CN111893109B

CN111893109B - 一种新型高效的β-葡萄糖苷酶CsBGL及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN111893109B
Application number: CN202010850880.7A
Authority: CN
Inventors: 肖敏; 阎振鑫; 徐莉
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2020-08-21
Filing date: 2020-08-21
Publication date: 2022-06-07
Anticipated expiration: 2040-08-21
Also published as: CN111893109A

Abstract

本发明涉及一种新型高效的β‑葡萄糖苷酶CsBGL及其编码基因与应用。一种β‑葡萄糖苷酶CsBGL，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述的β‑葡萄糖苷酶CsBGL的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的β‑葡萄糖苷酶CsBGL来源于金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)1433，所述金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)1433于2020年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.20188，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明提供新型高效的β‑葡萄糖苷酶CsBGL可以将甜菊苷的槐糖基水解为葡萄糖基，生成甜茶苷，并且不会进一步水解甜茶苷，使其对甜菊苷的转化率达到100％，甜茶苷的收率达100％。

Description

一种新型高效的β-葡萄糖苷酶CsBGL及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种新型高效的β-葡萄糖苷酶CsBGL及其编码基因与应用，属于生物技术技术领域。

背景技术

甜茶苷是生长在中国广西壮族自治区的蔷薇科悬钩子属植物甜茶的提取物，是一种天然的高效甜味剂，甜度是蔗糖的300倍，口味接近蔗糖，安全无毒，具有良好的降血糖，降血脂及抗龋齿等功效(Kim et al.,2019)，对糖尿病、高血糖及肥胖人群是良好的代糖天然甜味剂，广泛应用于食品、保健品等天然无卡路里甜味剂市场。另外，甜茶苷还是一种良好的天然助溶剂，可以帮助难溶的药物溶解以提高药效，比如抗癌药紫杉醇，白藜芦醇和姜黄素等(Chen et al.,2020；Zhang et al.,2012；Zhang et al.,2017)。但是，由于甜茶只适合于中国广西壮族自治区的湿润山区生长，所以天然提取的甜茶苷产量少，价格昂贵，限制了其在食品药品中的应用。为提高广大人民群众的生活质量和健康水平，科研人员一直在寻找一种可以便宜且大量的获取甜茶苷的方法。

甜菊苷的化学结构与甜茶苷相似，将甜菊苷在C13上的槐糖基水解为葡萄糖基就可以转化为甜茶苷。而且甜菊苷是甜菊糖的主要成分之一，中国作为全球最大的甜菊糖生产基地，甜叶菊种植面积已超过100万亩，所以甜菊苷是一种可以大量低价获取的原料。

现有以甜菊苷为原料生产甜茶苷的方法主要为化学法和生物法，化学法由于不能选择性的水解糖苷键导致甜茶苷的收率低，而且大量使用强酸或强碱试剂易对环境造成较大污染。而生物法由于对糖苷键具有高度的选择性以及其环境友好的特点，普遍被认为是更有前景的方法。

目前已经报道的可以水解甜菊苷分子中β-1,2糖苷键的酶分为两类，一类是β-半乳糖苷酶，一类是β-葡萄糖苷酶。2012年报道了Aspergillus sp.(CICIM F0620,来自CCTCC)来源的β-半乳糖苷酶甜菊苷的转化率为98.3％，而甜茶苷的收率只有91.4％(Wanet al.,2012)。2015年Streptomyces sp.GXT6来源的β-葡萄糖苷酶甜菊苷的转化率为98.2％，而甜茶苷的收率只有78.8％(Wang et al.,2015)；2019年报道的Sphingomonaselodea ATCC 31461β-葡萄糖苷酶甜菊苷的转化率为98％，而甜茶苷的收率达到99％(Lanet al.,2019)，k_cat/K_m为39.1(s·mM)^-1，但是目前的报道中所涉及的方法在转化率及水解效率上仍不完美，仍需继续开发研究。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种新型高效的β-葡萄糖苷酶CsBGL及其编码基因与应用。

发明概述

本发明针对甜茶苷在生产中面临的酶收率较低、效率低，专一性不好等问题，本发明提供了一种来源于金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)1433的新型高效的β-葡萄糖苷酶CsBGL及其编码基因与该酶在制备甜茶苷中的应用。

本发明的技术方案如下：

一种β-葡萄糖苷酶CsBGL，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

根据本发明优选的，所述β-葡萄糖苷酶CsBGL来源于金黄杆菌(Chryseobacteriumsp.)1433，所述金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)1433于2020年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.20188，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

根据本发明优选的，所述β-葡萄糖苷酶CsBGL对甜菊苷的转化率为100％，转化后得到的甜茶苷的收率为100％。

根据本发明优选的，所述β-葡萄糖苷酶CsBGL的最适pH为7.0～7.5，最适反应温度为35℃～45℃，Ag⁺显著抑制其酶活。

上述β-葡萄糖苷酶CsBGL的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明优选的，所述β-葡萄糖苷酶CsBGL的编码基因来源于金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)1433，所述金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)1433于2020年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.20188，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

一种重组载体，其特征在于，所述重组载体是由在质粒载体中插入上述如SEQ IDNO.1所示的β-葡萄糖苷酶CsBGL的核苷酸序列构建得到的。

根据本发明优选的，所述质粒载体为pET-28a(+)。

一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是将上述重组载体转化入宿主细胞中获得。

上述β-葡萄糖苷酶CsBGL和/或β-葡萄糖苷酶CsBGL的编码基因制备甜茶苷中的应用。

有益效果

1、本发明提供新型高效的β-葡萄糖苷酶CsBGL可以将甜菊苷的槐糖基水解为葡萄糖基，生成甜茶苷，并且不会进一步水解甜茶苷，使其对甜菊苷的转化率达到100％，甜茶苷的收率达100％，且k_cat/K_m达到160(s·mM)^-1以上，对24％(w/v，g/mL)的甜菊苷转化率为95％时的时空产率达到493.38g/(L·h)，效率远高于2019年报道的Sphingomonas elodeaATCC 31461β-葡萄糖苷酶k_cat/K_m为39.1(s·mM)^-1。

2、本发明提供新型高效的β-葡萄糖苷酶CsBGL催化专一性强，可以转化浓度达到0.1～50％的甜菊苷，对甜菊苷具有高效的水解能力，但是不水解莱鲍迪苷A和甜茶苷，非常适合甜茶苷的制备与生产。

3、本发明提供新型高效的β-葡萄糖苷酶CsBGL适用各种不同底物环境，对甜菊苷纯品和甜菊糖粗提物有同样的催化效果，pH稳定性及温度稳定性好，同时操作生产方法简单，可以广泛应用于以甜菊糖为原料的甜茶苷生产中，具有极好的工业化前景。

附图说明

图1是实施例3中异源表达的β-葡萄糖苷酶CsBGL的SDS-PAGE电泳图；

图中：M、分子量标准；1、镍亲和层析纯化获得的重组酶。

图2是β-葡萄糖苷酶CsBGL的酶学性质分析图；

图中：图A为最适pH和pH稳定性；图B为最适温度和1h温度稳定性；图C为37.5℃下不同时间的温度稳定性；图D为离子对酶活的影响。

图3是β-葡萄糖苷酶CsBGL水解莱鲍迪苷A、甜菊苷和甜茶苷的TLC检测图；

图中：1,3,5分别是β-葡萄糖苷酶CsBGL对莱鲍迪苷A、甜菊苷和甜茶苷的水解，2,4,6分别是灭活β-葡萄糖苷酶CsBGL对莱鲍迪苷A、甜菊苷和甜茶苷的水解；

图4是β-葡萄糖苷酶CsBGL水解莱鲍迪苷A、甜菊苷和甜茶苷的HPLC检测图。

图中：图A,C,E为灭活的β-葡萄糖苷酶CsBGL对莱鲍迪苷A、甜菊苷和甜茶苷的水解HPLC检测图；图B,D,F为有活性的β-葡萄糖苷酶CsBGL对莱鲍迪苷A、甜菊苷和甜茶苷的水解HPLC检测图；

图5是甜茶苷标准品、甜茶苷标准品碱水解、实施例6制备的甜茶苷的碱水解的TLC检测图；

图中：1,3为甜茶苷标准品，2为甜茶苷标准品碱水解，4为实施例6制备的甜茶苷碱水解。

图6是实施例6制备的甜茶苷的质谱图谱；

图7是不同浓度的β-葡萄糖苷酶CsBGL水解浓度为24％(w/v，g/mL)的甜菊苷检测图；

图中：横坐标是酶的浓度，单位：μg/mL；纵坐标是甜茶苷的收率；

图8是β-葡萄糖苷酶CsBGL水解浓度为24％(w/v，g/mL)的甜菊苷的时间曲线图；

图中：横坐标是时间，单位：分钟；纵坐标是甜茶苷的收率；

图9是β-葡萄糖苷酶CsBGL水解甜菊糖粗提物的HPLC检测图。

具体实施方式

下面结合附图和实施实例对本发明做进一步说明，但不限于此。实施例中未明确限定的均可按本领域现有技术。

生物材料：

金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)1433，2020年7月6日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.20188，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

实施例中涉及的药品及试剂盒，若无特殊说明，均为普通市售产品。

LB培养基：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，pH 7.0，121℃高压灭菌20min。

实施例1：β-葡萄糖苷酶CsBGL的粗酶液的制备

将金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)1433接种于LB无抗生素培养基中，在30℃，200rpm的条件下培养24h，然后以3000～10000rpm离心2～10min收集菌体沉淀。用pH 6.0～8.0的50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液重悬细胞，然后以3000～10000rpm离心2～10min再次收集菌体沉淀，再用10～20mL pH 6.0～8.0的50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液重悬细胞，超声波破碎细胞，以12000rpm离心20min，收集上清液即为β-葡萄糖苷酶CsBGL粗酶液。

实施例2：β-葡萄糖苷酶CsBGL粗酶液的酸性条件下的Native-PAGE电泳

将实施例1得到β-葡萄糖苷酶CsBGL粗酶液进行Native-PAGE电泳，电泳的具体参数为：正负电极倒置，用甲基绿(0.002％)示踪，4℃条件下10mA恒定电流，电泳2～3h。

酸性条件的Native-PAGE胶的配方如下：

1)分离胶：0.06M KOH，0.376M HAc，pH 4.3(7.7％胶浓度，丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺为37.5：1)；

2)堆积胶：0.06M KOH，0.063M HAc，pH 6.8(3.125％胶浓度，丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺为3:1)；

3)电泳缓冲液：0.14M L-丙氨酸，0.35M冰醋酸，pH 4.5。

用干净手术刀切下PAGE胶中的对应泳道，用pH7.4、50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液冲洗两次，将胶条浸泡于0.1％七叶苷/0.03％三氯化铁的染色液中，40℃显色5min，β-葡萄糖苷酶所在位置显示出清晰的铁锈色条带。

实施例3：β-葡萄糖苷酶CsBGL编码基因的克隆、重组载体的构建及异源表达

1、金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)1433基因组DNA的提取

将金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)1433接种于LB培养基中，在30℃，200rpm的条件下培养24h，然后以3000～10000rpm离心2～10min收集菌体沉淀。使用天根基因组DNA提取试剂盒，按照说明书步骤对收集的菌体沉淀进行DNA提取，得到金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)1433基因组DNA。

2、β-葡萄糖苷酶CsBGL氨基酸序列和编码基因核苷酸序列的鉴定

步骤1提取的金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)1433的基因组DNA进行测序。

将实施例2得到的Native-PAGE电泳活性染色条带切成1mm³大小，进行胰蛋白酶胶内酶切，并经肽谱鉴定后与测序得到的金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)1433基因组序列比对，确定β-葡萄糖苷酶CsBGL的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示，共2271bp；氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，共757个氨基酸残基。

3、β-葡萄糖苷酶CsBGL重组载体的构建

3.1引物的设计与合成

根据β-葡萄糖苷酶CsBGL的核苷酸序列信息，设计如下两条引物：

上游引物F：5’-GGGTCGCGGATCCGAACAGGAAATGGTTACAAAGCC-3’

下游引物R：5’-CGAGTGCGGCCGCAAGTTTCGTCCAGTTGATTTTTG-3’

下划线为pET-28a(+)的同源臂，质粒pET-28a(+)购自Novagen公司。

3.2、利用PCR进行基因序列扩增及产物纯化

(1)以F和R为引物，以金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)1433的基因组为模板，进行PCR扩增；

扩增体系为(总体积50μL)：

5×PCR缓冲液10μL，25mM MgSO₄ 3μL，2mM dNTP 5μL、10μmol/L引物各2μL、50μg/mL模板2μL、5U/μL KOD-Plus-Neo 1μL，超纯水25μL。

扩增程序为：

94℃预变性2分钟；反应30个循环即98℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸1.5分钟；30个循环结束后68℃延伸10分钟。

(2)对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果获得一条约2271bp的DNA片段，然后用Omega公司的DNA回收试剂盒按照其说明回收扩增出的DNA片段，得到纯化后的PCR产物。

3.3、重组载体的构建

(1)DNA片段与克隆载体连接

将纯化的PCR产物连接到Novagen公司的载体pET-28a(+)载体上，连接反应体系如下：

在30℃下消化40min，冰浴1min。

(2)将表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中

具体的步骤为：按《分子克隆实验指南》上制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态，将连接液加入50μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，静置冰浴30min；42℃热激90s；快速转至冰浴10min；加入500μL液体LB培养基，37℃水浴1h；离心后用约100μL重悬菌体涂布至含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB固体平板上，37℃过夜培养，挑取阳性单克隆菌落，提取质粒，基因测序结果与SEQ ID No.1相同。

3.4、β-葡萄糖苷酶CsBGL的异源表达

将获得的含有重组质粒的重组大肠杆菌BL21(DE3)接种于含卡那霉素LB液体培养基中，在37℃，200r/min的条件下培养至OD 600＝0.6～0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，在16℃、120r/min的条件下过夜诱导，离心收集细胞，用pH 7.4、50mMNa₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液重新悬浮菌体，并置于冰水浴中，超声波破碎细胞壁30min，再经12000r/min离心20min，上清液通过镍亲和层析纯化获得高效β-葡萄糖苷酶CsBGL。

将得到的β-葡萄糖苷酶CsBGL进行SDS-PAGE电泳，结果如图1所示。

由图1可知，β-葡萄糖苷酶CsBGL的分子量约为88kDa。

实施例4β-葡萄糖苷酶CsBGL的酶学性质分析

1、标准酶活测定

标准酶活测定体系：通过测定出释放的葡萄糖的物质的量来测定β-葡萄糖苷酶CsBGL的酶活。

具体反应体系为：足量反应底物和适量酶用50mM的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液(pH7.4)补足50μL，45℃反应5min。

对于对硝基苯酚类人工底物，加入150μL 2M Na₂CO₃溶液使反应终止，在400nm下测定释放出的对硝基苯酚，来代替对所释放的葡萄糖的测定。

对天然糖苷类及寡糖类底物，加热至95℃，保持5min以终止反应，用葡萄糖测定试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司，北京，中国)测定释放的葡萄糖。

对于蛋白质浓度，使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准品的Bradford assay法测定。

一个酶活性单位是指在测定条件下每分钟释放1μmol葡萄糖所需的酶量。

按照以上标准酶活测定体系测定β-葡萄糖苷酶CsBGL对不同糖苷底物的的水解活性，具体的β-葡萄糖苷酶CsBGL水解特异性分析，如表1所示。

表1.高效β-葡萄糖苷酶CsBGL水解特异性。

由表1可知，β-葡萄糖苷酶CsBGL只对β-1,2-葡萄糖苷键有活性；在人工硝基苯糖苷类底物中只对pNP-β-Glc有水解活性。

2、理化性质测定

2.1酶的最适pH及pH稳定性

分别用pH3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的Na₂HPO₄/Citric Acid缓冲液，pH为8.0、8.5、9.0的Tris/HCl缓冲液和pH为9.0、9.5、10.0、10.5的Gly/NaOH缓冲液测定β-葡萄糖苷酶CsBGL的酶活。

将β-葡萄糖苷酶CsBGL分别在上述不同pH的缓冲液中4℃保存12h后，在pH7.4Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液环境中测定酶活，测定结果如图2A所示。

具体酶活测定方法为：使用pNP-β-Glc做为底物，分别将Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液、8mM pNP-β-Glc和0.88μg浓度为4.4μg/mL的β-葡萄糖苷酶CsBGL溶液在冰上混合，总体积50μL，在45℃反应5min，加入50μL 2M碳酸钠溶液终止反应，在400nm吸收光处测定释放的对硝基苯的吸光值。

2.2、酶的最适反应温度及温度稳定性

将β-葡萄糖苷酶CsBGL分别在20、25、30、35、40、45、50、55℃下保温60min后，按照2.1中的方法在pH为7的条件下。测定β-葡萄糖苷酶CsBGL酶活，测定结果如图2B所示。

将β-葡萄糖苷酶CsBGL在37.5℃保温1d，2d，3d，4d，5d，6d，7d，8d，9d，10d，11d，12d，按照2.1中的方法在pH为7的条件下。测定β-葡萄糖苷酶CsBGL相对酶活，测定结果如图2C所示。

2.3、离子对酶活的影响

分别在含2mM的Ag⁺、EDTA、NH₄ ⁺、K⁺、Li⁺、Hg²⁺、Cu²⁺、Cr²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺和Zn²⁺的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液中，按照2.1中的方法测定β-葡萄糖苷酶CsBGL的相对酶活，测定结果如图2D所示。

结果表明β-葡萄糖苷酶CsBGL在以pNP-β-Glc为底物时，最适pH为7.0～7.5，最适反应温度为35℃～45℃，Ag⁺显著抑制酶活，EDTA、NH₄ ⁺、K⁺、Li⁺、Hg²⁺、Cu²⁺、Cr²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺部分抑制酶活，Co²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺及Zn²⁺对酶活无显著影响。酶水解pNP-β-Glc的K_m值为1.62mM，k_cat为16.77s^-1，k_cat/K_m为10.35(s·mM)^-1。酶水解甜菊苷的K_m值为0.53mM，k_cat为131.50s-1，k_cat/K_m为160.49(s·mM)^-1。在pH7.4的50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液中37.5℃可以保持活性9d。

实施例5β-葡萄糖苷酶CsBGL对甜菊糖系列底物的水解情况及甜茶苷的制备

1、甜茶苷的制备分别用50mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液(pH 7.4)配制10mM莱鲍迪苷A、10mM甜菊苷、10mM甜茶苷，24％(w/v，g/mL)甜菊苷作为水解底物，然后再分别加入0.22μg浓度为4.4μg/mL的β-葡萄糖苷酶CsBGL溶液，45℃反应10min，得到甜茶苷。

甜茶苷碱水解：将制备的甜茶苷溶于1N KOH和甲醇(85:15,v/v)，加热到85℃保温20min，用盐酸将pH调至中性后进行TLC检测。

β-葡萄糖苷酶CsBGL水解莱鲍迪苷A、甜菊苷和甜茶苷的TLC检测图，如图3所示；β-葡萄糖苷酶CsBGL水解莱鲍迪苷A、甜菊苷和甜茶苷的HPLC检测图，如图4所示。

由图3和图4可知，β-葡萄糖苷酶CsBGL对甜菊苷转化率达100％，甜茶苷的收率为100％，莱鲍迪苷A和甜茶苷无水解。

本实施例制备的甜茶苷的碱水解TLC检测图，如图5所示；本实施例制备的甜茶苷的质谱图谱，如图6所示；

由图5和图6可知，本实施例的水解产物为甜茶苷。

2、在50μL 24％(w/v，g/mL)甜菊苷中分别加入浓度为40、80、160、320或640μg/mL的β-葡萄糖苷酶CsBGL，在40℃下反应320min，使用HPLC检测水解情况，检测结果如图7所示。

由图7可知，当酶浓度为80μg/mL时，甜菊苷接近完全水解。

在50μL 24％(w/v，g/mL)甜菊苷中加入浓度为80μg/mL的β-葡萄糖苷酶CsBGL，在40℃下反应10、20、40、80、160或320min，99℃保持5min灭活，使用HPLC检测水解情况，检测结果如图8所示。

由图8可知，80％以上的甜菊苷在前160min被水解。

在1L 50％(w/v，g/mL)甜菊糖苷粗提物中加入浓度为300μg/mLβ-葡萄糖苷酶CsBGL，在40℃、200rpm下，反应3h，使用HPLC检测水解情况，检测结果如图9所示。

由图9可知，甜菊苷转化率达100％，甜茶苷的收率为100％。

甜菊苷转化率计算公式为：a＝[(C₀-C_t)/C₀]×100％

其中，a表示甜菊苷转化率，C₀表示溶液未反应时甜菊苷的浓度，C_t表示t时刻反应液中甜菊苷的浓度。C₀与C_t均通过标准曲线法进行计算。

甜茶苷收率计算公式为：b＝(C_m/C_n)×100％

其中，b表示甜茶苷的收率，C_m表示反应结束时甜茶苷的浓度，C_n表示理论上可以生成的甜茶苷的浓度。C_m通过标准曲线法进行计算。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一种高效β-葡萄糖苷酶CsBGL及其编码基因与应用

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2274

<212> DNA

<213> β-葡萄糖苷酶CsBGL

<400> 1

caggaaatgg ttacaaagcc ggttcagtct tatcagaccg gacaatatca atcaaagaaa 60

aaggcttttg ttgatgctct tttagctaaa atgaccttag atgaaaaaat cggacagctt 120

aatttaccga cttcgggaga ttttacaaca ggtcaggctc aaagttcaga catcggaaaa 180

aaagtagagc aaggtttagt tggtggatta ttcaacatca aaggagccga taaaattaaa 240

gcagttcaaa aagtagctgt tgaaaaaagc cgtctaaaaa ttccaatgat ttttgggatg 300

gatgtcattc atggatacga aactactttc cctattccat taggtttagc agcttcttgg 360

gatatgaatt tggtacagca gtcagcaagg gttgcagcaa aagaagcagc ttctgatgga 420

atcaactgga cgttctcgcc aatggtagat atttctcgtg aaccaagatg gggaagagtt 480

tctgaaggtt ctggtgaaga tccgtatttg ggaagtgaaa ttgctaaaaa tatggtctac 540

ggttatcagg gaaaagactt ggcaaacgga actaacattt tggcttgtgt aaaacatttt 600

gcgttatatg gagcaggtga agcgggtaga gattacaata cggttgatat gagtcatgtg 660

agaatgttca acgaatattt tccaccttat aaagcagcag ttgatgcggg agtaacttct 720

gtgatggctt cttttaatga agttgatgga gttccggcaa cgggaagcag atggcttcag 780

acggaggttt tgagaaatca atggaaattt aaaggttttg tggtgaccga ttataccgga 840

atcaacgaaa tggtagaaca cggaatggga gatcttcagc aggtttctgc tttagcttta 900

aaagccggtg ttgatatgga tatggttggt gaaggattct taaccacttt aaaaaaatct 960

ttagctgaag gaaaagtaac acaggctgaa atcgatatgg cagcgagaag aattcttgaa 1020

gctaaatatg atttaggttt attcgataat ccttacaagc acggtgatgc aaaattagcg 1080

gctaaagaag tttataattt agaaaaccgt aatatcgcaa gaagtgctgc agcgcagtca 1140

atggttttga tgaaaaatga aaaccaggtt ttacctttga aaaaatcagg aactgttgca 1200

gtaatcggcc cattggtaaa caattcgctt aacatggcgg gaacttggag tgtcgctaca 1260

aaacacgcaa tttctgttaa cttaatgcag ggtcttcagg ctaattatgg gaaagatgtg 1320

aaatttcttt ctgcaaaagg agctaacatt gattacgatg ccaaattaga agatatttat 1380

gcagctcacg gtaagaaaac cgacagagac aaccgttcaa aagaagcctt attaaaagaa 1440

gcagttgata tagcgaataa agctgacgtt attgttttgg caataggaga gtctgcagaa 1500

atgagtggag aatcttcttc aagaactgaa attacaattc ctcaatccca ggttgactta 1560

ttgaatgaat tgaaaaaaac aggaaaacca atcgcaatgg tacttttcac aggtcgtcct 1620

ttagcattaa ctaatgtaaa agatgctcct gatgctattt tgaatgcttg gtttgcgggt 1680

tcagaggctg gaaatgcaat tgccgatgta cttttcggta aagtaaatcc ttcaggaaaa 1740

ttgccgatga cattcccgag aagtcttggt caggttccta tttattataa tgctaaaaat 1800

acgggtcgtc ctttagctca ggataaagta gataaatgtg tttacgaaag attccgttct 1860

aattatatgg atgagtgtaa tacgccattg tatccatttg gatatggatt gagttattct 1920

aaattcaatt attctgatgt aacggtttct aatgcaaatc caaaaggaaa tcaatcaatc 1980

caggcttcag ttactgtaac aaattctgga aattatgatg gcgcagaagt cgttcagcta 2040

tacatcagag atatggtggg aagcatcaca agacctgtaa aagaattaaa aggattccaa 2100

aaagtaatgt tgaaaaaagg agagtctaaa aaggttactt tcgacatcac tccagaaagc 2160

ctgaaatttt acaacggaga tttgaaatac gattgggaag ctggagaatt tgatatcatg 2220

attggtacaa actctgaaga ggtgaaacat tcaaaaatca actggacgaa ataa 2274

<210> 2

<211> 757

<212> PRT

<213> β-葡萄糖苷酶CsBGL

<400> 2

Gln Glu Met Val Thr Lys Pro Val Gln Ser Tyr Gln Thr Gly Gln Tyr

1 5 10 15

Gln Ser Lys Lys Lys Ala Phe Val Asp Ala Leu Leu Ala Lys Met Thr

20 25 30

Leu Asp Glu Lys Ile Gly Gln Leu Asn Leu Pro Thr Ser Gly Asp Phe

35 40 45

Thr Thr Gly Gln Ala Gln Ser Ser Asp Ile Gly Lys Lys Val Glu Gln

50 55 60

Gly Leu Val Gly Gly Leu Phe Asn Ile Lys Gly Ala Asp Lys Ile Lys

65 70 75 80

Ala Val Gln Lys Val Ala Val Glu Lys Ser Arg Leu Lys Ile Pro Met

85 90 95

Ile Phe Gly Met Asp Val Ile His Gly Tyr Glu Thr Thr Phe Pro Ile

100 105 110

Pro Leu Gly Leu Ala Ala Ser Trp Asp Met Asn Leu Val Gln Gln Ser

115 120 125

Ala Arg Val Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ser Asp Gly Ile Asn Trp Thr

130 135 140

Phe Ser Pro Met Val Asp Ile Ser Arg Glu Pro Arg Trp Gly Arg Val

145 150 155 160

Ser Glu Gly Ser Gly Glu Asp Pro Tyr Leu Gly Ser Glu Ile Ala Lys

165 170 175

Asn Met Val Tyr Gly Tyr Gln Gly Lys Asp Leu Ala Asn Gly Thr Asn

180 185 190

Ile Leu Ala Cys Val Lys His Phe Ala Leu Tyr Gly Ala Gly Glu Ala

195 200 205

Gly Arg Asp Tyr Asn Thr Val Asp Met Ser His Val Arg Met Phe Asn

210 215 220

Glu Tyr Phe Pro Pro Tyr Lys Ala Ala Val Asp Ala Gly Val Thr Ser

225 230 235 240

Val Met Ala Ser Phe Asn Glu Val Asp Gly Val Pro Ala Thr Gly Ser

245 250 255

Arg Trp Leu Gln Thr Glu Val Leu Arg Asn Gln Trp Lys Phe Lys Gly

260 265 270

Phe Val Val Thr Asp Tyr Thr Gly Ile Asn Glu Met Val Glu His Gly

275 280 285

Met Gly Asp Leu Gln Gln Val Ser Ala Leu Ala Leu Lys Ala Gly Val

290 295 300

Asp Met Asp Met Val Gly Glu Gly Phe Leu Thr Thr Leu Lys Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ala Glu Gly Lys Val Thr Gln Ala Glu Ile Asp Met Ala Ala Arg

325 330 335

Arg Ile Leu Glu Ala Lys Tyr Asp Leu Gly Leu Phe Asp Asn Pro Tyr

340 345 350

Lys His Gly Asp Ala Lys Leu Ala Ala Lys Glu Val Tyr Asn Leu Glu

355 360 365

Asn Arg Asn Ile Ala Arg Ser Ala Ala Ala Gln Ser Met Val Leu Met

370 375 380

Lys Asn Glu Asn Gln Val Leu Pro Leu Lys Lys Ser Gly Thr Val Ala

385 390 395 400

Val Ile Gly Pro Leu Val Asn Asn Ser Leu Asn Met Ala Gly Thr Trp

405 410 415

Ser Val Ala Thr Lys His Ala Ile Ser Val Asn Leu Met Gln Gly Leu

420 425 430

Gln Ala Asn Tyr Gly Lys Asp Val Lys Phe Leu Ser Ala Lys Gly Ala

435 440 445

Asn Ile Asp Tyr Asp Ala Lys Leu Glu Asp Ile Tyr Ala Ala His Gly

450 455 460

Lys Lys Thr Asp Arg Asp Asn Arg Ser Lys Glu Ala Leu Leu Lys Glu

465 470 475 480

Ala Val Asp Ile Ala Asn Lys Ala Asp Val Ile Val Leu Ala Ile Gly

485 490 495

Glu Ser Ala Glu Met Ser Gly Glu Ser Ser Ser Arg Thr Glu Ile Thr

500 505 510

Ile Pro Gln Ser Gln Val Asp Leu Leu Asn Glu Leu Lys Lys Thr Gly

515 520 525

Lys Pro Ile Ala Met Val Leu Phe Thr Gly Arg Pro Leu Ala Leu Thr

530 535 540

Asn Val Lys Asp Ala Pro Asp Ala Ile Leu Asn Ala Trp Phe Ala Gly

545 550 555 560

Ser Glu Ala Gly Asn Ala Ile Ala Asp Val Leu Phe Gly Lys Val Asn

565 570 575

Pro Ser Gly Lys Leu Pro Met Thr Phe Pro Arg Ser Leu Gly Gln Val

580 585 590

Pro Ile Tyr Tyr Asn Ala Lys Asn Thr Gly Arg Pro Leu Ala Gln Asp

595 600 605

Lys Val Asp Lys Cys Val Tyr Glu Arg Phe Arg Ser Asn Tyr Met Asp

610 615 620

Glu Cys Asn Thr Pro Leu Tyr Pro Phe Gly Tyr Gly Leu Ser Tyr Ser

625 630 635 640

Lys Phe Asn Tyr Ser Asp Val Thr Val Ser Asn Ala Asn Pro Lys Gly

645 650 655

Asn Gln Ser Ile Gln Ala Ser Val Thr Val Thr Asn Ser Gly Asn Tyr

660 665 670

Asp Gly Ala Glu Val Val Gln Leu Tyr Ile Arg Asp Met Val Gly Ser

675 680 685

Ile Thr Arg Pro Val Lys Glu Leu Lys Gly Phe Gln Lys Val Met Leu

690 695 700

Lys Lys Gly Glu Ser Lys Lys Val Thr Phe Asp Ile Thr Pro Glu Ser

705 710 715 720

Leu Lys Phe Tyr Asn Gly Asp Leu Lys Tyr Asp Trp Glu Ala Gly Glu

725 730 735

Phe Asp Ile Met Ile Gly Thr Asn Ser Glu Glu Val Lys His Ser Lys

740 745 750

Ile Asn Trp Thr Lys

755

Claims

1.一种利用β-葡萄糖苷酶CsBGL制备甜茶苷的方法，其特征在于，在1L 50%（w/v，g/mL）甜菊糖苷粗提物中加入浓度为300 μg/mLβ-葡萄糖苷酶CsBGL，在40℃、200 rpm下，反应3h；

所述β-葡萄糖苷酶CsBGL的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述β-葡萄糖苷酶CsBGL来源于金黄杆菌 (Chryseobacteriumsp.) 1433，所述金黄杆菌 (Chryseobacteriumsp.)1433于2020年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.20188，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶CsBGL对甜菊苷的转化率为100％，转化后得到的甜茶苷的收率为100％。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶CsBGL的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。