CN111394336A

CN111394336A - 一种玉米赤霉烯酮水解酶及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN111394336A
Application number: CN202010272789.1A
Authority: CN
Inventors: 褚华硕; 于海娜; 姚宏明; 宫瑞雪; 黄玉岚; 高长斌; 刘延亭
Original assignee: BEIJING VICA BIOTECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: BEIJING VICA BIOTECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2020-04-09
Filing date: 2020-04-09
Publication date: 2020-07-10

Abstract

本发明通过对玉米赤霉烯酮解毒酶的氨基酸序列进行优化，改变了解毒酶的10个氨基酸残基（与zhd101解毒酶有10个氨基酸差异），使重组后的玉米赤霉烯酮解毒酶最适反应pH由8.5降低到6.5，与鸡、猪的肠道pH非常吻合，当pH低至3.0时，解毒酶活仍保留40%以上，大大提高该玉米赤霉烯酮解毒酶作为饲料添加剂在实际应用中的解毒效率。本发明还通过对玉米赤霉烯酮解毒酶基因进行密码子优化，并将该基因在枯草芽孢杆菌中进行了表达。

Description

一种玉米赤霉烯酮水解酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及饲用酶领域，具体涉及玉米赤霉烯酮水解酶ZENWJ及编码基因和应用。

背景技术

赤霉烯酮(ZEN)是由禾谷镰刀菌产生的一种非甾体霉菌毒素，最初于1962年由Stob等从发霉的玉米中分离得到。1966年，Urry等利用经典化学，核磁共振及质朴分析等方法确定了该物质的化学结构，并称之为F-2毒素。其化学名称为：6-（10-羟基-6-氧基-十一碳烯基）-β-雷羧酸内酯，又称F-2毒素，其化学名为6-（10-羟基-6-氧基-十一碳烯基）β-雷羧酸内酯，分子式为C₁₈H₂₂O₅，分子量为318，熔点为165℃，对热较稳定，120℃加热4h不被降解。

根据联合国粮农组织（FAO）估计，全球每年约25%的粮食和饲料被霉菌毒素污染，平均2%的粮食不能食用。亚太地区大约有三分之一的饲料和饲料样品霉菌毒素检测呈现阳性。其中玉米赤霉烯酮（Zearalenone, ZEN）是世界上分布最广泛的一种真菌毒素，在亚洲、欧洲和美洲等地的谷物及农副产品种均有发生。ZEN具有类雌激素性质， ZEN具有很强的生殖毒性，能够与雌激素受体产生竞争性结合，继而表现出雌激素活性。ZEN与雌受体的结合导致雌受体构型发生改变，转移至细胞核中进一步与染色质结合，调节基因转录和蛋白质合成这两大过程，因此使细胞的分裂和生长受到影响。ZEN主要污染玉米、小麦、大麦等农作物和饲料，能引起猪、鸡等家禽或家禽的性早熟、生殖周期紊乱，给种、养殖业带来巨大损失。ZEN还具有强致癌性，导致乳腺癌、食管癌等发病率增加，成为现今癌症发病率节节上升的原因之一。

目前ZEN的检测方法已较为完善，但有关ZEN转化、降解等方面的问题迫在眉睫却仍悬而未决。ZEN污染范围广泛，危害程度严重，因此，有效控制和解决其对粮食和饲料的污染，对改善动物生产性能和提高人类食品安全有着非常重要的意义。

目前去除ZEN的方法主要包括物理法、化学法以及生物法，主要是通过破坏、修饰及吸附的方式作用于真菌毒素，从而达到削减或消除毒素的目的。物理法的毒素降解效果不太明显，化学法效果虽比物理法较佳，但可能造成营养成分丢失或化学试剂残留。

近年来ZEN生物降解方法越来越受到重视。生物法主要是基于微生物菌体对毒素的吸附作用，或利用微生物产生的胞内、胞外酶将ZEN降解成无毒或毒性较低的物质，生物法具有去毒效率高、反应条件温和不破坏营养等优点。采用高效、专一及环境友好的生物酶法进行绿色解毒，成为近年来国内外研究的新热点。目前已经发现包括细菌、真菌在内的多种微生物能够产生赤霉烯酮分解酶，有效的分解ZEN。、由于微生物及其生物酶降解ZEN的方法能够彻底去除毒素，同时，该方法的专一性强、对饲料无污染、不会影响饲料营养价值，因此，该方法在动物霉变饲料和饲料原料中的应用具有广阔的发展前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种玉米赤霉烯酮水解酶,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

其中，该酶包括264个氨基酸，未预测到信号肽序列，该蛋白理论分子量为29.3kDa。

所述水解酶是由玉米赤霉烯酮水解酶编码基因编码。

所述玉米赤霉烯酮水解酶编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种玉米赤霉烯酮水解酶基因的重组载体，重组载体包含玉米赤霉烯酮水解酶编码基因。

所述重组载体的承租载体为pHT43-zenwj。

本发明还提供了一种玉米赤霉烯酮水解酶基因的重组细胞，重组细胞包含玉米赤霉烯酮水解酶基因的重组载体。

所述重组细胞为枯草芽孢杆菌。

玉米赤霉烯酮水解酶ZENWJ的应用。

玉米赤霉烯酮水解酶基因的应用。

将本发明的玉米赤霉烯酮水解酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最有选的实施方案，优选为将本发明的赤霉烯酮水解酶基因插入到质粒pHT43上的BamH I和Xho I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控，得到重组枯草芽孢杆菌表达质粒pHT43-zenwj。

本发明还提供了包含上述赤霉烯酮水解酶基因zenwj的重组菌株，优选所述菌株为枯草芽孢ganj WB800N/zenwj。

本发明还提供了一种制备赤霉烯酮水解酶ZENWJ的方法，包括以下步骤：

1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组赤霉烯酮水解酶表达；

3）回收并纯化所表达得赤霉烯酮水解酶ZENWJ蛋白。

4）根据本发明的具体实施方式，在枯草芽孢杆菌中表达赤霉烯酮水解酶。为了测定赤霉烯酮水解酶的性质，通过如硫酸铵沉淀，透析、超滤和层析的简单方法纯化赤霉烯酮水解酶。经过简单的净化，赤霉烯酮水解酶的纯度足以研究酶学性质的研究。

本发明还提供了上述赤霉烯酮水解酶ZENWJ的应用，包括生物质能源、食品工业和饲料工业等方面的应用。

重组表达的赤霉烯酮水解酶ZENWJ具有宽泛的pH范围，在pH 2.0-8.0均具有较好的水解能力，其最适温度范围为35-40摄氏度。

附图说明

图1显示赤霉烯酮水解酶的SDS-PAGE分析结果。

图2显示赤霉烯酮水解酶降解不同浓度玉米赤霉烯酮底物降解结果。

图3为玉米赤霉烯酮水解酶ZENWJ降解实验结果。

具体实施方式

实验材料和试剂

1、菌株及载体：本发明的赤霉烯酮水解酶ZENWJ的编码基因(SEQ ID NO.2)在诺赛公司合成。

2、酶类及其它生化试剂：限制性内切酶购自TaKaRa公司，DNA连接酶购自Invitrogen公司。其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。

3、枯草芽孢杆菌培养基2xYT(每升培养基中含有16g蛋白胨、10g酵母提取物、5gNaCl，无需调节pH)。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版） J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1重组赤霉烯酮水解酶ZENWJ表达载体的构建

将优化后的基因序列由基因合成公司直接将表达载体pHT43与赤霉烯酮水解酶编码基因zenwj连接，获得重组质粒pHT43-zenwj并转化枯草芽孢杆菌WB800N，获得重组枯草芽孢杆菌菌株WB800N/zenwj。

待测序正确后，将重组质粒pHT43-zenwj转化枯草芽孢杆菌感受态WB800N进行诱导表达。分别挑取3-5个阳性转化子接种至30ml含有100μg/ml卡纳霉素的2xYT液体培养基中，37℃、250rpm培养6小时，此为预培养；将此预培养转接至300ml含有100μg/ml卡纳霉素的2xYT液体培养基中，37℃、250rpm培养2-3小时，此OD600约为0.5。将1M IPTG储液加入到此培养物中，使IPTG终浓度达到0.4mM，同时维持摇床的温度和转速不变，继续诱导6小时。4000g离心15分钟，弃菌体并收集上清。上清液中含有重组的赤霉烯酮水解酶蛋白，经测序，赤霉烯酮水解酶ZENWJ氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2重组赤霉烯酮水解酶的活性检测分析

经过密码子优化的赤霉烯酮水解酶的ZENWJ，经过IPTG诱导，表达及纯化后的蛋白SDS-PAGE分析结果如图1所示，赤霉烯酮水解酶降解不同浓度的玉米赤霉烯酮的分析如图2所示，

反应体系为：

800ul的pH6.0的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液，加上100ul溶于DMSO的0.5g/L的赤霉烯酮毒素(购自sigma公司)，然后加入100ul经过适当稀释的酶液，37摄氏度温浴小时，然后加入2倍体积的DMSO终止反应，同时剧烈震荡后，吸取部分样品过微孔滤膜后，上样高效液相分析(HPLC)，对照为适当稀释的酶液在沸水浴中5分钟灭活。

重组表达的赤霉烯酮水解酶ZENWJ具有宽泛的pH范围，在pH 2.0-8.0均具有较好的水解能力，其最适温度范围为35-40℃。

实施例3 玉米赤霉烯酮水解酶ZENWJ的应用实验

从市场上收集污染ZEN的玉米碴，检测ZEN含量为1225μg/kg。用缓冲液将枯草芽孢杆菌发酵上清液(酶液)分别稀释2、5、10倍。按照发酵液与玉米碴(v：w)1:1的比例混合均匀(即酶液添加量分别为0.1、0.2、0.5mL/g)，37℃反应0、3、6、12、24h，不加酶液作为对照。按照GB/T 23504～2009提取玉米碴中的ZEN，利用HPLC检测ZEN的残留量，计算玉米碴中ZEN的降解率。

如图3所示，随着降解时间的延长，样品中ZEN含量逐渐降低，反应前6h降解速率较快，6h以后降解速率趋于平缓。酶液添加量越高降解速率越快，降解率也越高，当酶液的添加量为0.1mL/g玉米时，反应6h ZEN的降解率仅为15.32％，反应24h后，ZEN降解率为45.18％。当酶液的添加量未0.2mL/g玉米时，反应6h ZEN的降解率为44.9%，反应24h后，ZEN降解率为41.5%。而当酶液添加量为0.5mL/g玉米时，处理6h玉米碴中ZEN含量由1225μg/kg降低到356.3μg/kg，降解率为70.9％；处理24h，玉米碴中ZEN含量降低到241.8μg/kg，降解率为80.3％。可以表明，重组表达的玉米赤霉烯酮降解酶对玉米碴等谷物和饲料中ZEN具有较好。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京大伟嘉生物技术股份有限公司

<120> 一种玉米赤霉烯酮水解酶及其编码基因和应用

<130> 1

<141> 2020-04-09

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 264

<212> PRT

<213> SEQ ID NO.1

<400> 1

Met Arg Thr Arg Ser Thr Ile Ser Thr Pro Asn Gly Ile Thr Trp Tyr

1 5 10 15

Tyr Glu Gln Glu Gly Thr Gly Pro Asp Val Val Leu Val Pro Asp Gly

20 25 30

Leu Gly Glu Cys Gln Met Phe Asp Ser Ser Val Ser Gln Ile Ala Ala

35 40 45

Gln Gly Phe Arg Val Thr Thr Phe Asp Met Pro Gly Met Ser Arg Ser

50 55 60

Ala Lys Ala Pro Pro Glu Thr Tyr Thr Glu Val Thr Ala Gln Lys Leu

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Val Ile Ser Ile Leu Asp Ala Leu Asp Ile Lys His Ala

85 90 95

Thr Val Trp Gly Cys Ser Ser Gly Ala Ser Thr Val Val Ala Leu Leu

100 105 110

Leu Gly Tyr Pro Asp Arg Ile Arg Asn Ala Met Cys His Glu Leu Pro

115 120 125

Thr Lys Leu Leu Asp His Leu Ser Asn Thr Ala Val Leu Glu Asp Glu

130 135 140

Glu Ile Ser Lys Ile Leu Ala Asn Val Met Leu Asn Asp Val Ser Gly

145 150 155 160

Gly Ser Glu Ala Trp Gln Ala Met Gly Asp Glu Val His Ala Arg Leu

165 170 175

His Lys Asn Tyr Pro Val Trp Ala Arg Gly Tyr Pro Arg Thr Ile Pro

180 185 190

Pro Ser Ala Pro Val Lys Asp Leu Glu Ala Leu Arg Gly Lys Pro Leu

195 200 205

Asp Trp Thr Val Gly Ala Ala Thr Pro Thr Glu Ser Phe Phe Asp Asn

210 215 220

Ile Val Thr Ala Thr Lys Ala Gly Val Asn Ile Gly Leu Leu Pro Gly

225 230 235 240

Met His Phe Pro Tyr Val Ser His Pro Asp Val Phe Ala Lys Tyr Val

245 250 255

Val Glu Thr Thr Gln Lys His Leu

260

<210> 2

<211> 795

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.2

<400> 2

atgagaacta gatctactat ctctactcca aacggtatca cttggtacta cgaacaagaa 60

ggtactggtc cagacgttgt tttggttcca gacggtttgg gtgaatgtca aatgttcgac 120

tcttctgttt ctcaaatcgc tgctcaaggt ttcagagtta ctactttcga catgccaggt 180

atgtctagat ctgctaaggc tccaccagaa acttacactg aagttactgc tcaaaagttg 240

gcttcttacg ttatctctat cttggacgct ttggacatca agcacgctac tgtttggggt 300

tgttcttctg gtgcttctac tgttgttgct ttgttgttgg gttacccaga cagaatcaga 360

aacgctatgt gtcacgaatt gccaactaag ttgttggacc acttgtctaa cactgctgtt 420

ttggaagacg aagaaatctc taagatcttg gctaacgtta tgttgaacga cgtttctggt 480

ggttctgaag cttggcaagc tatgggtgac gaagttcacg ctagattgca caagaactac 540

ccagtttggg ctagaggtta cccaagaact atcccaccat ctgctccagt taaggacttg 600

gaagctttga gaggtaagcc attggactgg actgttggtg ctgctactcc aactgaatct 660

ttcttcgaca acatcgttac tgctactaag gctggtgtta acatcggttt gttgccaggt 720

atgcacttcc catacgtttc tcacccagac gttttcgcta agtacgttgt tgaaactact 780

caaaagcact tgtaa 795

Claims

1.一种玉米赤霉烯酮水解酶, 其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的玉米赤霉烯酮水解酶，其特征在于，所述水解酶是由玉米赤霉烯酮水解酶编码基因编码。

3.根据权利要求2所述的玉米赤霉烯酮水解酶，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮水解酶编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种玉米赤霉烯酮水解酶基因的重组载体，其特征在于，重组载体包含玉米赤霉烯酮水解酶编码基因。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的承租载体为pHT43-zenwj。

6.一种玉米赤霉烯酮水解酶基因的重组细胞，其特征在于，重组细胞包含玉米赤霉烯酮水解酶基因的重组载体。

7.根据权利要求6所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为枯草芽孢杆菌。

8.玉米赤霉烯酮水解酶ZENWJ的应用。

9.玉米赤霉烯酮水解酶基因的应用。