莱鲍迪苷A后的甜菊糖母液糖固体(莱鲍迪苷A 19％，斯替夫苷66％，莱鲍迪苷C 9％)以95％乙醇为重结晶溶剂进行重结晶操作，分离得莱鲍迪苷A，纯度为84.2％，收率为54.9％。
与实施例2相比，可以看出，通过采用实施例2记载的酶法转化母液糖，不仅可以提高莱鲍迪苷A的纯度，莱鲍迪苷A的绝对收率提高了31.1％，相对提高56.6％。
实施例3由甜菊糖母液糖制备甜茶苷并进一步分离莱鲍迪苷A
将精制莱鲍迪苷A时副产的甜菊糖母液糖溶液浓缩到固含量30％(莱鲍迪苷A33％，斯替夫苷41％，莱鲍迪苷C 11％)，于30℃下加入实施例1中所得的乳糖酶，加酶量为80U/g斯替夫苷，反应1h。反应液经喷雾干燥后以95％乙醇为重结晶溶剂进行重结晶操作，分离得甜茶苷，纯度为96.7％，收率为91.7％；莱鲍迪苷A纯度为95.7％，收率为87.2％。
对比例2：将精制莱鲍迪苷A时副产的甜菊糖母液糖(莱鲍迪苷A33％，斯替夫苷41％，莱鲍迪苷C 11％)喷雾干燥后，以95％乙醇为重结晶溶剂进行重结晶操作，分离得莱鲍迪苷A，纯度为86.2％，收率为61.8％。
与实施例3相比，可以看出，通过采用实施例3记载的酶法转化母液糖，不仅可以提高莱鲍迪苷A的纯度，莱鲍迪苷A的绝对收率提高了25.4％，相对提高41.1％。
实施例4由甜菊糖制备甜茶苷
将甜菊糖(按质量分数计，含有：莱鲍迪苷A 22％，斯替夫苷68％，莱鲍迪苷C 3％)用去离子水配置成250g/L的糖液，于35℃下加入实施例1中所得的乳糖酶冻干粉，加酶量为60U/g斯替夫苷，反应2h。用高效液相色谱仪分析反应液，产品的HPLC图见附图1(a)，斯替夫苷转化率达98.3％，甜茶苷的收率为97.7％。
对比例3：将甜菊糖(甜菊糖中按质量分数计，含有：莱鲍迪苷A 22％，斯替夫苷68％，莱鲍迪苷C 3％)用去离子水配置成250g/L的糖液，于35℃下加入实施例1中所得的乳糖酶冻干粉，加酶量为150U/g斯替夫苷，反应24h。用高效液相色谱仪分析反应液，产品的HPLC图见附图1(b)。斯替夫苷转化率达99.5％，甜茶苷的产率为89.1％。由图1(b)可以看出乳糖酶的加酶量过多后，有转苷产物生成，液质分析的结果表明转苷产物的分子量与St-Glc2或RA-Glc1相符。
实施例5由甜菊糖母液糖制备甜茶苷
将甜菊糖母液糖(甜菊糖母液糖中按质量分数计，含有：莱鲍迪苷A 47％，斯替夫苷19％，莱鲍迪苷C 7％)配置成100g/L的糖液，于25℃下加入实施例1中所得的乳糖酶冻干粉，加酶量30U/g斯替夫苷，反应0.5h。用高效液相色谱仪分析反应液，反应液的HPLC图见附图2，斯替夫苷转化率达72.7％，甜茶苷的产率为70.5％，可见，温度低、加酶量少且反应时间短时，斯替夫苷转化率会有所下降。
实施例6由斯替夫苷制备甜茶苷
将20g斯替夫苷(97％，HPLC)溶解于100mL的去离子水中，配置成200g/L的斯替夫苷溶液置于反应器中，于35℃下加入实施例1中所得的乳糖酶冻干粉，加酶量为90U/g斯替夫苷，反应2h。用高效液相色谱仪分析反应液，产品的HPLC图见附图3，斯替夫苷转化率达98.9％，甜茶苷的产率为97.9％。
对比例4：将固含量200g/L的混合糖苷溶液(斯替夫苷50％，莱鲍迪苷A 50％)于35℃下加入实施例1中所得的乳糖酶冻干粉，加酶量200U/g斯替夫苷，反应2h。用高效液相色谱仪分析反应液，斯替夫苷转化率达99.5％，甜茶苷的产率为83％，产品的HPLC图见附图4(a)，有转苷产物生成，液质分析转苷产物的分子量为1128。
分别配置20mg/mL的斯替夫苷(97％，HPLC)溶液与20mg/mL的50wt％莱鲍迪苷A+50wt％斯替夫苷溶液，将这两种糖液分别用高效液相色谱仪分析，两种糖液的HPLC图见附图4(b,c)。
对比例5：将1g莱鲍迪苷A(99％，HPLC)溶解于100mL的去离子水中，配置成10g/L的莱鲍迪苷A溶液，将该溶液于30℃预热30min，加入实施例1中所得的乳糖酶冻干粉，加酶量为100U/g莱鲍迪苷A，反应24h。用高效液相色谱仪分析反应液，产品的HPLC图见附图5，莱鲍迪苷A没有发生反应。
对比例6：将甜菊糖(按质量分数计，含有：莱鲍迪苷A 22％，斯替夫苷68％，莱鲍迪苷C 3％)用pH5的磷酸-磷酸钾缓冲液(50mmol/L)配置成450g/L的糖液，于30℃下加入乳糖酶Lactozym Pure 7500L(购自Novozymes公司，中国)，加酶量为100U/g斯替夫苷，反应2h。反应结束后，用高效液相色谱仪分析反应液，结果表明反应液中没有甜茶苷生成，斯替夫苷也没有转化。
对比例7：将甜菊糖(按质量分数计，含有：莱鲍迪苷A 22％，斯替夫苷68％，莱鲍迪苷C 3％)用pH5的磷酸-磷酸钾缓冲液(50mmol/L)配置成450g/L的糖液，于30℃下加入来源于Kluyveromyces lactis的乳糖酶(商品名Lactozym 3000L HP-G，购自Novozymes公司，中国)，加酶量为100U/g斯替夫苷，反应2h。反应结束后，用高效液相色谱仪分析反应液，结果表明反应液中斯替夫苷的含量没有减少、斯替夫苷没有发生转化，也没有甜茶苷生成。
对比例8：将甜菊糖(按质量分数计，含有：莱鲍迪苷A 22％，斯替夫苷68％，莱鲍迪苷C 3％)用pH5的磷酸-磷酸钾缓冲液(50mmol/L)配置成450g/L的糖液，于30℃下加入来源于Kluyveromyces lactis(商品名Maxilact LG 2000，购自Royal DSM公司，N.V.)的乳糖酶，加酶量为100U/g斯替夫苷，反应2h后，用高效液相色谱仪分析反应液，结果表明反应液中的斯替夫苷的含量没有发生变化，也没有甜茶苷生成，表明斯替夫苷没有转化；但是，如果将反应时间由2h调整为20h，依然没有甜茶苷生成，而是生成甜菊双糖苷。
对比例9：将甜菊糖(按质量分数计，含有：莱鲍迪苷A 22％，斯替夫苷68％，莱鲍迪苷C 3％)用pH5的磷酸-磷酸钾缓冲液(50mmol/L)配置成450g/L的糖液，于30℃下加入来源于Aspergillus niger(9029TM)的乳糖酶，加酶量为100U/g斯替夫苷，反应2h后，用高效液相色谱仪分析反应液，结果表明反应液中的斯替夫苷的含量没有发生变化，也没有甜茶苷生成。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种高值化甜菊糖母液糖制备甜茶苷的方法，其特征在于，以甜菊糖母液糖为底物，利用来自脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)的乳糖酶在25-45℃的温度条件下反应1-3h来专一地催化水解甜菊糖母液糖中的斯替夫苷，将斯替夫苷水解成甜茶苷；莱鲍迪苷A不参加反应而继续留在甜菊糖母液糖中，反应结束后分离得到甜茶苷和莱鲍迪苷A；乳糖酶的加酶量为10-100U/g斯替夫苷，并且所添加的乳糖酶的质量不超过所用甜菊糖母液糖的质量的1％。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甜菊糖母液糖是指以甜叶菊为原料经过浸提法提取甜菊糖苷的过程中，甜菊糖苷提取纯化后产生的母液或母液的干燥产品，甜菊糖母液糖中含有斯替夫苷。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述乳糖酶的加酶量为10-100U/g斯替夫苷；所述甜菊糖母液糖溶液为水溶液或缓冲溶液，其中甜菊糖苷的质量浓度为100-500g/L。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，反应pH为pH4-6。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，反应结束后，包括莱鲍迪苷A在内的其它甜菊糖苷通过排阻色谱或重结晶与甜茶苷分离。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述甜菊糖母液糖还可以用含有斯替夫苷的混合甜菊糖苷来替代。
7.一种高效催化转化斯替夫苷合成甜茶苷的方法，其特征在于，利用来自脆壁克鲁维酵母Kluyveromyces fragilis的乳糖酶专一地催化水解斯替夫苷，将斯替夫苷水解成甜茶苷。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述乳糖酶来自脆壁克鲁维酵母Kluyveromyces fragilis，乳糖酶的形式包括浓缩液、冻干粉或者固定化酶，加酶量不超过所用甜菊糖底物质量的1％。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，在25-45℃的温度条件下反应1-3h来专一地催化水解甜菊糖母液糖中的斯替夫苷，将斯替夫苷水解成甜茶苷。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在30℃的温度条件下反应2-3h来专一地催化水解甜菊糖母液糖中的斯替夫苷，将斯替夫苷水解成甜茶苷。
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