CN111549007B

CN111549007B - 一种转氨酶tsta、制备方法和应用

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Publication number: CN111549007B
Application number: CN202010263849.3A
Authority: CN
Inventors: 李中媛; 张同存; 刘天会
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2020-04-07
Filing date: 2020-04-07
Publication date: 2022-10-04
Anticipated expiration: 2040-04-07
Also published as: CN111549007A

Abstract

本发明涉及一种转氨酶TSTA，所述转氨酶TSTA的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。本发明转氨酶TSTA的最适温度40℃，最适pH为9.0。在最适温度和最适pH下，本发明转氨酶TSTA对HFB1的降解率为100％。本发明转氨酶TSTA性质优良，该酶可以应用于农业、饲料和食品等工业，减少伏马毒素FB1对动物及人类健康的危害。

Description

一种转氨酶TSTA、制备方法和应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，尤其是一种转氨酶TSTA、制备方法和应用。

背景技术

曲霉和镰刀菌是与玉米污染有关的主要真菌属。事实上，许多曲霉和镰刀菌被认为是食品和饲料的常见污染物，因为它们能够在广泛的环境条件下定居和生长。此外，这些物种还能产生真菌毒素。在食用受污染的食物或饲料后可能会对人和动物的健康造成不良影响。因此，一旦这些谷物不能被摄取或销售，被真菌毒素污染的作物就会导致疾病和经济损失。伏马毒素是由镰刀菌种合成的一组真菌毒素。伏马毒素B系列因其流行率和毒理学效应而受到广泛研究。特别是，伏马毒素B1(FB1)与人类健康的慢性影响有关，例如肝癌、肾毒性、免疫系统抑制和神经管缺陷。

为了减少暴露伏马毒素的潜在危险，2017年，中国限定了粮油食品中的伏马毒素的含量。虽然预防农产品中的真菌污染是减轻真菌毒素对人和动物健康影响的有效办法，但当前的农业和生产实践不能完全解决这个问题。其他的化学与物理方法对降解伏马毒素而言都有很大的局限性，因此通过生物技术，找到降解伏马毒素毒性的微生物与酶就成为了关键。相比较微生物制剂的不稳定来说，酶制剂不仅保持高效且专一的降解能力，而且在存贮方面具有更高的稳定性。因此找到新的降解伏马毒素的酶制剂就显得尤为重要了。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种转氨酶TSTA、制备方法和应用，该转氨酶TSTA能够降解伏马毒素中的氨基以解除其毒性。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种转氨酶TSTA，所述转氨酶TSTA的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

一种如上所述的转氨酶TSTA的制备方法，步骤如下：

⑴用包含编码所述转氨酶TSTA的基因的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

⑵培养重组菌株，诱导转氨酶TSTA表达；

⑶分离纯化获得的转氨酶TSTA。

而且，所述宿主细胞为大肠细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞。

如上所述的转氨酶TSTA在降解伏马毒素方面中的应用。

一种编码如上所述的转氨酶TSTA的转氨酶TSTA基因。

而且，所述转氨酶TSTA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

包含如上所述的转氨酶TSTA基因的重组载体。

包含如上所述的转氨酶TSTA基因的重组载体pET28a(+)-TSTA。

包含如上所述的转氨酶TSTA基因的重组菌株。

而且，所述重组菌株为大肠杆菌。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明转氨酶TSTA的最适温度40℃，最适pH为9.0。在最适温度和最适pH下，本发明转氨酶TSTA对HFB1的降解率为100％。本发明转氨酶TSTA性质优良，该酶可以应用于农业、饲料和食品等工业，减少伏马毒素FB1对动物及人类健康的危害。

2、本发明转氨酶TSTA可以降解催化降解伏马毒素FB1(HFB1)的氨基，消除伏马毒素的活性。由于氨基是使得伏马毒素具有毒性作用的关键官能团之一，因此去除氨基是解除伏马毒素毒性的关键点。本发明转氨酶TSTA具有降解水解伏马毒素HFB1的活性，可以应用于农业、饲料和食品等工业，减少伏马毒素对动物及人类健康的危害。

附图说明

图1为本发明中转氨酶TSTA的SDS-PAGE纯化图；其中，M：蛋白marker；1:转氨酶TSTA；

图2为本发明中显示转氨酶TSTA的降解效果示意图；

图3为本发明中显示转氨酶TSTA的最适温度图；

图4为本发明中显示转氨酶TSTA的最适pH图。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种转氨酶TSTA，所述转氨酶TSTA的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

一种如上所述的转氨酶TSTA的制备方法，步骤如下：

⑵培养重组菌株，诱导转氨酶TSTA表达；

⑶分离纯化获得的转氨酶TSTA。

较优地，所述宿主细胞为大肠细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

如上所述的转氨酶TSTA在降解伏马毒素方面中的应用。

一种编码如上所述的转氨酶TSTA的转氨酶TSTA基因。

较优地，所述转氨酶TSTA基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

包含如上所述的转氨酶TSTA基因的重组载体。

包含如上所述的转氨酶TSTA基因的重组载体pET28a(+)-TSTA。

包含如上所述的转氨酶TSTA基因的重组菌株。

较优地，所述重组菌株为大肠杆菌。

具体地，本发明转氨酶TSTA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

SEQ ID NO.1：

MWTNAKNAALRERAAQVIPGGMYGHMSTALLPSEFPQFFARGKGCRIWDADNNEYVDFMSAFGPSLLGYCDSDIDAAAQRQQALGDALNGPGEVMVELAEQFVATVSHASWAMFCKNGTDATTMAMVVARAHTGRRIILAAEGAYHGAAPWCVPATRSTGTLPEERAHVVYYKYNDAQSLTDAFRKHDGQIAAVFATPFRHEVFADQHDPDLEYAQTARQLCDESGALLVVDDVRAGFRLARDCSWSRLGIAPDLSCWGKCFANGYPISALLGSEHVRAAAGKIFVTGSFWFSAVPMAAGIATLRRISQTDYLERMIATGQQLRDGLAARARAHQFSLRQTGPVQMPQILFEDDPDFRIGYAWVVECLKRGAYFHPYHNMFVSAAHTAADIDVALDAADLAFEAVRKRRGDIPPVAQLASLFKARADA

其中，该酶基因编码428个氨基酸，没有信号肽，因此，成熟的转氨酶TSTA的理论分子量为47.67kDa。

本发明提供了编码上述转氨酶TSTA。该基因的基因组序列如SEQ ID NO.2所示：

SEQ ID NO.2：

ATGTGGACTAACGCTAAGAACGCTGCCTTGAGAGAAAGAGCTGCTCAGGTTATTCCAGGTGGTATGTACGGTCACATGTCCACTGCTTTGTTGCCATCTGAGTTCCCACAGTTCTTCGCTAGAGGTAAGGGTTGTAGAATTTGGGACGCTGACAACAACGAGTACGTGGACTTTATGTCTGCTTTCGGTCCATCCTTGTTGGGTTACTGTGACTCTGATATTGACGCTGCTGCTCAAAGACAACAGGCTTTGGGTGATGCTTTGAACGGTCCAGGTGAAGTTATGGTTGAGTTGGCTGAGCAGTTCGTTGCTACTGTTTCTCATGCTTCCTGGGCCATGTTCTGCAAGAACGGTACTGATGCTACCACTATGGCTATGGTTGTTGCTAGAGCCCATACCGGTAGAAGAATCATTTTGGCTGCTGAGGGTGCTTACCACGGTGCTGCACCTTGGTGTGTTCCAGCTACTAGATCCACTGGTACTTTGCCTGAAGAGAGAGCCCACGTTGTCTACTACAAGTACAACGACGCTCAGTCCTTGACTGACGCTTTCAGAAAGCACGACGGTCAGATTGCTGCTGTTTTCGCTACTCCATTCAGACACGAAGTTTTCGCTGATCAACACGACCCAGACTTGGAGTACGCTCAAACTGCTAGACAATTGTGTGACGAGTCTGGTGCCTTGTTGGTTGTTGATGATGTTAGAGCCGGTTTCAGATTGGCCAGAGACTGTTCTTGGTCCAGATTGGGTATTGCTCCAGACTTGTCTTGTTGGGGTAAGTGTTTCGCTAACGGTTACCCAATTTCCGCTTTGCTGGGTTCTGAACACGTTAGAGCTGCTGCCGGTAAGATTTTCGTTACTGGTTCTTTCTGGTTCTCCGCCGTTCCAATGGCTGCTGGTATTGCTACTTTGAGAAGAATCTCCCAGACCGACTACTTGGAGAGAATGATTGCTACTGGTCAGCAGCTGAGAGATGGATTGGCTGCTAGAGCTAGAGCACACCAATTTTCCCTGAGACAGACTGGTCCAGTTCAGATGCCACAGATTTTGTTCGAAGATGACCCCGACTTCAGAATCGGTTACGCTTGGGTTGTTGAGTGCTTGAAGAGAGGTGCTTACTTTCACCCATACCACAACATGTTCGTTTCCGCTGCTCATACTGCTGCTGACATTGATGTTGCTTTGGATGCTGCTGATTTGGCCTTCGAGGCCGTCAGAAAAAGAAGAGGTGATATCCCACCAGTTGCTCAGTTGGCTTCTTTGTTCAAGGCTAGAGCTGATGCT

本发明通过PCR的方法分离克隆了转氨酶TSTA，DNA全序列分析结果表明，转氨酶TSTA基因开放阅读框架序列(ORF)全长1284bp。

本发明还提供了包含上述转氨酶TSTA的重组载体，将优选重组载体命名为pET28a-TSTA。将本发明的降解酶TSTA基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的解毒酶基因插入到质粒pET28a上的EcoR I和Xhol I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控，得到重组大肠表达质粒pET28a-TSTA。

更具体地，相关制备及检测如下：

试验材料和试剂：

1、菌株及载体：本发明得到一种新的转氨酶TSTA。大肠杆菌表达载体pET28a(+)及菌株BL21(DE3)为实验室保存。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH 7.0)。

说明：以下未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

一、转氨酶TSTA的克隆

利用人工化学合成的方法获得转氨酶TSTA的基因片段，并在5’端引入内切酶位点EcoR I、在3’端引入内切酶位点Xhol I。

二、重组转氨酶TSTA的制备

将表达载体pET28a进行双酶切(EcoR I+XholI)，同时将编码转氨酶TSTA的基因双酶切(EcoR I+XholI)，切出编码成熟转氨酶的基因片段与表达载体pET28a连接，获得含有转氨酶基因TSTA的重组质粒pET28a-TSTA并转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21/TSTA。

取含有质粒的BL21(DE3)菌株，接种于100mL LB培养液中，37℃、220rpm振荡培养约2h后，加入1mM IPTG，置于25℃、220rpm进行诱导，约20h后测定胞内和胞外的转氨酶活力。在胞内检测到转氨酶酶的活性，经过镍柱纯化，SDS-PAGE结果表明，重组转氨酶得到了表达。如图1所示，泳道1为纯化后的结果。

三、重组转氨酶的性质测定

高效液相色谱检测转氨酶的酶活，具体方法如下：

(1)HFB1标准储备液：配制成浓度为100μg/mL的标准液，-20℃保存。

(2)样品的制备：取纯化好的转氨酶酶液850μL，加入100μL的HFB1标准储备液和50μL的丙酮酸溶液，使HFB1的终浓度为10μg/mL，37℃，220rpm，避光培养20min。

(3)样品衍生化：取待测样品100μL，加入400μL50％乙腈水，500μL OPA衍生液，混匀30s，衍生2min内进样，过滤膜待测。通过与HFB1的标品的峰图对比，来确定转氨酶TSTA的酶活性。

1、测定伏马毒素降解酶的降解能力

在900μL的转氨酶TSTA的酶液与丙酮酸的混合液(柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，pH＝7.0)中加入100μL的HFB1溶液，使得HFB1的终浓度为10μg/mL。将反应液置于37℃，pH＝7的条件下，反应12h，未添加纯化酶的溶液分别作为对照。反应完成后沸水煮10min，让酶失活。冷却至室温后过膜，待高效液相色谱检测。

如图2a所示，HFB1在液相色谱检测的出峰方时间11.627min，而添加了纯化后的转氨酶TSTA在该时间段没有出现物质峰(图2b)。这个结果表明转氨酶TSTA的降解能力很强，能够在12h内将10μg/mLHFB1降解完全。

2、测定伏马毒素降解酶的最适温度

以HFB1为底物，取100μL底物并加入850μL的酶液和50μL的丙酮酸溶液，终浓度为10μg/mL，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH7.0)缓冲液体系及不同温度下，反应1h，然后沸水煮10min，让酶失活。冷却至室温后过膜，待高效液相色谱检测。

如图3所示，转氨酶TSTA的最适温度为40℃。该酶在温度35℃-50℃之间具有较高的活力，均为50％以上。由于伏马毒素主要在玉米等饲料中被发现，转胺酶TSTA在应用于饲料中时，随饲料进入动物的肠道后，在其体温37℃下会保持较高活性，因此转胺酶TSTA非常适合用于动物喂养中降解伏马毒素毒性。

3、测定转氨酶TSTA的最适pH

将纯化的重组转氨酶TSTA在不同的pH缓冲液下进行酶促反应，以测定其最适pH，所选用的缓冲溶液的缓冲梯度为100mM柠檬酸-磷酸氢二钠(pH 3.0–8.0)，100mM的Tris-HCl(pH 7.0-9.0)，100mM甘氨酸-NaOH(pH 9.0–10.0)。转氨酶TSTA在上述不同的缓冲液中与底物HFB1(终浓度为1μg/mL)在37℃反应1h，沸水煮10min，高效液相色谱检测。

结果如图4所示，转氨酶TSTA的最适pH为9.0。在pH＝7-9之间，酶的相对活力能够保持在50％以上，并且其在碱性条件下仍具有较高活力。动物的胃液的pH约为9，与转氨酶TSTA的最适温度接近，表明该酶在添加进饲料后，能够在动物胃中会发挥较好的效益。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种转氨酶TSTA、制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 428

<212> PRT

<213> 转氨酶TSTA的氨基酸序列(Unknown)

<400> 1

Met Trp Thr Asn Ala Lys Asn Ala Ala Leu Arg Glu Arg Ala Ala Gln

1 5 10 15

Val Ile Pro Gly Gly Met Tyr Gly His Met Ser Thr Ala Leu Leu Pro

20 25 30

Ser Glu Phe Pro Gln Phe Phe Ala Arg Gly Lys Gly Cys Arg Ile Trp

35 40 45

Asp Ala Asp Asn Asn Glu Tyr Val Asp Phe Met Ser Ala Phe Gly Pro

50 55 60

Ser Leu Leu Gly Tyr Cys Asp Ser Asp Ile Asp Ala Ala Ala Gln Arg

65 70 75 80

Gln Gln Ala Leu Gly Asp Ala Leu Asn Gly Pro Gly Glu Val Met Val

85 90 95

Glu Leu Ala Glu Gln Phe Val Ala Thr Val Ser His Ala Ser Trp Ala

100 105 110

Met Phe Cys Lys Asn Gly Thr Asp Ala Thr Thr Met Ala Met Val Val

115 120 125

Ala Arg Ala His Thr Gly Arg Arg Ile Ile Leu Ala Ala Glu Gly Ala

130 135 140

Tyr His Gly Ala Ala Pro Trp Cys Val Pro Ala Thr Arg Ser Thr Gly

145 150 155 160

Thr Leu Pro Glu Glu Arg Ala His Val Val Tyr Tyr Lys Tyr Asn Asp

165 170 175

Ala Gln Ser Leu Thr Asp Ala Phe Arg Lys His Asp Gly Gln Ile Ala

180 185 190

Ala Val Phe Ala Thr Pro Phe Arg His Glu Val Phe Ala Asp Gln His

195 200 205

Asp Pro Asp Leu Glu Tyr Ala Gln Thr Ala Arg Gln Leu Cys Asp Glu

210 215 220

Ser Gly Ala Leu Leu Val Val Asp Asp Val Arg Ala Gly Phe Arg Leu

225 230 235 240

Ala Arg Asp Cys Ser Trp Ser Arg Leu Gly Ile Ala Pro Asp Leu Ser

245 250 255

Cys Trp Gly Lys Cys Phe Ala Asn Gly Tyr Pro Ile Ser Ala Leu Leu

260 265 270

Gly Ser Glu His Val Arg Ala Ala Ala Gly Lys Ile Phe Val Thr Gly

275 280 285

Ser Phe Trp Phe Ser Ala Val Pro Met Ala Ala Gly Ile Ala Thr Leu

290 295 300

Arg Arg Ile Ser Gln Thr Asp Tyr Leu Glu Arg Met Ile Ala Thr Gly

305 310 315 320

Gln Gln Leu Arg Asp Gly Leu Ala Ala Arg Ala Arg Ala His Gln Phe

325 330 335

Ser Leu Arg Gln Thr Gly Pro Val Gln Met Pro Gln Ile Leu Phe Glu

340 345 350

Asp Asp Pro Asp Phe Arg Ile Gly Tyr Ala Trp Val Val Glu Cys Leu

355 360 365

Lys Arg Gly Ala Tyr Phe His Pro Tyr His Asn Met Phe Val Ser Ala

370 375 380

Ala His Thr Ala Ala Asp Ile Asp Val Ala Leu Asp Ala Ala Asp Leu

385 390 395 400

Ala Phe Glu Ala Val Arg Lys Arg Arg Gly Asp Ile Pro Pro Val Ala

405 410 415

Gln Leu Ala Ser Leu Phe Lys Ala Arg Ala Asp Ala

420 425

<210> 2

<211> 1284

<212> DNA/RNA

<213> 转氨酶TSTA基因的核苷酸序列(Unknown)

<400> 2

atgtggacta acgctaagaa cgctgccttg agagaaagag ctgctcaggt tattccaggt 60

ggtatgtacg gtcacatgtc cactgctttg ttgccatctg agttcccaca gttcttcgct 120

agaggtaagg gttgtagaat ttgggacgct gacaacaacg agtacgtgga ctttatgtct 180

gctttcggtc catccttgtt gggttactgt gactctgata ttgacgctgc tgctcaaaga 240

caacaggctt tgggtgatgc tttgaacggt ccaggtgaag ttatggttga gttggctgag 300

cagttcgttg ctactgtttc tcatgcttcc tgggccatgt tctgcaagaa cggtactgat 360

gctaccacta tggctatggt tgttgctaga gcccataccg gtagaagaat cattttggct 420

gctgagggtg cttaccacgg tgctgcacct tggtgtgttc cagctactag atccactggt 480

actttgcctg aagagagagc ccacgttgtc tactacaagt acaacgacgc tcagtccttg 540

actgacgctt tcagaaagca cgacggtcag attgctgctg ttttcgctac tccattcaga 600

cacgaagttt tcgctgatca acacgaccca gacttggagt acgctcaaac tgctagacaa 660

ttgtgtgacg agtctggtgc cttgttggtt gttgatgatg ttagagccgg tttcagattg 720

gccagagact gttcttggtc cagattgggt attgctccag acttgtcttg ttggggtaag 780

tgtttcgcta acggttaccc aatttccgct ttgctgggtt ctgaacacgt tagagctgct 840

gccggtaaga ttttcgttac tggttctttc tggttctccg ccgttccaat ggctgctggt 900

attgctactt tgagaagaat ctcccagacc gactacttgg agagaatgat tgctactggt 960

cagcagctga gagatggatt ggctgctaga gctagagcac accaattttc cctgagacag 1020

actggtccag ttcagatgcc acagattttg ttcgaagatg accccgactt cagaatcggt 1080

tacgcttggg ttgttgagtg cttgaagaga ggtgcttact ttcacccata ccacaacatg 1140

ttcgtttccg ctgctcatac tgctgctgac attgatgttg ctttggatgc tgctgatttg 1200

gccttcgagg ccgtcagaaa aagaagaggt gatatcccac cagttgctca gttggcttct 1260

ttgttcaagg ctagagctga tgct 1284

Claims

1. 一种转氨酶TSTA在降解伏马毒素B1方面中的应用，所述转氨酶TSTA的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，所述应用为非疾病的治疗目的。