CN110157698B

CN110157698B - 一种深海微生物来源壳聚糖酶CsnA1及其应用

Info

Publication number: CN110157698B
Application number: CN201910549992.6A
Authority: CN
Inventors: 杨文钰
Original assignee: Guangdong Oumeili Health Industry Co ltd
Current assignee: Guangdong oumeili Health Industry Co.,Ltd.
Priority date: 2019-06-24
Filing date: 2019-06-24
Publication date: 2021-07-09
Anticipated expiration: 2039-06-24
Also published as: CN110157698A

Abstract

本发明涉及一种深海微生物来源壳聚糖酶CsnA1及其应用。所述壳聚糖酶CsnA1氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供一种壳聚糖酶CsnA1的发酵和纯化方法，发酵液酶活力高达379.9 U/mL，一步纯化纯度>95%，回收率为93.7%。本发明所述壳聚糖酶CsnA1具有嗜冷特性，最适反应温度为25℃，在0℃，10℃，15℃下检测活性可达到最适反应温度下的67.6%，81.5%和89.3%。所述壳聚糖酶CsnA1降解主产物壳二糖和壳三糖，具有良好的应用潜质。

Description

一种深海微生物来源壳聚糖酶CsnA1及其应用

技术领域

本发明涉及一种深海微生物来源壳聚糖酶CsnA1及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

壳聚糖(chitosan)是由自然界广泛存在的几丁质(chitin)经过脱乙酰作用得到的，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖。小分子的壳聚糖降解产物壳寡糖具有广泛的抑菌、抗炎、抗肿瘤作用，被公认为有效的保健功能食品，被誉为“生命的第六元素”。壳寡糖极易溶于水，在医药、保健品、功能食品等领域比大分子壳聚糖有更大的应用价值。

相比传统的酸解法，利用壳聚糖酶生物酶法降解大分子壳聚糖具有反应条件温和、降解产物单一、反应过程容易控制、环境友好等优势，逐渐成为壳寡糖制备过程中的主流方法。但是，目前市场上销售的壳聚糖酶价格昂贵、活力较低，品种单一，无法满足特定条件下的应用，因此急需开发新的壳聚糖酶。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种深海微生物来源壳聚糖酶CsnA1及其制备方法。本发明所述壳聚糖酶CsnA1产量高达379.4 U/mL，一步纯化纯度>95%，回收率为93.7%。本发明所述壳聚糖酶CsnA1具有嗜冷特性，最适反应温度为25 ℃，在0 ℃，10 ℃，15℃下检测活性可达到最适反应温度下的67.6%，81.5%和89.3%。所述壳聚糖酶CsnA1降解主产物壳二糖和壳三糖，具有良好的应用潜质。

一方面，本发明提供一种新型壳聚糖酶CsnA1，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

SEQ ID NO.1：

AGHYAAGALFGPSKAAAASPDDNFSPEALQFLRNNAGLDGEQWNNIMKLINKPEQDDLNWIKYYGYCEDIEDERGYAIGLFGAAAGGSRDAHPDGPDLFKAYDAAKGASNPSADGALKRLGINGKMKGSILEIKDSEKVFCGKIKKLQNDAAWRKAMWEAFYNVYIRYSVEQARQRGFASAVAIGSFVDAALNQGAAGGSDALQGLLARSGSSSNEKAFMKNFHAKRALVVDANKYNKPPNGKNRVKQWDALVDMGKMNLKNVDSEIAQVADWEMK

另一方面，本发明还提供一种壳聚糖酶CsnA1对应的核酸序列，如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：

GCTGGTCACTACGCTGCTGGTGCTCTGTTCGGTCCGTCTAAAGCTGCTGCTGCTTCTCCGGACGACAACTTCTCTCCGGAAGCTCTGCAGTTCCTGCGTAACAACGCTGGTCTGGACGGTGAACAGTGGAACAACATCATGAAACTGATCAACAAACCGGAACAGGACGACCTGAACTGGATCAAATACTACGGTTACTGCGAAGACATCGAAGACGAACGTGGTTACGCTATCGGTCTGTTCGGTGCTGCTGCTGGTGGTTCTCGTGACGCTCACCCGGACGGTCCGGACCTGTTCAAAGCTTACGACGCTGCTAAAGGTGCTTCTAACCCGTCTGCTGACGGTGCTCTGAAACGTCTGGGTATCAACGGTAAAATGAAAGGTTCTATCCTGGAAATCAAAGACTCTGAAAAAGTTTTCTGCGGTAAAATCAAAAAACTGCAGAACGACGCTGCTTGGCGTAAAGCTATGTGGGAAGCTTTCTACAACGTTTACATCCGTTACTCTGTTGAACAGGCTCGTCAGCGTGGTTTCGCTTCTGCTGTTGCTATCGGTTCTTTCGTTGACGCTGCTCTGAACCAGGGTGCTGCTGGTGGTTCTGACGCTCTGCAGGGTCTGCTGGCTCGTTCTGGTTCTTCTTCTAACGAAAAAGCTTTCATGAAAAACTTCCACGCTAAACGTGCTCTGGTTGTTGACGCTAACAAATACAACAAACCGCCGAACGGTAAAAACCGTGTTAAACAGTGGGACGCTCTGGTTGACATGGGTAAAATGAACCTGAAAAACGTTGACTCTGAAATCGCTCAGGTTGCTGACTGGGAAATGAAA

另一方面，本发明还提供一种壳聚糖酶CsnA1的制备与纯化方法。

另一方面，本发明还提供了所述壳聚糖酶CsnA1在降解壳聚糖中的应用。

另一方面，一种降解壳聚糖的方法，所选用的壳聚糖酶为CsnA1。

优选：所述降解条件中反应温度为0~50℃。最适反应温度为25℃。

有益效果：

1.本发明的壳聚糖酶CsnA1为新颖的壳聚糖酶，在《Genbank》数据库中与本发明所述壳聚糖酶CsnA1最高氨基酸序列相似度仅为92.03%，说明本发明的壳聚糖酶CsnA1为序列和结构新颖的壳聚糖酶。

2.本发明提供了一种制备壳聚糖酶CsnA1的方法，即利用基因工程的技术方法，将壳聚糖酶CsnA1的基因序列异源重组表达到大肠杆菌，经发酵后，发酵液酶活力高达379.9U/mL，具有工业化生产的潜质。该酶纯化方法简单，利用镍柱对其进行一步亲和纯化，回收率高达93.7%，蛋白质纯度>95%。

3.本发明所述壳聚糖酶CsnA1具有嗜冷特性，最适反应温度为25 ℃，在0 ℃，10℃，15 ℃下检测活性可达到最适反应温度下的67.6%，81.5%和89.3%，可满足在低温下应用的社会需求。

综上所述，本发明所述壳聚糖酶CsnA1序列新颖、产量高、制备简单、性质特殊，具有良好的工业化应用潜质。

附图说明

图1为本发明壳聚糖酶CsnA1的蛋白质分离纯化图（M，蛋白质标准品；1，纯化所得壳聚糖酶CsnA1）；

图2为本发明壳聚糖酶CsnA1的最适反应温度分析

图3为本发明壳聚糖酶CsnA1的温度稳定性分析

图4为薄层层析（TLC）法检测本发明壳聚糖酶CsnA1的降解方式和酶解产物（M，DP2-3，壳寡糖2-3糖标准品；0-6分别为降解0, 1, 5, 15, 30, 60, 120 min样品）。

具体实施方式

实施例1 壳聚糖酶CsnA1的序列分析

本发明所述壳聚糖酶CsnA1的产酶基因csnA1为人工合成序列。前期研究中，我们发现深海细菌Vibrio sp. A1-09具有较高的壳聚糖酶活性，对其进行全基因测序时，发现其含有一个预测的壳聚糖酶序列，将其命名为csnA1。在氨基酸序列不变的情况下，我们将该基因序列根据宿主（大肠杆菌的）的密码子偏好性，进行了碱基序列优化，利于其在大肠杆菌中进行高效表达。本发明所述壳聚糖酶CsnA1包含有828个碱基序列，编码276个氨基酸序列。利用NCBI中的保守结构域Conserved domain (CDD)分析，发现该序列包含有一个多糖水解酶第46家族（GH-46）的保守区。多重序列比对Basic Local Alignment Search Tool(Blast)发现，在《Genbank》数据库中，与本发明所述的壳聚糖酶CsnA1氨基酸序列相似度最高的为Bacillus菌株中的壳聚糖酶（P33673）。经过Clustal W软件分析发现，两者之间的序列相似度为92.03%。我们深入分析发现壳聚糖酶（WP_012246499.1）为预测蛋白，并未有文献报道其生物学功能。该序列含有301个氨基酸序列，其中1-42位氨基酸预测为信号肽序列，43-301位氨基酸预测为催化区，与本发明所述壳聚糖酶CsnA1具有较大差异。

将壳聚糖酶CsnA1的碱基序列以限制性内切酶Nco I和Xho I为酶切位点，设计重组引物如下（下划线为限制性内切酶位点，斜体为限制性内切酶保护碱基）：

正向引物：PCsnA1-F：

5’- CATGCCATGGGCTGGTCACTACGCTGCTGG-3’ (Nco I)

反向引物：PCsnA1-R：

5’- CCGCTCGAGTTTCATTTCCCAGTCAGCAAC-3’ (Xho I)

PCR扩增条件为：94℃预变性3 min；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1min，共 30个循环；72℃延伸1 min；4℃稳定15 min。PCR反应所用DNA聚合酶为PrimerstarHS购自大连宝生物公司。

PCR产物用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物。pET22b (+)质粒DNA（美国Invitrogen公司），同样用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段。酶切所用酶和底物反应体系（温度、时间、DNA用量等）均参照大连宝生物提供的产品说明操作。

双酶切处理的PCR产物和pET-22b(+)质粒载体参照DNA连接酶（大连宝生物公司）说明书进行连接反应；连接产物转化至大肠杆菌DH5α菌株（美国Invitrogen公司），涂布在Luria-Bertani (LB)培养基固体平板上（含有50 μg/mL氨苄青霉素的），37℃温箱中培养12-16小时后，挑取单克隆；将单克隆转接至LB液体培养基中（含有50 μg/mL氨苄青霉素），转速为180 rpm的37℃摇床中培养过夜。将单克隆进行序列测定，选择阳性克隆，并将其命名为pET22b-CsnA1。重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)（购自大连宝生物公司），将重组大肠菌株命名为BL21(DE3)/pET22b-CsnA1，保存在-80℃备用。

实施例2 壳聚糖酶CsnA1的制备及纯化方法

将重组菌株BL21(DE3)/pET22b-CsnA1在100 mL的LB液体培养基中（50 μg/mL氨苄青霉素），在37℃摇床中180 rpm震荡培养至OD₆₀₀=0.6，加入终浓度为0.1 mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），在20℃诱导20 h。壳聚糖酶CsnA1活性的标准测定方法为：100 μL酶液加入900 μL 0.3%壳聚糖底物（20 mM 醋酸-醋酸钠，pH=6.0），在25℃下反应10min，加入750 μL的DNS试剂，沸水中反应10 min进行显色，在OD520下检测其吸光度。酶活力定义为1 U为每min产生1 μM还原糖所需要的酶量。经检测，发酵液中壳聚糖酶活力可达379.9 U/mL。

发酵停止后，12000 rpm离心10 min，弃菌体，收集上清液；发酵上清液上样于10mL镍离子亲和层析柱，上样流速为5 mL/min，利用10 mM咪唑洗脱，去除杂蛋白，再利用150mM的咪唑洗脱，收集洗脱组分。将活性成分透析去除咪唑，分装储存在-20℃备用。通过镍离子一步亲和纯化，蛋白回收率达到93.7%。纯化所得壳聚糖酶CsnA1进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），如图1所示，壳聚糖酶CsnA1的分子量为30 kDa左右，与序列分析中预测的蛋白大小一致。通过凝胶分析发现，纯化所得壳聚糖酶CsnA1的蛋白纯度达到95%以上。

实施例3 温度对壳聚糖酶CsnA1的影响

将实施例2中纯化所得壳聚糖酶CsnA1在不同条件下进行酶活力测定，检测不同温度和pH对酶活力的影响。在不同温度（0-50℃）下反应10 min，检测不同反应温度对酶活力的影响，以最高酶活力为100%，计算不同温度下壳聚糖酶CsnA1的相对酶活力。如图2所示，壳聚糖酶CsnA1的最适反应温度为25℃。本发明所述壳聚糖酶CsnA1具有嗜冷特性，在0 ℃，10 ℃，15 ℃下检测活性可达到最适反应温度下的67.6%，81.5%和89.3%，可满足在低温下应用的社会需求。

将实施例2中纯化所得壳聚糖酶CsnA1在不同温度（0-50 ℃）下孵育1 h，取出后，在其最适反应温度（25℃）下检测其酶活力，以孵育前的活力作为100%，如图3所示，壳聚糖酶CsnA1在0-30 ℃下保持稳定，酶活力可保留80%以上，利于其后续应用。

实施例4 壳聚糖酶CsnA1酶解产物薄层层析分析

将实施例2中纯化所得壳聚糖酶CsnA1与0.3%壳聚糖在50℃下分别孵育0，1，5，15，30，60，120 min，然后在高效薄层层析板（HPTLC）检测。具体为：将HPTLC层析板裁剪成7 cm宽合适大小的样本，将孵育前后样品点样在原点处，置于有展开剂（正丁醇:冰醋酸:水=2:2:1）的展缸中30 min，吹干层析板，浸入显色剂（0.5%茚三酮乙醇溶液）中2s，取出吹干，80℃烘烤，至样品出现。如图4所示，与标准品迁徙率比较发现，壳聚糖酶CsnA1酶解主产物为壳二糖（DP2）和壳三糖（DP3），也含有少量的单糖组分。

序列表

<110> 山东昊岳医药科技有限公司

<120> 一种深海微生物来源壳聚糖酶CsnA1及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 276

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Gly His Tyr Ala Ala Gly Ala Leu Phe Gly Pro Ser Lys Ala Ala

1 5 10 15

Ala Ala Ser Pro Asp Asp Asn Phe Ser Pro Glu Ala Leu Gln Phe Leu

20 25 30

Arg Asn Asn Ala Gly Leu Asp Gly Glu Gln Trp Asn Asn Ile Met Lys

35 40 45

Leu Ile Asn Lys Pro Glu Gln Asp Asp Leu Asn Trp Ile Lys Tyr Tyr

50 55 60

Gly Tyr Cys Glu Asp Ile Glu Asp Glu Arg Gly Tyr Ala Ile Gly Leu

65 70 75 80

Phe Gly Ala Ala Ala Gly Gly Ser Arg Asp Ala His Pro Asp Gly Pro

85 90 95

Asp Leu Phe Lys Ala Tyr Asp Ala Ala Lys Gly Ala Ser Asn Pro Ser

100 105 110

Ala Asp Gly Ala Leu Lys Arg Leu Gly Ile Asn Gly Lys Met Lys Gly

115 120 125

Ser Ile Leu Glu Ile Lys Asp Ser Glu Lys Val Phe Cys Gly Lys Ile

130 135 140

Lys Lys Leu Gln Asn Asp Ala Ala Trp Arg Lys Ala Met Trp Glu Ala

145 150 155 160

Phe Tyr Asn Val Tyr Ile Arg Tyr Ser Val Glu Gln Ala Arg Gln Arg

165 170 175

Gly Phe Ala Ser Ala Val Ala Ile Gly Ser Phe Val Asp Ala Ala Leu

180 185 190

Asn Gln Gly Ala Ala Gly Gly Ser Asp Ala Leu Gln Gly Leu Leu Ala

195 200 205

Arg Ser Gly Ser Ser Ser Asn Glu Lys Ala Phe Met Lys Asn Phe His

210 215 220

Ala Lys Arg Ala Leu Val Val Asp Ala Asn Lys Tyr Asn Lys Pro Pro

225 230 235 240

Asn Gly Lys Asn Arg Val Lys Gln Trp Asp Ala Leu Val Asp Met Gly

245 250 255

Lys Met Asn Leu Lys Asn Val Asp Ser Glu Ile Ala Gln Val Ala Asp

260 265 270

Trp Glu Met Lys

275

<210> 2

<211> 828

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctggtcact acgctgctgg tgctctgttc ggtccgtcta aagctgctgc tgcttctccg 60

gacgacaact tctctccgga agctctgcag ttcctgcgta acaacgctgg tctggacggt 120

gaacagtgga acaacatcat gaaactgatc aacaaaccgg aacaggacga cctgaactgg 180

atcaaatact acggttactg cgaagacatc gaagacgaac gtggttacgc tatcggtctg 240

ttcggtgctg ctgctggtgg ttctcgtgac gctcacccgg acggtccgga cctgttcaaa 300

gcttacgacg ctgctaaagg tgcttctaac ccgtctgctg acggtgctct gaaacgtctg 360

ggtatcaacg gtaaaatgaa aggttctatc ctggaaatca aagactctga aaaagttttc 420

tgcggtaaaa tcaaaaaact gcagaacgac gctgcttggc gtaaagctat gtgggaagct 480

ttctacaacg tttacatccg ttactctgtt gaacaggctc gtcagcgtgg tttcgcttct 540

gctgttgcta tcggttcttt cgttgacgct gctctgaacc agggtgctgc tggtggttct 600

gacgctctgc agggtctgct ggctcgttct ggttcttctt ctaacgaaaa agctttcatg 660

aaaaacttcc acgctaaacg tgctctggtt gttgacgcta acaaatacaa caaaccgccg 720

aacggtaaaa accgtgttaa acagtgggac gctctggttg acatgggtaa aatgaacctg 780

aaaaacgttg actctgaaat cgctcaggtt gctgactggg aaatgaaa 828

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catgccatgg gctggtcact acgctgctgg 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgctcgagt ttcatttccc agtcagcaac 30

Claims

1.一种新型壳聚糖酶CsnA1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的壳聚糖酶CsnA1在降解壳聚糖中的应用。

3.一种降解壳聚糖的方法，其特征是，所选用的壳聚糖酶为权利要求1所述的壳聚糖酶CsnA1。

4.如权利要求3所述的方法，其特征是，降解条件中反应温度为0~50℃。