CN116144632B - 一种茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents
一种茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白及其制备方法和应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明所述制备方法，包括：采用BamHⅠ对pMAL‑C2X质粒进行单酶切反应，将得到的载体片段与CsINV2基因连接，得到重组质粒pMAL‑C2X‑CsINV2，转化到表达菌株中，获得重组菌株；将所述重组菌株经培养后得到的菌液破碎、离心，得到上清粗蛋白，用过柱法纯化所述上清粗蛋白，得到茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白。采用本发明的方法能够克服中性/碱性转化酶因蛋白不稳定和很难纯化的问题，为工业化生产葡萄糖和果糖提供强有力的技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程技术领域，尤其涉及一种茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
转化酶(invertase,INV)作为一类蔗糖水解酶，能不可逆将蔗糖水解为葡萄糖和果糖。根据不同生化活性及最佳pH不同，INV可进一步分为酸性转化酶和中性/碱性转化酶两类。前期大量研究已证明，中性/碱性转化酶在植物碳分配、能量代谢、细胞分化、组织发育和逆境胁迫响应等方面具有重要作用。此外，转化酶作为蔗糖水解酶，其具备专一性、无副反应、反应效率高且反应条件容易控制、工业生产费用低和用量少等优点，其在葡萄糖和果糖的工业化生产中具有重要的应用潜力和经济价值。其中，中性/碱性转化酶亚家族基因数量比酸性转化酶亚家族基因数量要多，说明其在调控植物碳水化物代谢方面发挥着重要作用。
然而，中性/碱性转化酶因蛋白不稳定和很难纯化，使得目前对中性/碱性转化酶的应用研究较少。因此，亟需克服中性/碱性转化酶因蛋白不稳定和很难纯化的问题，为工业化生产葡萄糖和果糖提供强有力的技术支撑。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白及其制备方法和应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白，所述茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述。
本发明还提供了上述CsINV2蛋白的制备方法，包括以下步骤：采用BamHⅠ对pMAL-C2X质粒进行单酶切反应，将得到的载体片段与CsINV2基因连接，得到重组质粒pMAL-C2X-CsINV2，转化到表达菌株中，获得重组菌株；将所述重组菌株经培养后得到的菌液破碎、离心，得到上清粗蛋白，用过柱法纯化所述上清粗蛋白，得到茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白；所述CsINV2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述CsINV2基因的获得包括：设计BamHⅠ酶切位点的上下游引物，以pEASY-CsINV2质粒为模板进行PCR扩增，获得所述CsINV2基因。
优选的，所述BamHⅠ酶切位点的上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ ID NO.4所示。
优选的，所述表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。
优选的，所述菌液的OD600为0.5-0.7。
优选的，所述过柱法纯化蛋白的填料为直链淀粉树脂，洗脱液为麦芽糖上样缓冲液；所述麦芽糖上样缓冲液包括以下浓度的组分：NaCl 10-12g/L，EDTA0.35-0.40g/L，Tris2.40-2.45g/L，DTT 0.152-0.158g/L，麦芽糖3-4g/L。
本发明还提供了上述CsINV2蛋白在制备葡萄糖和果糖中的应用。
优选的，所述CsINV2蛋白能酶解蔗糖。
优选的，所述CsINV2蛋白的酶解温度为40-50℃，pH值为7.5-8.5，Km值为139.52mmol/L。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白的制备方法，包括：采用BamHⅠ对pMAL-C2X质粒进行单酶切反应，将得到的载体片段与CsINV2基因连接，得到重组质粒pMAL-C2X-CsINV2，转化到表达菌株中，获得重组菌株；将所述重组菌株经培养后得到的菌液破碎、离心，得到上清粗蛋白，用过柱法纯化所述上清粗蛋白，得到茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白；所述CsINV2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。采用本发明的方法能够克服中性/碱性转化酶因蛋白不稳定和很难纯化的问题，为工业化生产葡萄糖和果糖提供强有力的技术支撑。
附图说明
图1为茶树中性/碱性转化酶CsINV2基因PCR扩增结果；
图2为茶树中性/碱性转化酶CsINV2原核表达载体构建凝胶图；其中A为pMAL空载单酶切凝胶图，B为CsINV2基因ORF扩增凝胶图，C为pMAL-C2X-CsINV2重组载体菌液PCR跑胶图；
图3为实施例2茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白纯化结果；
图4为对比例1茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白纯化结果；
图5为茶树中性/碱性转化酶CsINV2基因外显子和内含子结构；
图6为茶树中性/碱性转化酶CsINV2基因染色体定位；
图7为茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白的蔗糖水解活性；
图8为茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白酶活最佳温度和pH；
图9为茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白的米氏方程。
具体实施方式
本发明提供了本发明还提供了一种茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白，所述茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明中，所述CsINV2蛋白的分子质量为76.54kDa，理论等电点(pI)为7.77，无信号肽和跨膜结构域，二级结构由26.67％的α-螺旋，22.07％的β-折叠和51.26％的无规则卷曲构成。
一种茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白的制备方法，包括以下步骤：采用BamHⅠ对pMAL-C2X质粒进行单酶切反应，将得到的载体片段与CsINV2基因连接，得到重组质粒pMAL-C2X-CsINV2，转化到表达菌株中，获得重组菌株；将所述重组菌株经培养后得到的菌液破碎、离心，得到上清粗蛋白，用过柱法纯化所述上清粗蛋白，得到茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白；所述CsINV2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明采用pMAL-C2X质粒，相对于其他质粒，所述pMAL-C2X质粒上具有tac启动子和MBP标签，其中tac启动子可以有效的促进MBP标签及目的基因的转录和翻译，以获得更多的目的蛋白；MBP标签则可以与纯化柱内的填料结合，方便过柱法进行纯化。本发明得到的pMAL-C2X-CsINV2重组质粒，在进行诱导蛋白的时候，不易产生包涵体，不会影响后续过柱法的纯化过程。
在本发明中，所述CsINV2基因的获得优选包括：设计BamHⅠ酶切位点的上下游引物，以pEASY-CsINV2质粒为模板进行PCR扩增，获得所述CsINV2基因。所述BamHⅠ酶切位点的上游引物为5’-GAAGGATTTCAGAATTCGGATCCATGAATACTTGTAGCTGTAT-3’(如SEQ ID NO.3所示)和下游引物为5’-CTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCTTAA ATGTGAATCTGTGATT-3’(如SEQ IDNO.4所示)。
本发明所述CsINV2基因定位于茶树基因组9号染色体，DNA结构上包含8个外显子和7个内含子，ORF全长为2028bp，编码675个氨基酸，理论等电点为7.47，分子量为76.5kD，亚细胞预测定位于线粒体。
在进行单酶切反应后，优选采用GBclonrt无缝克隆技术连接CsINV2基因和载体片段，得到重组质粒pMAL-C2X-CsINV2。所述连接的温度优选为40-50℃，更优选为45℃，时间优选为25-35min，更优选为30min。将得到的重组质粒pMAL-C2X-CsINV2转化表达菌株中，获得重组菌株，所述表达菌株优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明在获得重组菌株后，对获得的重组菌株进行种子培养。将所述重组菌株进行活化，接种于LB发酵培养基中进行诱导发酵培养获得大量重组菌株。
在本发明中，所述发酵培养基中优选含有40～60μg/mL氨苄青霉素，更优选为50μg/mL；本发明中当所述发酵培养液的OD600优选在0.5-0.7时，加入90-110μL的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导培养。在本发明中所述IPTG溶度优选的为100～140mg/mL，更优选的为120mg/mL，在本发明中所述IPTG诱导培养的温度优选的为25～30℃，更优选的为28℃；所述IPTG诱导培养的转速优选为180～230rpm，更优选的为200rpm；所述IPTG诱导培养的时间优选为14～16h，更优选的为15h。本发明在所述IPTG诱导培养结束后获得大量表达茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白的重组菌株。
本发明所述过柱法纯化蛋白的方法没有特殊限定，采用本领域常规方法即可。作为一种可实施方式，本发明过柱法纯化蛋白的方法步骤包括：(1)倒入50mL蒸馏水于纯化柱中，清洗纯化柱内的20％乙醇，等柱子中的蒸馏水剩余10mL的时候，继续倒入50mL上样缓冲液(如表1所示)，清洗蒸馏水并创造柱内缓冲液环境；(2)将获得的粗蛋白上清倒入纯化柱内(MBP标签可以与纯化柱内的填料直链淀粉树脂结合，而不被上样缓冲液清洗掉)，等纯化柱内的蛋白上清剩余10mL的时候，倒入50mL上样缓冲液清洗掉纯化柱内的杂蛋白；(3)倒入50mL 3.6g/L麦芽糖上样缓冲液(在表1上样缓冲液中加入麦芽糖)，洗脱纯化柱内的目的蛋白(MBP标签可以被麦芽糖缓冲液洗脱)，最终获得纯化后的目的蛋白上清。
本发明还提供了上述CsINV2蛋白在制备葡萄糖和果糖中的应用。本发明中，所述CsINV2蛋白能特异将蔗糖水解为葡萄糖和果糖。
在本发明中，所述CsINV2蛋白能酶解蔗糖；所述CsINV2蛋白的酶解温度优选为40-50℃，更优选为45℃，pH值优选为7.5-8.5，更优选为8.0；Km值优选为139.52mmol/L。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
茶树中性/碱性转化酶CsINV2基因克隆
1、RNA提取
以茶树品种‘舒茶早’的成熟叶为材料，利用RNA提取试剂盒(Biospin多糖多酚植物总RNA提取试剂盒)进行RNA提取。
(1)液氮研磨‘舒茶早’的成熟叶至粉末状，并称取50-100mg茶叶粉末放入装有500μLAG Lysis的2mL离心管中，立即剧烈振荡至无明显颗粒物；
(2)在12000rpm离心5min，小心吸取上清液至一个新的RNase-Free的1.5mL离心管中，估计吸取上清体积并加入0.5倍的无水乙醇，立即振荡混匀；
(3)将上述混合物全部吸入Spin column中，12000rpm离心1min后，倒掉接液管中的液体；
(4)向Spin column中加入500μL Wash Buffer，12000rpm离心30s，倒掉接液管中的液体(重复此步骤一次)；
(5)将空柱于12000rpm离心1min后，将Spin column移入新的1.5mL RNase-Free离心管中，在过滤膜中央加入RElution Buffer 50-100μL，室温静置2min，12000rpm离心1min，获得总RNA。
2、获得cDNA
利用cDNA反转录试剂盒(III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)，南京诺唯赞)获得茶树品种‘舒茶早’的cDNA。
(1)基因组DNA去除反应：在RNase-free离心管中加入4μL的4×gDNA wiper Mix和1μg的Total RNA，最后用RNase-free dd H2O补齐16μL。混匀后42℃反应2min。
(2)RNA逆转录反应：在上述反应液中加入4μL的5×HiScript III qRTSuperMixa，混匀后进行逆转录反应，37℃反应15min，85℃反应5s，即完成逆转录反应，获得cDNA。
3、引物设计和合成
根据CsINV2基因序列(GB:KF718860.1)设计上游引物：5’-ATGAATACTTGTAGCTGT-3’(如SEQ ID NO.5所示)和下游引物：5’-TTAAATGTGAATCTGTGA-3’(如SEQ ID NO.6所示)。
4、PCR扩增
利用(2×Flash MasterMix,南京诺唯赞)试剂盒，以第2步获得的茶树品种‘舒茶早’cDNA为模板，依照第3步的引物进行目的基因扩增，并将PCR扩增获得产物进行电泳凝胶验证。
(1)在200μL离心管中加入25μL的2×Phanta Flash Master Mix、上游引物2μL、下游引物2μL和2μL的‘舒茶早’cDNA模板，最后加入19μL无菌水(dd H2O)补齐50μL反应体系。
(2)在Fast Gradient Thermal CyclerPCRA300型PCR仪上98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸10s，共35个循环；之后72℃后延伸1min，最后12℃保存。
(3)将上述PCR扩增获得的产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，最终获得大小约为2000bp左右的单一条带(图1所示)，并在蓝光灯下切胶回收，冻存于-20℃备用。
5、获得目的基因回收产物
(1)将上述切胶获得的琼脂糖凝胶进行称重，计算凝胶重量。重量与体积的换算关系。(100mg＝100μL)
(2)加入3倍体积的Buffer DE-A,混合均匀之后55℃加热5-10min(直到胶块完全融化)。
(3)加入1.5倍体积的Buffer DE-B的混合均匀，当分离的DNA片段小于400bp时，需要加入相同凝胶体积的异丙醇。
(4)将(3)中的混合液转移至2mL DNA制备管中(试剂盒提供)，接着12000rpm离心1min，弃滤液。
(5)向制备管中加入500μL Buffer W1，12000rpm离心30s，弃滤液。
(6)向制备管中加入700μLBuffer W2，12000rpm离心30s,弃滤液，重复一次此步骤。再将空制备管12000rpm离心1min。
(8)将制备管置于干净的1.5mL离心管中(试剂盒提供)，在制备膜中央加入25-30μL Eluent或者去离子水。于室温静置1min后12000g离心1min，获得目的基因回收产物。
6、TA克隆和测序
取1μL平末端-Blunt Zero Cloning Kit(北京全式金)与4μL第4步获得的回收产物进行连接，得到pEASY-CsINV2质粒，并转化至Trans5αChemically CompetentCell(北京全式金)感受态中进行阳性筛选，过夜培养后，利用2×Rapid Taq Master Mix试剂盒(南京诺唯赞)依照如下步骤进行阳性单克隆PCR验证：
(1)挑取培养板上的单克隆菌落进行扩摇培养3-5h，获得单克隆菌液。
(2)配置25μL的PCR反应体系：12.5μL的2×Rapid Taq Master Mix酶液、上游引物1.5μL、下游引物1.5μL和3μL的单克隆菌液和6.5μL的ddH2O。
(3)在Fast Gradient Thermal Cycler PCR A300型PCR仪上95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，共31个循环；最后12℃保存。
(4)将上述PCR扩增获得产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并在蓝光灯下观察是否为CsINV2基因条带大小。
选取4、5和6条带清晰且大小正确则送到生工生物技术有限公司进行基因测序，经过检测，得到的茶树中性/碱性转化酶CsINV2基因如SEQ ID NO:1所示。经过对比CsINV2基因序列(GB:KF718860.1)发现，与本发明茶树中性/碱性转化酶CsINV2基因存在差异，可能由于茶树种类的不同所导致。
将最终获得的pEASY-CsINV2质粒保存保存于-20℃待用。
实施例2
茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白的制备和纯化
1、载体构建
利用单酶切方法，设计带有BamHⅠ酶切位点的上游引物5’-GAAGGATTTCAGAATTCGGATCCATGAATACTTGTAGCTGTAT-3’(如SEQ ID NO.3所示)和下游引物5’-CTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCTTAAATGTGAATCTGTGATT-3’(如SEQ ID NO.4所示)，以实施例1获得的pEASY-CsINV2质粒为模板进行PCR扩增获得目的基因片段并纯化回收。
采用BamHⅠ对pMAL-C2X质粒进行单酶切反应，采用GBclonrt无缝克隆技术连接目的基因和载体片段，45℃水浴连接30min。将连接产物全部转化进DH5α大肠杆菌感受态细胞内，涂布于含有氨苄霉素抗性的LB培养板上，37℃倒置培养过夜至单菌落长出，挑取单菌落扩大培养后进行菌液PCR鉴定，将检测到的阳性菌落送上海生工生物工程有限公司进行测序。测序结果经过序列比对正确以后，提取正确的pMAL-C2X-CsINV2质粒，并再次转化进BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，保菌于-80℃冰箱中待用。
pMAL-C2X空载单酶切，以实施例1的方法利用带有BamHⅠ酶切位点的引物扩增获得带有pAML-C2X接头的CsINV2基因序列及pMAL-C2X-CsINV2重组载体菌液PCR跑胶图如图2所示。
由图2A可知，本发明成功将pMAL-C2X环型质粒线性化(线性化质粒在未酶切质粒靠下位置)；图2B可知，利用带有BamHⅠ酶切位点的引物成功扩增获得带有pMAL-C2X质粒接头的CsINV2基因序列；图2C可知，将线性化pMAL-C2X质粒和带有pMAL-C2X接头的目的基因序列进行连接、转化并菌液PCR验证成功。
2、蛋白纯化
取-80℃冰箱中保存的含有pMAL-C2X-CsINV2质粒的BL21(DE3)菌液进行活化，取1mL活化后的菌液于含有50μg/mL氨苄霉素抗性的100mL LB培养液中扩摇至OD600为0.6左右，加入100μL IPTG于28℃摇床200rpm培养16-18h诱导细胞产蛋白。菌液收集离心后用pH为7.5-8.0之间的上样缓冲液重悬菌体，之后利用超声破碎仪器破碎细胞(20-30min)，5500rpm离心10min，获得上清粗蛋白。
利用过柱法(MBP标签)纯化目的蛋白：
(1)倒入50mL蒸馏水于纯化柱中，清洗纯化柱内的20％乙醇，等柱子中的蒸馏水剩余10mL时，继续倒入50mL上样缓冲液，清洗蒸馏水并创造柱内缓冲液环境；
表1上样缓冲液(1L)配置
(2)将获得的粗蛋白上清倒入纯化柱内(MBP标签可以与纯化柱内的填料直链淀粉树脂Amylose Resin结合，而不被上样缓冲液清洗掉)，等纯化柱内的蛋白上清剩余10mL的时候，倒入50mL上样缓冲液清洗掉纯化柱内的杂蛋白；
(3)倒入50mL 3.6g/L的麦芽糖上样缓冲液(在表1上样缓冲液中加入麦芽糖)，洗脱纯化柱内的目的蛋白(MBP标签可以被麦芽糖缓冲液洗脱)，最终获得纯化后的目的蛋白上清，并浓缩至300μL，获得纯化蛋白。最后，将获得的纯化蛋白、粗蛋白和MBP蛋白进行SDS聚丙烯酰胺电泳跑胶，具体结果如图3所示。由图3可知，CsINV2蛋白大小为76kDa左右。
图3的蛋白胶图证明，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，本发明已经分离出纯度很高的CsINV2蛋白。本发明通过调节蛋白诱导时间(16-18h)、上样缓冲液的pH(7.5-8.0)和超声细胞破碎仪器的工作时间(20-30min)，控制了CsINV2蛋白的稳定性，使其具有较高的酶活性。
对比例1
具体实施方式和实施例2相同，不同的是将“pMAL-C2X质粒”替换为“PRSFD质粒”。对得到的纯化蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，具体结果如图4所示。
由图4可知，最右侧(+纯化)为利用过柱法纯化后的结果，发现没有任何纯化效果，可见，采用PRSFD质粒制备并纯化得到的蛋白，存在包涵体情况，采用过柱法进行纯化，并不能获得纯度较高的目的蛋白。因此，采用pMAL-C2X质粒相对于PRSFD质粒，更有利于进行蛋白诱导和纯化。
实施例3
茶树中性/碱性转化酶CsINV2的生物信息学分析
经上述克隆和测序，利用ORF finder网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)检索CsINV2的开放阅读框(ORF)与氨基酸长度，使用ProtParam工具(http://web.expasy.org/protparam/)计算CsINV2的分子量和理论等电点(pI)，利用SignalP-3.0工具(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-3.0)预测蛋白信号肽，利用TMHMM-2.0工具(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0)预测蛋白跨膜结构域，利用Jpred4工具(http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred4/index_up.htmL)预测蛋白二级结构，利用TargetP-2.0工具(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php？TargetP-2.0)预测其亚细胞定位。
结果发现，茶树中性/碱性转化酶CsINV2的ORF长度为2028bp，编码675个氨基酸组成的蛋白质，茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白质分子质量为76.54kDa，理论等电点(pI)为7.77，无信号肽和跨膜结构域。另外，茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白二级结构由26.67％的α-螺旋，22.07％的β-折叠和51.26％的无规则卷曲构成。
利用TBtools软件分析茶树中性/碱性转化酶CsINV2的DNA结构发现，该基因包含8个外显子和7个内含子如图5所示。
利用TBtools软件分析CsINV2基因的染色体定位发现，该基因定位于茶树基因组第9号染色体上如图6所示。亚细胞预测定位于线粒体。
实施例4
茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白蔗糖水解
1、茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白对蔗糖的定性分析
配置10％的蔗糖底物5mL，利用二硝基水杨酸(Dinitrosalicylic acid,DNS)显色反应验证获得的目的蛋白是否具有降解蔗糖的功能。
反应体系分别为：1、蔗糖500μL+水500μL；2、蔗糖500μL+PMAL空载蛋白500μL；3、葡萄糖500μL+水500μL；4、果糖500μL+水500μL；5、蔗糖500μL，实施例2得到的茶树中性/碱性转化酶CsINV2纯化蛋白500μL。其中，蔗糖为非还原性糖，葡萄糖和果糖为还原性糖。配置完成后，进行40oC水浴30min，之后100oC灭活5min，待冷却后加入100μL的DNS煮沸10min进行显色反应，结果如图7所示。
由图7可知，茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白能将蔗糖水解为葡萄糖和果糖。
2、茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白最佳温度和pH测定
分别配置pH为4、5、6、7、7.5、8、9、10的上样缓冲液重悬离心后的菌体，之后进行超声破碎获得不同pH下的茶树中性/碱性转化酶CsINV2纯化蛋白，以进行最适pH测定。
分别在10℃、20℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃、70℃水浴下进行最适温度测定。具体结果如图8所示。
由图8可知，茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白酶活最佳pH为8.0，最佳反应温度为45℃。
3、茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白酶动力参数Km值测定
配置5.6mmol/L的葡萄糖溶液，分别取20μL、50μL、70μL、100μL和150μL与DNS进行充分显色反应，并测定出在OD520下的吸光值，从而制作出不同Glc物质的量下的DNS显色反应标准曲线。
配置0.3mol/L蔗糖溶液，分别取20μL、50μL、70μL、100μL、150μL、200μL和300μL在最适温度和最适pH下与实施例2得到的茶树中性/碱性转化酶CsINV2重组纯化蛋白反应15min后迅速置于100℃水浴中煮沸5min，待冷却后进行DNS显色反应，并在OD520下测定吸光值。利用双倒数法绘图，得出相应米氏方程，计算酶动力参数Km值。具体结果如图9所示。
由图9所示，茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白的Km值为139.52mmol/L，最大反应速率为106.63nmol/min。
本发明对CsINV2蛋白的纯化、活性等进行了全面的研究，明确了CsINV2蛋白水解蔗糖的最佳反应体系，包括最佳温度、pH及Km值，这为CsINV2蛋白的潜在应用提供了技术支撑。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
采用BamHⅠ对pMAL-C2X质粒进行单酶切反应，将得到的载体片段与CsINV2基因连接，得到重组质粒pMAL-C2X-CsINV2，转化到表达菌株中，获得重组菌株；
将所述重组菌株培养后得到的菌液破碎、离心，得到上清粗蛋白，用过柱法纯化所述上清粗蛋白，得到茶树中性/碱性转化酶CsINV2蛋白；
所述CsINV2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述CsINV2基因的获得包括：设计BamHⅠ酶切位点的上下游引物，以pEASY-CsINV2质粒为模板进行PCR扩增，获得所述CsINV2基因。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述BamHⅠ酶切位点的上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述菌液的OD600为0.5-0.7。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述过柱法纯化蛋白的填料为直链淀粉树脂，洗脱液为麦芽糖上样缓冲液；所述麦芽糖上样缓冲液包括以下浓度的组分：NaCl10-12g/L，EDTA 0.35-0.40g/L，Tris 2.40-2.45g/L，DTT 0.152-0.158g/L，麦芽糖3-4g/L。
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