CN111088183B

CN111088183B - 一种海洋弧菌及其在制备热稳定特性的ι-卡拉胶酶中的应用

Info

Publication number: CN111088183B
Application number: CN201911374849.4A
Authority: CN
Inventors: 李尚勇
Original assignee: Qingdao University
Current assignee: Qingdao University
Priority date: 2018-12-26
Filing date: 2018-12-26
Publication date: 2021-07-13
Anticipated expiration: 2038-12-26
Also published as: CN109735520A; CN109735520B; CN111088183A

Abstract

本发明涉及一种海洋弧菌及其在制备热稳定特性的ι‑卡拉胶酶中的应用，海洋细菌Vibrio sp.SY08，菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC No：M2018769，保藏日期2018年11月27日，保藏地址中国武汉市武汉大学。本发明所述的ι‑卡拉胶酶为重组表达工程菌株纯化所得，具有热稳定特性，在40℃的活性半衰期长达6.5h，30℃的活性半衰期长达42h，具备工业化应用潜质。

Description

一种海洋弧菌及其在制备热稳定特性的ι-卡拉胶酶中的应用

原申请的申请日2018年12月26日、申请号201811596818.9，发明创造名称一种具有热稳定特性的ι-卡拉胶酶及其应用。

技术领域

本发明涉及一种海洋弧菌，以及该海洋弧菌在制备热稳定特性的ι-卡拉胶酶中的应用，属于微生物以及微生物应用的技术领域。

背景技术

卡拉胶是由1,4-α-D-吡喃半乳糖和1,3-β-D-吡喃半乳糖作为基本骨架，交替连接而成的硫酸线性多糖。根据是否含有3,6-内醚半乳糖结构以及硫酸基的含量的不同，目前工业上生产和使用的卡拉胶主要为ι-型、ι-型和λ-型三种，其二糖单元分别含有1个、2个和3个硫酸基。卡拉胶寡糖作为一种富含硫酸基的硫酸酯化糖类物质，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤、降血脂、免疫调节和抗凝血等生物活性。

卡拉胶降解酶是一种糖水解酶，通过断裂卡拉胶的β-1,4糖苷键将大分子卡拉胶降解为寡糖的酶。ι-卡拉胶酶是指专一性降解ι-卡拉胶的卡拉胶酶，传统的ι-卡拉胶酶是从海洋细菌的发酵液上清中直接分离提取，受限于天然ι-卡拉胶酶产量低，发展基因工程的ι-卡拉胶酶势在必行。并且大多数报道的ι-卡拉胶酶热稳定和热恢复性较差，容易失活，无法达到工业化应用的要求。因此，寻找具有特殊性质的ι-卡拉胶酶具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种海洋弧菌，海洋细菌Vibrio sp.SY08，菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC No：M2018769，保藏日期2018年11月27日，保藏地址中国武汉市武汉大学。

本发明的目的之二是提供上述海洋细菌Vibrio sp.SY08在制备具有热恢复特性的ι-卡拉胶酶CgiV中的应用。

优选的：上述海洋细菌Vibrio sp.SY08的基因序列在制备具有热恢复特性的ι-卡拉胶酶CgiV中的应用。

优选的：所述应用方法如下：将海洋细菌Vibrio sp.SY08中ι-卡拉胶酶CgiV基因序列以限制性内切酶Nco I和Xho I为酶切位点，设计重组引物如下：

正向引物：SEQ ID NO.3：PCgiVF：

5’-CATGCCATGGATGATTAAAGCATCTGATTTC-3’(Nco I)

反向引物：SEQ ID NO.4：PCgiVR：

5’-CCGCTCGAGTTTACCTTGTTTACAGTTTTTTAC-3’(Xho I)

PCR扩增条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1.5分钟，共30个循环；72℃延伸5分钟；4℃稳定15分钟；

PCR产物用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物，同样用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段；

双酶切处理的PCR产物和pET-22b(+)质粒载体参照DNA连接酶说明书进行连接反应；连接产物转化至大肠杆菌DH5α菌株，涂布在Luria-Bertani(LB)培养基固体平板上，含有50μg/mL氨苄青霉素的，37℃温箱中培养12-16小时后，挑取单克隆；将单克隆转接至LB液体培养基中，含有50μg/mL氨苄青霉素，转速为180rpm的37℃摇床中培养过夜，将单克隆进行序列测定，选择阳性克隆，并将其命名为pET22b-CgiV，重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，将重组大肠菌株命名为BL21(DE3)/pET22b-CgiV，保存在-80℃备用；

将上述构建的大肠杆菌BL21(DE3)/pET22b-CgiV转接至LB液体培养基中，50μg/mL氨苄青霉素，在37℃摇床中180rpm震荡培养至OD₆₀₀＝0.6，加入终浓度为0.1mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在20℃诱导24h，发酵停止后，12000rpm离心10min，弃菌体，收集上清液；上样于镍离子亲和层析柱，上样流速为5ml/min，利用10mM咪唑洗脱，去除杂蛋白，再利用150mM的咪唑洗脱，收集洗脱组分，将活性成分透析去除咪唑即得。

提供了一种具有热恢复特性的ι-卡拉胶酶CgiV及其应用。本发明提供的ι-卡拉胶酶基因来源于海洋细菌Vibrio sp.SY08，菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC No：M2018769。本发明提供的ι-卡拉胶酶与已有ι-卡拉胶酶的氨基酸相似度仅为88％。最适反应温度为40℃；具有热稳定特性，在40℃的活性半衰期长达6.5h，30℃的活性半衰期长达42h。酶解主产物为ι-卡拉胶二糖和四糖。

一方面，本发明提供一种新型ι-卡拉胶酶CgiV，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MIKASDFYTDKIKEAKKTVNYTGYKVNNKDDQDDSKNLQKAIDDLTAIKKGGVINIPEGKYYFKNIILKSNVHIVIDEKATIYATYPGSDKNFMIMSFGEFGTHYVSVRAKKGMYTVDLSVSKNKNVRMFQVNNSENYKGQQRENILDDNTKFNGITLGYCKYNGKYVMPENGVIKNCRIEKAHYGYGLIQSQASTNVYYENIWGDGGVTLRLETDNLKMNDLQVGGNHNIHGKNIYCQNGNAASHYTHEMQNGHVEMDGVESVNCGFAVRIGKGYVSKKQKVANLKPGTYANQAVESKLGRGCAQGTYREWNGGTRWAARVTQKDACLDKAKLEYGIEPGSFGTVKVSNIKSTYGTTAQVKSKHFKYMPCPERKLIRVCLALMVSPHSIQNGHVEAENVEAVNCVNAKGKGGAPKGYWNVEITNVESVGYPHQSKDILYEQDAVKNCKEGK

另一方面，本发明还提供一种ι-卡拉胶酶CgiV对应的核酸序列，如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：

ATGATTAAAGCATCTGATTTCTACACAGATAAAATTAAAGAAGCAAAAAAAACAGTAAACTACACAGGTTACAAAGTAAACAACAAAGATGATCAAGATGATTCTAAAAACTTACAAAAAGCAATTGATGATTTAACAGCAATTAAAAAAGGTGGTGTAATTAACATTCCAGAAGGTAAATACTACTTCAAAAACATTATTTTAAAATCTAACGTACATATTGTAATTGATGAAAAAGCAACAATTTACGCAACATACCCAGGTTCTGATAAAAACTTCATGATTATGTCTTTCGGTGAATTCGGTACACATTACGTATCTGTACGTGCAAAAAAAGGTATGTACACAGTAGATTTATCTGTATCTAAAAACAAAAACGTACGTATGTTCCAAGTAAACAACTCTGAAAACTACAAAGGTCAACAACGTGAAAACATTTTAGATGATAACACAAAATTCAACGGTATTACATTAGGTTACTGTAAATACAACGGTAAATACGTAATGCCAGAAAACGGTGTAATTAAAAACTGTCGTATTGAAAAAGCACATTACGGTTACGGTTTAATTCAATCTCAAGCATCTACAAACGTATACTACGAAAACATTTGGGGTGATGGTGGTGTAACATTACGTTTAGAAACAGATAACTTAAAAATGAACGATTTACAAGTAGGTGGTAACCATAACATTCATGGTAAAAACATTTACTGTCAAAACGGTAACGCAGCATCTCATTACACACATGAAATGCAAAACGGTCATGTAGAAATGGATGGTGTAGAATCTGTAAACTGTGGTTTCGCAGTACGTATTGGTAAAGGTTACGTATCTAAAAAACAAAAAGTAGCAAACTTAAAACCAGGTACATACGCAAACCAAGCAGTAGAATCTAAATTAGGTCGTGGTTGTGCACAAGGTACATACCGTGAATGGAACGGTGGTACACGTTGGGCAGCACGTGTAACACAAAAAGATGCATGTTTAGATAAAGCAAAATTAGAATACGGTATTGAACCAGGTTCTTTCGGTACAGTAAAAGTATCTAACATTAAATCTACATACGGTACAACAGCACAAGTAAAATCTAAACATTTCAAATACATGCCATGTCCAGAACGTAAATTAATTCGTGTATGTTTAGCATTAATGGTATCTCCACATTCTATTCAAAACGGTCATGTAGAAGCAGAAAACGTAGAAGCAGTAAACTGTGTAAACGCAAAAGGTAAAGGTGGTGCACCAAAAGGTTACTGGAACGTAGAAATTACAAACGTAGAATCTGTAGGTTACCCACATCAATCTAAAGATATTTTATACGAACAAGATGCAGTAAAAAACTGTAAAGAAGGTAAATAA

另一方面，本发明还提供一种新型ι-卡拉胶酶CgiV的制备方法。

另一方面，本发明还提供了所述ι-卡拉胶酶CgiV在水解卡拉胶中的应用。

另一方面，本发明还提供了所述ι-卡拉胶酶CgiV在制备ι-卡拉胶寡糖中的应用。

另一方面，一种水解ι-卡拉胶的方法，所选用的ι-卡拉胶酶为CgiV。

优选：所述水解条件中反应温度为0～70℃。最适反应温度为40℃。

有益效果：

1.本发明的ι-卡拉胶酶CgiV为结构与功能新颖的ι-卡拉胶酶，归属于多糖水解酶第82家族(GH82)，其氨基酸序列与已有的ι-卡拉胶酶序列相似度为88％。

2.本发明提供了一种制备ι-卡拉胶酶CgiV的方法，即利用基因工程的技术方法，将CgiV的基因序列异源重组表达到大肠杆菌，经摇瓶发酵后，发酵液酶活力达到37.9U/mL。该酶纯化方法简单，利用镍柱对其进行一步亲和纯化，回收率高达88.6％，蛋白质纯度高达98.2％。

3.本发明的ι-卡拉胶酶CgiV具有优良的理化性质，具有热稳定特性，在50℃的活性半衰期长达0.7h，在40℃的活性半衰期长达6.5h，30℃的活性半衰期长达42h。降解产物分析，该酶降解主产物为ι-卡拉胶二糖和四糖。

综上所述，本发明所述的ι-卡拉胶酶CgiV具有良好的工业化应用前景。

附图说明

图1为本发明ι-卡拉胶酶CgiV蛋白质分离纯化图(M，蛋白质标准品；1，纯化所得ι-卡拉胶酶CgiV)；

图2为本发明ι-卡拉胶酶CgiV的最适反应温度；

图3为本发明ι-卡拉胶酶CgiV的温度稳定性；

图4为本发明ι-卡拉胶酶CgiV在30℃的活性半衰期；

图5为本发明ι-卡拉胶酶CgiV在40℃的活性半衰期；

图6为本发明ι-卡拉胶酶CgiV在50℃的活性半衰期；

图7为薄层层析(TLC)法检测本发明ι-卡拉胶酶CgiV的酶解产物(M，ι-卡拉胶寡糖DP2、4糖DP4标准品；0，酶解前底物；1，酶解后产物)；

具体实施方式

实施例1ι-卡拉胶酶CgiV序列分析

本发明所述ι-卡拉胶酶CgiV的产酶基因CgiV来源于海洋细菌Vibrio sp.SY08，菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC No：M2018769。包含有1359个碱基序列，编码452个氨基酸序列。利用National Center for Biotechnology Information(NCBI)中的保守结构域分析Conserved domain(CDD)和多重序列比对Basic Local AlignmentSearch Tool(Blast)发现，该序列包含有一段多糖水解酶(GH 82)家族的保守区。已经报道的ι-卡拉胶酶中，与CgiV氨基酸序列相似度最高的为来源于Flavobacterium sp.的GH82家族的ι-卡拉胶酶(Genbank APX55175)，两者之间的氨基酸序列相似度(Identity)为88％。

实施例2ι-卡拉胶酶CgiV的重组表达

将实施例1中ι-卡拉胶酶CgiV基因序列以限制性内切酶Nco I和Xho I为酶切位点，设计重组引物如下(下划线为限制性内切酶位点，斜体为限制性内切酶保护碱基)：

正向引物：SEQ ID NO.3：PCgiVF：

5’-CATGCCATGGATGATTAAAGCATCTGATTTC-3’(Nco I)

反向引物：SEQ ID NO.4：PCgiVR：

5’-CCGCTCGAGTTTACCTTGTTTACAGTTTTTTAC-3’(Xho I)

PCR扩增条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1.5分钟，共30个循环；72℃延伸5分钟；4℃稳定15分钟。PCR反应所用DNA聚合酶为Primerstar HS购自大连宝生物公司。

PCR产物用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物。pET22b(+)质粒DNA(美国Invitrogen公司)，同样用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段。酶切所用酶和底物反应体系(温度、时间、DNA用量等)均参照大连宝生物提供的产品说明操作。

双酶切处理的PCR产物和pET-22b(+)质粒载体参照DNA连接酶(大连宝生物公司)说明书进行连接反应；连接产物转化至大肠杆菌DH5α菌株(美国Invitrogen公司)，涂布在Luria-Bertani(LB)培养基固体平板上(含有50μg/mL氨苄青霉素的)，37℃温箱中培养12-16小时后，挑取单克隆；将单克隆转接至LB液体培养基中(含有50μg/mL氨苄青霉素)，转速为180rpm的37℃摇床中培养过夜。将单克隆进行序列测定，选择阳性克隆，并将其命名为pET22b-CgiV。重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)(购自大连宝生物公司)，将重组大肠菌株命名为BL21(DE3)/pET22b-CgiV，保存在-80℃备用。

实施例3ι-卡拉胶酶CgiV的发酵及纯化制备方法

将实施例2中构建的大肠杆菌BL21(DE3)/pET22b-CgiV转接至LB液体培养基中(50μg/mL氨苄青霉素)，在37℃摇床中180rpm震荡培养至OD₆₀₀＝0.6。加入终浓度为0.1mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在20℃诱导24h。ι-卡拉胶酶活性利用DNS法测定，具体方法为：100μl酶液加入900μl 0.3％ι-卡拉胶底物(20mM磷酸盐缓冲液，pH＝7.0)，在40℃下反应10min，加入750μl DNS试剂终止反应，沸水中煮沸10min，用分光光度计测定A520的数值。对照组加入样品后直接加入750μL的DNS试剂并沸水煮沸10min后检测。酶活力定义为：每分钟催化产生1μmol还原糖所需的酶用量定义为一个酶活力单位(U)。经检测，发酵液中ι-卡拉胶酶的酶活力为37.9U/mL。

发酵停止后，12000rpm离心10min，弃菌体，收集上清液；上样于镍离子亲和层析柱，上样流速为5ml/min，利用10mM咪唑洗脱，去除杂蛋白，再利用150mM的咪唑洗脱，收集洗脱组分。将活性成分透析去除咪唑，分装储存在-20℃备用。通过镍离子一步亲和纯化，蛋白回收率达到88.6％。纯化所得酶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，如图1所示，纯化所得CgiV的分子量约为45kDa，与序列分析中预测的蛋白大小一致。通过凝胶分析发现，纯化所得ι-卡拉胶酶的蛋白纯度达到98.2％。

实施例4温度对ι-卡拉胶酶CgiV的影响

为了检测卡拉胶酶最适反应温度，0.3％的卡拉胶底物分别置于0-70℃保温10min后加入将实施例3中纯化所得ι-卡拉胶酶(溶解于pH7.0的磷酸盐缓冲液)，用DNS法检测酶活性，根据OD520的数值确定酶促反应的最适反应温度，以酶活性最高时的活性定义为100％。如图2所示，ι-卡拉胶酶CgiV的最适反应温度为40℃。

将实施例3中纯化所得ι-卡拉胶酶1mL在不同温度(0-70℃)下孵育1h，取出后，立即在其最适反应温度(40℃)下检测其酶活力，以孵育前的活力作为100％，如图3所示，ι-卡拉胶酶CgiV温度稳定性较好，在40℃下孵育1h，仍然可保持87.3％的活性，在50℃下孵育1h，仍然可保持37.2％的活性。

实施例5ι-卡拉胶酶CgiV的热稳定性测定

将实施例3中纯化所得ι-卡拉胶酶CgiV分别在30℃、40℃、50℃孵育不同时间，分别检测剩余的酶活力，以孵育前的活力作为100％，利用origin软件计算酶活力在不同温度下丧失一半的时间，即活性半衰期(t1/2)。如图4所示，CgiV在30℃下保持良好的稳定性，活性半衰期(t1/2)长达42h；如图5所示，CgiV在40℃下的活性半衰期(t1/2)为6.5h；如图6所示，CgiV在50℃下的活性半衰期(t1/2)为0.7h。通过半衰期检测发现，本发明所提供的ι-卡拉胶酶CgiV具备良好的热稳定性，在运输和发生催化过程中，具备良好的应用前景。

实施例6ι-卡拉胶酶CgiV酶解产物薄层层析分析

将实施例3中纯化所得ι-卡拉胶酶CgiV纯酶(20U)与0.1％的ι-卡拉胶在40℃下孵育6h，然后在高效薄层层析板(HPTLC)检测。具体为：TLC把预先在100℃烘箱中活化2h的HPTLC层析板裁剪成7cm宽合适大小的样本，将孵育前后样品点样在原点处，置于有展开剂(正丁醇:冰乙酸:水＝2:1:1)的展缸中20min，吹干层析板，浸入显色剂(苯胺二苯胺)中2s，取出吹干，高温烘烤，至样品出现。如图7所示，与标准品迁徙率比较发现，ι-卡拉胶酶CgiV酶解主产物为二糖(DP2)和四糖(DP4)。

序列表

<110> 青岛大学

<120> 一种海洋弧菌及其在制备热稳定特性的ι-卡拉胶酶中的应用

<141> 2019-12-27

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 452

<212> PRT

<213> Vibrio sp. SY08

<400> 1

Met Ile Lys Ala Ser Asp Phe Tyr Thr Asp Lys Ile Lys Glu Ala Lys

1 5 10 15

Lys Thr Val Asn Tyr Thr Gly Tyr Lys Val Asn Asn Lys Asp Asp Gln

20 25 30

Asp Asp Ser Lys Asn Leu Gln Lys Ala Ile Asp Asp Leu Thr Ala Ile

35 40 45

Lys Lys Gly Gly Val Ile Asn Ile Pro Glu Gly Lys Tyr Tyr Phe Lys

50 55 60

Asn Ile Ile Leu Lys Ser Asn Val His Ile Val Ile Asp Glu Lys Ala

65 70 75 80

Thr Ile Tyr Ala Thr Tyr Pro Gly Ser Asp Lys Asn Phe Met Ile Met

85 90 95

Ser Phe Gly Glu Phe Gly Thr His Tyr Val Ser Val Arg Ala Lys Lys

100 105 110

Gly Met Tyr Thr Val Asp Leu Ser Val Ser Lys Asn Lys Asn Val Arg

115 120 125

Met Phe Gln Val Asn Asn Ser Glu Asn Tyr Lys Gly Gln Gln Arg Glu

130 135 140

Asn Ile Leu Asp Asp Asn Thr Lys Phe Asn Gly Ile Thr Leu Gly Tyr

145 150 155 160

Cys Lys Tyr Asn Gly Lys Tyr Val Met Pro Glu Asn Gly Val Ile Lys

165 170 175

Asn Cys Arg Ile Glu Lys Ala His Tyr Gly Tyr Gly Leu Ile Gln Ser

180 185 190

Gln Ala Ser Thr Asn Val Tyr Tyr Glu Asn Ile Trp Gly Asp Gly Gly

195 200 205

Val Thr Leu Arg Leu Glu Thr Asp Asn Leu Lys Met Asn Asp Leu Gln

210 215 220

Val Gly Gly Asn His Asn Ile His Gly Lys Asn Ile Tyr Cys Gln Asn

225 230 235 240

Gly Asn Ala Ala Ser His Tyr Thr His Glu Met Gln Asn Gly His Val

245 250 255

Glu Met Asp Gly Val Glu Ser Val Asn Cys Gly Phe Ala Val Arg Ile

260 265 270

Gly Lys Gly Tyr Val Ser Lys Lys Gln Lys Val Ala Asn Leu Lys Pro

275 280 285

Gly Thr Tyr Ala Asn Gln Ala Val Glu Ser Lys Leu Gly Arg Gly Cys

290 295 300

Ala Gln Gly Thr Tyr Arg Glu Trp Asn Gly Gly Thr Arg Trp Ala Ala

305 310 315 320

Arg Val Thr Gln Lys Asp Ala Cys Leu Asp Lys Ala Lys Leu Glu Tyr

325 330 335

Gly Ile Glu Pro Gly Ser Phe Gly Thr Val Lys Val Ser Asn Ile Lys

340 345 350

Ser Thr Tyr Gly Thr Thr Ala Gln Val Lys Ser Lys His Phe Lys Tyr

355 360 365

Met Pro Cys Pro Glu Arg Lys Leu Ile Arg Val Cys Leu Ala Leu Met

370 375 380

Val Ser Pro His Ser Ile Gln Asn Gly His Val Glu Ala Glu Asn Val

385 390 395 400

Glu Ala Val Asn Cys Val Asn Ala Lys Gly Lys Gly Gly Ala Pro Lys

405 410 415

Gly Tyr Trp Asn Val Glu Ile Thr Asn Val Glu Ser Val Gly Tyr Pro

420 425 430

His Gln Ser Lys Asp Ile Leu Tyr Glu Gln Asp Ala Val Lys Asn Cys

435 440 445

Lys Glu Gly Lys

450

<210> 2

<211> 1359

<212> DNA

<213> Vibrio sp. SY08

<400> 2

atgattaaag catctgattt ctacacagat aaaattaaag aagcaaaaaa aacagtaaac 60

tacacaggtt acaaagtaaa caacaaagat gatcaagatg attctaaaaa cttacaaaaa 120

gcaattgatg atttaacagc aattaaaaaa ggtggtgtaa ttaacattcc agaaggtaaa 180

tactacttca aaaacattat tttaaaatct aacgtacata ttgtaattga tgaaaaagca 240

acaatttacg caacataccc aggttctgat aaaaacttca tgattatgtc tttcggtgaa 300

ttcggtacac attacgtatc tgtacgtgca aaaaaaggta tgtacacagt agatttatct 360

gtatctaaaa acaaaaacgt acgtatgttc caagtaaaca actctgaaaa ctacaaaggt 420

caacaacgtg aaaacatttt agatgataac acaaaattca acggtattac attaggttac 480

tgtaaataca acggtaaata cgtaatgcca gaaaacggtg taattaaaaa ctgtcgtatt 540

gaaaaagcac attacggtta cggtttaatt caatctcaag catctacaaa cgtatactac 600

gaaaacattt ggggtgatgg tggtgtaaca ttacgtttag aaacagataa cttaaaaatg 660

aacgatttac aagtaggtgg taaccataac attcatggta aaaacattta ctgtcaaaac 720

ggtaacgcag catctcatta cacacatgaa atgcaaaacg gtcatgtaga aatggatggt 780

gtagaatctg taaactgtgg tttcgcagta cgtattggta aaggttacgt atctaaaaaa 840

caaaaagtag caaacttaaa accaggtaca tacgcaaacc aagcagtaga atctaaatta 900

ggtcgtggtt gtgcacaagg tacataccgt gaatggaacg gtggtacacg ttgggcagca 960

cgtgtaacac aaaaagatgc atgtttagat aaagcaaaat tagaatacgg tattgaacca 1020

ggttctttcg gtacagtaaa agtatctaac attaaatcta catacggtac aacagcacaa 1080

gtaaaatcta aacatttcaa atacatgcca tgtccagaac gtaaattaat tcgtgtatgt 1140

ttagcattaa tggtatctcc acattctatt caaaacggtc atgtagaagc agaaaacgta 1200

gaagcagtaa actgtgtaaa cgcaaaaggt aaaggtggtg caccaaaagg ttactggaac 1260

gtagaaatta caaacgtaga atctgtaggt tacccacatc aatctaaaga tattttatac 1320

gaacaagatg cagtaaaaaa ctgtaaagaa ggtaaataa 1359

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catgccatgg atgattaaag catctgattt c 31

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgctcgagt ttaccttgtt tacagttttt tac 33

Claims

1.一种海洋弧菌Vibrio sp. SY08，菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC No：M2018769，保藏日期2018年11月27日，保藏地址中国武汉市武汉大学。

2.如权利要求1所述的海洋弧菌Vibrio sp. SY08在制备具有热恢复特性的ι-卡拉胶酶CgiV中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征是：所述海洋弧菌Vibrio sp. SY08的基因序列在制备具有热恢复特性的ι-卡拉胶酶CgiV中的应用。

4.如权利要求2所述的应用，其特征是：所述应用方法如下：将海洋弧菌Vibrio sp.SY08中ι-卡拉胶酶CgiV基因序列以限制性内切酶Nco I和Xho I为酶切位点，设计重组引物如下：

正向引物：SEQ ID NO.3：PCgiVF：

5’- CATG CCATGGATGATTAAAGCATCTGATTTC-3’ (Nco I)

反向引物：SEQ ID NO.4：PCgiVR：

5’- CCG CTCGAGTTTACCTTGTTTACAGTTTTTTAC -3’ (Xho I)

PCR扩增条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1.5分钟，共 30个循环；72℃延伸5分钟；4℃稳定15分钟；

PCR产物用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物，同样用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段；

双酶切处理的PCR产物和pET-22b(+)质粒载体参照DNA连接酶说明书进行连接反应；连接产物转化至大肠杆菌DH5α菌株，涂布在Luria-Bertani (LB)培养基固体平板上，含有50μg/mL氨苄青霉素的，37℃温箱中培养12-16小时后，挑取单克隆；将单克隆转接至LB液体培养基中，含有50 μg/mL氨苄青霉素，转速为180 rpm的37℃摇床中培养过夜，将单克隆进行序列测定，选择阳性克隆，并将其命名为pET22b-CgiV，重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，将重组大肠菌株命名为BL21(DE3)/pET22b-CgiV，保存在-80℃备用；

将上述构建的大肠杆菌BL21(DE3)/pET22b-CgiV转接至LB液体培养基中，50 μg/mL氨苄青霉素，在37℃摇床中180 rpm震荡培养至OD₆₀₀=0.6，加入终浓度为0.1 mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），在20℃诱导24 h，发酵停止后，12000 rpm离心10 min，弃菌体，收集上清液；上样于镍离子亲和层析柱，上样流速为5 ml/min，利用10 mM咪唑洗脱，去除杂蛋白，再利用150 mM的咪唑洗脱，收集洗脱组分，将活性成分透析去除咪唑即得。