CN113755468B

CN113755468B - 一种对胰蛋白酶抗性提高的玉米赤霉烯酮水解酶

Info

Publication number: CN113755468B
Application number: CN202111052143.3A
Authority: CN
Inventors: 姚冬生; 牛芳园; 钱丹; 刘大岭; 谢春芳; 刘桂祯; 黄炯威; 莫世艺
Original assignee: Guangdong Fang Can Animal Health Care Co ltd; Jinan University
Current assignee: Guangdong Fang Can Animal Health Care Co ltd; Jinan University
Priority date: 2021-09-08
Filing date: 2021-09-08
Publication date: 2023-06-30
Anticipated expiration: 2041-09-08
Also published as: CN113755468A

Abstract

本发明公开了一种对胰蛋白酶抗性提高的玉米赤霉烯酮水解酶，它是由氨基酸序列为SEQ ID NO.1的来源于粉红螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea)的玉米赤霉烯酮水解酶中制造单个氨基酸取代而产生的、对胰蛋白酶抗性更强的酶，所述的氨基酸取代是第262位的取代。本发明通过蛋白质工程技术对野生型玉米赤霉烯酮水解酶分子内的关键氨基酸残基进行了改造，提供了一种对胰蛋白酶抗性提高的玉米赤霉烯酮水解酶突变体，该酶对胰蛋白酶的抗性半衰期比野生型玉米赤霉烯酮水解酶延长了20.8％，其他酶学性质与野生型玉米赤霉烯酮水解酶基本一致。

Description

一种对胰蛋白酶抗性提高的玉米赤霉烯酮水解酶

技术领域

本发明涉及玉米赤霉烯酮水解酶，特别涉及到对胰蛋白酶抗性提高的玉米赤霉烯酮水解酶。

背景技术

玉米赤霉烯酮水解酶(简称ZHD101)，又称为玉米赤霉烯酮降解酶。玉米赤霉烯酮降解酶ZHD101基因是粉红螺旋聚孢霉中的一个编码泛解酸内酯水解酶的基因，该基因编码的蛋白ZHD101能够特异性结合并降解玉米赤霉烯酮。其反应降解机制是ZHD101将ZEN的酯键断开，变成带有开放侧链的二羟基苯基衍生物，随后丢失CO₂得到一种无毒的烷基间苯二酚产物，该产物无毒。因此，它常被用作食品添加剂，或者用作饲料添加剂以提高饲料利用率。

ZHD101分为水解酶折叠中心结构域和帽子结构。两个结构的连接处形成一个较大的凹槽，此凹槽经底物复合体结构证实为底物结合位点。底物ZEN间苯环部分主要被氢键固定，内酯环部分主要通过疏水作用力结合到活性中心。由结构分析的结果，ZHD101的催化三联体是S102，H242和E126，收集底物复合体的结构S102突变为A102。S102作为亲核试剂攻击底物内酯环中的羰基C，使得底物被水解。

迄今，有关玉米赤霉烯酮水解酶和玉米赤霉烯酮降解酶的研究主要集中于发现和筛选来自不同来源的产不同特征的玉米赤霉烯酮水解酶的菌株或通过基因重组方法获得产不同特征的玉米赤霉烯酮水解酶的菌株，以及玉米赤霉烯酮水解酶的制备与应用等。检索中国专利文库，发现有关玉米赤霉烯酮降解酶的专利有近70个，关于发现或筛选来自不同微生物来源的具有不同特征的玉米赤霉烯酮降解酶及其编码基因的专利包含多个方面：其中，关于提高玉米赤霉烯酮降解酶PH适用范围的专利有：CN202010272789.1、CN201711180443.3等；关于提高玉米赤霉烯酮降解酶酶活力的专利有：CN201910825318.6、CN201910823208.6、CN201911024030.5、CN201110082679.X等；关于综合提升玉米赤霉烯酮降解酶稳定性的专利有：CN202011381340.5、CN201810010538.9、CN201710516347.5等；关于提高玉米赤霉烯酮降解酶蛋白表达量的专利有：CN201910823034.3、CN201910822888.X、CN201910321167.0、CN201610156145.X等；通过基因重组方法获得产玉米赤霉烯酮水解酶的菌株或突变体的专利有：CN201911024030.5、CN201911023315.7、CN201711180443.3、CN202110157570.1、CN201810010538.9、CN201710322734.5等；关于玉米赤霉烯酮水解酶制备方法的专利有：CN201611249978.7、CN201510943066.9、CN201910308008.7、CN201611250033.7等；关于构建产玉米赤霉烯酮毒素降解酶基因工程菌方法的专利有：CN202110124614.0、CN202110124609.X、CN201610156145.X、CN201911018173.5、CN202011381340.5、CN201911023315.7等；关于发现或筛选不同微生物来源的产玉米赤霉烯酮降解酶的菌株的专利有：CN202011325114.5、CN201910556331.6、CN202010991141.X、CN201911186458.X、CN201910556331.6、CN201410147140.1、CN201410047870.4等；关于玉米赤霉烯酮降解酶应用的专利有：CN201911327678.X、CN201911038267.9、CN201910693874.2、CN201910298924.7、CN201610372613.7、CN201480055221.7、CN200910241454.7、CN201310356776.2、CN201310083469.1、CN201511015441.X、CN201910938276.7、CN201910228804.X等。检索中国学位论文库有关玉米赤霉烯酮降解酶的主要研究包括挖掘具有高效降解率的玉米赤霉烯酮降解酶的基因资源、研究酶学性质、催化反应机理、酶基因克隆与表达、酶的定向改造及在饲料工业等中的应用等。而有关具有胰蛋白酶抗性提高的玉米赤霉烯酮水解酶的研究和专利，迄今尚未见报道。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种对胰蛋白酶抗性提高的玉米赤霉烯酮水解酶。

本发明所述的对胰蛋白酶抗性提高的玉米赤霉烯酮水解酶，是由氨基酸序列为SEQ ID NO.1的来源于粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)的玉米赤霉烯酮水解酶中制造单个氨基酸取代而产生的，对胰蛋白酶抗性提高的玉米赤霉烯酮水解酶，所述的氨基酸取代是第262位的取代。

本发明是对玉米赤霉烯酮水解酶的基因(称为ZDH101基因)进行定点突变。由粉红螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea)中获得的玉米赤霉烯酮水解酶，其基因序列的GENBANK登录号为KR363960.1。该酶的成熟蛋白的氨基酸序列为ALI16790.1(SEQ ID NO.1)。

本发明通过对玉米赤霉烯酮水解酶进行突变筛选到了一株玉米赤霉烯酮水解酶突变体，所获得的ZHD101突变体对玉米赤霉烯酮的水解功能不受影响，对胰蛋白酶的抗性半衰期比野生型ZHD101延长了20.8％，命名为ZHD101^K262I。

根据本发明所述的定点突变改造的玉米赤霉烯酮水解酶的进一步特征，所述在第262位的氨基酸取代是用异亮氨酸取代赖氨酸。所述的定点突变改造的玉米赤霉烯酮水解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

本发明所述的玉米赤霉烯酮水解酶突变体(ZHD101^K262I)，经模拟人工胰液(pH为6.8，浓度为1mg/mL的胰蛋白酶在40℃条件下)消化处理100分钟后，溶液中残留突变体ZHD101^K262I比残留野生型ZHD101^wt的百分含量多了8.6％，其半衰期约151min，而野生型ZHD101^wt其半衰期约125min。显示突变体ZHD101^K262I对胰蛋白酶的抗性比野生型ZHD101^wt显著提高了。突变体ZHD101^K262I的其他酶学性质与野生型ZHD101^wt基本一致。

本发明的第二个目的是提供一种DNA分子，其编码本发明所述的对胰蛋白酶抗性提高的玉米赤霉烯酮水解酶。

优选地，本发明所述的突变体DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

本发明的第三个目的是提供一种载体，其含有本发明所述的DNA分子。

本发明的第四个目的是提供一种宿主细胞，其含有本发明所述的DNA分子，或者含有本发明所述的载体。

本发明的第五个目的是提供本发明所述的对胰蛋白酶抗性提高的玉米赤霉烯酮水解酶的生产方法，包括：在适于玉米赤霉烯酮水解酶表达的条件下培养本发明所述的宿主细胞，并从培养基中分离所述的玉米赤霉烯酮水解酶。

当本发明所述的DNA分子以合适的取向和正确的阅读框插入到所述的载体，或者转入所述的宿主细胞中，所述的DNA分子可以在任何真核或者原核表达系统中表达。许多宿主-载体系统都可以用来表达蛋白质编码序列。宿主-载体系统包括但不限于：用噬菌体、质粒或粘粒转化的细菌；含有酵母载体的微生物，如酵母；用病毒感染的哺乳动物细胞系统；用病毒感染的昆虫细胞系统；用细菌感染的植物细胞系统。本发明优选的载体包括病毒载体、质粒、粘粒或者寡核苷酸。

上述载体和宿主细胞都可以通过本领域公知的技术手段进行制备。本发明优选的宿主为真核系统如毕赤酵母；本发明优选的蛋白质表达方法为毕赤酵母分泌表达。

本发明的第六个目的是提供所述的对胰蛋白酶抗性提高的玉米赤霉烯酮水解酶的用途，具体是所述的对胰蛋白酶抗性提高的玉米赤霉烯酮水解酶在制备食品添加剂或饲料添加剂中的应用。

附图说明

图1和图2是SDS-PAGE蛋白电泳图，黑色箭头所指处为Marker 25Kd条带，黑色方框中为目的蛋白，大小为29Kd左右。其中，泳道1、4为不含目的基因的野生型毕赤酵母GS115对照样品；泳道2为野生型玉米赤霉烯酮水解酶蛋白培养上清；泳道3为纯化后野生型玉米赤霉烯酮水解酶蛋白；泳道5为突变体玉米赤霉烯酮水解酶蛋白培养上清；泳道6为纯化后突变体玉米赤霉烯酮水解酶蛋白。

图3是本发明所述的野生型ZHD101^wt与突变体ZHD101^K262I蛋白在人工胰液处理前和经人工胰液处理后的残留蛋白结果图；1-8泳道分别为经胰蛋白酶消化0、10、20、30、40、60、80、100min后剩余的ZHD101蛋白量。

图4为本发明所述的野生型ZHD101^wt与突变体ZHD101^K262I蛋白灰度扫描数据结果图。人工胰液中含胰蛋白酶。

具体实施方式

本文中所采用的术语，除非另有说明，均为本领域技术人员所通常理解的含义。以下提供在本发明中使用的一些特殊术语的定义。

“ZHD101^wt”表示野生型玉米赤霉烯酮水解酶，其基因以斜体“ZHD101^wt”表示。

“ZHD101^K262I”表示突变体玉米赤霉烯酮水解酶，其基因以斜体“ZHD101^K262I”表示。

实施例1：玉米赤霉烯酮水解酶基因的合成

本发明采用Clonostachys rosea来源的野生型玉米赤霉烯酮水解酶的基因(GenBank注册号为KR363960.1)，由上海捷瑞基因公司合成(其它具有全基因合成的商业公司同样可以完成)。

实施例2：玉米赤霉烯酮水解酶基因(ZHD101)与克隆载体Taox+PgHT+BBPB的连接

1.将全基因合成的含ZHD101目的基因的pGH质粒和克隆载体Taox+PgHT+BBPB分别用限制性内切酶EcoRI和SpeI/XbaI于37℃酶切30min，酶切条件如下：

2.酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后分别回收两个目的片段，用T₄DNA连接酶连接，连接体系如下：

ZHD101酶切产物	7.0μL
		克隆载体酶切产物	1.0μL
T₄DNA连接酶	1.0μL
		T₄DNA连接酶缓冲液	1.0μL
ddH₂O	1.0μL
		总体积	10.0μL

用DNA连接酶16℃连接16h，连接产物转化DH5α感受态细胞扩增后用质粒抽提试剂盒抽提质粒，用EcoRI和PstI双酶切后跑电泳结果显示有3.8kb和6.3kb两条带，表明连接成功，通过DNA测序，确定为玉米赤霉烯酮水解酶基因。

实施例3：基因片段Paox+Pgap+SS1与克隆载体M+Taox+PgHT+PB连接

1.基因片段Paox-+Pgap+SS1由本发明人保存的克隆载体Paox+SS1+PB中调出，使用EcoRI和SpeI内切酶双酶切并纯化回收获得；

2.克隆载体M+Taox+PgHT+PB由实施例2获得，基因片段Paox+Pgap+SS1与克隆载体M+Taox+PgHT+PB的连接方法同实施例2。

实施例4：定点突变

经过利用酶促反应过渡态理论和蛋白分子之间相互识别的原理，以及计算化学的方法在Discovery Studio 4.5软件平台上进行，发明人确定对第262位氨基酸进行定点突变，突变后的突变体ZHD101^K262I基因由上海捷瑞基因公司合成。也可以由其它具有全基因合成的商业公司完成基因合成。

实施例5：野生型ZHD101^wt基因与突变体ZHD101^K262I基因分别整合毕赤酵母基因组及重组蛋白的分泌表达

为了提高单拷贝表达盒在毕赤酵母染色体上的整合效率，利用限制性内切酶XbaI和Spe I对Biobricks进行线性化，以除去质粒骨架的Biobricks序列，随后利用Biobricks两端所设计的整合位点Paox和Taox可以通过同源重组双交换的方式，得到稳定的携带目的基因的重组子。本实验的受体菌为毕赤酵母GS115，电转化后使用MD平板进行初步筛选，然后挑取MD平板上的单克隆于2mL的YPG液体培养基中培养14～16h后抽取毕赤酵母基因组进行PCR验证和进一步筛选阳性克隆重组子。

实施例6：野生型ZHD101^wt及突变体ZHD101^K262I重组蛋白的SDS-PAGE电泳检测

(1)配置10mL 10％的分离胶，混匀后用微量移液器往玻璃板中灌胶，直到离短玻璃板上沿2～3厘米处停止，然后用蒸馏水封住胶面，可轻轻抬起制胶器一端然后放下使胶面平整，聚合40min后到弃蒸馏水，用滤纸吸去多余水分；

(2)配置4mL 5％的浓缩胶，均匀的灌在分离胶之上，插入相应规格的梳子同时应避免产生气泡，聚合30min待胶凝固；

(3)装好电泳槽，将槽内灌电泳液，体积宜大于电泳槽体积的一半，把制好的胶移入电泳槽中，小心拔去梳子；

(4)依次点样，点样量不宜过多，15μL每孔为合适；

(5)电泳开始时先设置90V跑胶，指示剂至浓缩胶部分将电压改为120V继续电泳，目的条带跑到中间位置时可停止电泳(目的条带对应于Maker的相应条带，事先可获知)；

(6)小心剥下凝胶，考马斯亮蓝R-250染色30min后，脱色液脱色至背景较浅蛋白条带清晰即可；

(7)凝胶成像并观察结果。SDS-PAGE蛋白电泳结果如图1和图2所示。

实施例7：电泳检测野生型ZHD101^wt及突变体ZHD101^K262I重组蛋白的胰蛋白酶抗性检测

将野生ZHD101^wt和突变体ZHD101^K262I用人工胰液(pH为6.8，浓度为1mg/mL的胰蛋白酶在40℃条件下)消化(野生型ZHD101^wt蛋白与突变体ZHD101^K262I蛋白的添加量相同，人工胰液和酶蛋白含量按照质量比为1：50的比例)分别在0、10、20、30、40、50、60、80、100min取出20μl并加入7μl蛋白电泳缓冲液终止消化并立即煮沸5min，然后进行SDS-PAGE电泳检测胰蛋白酶的消化效果，对SDS-PAGE电泳蛋白条带进行灰度扫描检测残留蛋白量，计算野生型ZHD101^wt与突变体ZHD101^K262I蛋白经胰蛋白酶处理前和处理后的酶半衰期，结果如图3和图4所示。

SEQUENCE LISTING

<110> 暨南大学、广东方善能动物保健有限公司

<120> 一种对胰蛋白酶抗性提高的玉米赤霉烯酮水解酶

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 264

<212> PRT

<213> Clonostachys rosea

<400> 1

Met Arg Thr Arg Ser Thr Ile Ser Thr Pro Asn Gly Ile Thr Trp Tyr

1 5 10 15

Tyr Glu Gln Glu Gly Thr Gly Pro Asp Val Val Leu Val Pro Asp Gly

20 25 30

Leu Gly Glu Cys Gln Met Phe Asp Ser Ser Val Ser Gln Ile Ala Ala

35 40 45

Gln Gly Phe Arg Val Thr Thr Phe Asp Met Pro Gly Met Ser Arg Ser

50 55 60

Ala Lys Ala Pro Pro Glu Thr Tyr Thr Glu Val Thr Ala Gln Lys Leu

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Val Ile Ser Ile Leu Asp Ala Leu Asp Ile Lys His Ala

85 90 95

Thr Val Trp Gly Cys Ser Ser Gly Ala Ser Thr Val Val Ala Leu Leu

100 105 110

Leu Gly Tyr Pro Asp Arg Ile Arg Asn Ala Met Cys His Glu Leu Pro

115 120 125

Thr Lys Leu Leu Asp His Leu Ser Asn Thr Ala Val Leu Glu Asp Glu

130 135 140

Glu Ile Ser Lys Ile Leu Ala Asn Val Met Leu Asn Asp Val Ser Gly

145 150 155 160

Gly Ser Glu Ala Trp Gln Ala Met Gly Asp Glu Val His Ala Arg Leu

165 170 175

His Lys Asn Tyr Pro Val Trp Ala Arg Gly Tyr Pro Arg Thr Ile Pro

180 185 190

Pro Ser Ala Pro Val Lys Asp Leu Glu Ala Leu Arg Gly Lys Pro Leu

195 200 205

Asp Trp Thr Val Gly Ala Ala Thr Pro Thr Glu Ser Phe Phe Asp Asn

210 215 220

Ile Val Thr Ala Thr Lys Ala Gly Val Asn Ile Gly Leu Leu Pro Gly

225 230 235 240

Met His Phe Pro Tyr Val Ser His Pro Asp Val Phe Ala Lys Tyr Val

245 250 255

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<210> 2

<211> 264

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

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1 5 10 15

Tyr Glu Gln Glu Gly Thr Gly Pro Asp Val Val Leu Val Pro Asp Gly

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Leu Gly Glu Cys Gln Met Phe Asp Ser Ser Val Ser Gln Ile Ala Ala

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50 55 60

Ala Lys Ala Pro Pro Glu Thr Tyr Thr Glu Val Thr Ala Gln Lys Leu

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Val Ile Ser Ile Leu Asp Ala Leu Asp Ile Lys His Ala

85 90 95

Thr Val Trp Gly Cys Ser Ser Gly Ala Ser Thr Val Val Ala Leu Leu

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115 120 125

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165 170 175

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180 185 190

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225 230 235 240

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atgcgcactc gcagcacaat ctcgaccccg aatggcatca cctggtacta tgagcaggag 60

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agctccgtgt cgcaaattgc tgcccaaggc tttcgggtca ccacgtttga catgcccgga 180

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gcttcctatg tcatctccat cctggatgct cttgacatca agcacgctac tgtctggggc 300

tgcagctcag gagcttccac cgtcgtggcg ctgttgctcg gttaccccga caggatacgc 360

aacgccatgt gccacgaact gccaacaaag ctactggacc acctttcaaa caccgctgtg 420

ctcgaagacg aggaaatctc aaagatcctg gccaatgtaa tgttgaacga cgtgtctgga 480

ggctcggagg cgtggcaagc catgggggac gaggtgcacg cgagactgca caagaactac 540

ccggtttggg ctcgaggata ccctcgcact attcctccct cagctccggt taaggatctg 600

gaggctctgc gtgggaagcc cctggactgg actgtcggcg ctgcgacacc aaccgagtct 660

ttctttgaca acattgttac cgctaccaag gctggtgtca acattgggtt gcttccaggg 720

atgcatttcc cttatgtttc ccacccggac gttttcgcta aatatgttgt ggaaactacg 780

cagatccatc tt 792

Claims

1.一种对胰蛋白酶抗性提高的玉米赤霉烯酮水解酶，其特征在于：它是如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第262位用异亮氨酸取代赖氨酸。

2.一种DNA分子，其特征在于：其编码权利要求1所述的对胰蛋白酶抗性提高的玉米赤霉烯酮水解酶。

3. 根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO. 3。

4.一种载体，其特征在于：其含有权利要求2或3所述的DNA分子。

5.一种非动物或植物品种的宿主细胞，其特征在于：其含有权利要求2或3所述的DNA分子，或者含有权利要求4所述的载体。

6.一种如权利要求1所述的对胰蛋白酶抗性提高的玉米赤霉烯酮水解酶的生产方法，其特征在于，所述方法包括：在适于玉米赤霉烯酮水解酶表达的条件下培养权利要求5所述的宿主细胞，并从培养基中分离所述的玉米赤霉烯酮水解酶。

7.如权利要求1所述的对胰蛋白酶抗性提高的玉米赤霉烯酮水解酶在制备食品添加剂或饲料添加剂中的应用。