JP7430189B2 - 外来遺伝子を発現させるためのピキア・パストリス変異株 - Google Patents

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Description

CGMCC CGMCC 16670 CGMCC CGMCC 16669 CGMCC CGMCC 19221
技術分野
本発明は、外来遺伝子を発現させるためのピキア変異株に関する。
背景技術
ピキア・パストリス(Pichia pastoris)発現系は、１９８０年代初期に開発された新しいタイプの外因性タンパク質発現系である。操作が容易、培養が容易、成長が速い、高発現および低費用などの原核生物発現系の利点があり、またグリコシル化、タンパク質リン酸化など、原核生物発現系が有しない外因性タンパク質の翻訳後修飾などの特徴も有する。同時に、分泌効率が悪い、発現株が十分に安定ではないおよび発現プラスミドを失いやすいなどのサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)の欠点も回避する。それ故に、この発現系は今日では、急速に、最良かつ最も広く使用される外来遺伝子発現系の一つとなっている。
緒方浩一らは、ある種の酵母が、増殖のための唯一の炭素源およびエネルギー源としてメタノールを使用できることを、１９６９年に初めて発見した(Ogata, et al. 1969)。それ以降、動物飼料として単細胞タンパク質を産生するためのメタノール資化酵母の使用の可能性が広く注目を浴びている。１９８７年、Cregg et al.が、初めてＢ型肝炎表面抗原(ＨｂｓＡｇ)を発現するためのメタノール栄養型酵母の使用を報告し、その後、Philip Petroleum and Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates(SIBIA)がピキア発現系の共同開発を開始した。ＳＩＢＩＡの研究者らは、ＡＯＸ遺伝子のプロモーターおよび宿主株を単離し、ベクターを構築し、対応するピキア遺伝子操作技術を開発した。Philip Petroleumの単細胞タンパク質を産生するための発酵法と組み合わされ、外因性タンパク質の効率的発現が達成された。１９９３年、Philip Petroleumは、ピキア発現系の特許をResearch Corporation Technologies(ＲＣＴ)に売却した。
ＲＣＴの基本株ＧＳ１１５は、元の株ＮＲＲＬ－Ｙ １１４３０(ATCC 76273)の化学的変異誘発に由来し、クローンスクリーニングに便利なヒスチジン栄養要求性宿主(Ｈｉｓ－)とした。ＧＳ１１５のアルコールオキシダーゼ遺伝子ＡＯＸ１は完全であり、大部分の外因性タンパク質発現にメタノールを使用できるが、そのバックグラウンドＡＯＸ１はなお効率的に発現される。よって、一部遺伝子の収率が影響を受ける。ピキア由来株のその後の方向性の一つは、ＧＳ１１５をベースにＡＯＸ１遺伝子をノックアウトし、そしてそれをサッカロマイセス・セレビシエＡＲＧ４遺伝子と置き換えて、ＫＭ７１(ｈｉｓ４ ａｒｇ４ ａｏｘ１Δ：：ＡＲＧ４)を得ることであるが、そのＡＯＸ２遺伝子はインタクトのままであり、故に、メタノール利用率が低く、唯一の炭素源としてメタノールを用いる培養下では極めて増殖が遅かった。ＡＯＸ２遺伝子をさらにノックアウトし、メタノールを使用できない宿主ＭＣ１００－３(ｈｉｓ４ ａｒｇ４ ａｏｘ１Δ：：ＳＡＲＧ４ａｏｘ２Δ：：Ｐｈｉｓ４)を得た。ＧＳ１１５をベースになされた別の方向の修飾は、宿主プロテアーゼの不活性化であった。ピキア液胞プロテアーゼＢ(プロテイナーゼＢ、ｐｒｂ１)をノックアウトしてＳＭＤ１１６５(ｈｉｓ４ ｐｒｂ１)を得るかまたは液胞アスパラギンプロテアーゼ(ＰＥＰ４)をノックアウトとしてＳＭＤ１１６８(ｈｉｓ４ ｐｅｐ４)を得た。このプロテアーゼを、カルボキシペプチダーゼＹおよびプロテアーゼＢを含む他の液胞プロテアーゼの活性化に使用した。次いで、ＳＭＤ１１６８をベースに、液胞プロテアーゼＢ(プロテイナーゼＢ、ｐｒｂ１)をさらにノックアウトして、ＳＭＤ１１６３(ｈｉｓ４ ｐｅｐ４ ｐｒｂ１)を得た。すなわち、ＰＥＰ４プロテアーゼがより重要であり、一部プロテアーゼの活性化に使用される。必要であれば、液胞プロテアーゼｐｒｂ１およびカルボキシペプチダーゼをさらにノックアウトできる。
発明の概要
本発明は、種々のタンパク質、特にホスホリパーゼおよびリパーゼの効率的発現のために使用できるピキアを得るためにピキアＣＩＣＣ３２８０６を遺伝子操作した。
本発明の第一の態様は、ピキア株ＧＳ１１５またはＣＩＣＣ３２８０６と比較して、次の６つの変異の１以上を含む、ピキア株の提供である：ＢＱ９３８２＿Ｃ１－２２６０(３０８～３１０位でＥＫＫ欠失、仮説タンパク質)；ＢＱ９３８２＿Ｃ１－３８００(Ｅ１２９Ｋ、６０Ｓリボソームサブユニット組立／輸送タンパク質ＬＯＣ１)；ＢＱ９３８２＿Ｃ１－５７００(Ｉ３１２Ｍ、ミトコンドリア外ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、クラスII ＮＡＤ(Ｐ)Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ)；ＢＱ９３８２＿Ｃ２－３９５０(Ｑ１４５Ｘ、結合対Ｐｓｒ１ｐを有し、一般的ストレス応答の完全活性化に使用される必須タンパク質)；ＢＱ９３８２＿Ｃ３－２２２０(Ｅ１８８Ｋ、仮説タンパク質)；およびＢＱ９３８２＿Ｃ３－４３７０(Ｗ１９６Ｘ、オロチジン５'－リン酸脱炭酸酵素)。
１以上の実施態様において、株は上記６つの変異を含む。
ピキア株は、受託番号CGMCC No. 16670であるピキア・パストリス株、受託番号CGMCC No. 16669であるピキア・パストリス株および受託番号CGMCC No. 19221であるピキア・パストリス株である。
１以上の実施態様において、本発明により提供されるピキア株は、ヒスチジンおよびウラシル二重欠損株である。
１以上の実施態様において、本発明は、受託番号CGMCC No. 16670であるピキア・パストリス株を提供する。
本発明はまた遺伝子操作されたピキア株も提供し、これは、受託番号CGMCC No. 16670であり、(ａ)ヒスチジン欠損株である；および／または(ｂ)増殖促進因子を発現するプラスミドを含むおよび／またはゲノムに増殖促進因子のコード化配列が統合されているおよび／または増殖促進因子を発現する、遺伝子操作されたピキア・パストリス株である。
１以上の実施態様において、遺伝子操作されたピキア株は、受託番号CGMCC No. 16669であるピキア・パストリス株である。
前記実施態様の何れかに記載されたピキア株を、目的の外来遺伝子を発現するよう遺伝子操作するための、基本株として使用できる。それ故に、本発明はまた、外来遺伝子または外来遺伝子を含むベクターを含むように遺伝子操作されている、外来遺伝子または外来遺伝子を含むベクターを含むCGMCC No. 16670の遺伝子操作されたピキア・パストリス株、ヒスチジンおよびウラシル二重欠損株、ヒスチジン単一欠損株および／または増殖促進因子を発現するプラスミドを含む、ゲノムに増殖促進因子のコード化配列が統合されているおよび／または増殖促進因子を発現する遺伝子操作されたピキア株および受託番号CGMCC No. 16669であるピキア・パストリス株を含む、前記実施態様の何れかのピキア株である遺伝子操作されたピキア株も提供する。ここに記載する外来遺伝子は、増殖促進因子をコードする遺伝子を含まず、あらゆる他の目的の外来遺伝子を、増殖促進因子を発現する遺伝子に加えて、遺伝子操作により包含させ得ることは理解される。
１以上の実施態様において、外来遺伝子は、株のゲノムに統合されている。
１以上の実施態様において、外来遺伝子は、工業、飼料または食品の分野で使用されるタンパク質のコード配列である。
１以上の実施態様において、外来遺伝子は、酵素のコード配列である。好ましくは、酵素は、次の酵素群リパーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、フィターゼ、エステラーゼ、ペクチナーゼ、ガラクトシダーゼおよびホスホリパーゼから選択される少なくとも１つである。
本発明はまた本発明の何れかの実施態様のピキア株および所望により、培養培地を含む培養物も提供する。
１以上の実施態様において、培地は種培地または発酵培地である。
１以上の実施態様において、培地はＹＰＤ培地またはＢＭＭＹ培地である。
本発明はまた、酵素のコード配列である外来遺伝子を有する本発明の何れかの実施態様のピキアの発酵ブロス、発酵により得た細胞のライセートまたは該発酵ブロスもしくはライセートの濃縮物を含む、酵素調製物も提供する。
本発明はまた、エステル交換における本発明の酵素調製物の使用も提供し、ここで、該酵素調製物はリパーゼのコード配列である外来遺伝子を有する本発明の何れかの実施態様のピキアの発酵ブロス、発酵により得た細胞のライセートまたは該発酵ブロスもしくはライセートの濃縮物を含む。
本発明はまた油脂の脱ガムにおける本発明の酵素調製物の使用も提供し、ここで、該酵素調製物は、ホスホリパーゼ(好ましくはホスホリパーゼＣ)のコード配列である外来遺伝子を有する本発明の何れかの実施態様のピキアの発酵ブロス、発酵により得た細胞のライセートまたは該発酵ブロスもしくはライセートの濃縮物を含む。
１以上の実施態様において、リパーゼのアミノ酸配列は、配列番号７または９と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列である。より好ましくは、リパーゼのアミノ酸配列は配列番号７または９に示される。
１以上の実施態様において、ホスホリパーゼのアミノ酸配列は、配列番号２と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列である。より好ましくは、ホスホリパーゼのアミノ酸配列は配列番号２に示される。
本発明は、ヒスチジンおよびウラシル二重欠損ピキア株を調製する方法を提供し、該方法は、
(１)ピキアで変異誘発を実施し、スクリーニングしてウラシル栄養要求性変異体を得る；
(２)工程(１)で得たウラシル栄養要求性変異体からＨＩＳ４遺伝子をノックアウトし、スクリーニングして、ヒスチジン欠損変異体を得る；
(３)工程(２)で得たヒスチジン欠損変異体に外来遺伝子およびＨＩＳ４遺伝子をノック員して、スクリーニングして、外来遺伝子を発現する変異体を得る；
(４)工程(３)で得た変異体で変異誘発を実施し、スクリーニングして、工程(３)でノックインした外来遺伝子は変異されていないが、該外来遺伝子の発現が比較的高いまたはその発現産物の活性が比較的高い変異体を得る；および
(５)工程(４)で得た変異体から工程(３)でノックインしたＨＩＳ４遺伝子をノックアウトし、スクリーニングしてヒスチジン欠損変異体を得る；および所望により、
(６)工程(５)で得たヒスチジン欠損変異体におけるＵＲＡ３遺伝子をノックアウトし、スクリーニングして、ヒスチジンおよびウラシル二重変異された変異体を得る
ことを含む。
本発明はまた外来遺伝子を発現するためのピキア株を調製する方法を提供し、該方法は、
(１)ピキアで変異誘発を実施し、スクリーニングしてウラシル栄養要求性変異体を得る；
(２)工程(１)で得たウラシル栄養要求性変異体からＨＩＳ４遺伝子をノックアウトし、スクリーニングして、ヒスチジン欠損変異体を得る；
(３)工程(２)で得たヒスチジン欠損変異体に外来遺伝子およびＨＩＳ４遺伝子をノックインして、スクリーニングして、外来遺伝子を発現する変異体を得る；
(４)工程(３)で得た変異体で変異誘発を実施し、スクリーニングして、工程(３)でノックインした外来遺伝子は変異されていないが、該外来遺伝子の発現が比較的高いまたはその発現産物の活性が比較的高い変異体を得る；および
(５)工程(４)で得た変異体から工程(３)でノックインしたＨＩＳ４遺伝子をノックアウトし、スクリーニングしてヒスチジン欠損変異体を得る；および所望により、
(６)工程(５)で得たヒスチジン欠損変異体におけるＵＲＡ３遺伝子をノックアウトし、スクリーニングして、ヒスチジンおよびウラシル二重変異された変異体を得る；
(７)工程(６)で得た二重変異体に増殖促進遺伝子およびＵＲＡ３遺伝子をノックインして、スクリーニングしてヒスチジン欠損変異体を得る；および
(８)工程(６)で得た二重変異体に液胞プロテアーゼＡ遺伝子およびＵＲＡ３遺伝子をノックインして、スクリーニングしてヒスチジン欠損変異体を得る。
本発明はまた外来遺伝子を発現する株の構築における、ここに記載するピキア・パストリス株の使用も提供する。
本発明のピキア変異株は、外因性発現のために有効な一般的宿主であり、効率的に種々のタンパク質、特にホスホリパーゼおよびリパーゼを発現できる。
ｍ３１４－ＳＰＬＣにより発現されたＰＬＣのＰＬＣ酵素活性の比較図。
ｍ３１４－ＳＰＬＣにより発現されたＰＬＣのタンパク質電気泳動の比較図。
ｍ３１４Ｈにより発現されたＲＭＬの酵素活性の比較図。
ｍ３１４Ｈにより発現されたＲＭＬのタンパク質電気泳動の比較図。
ｍ３１５Ｈにより発現されたＴＬの酵素活性の比較図。
ｍ３１５Ｈにより発現されたＴＬのタンパク質電気泳動の比較図。
ｍ３１６Ｈにより発現されたＴＬの酵素活性の比較図。
ｍ３１６Ｈにより発現されたＴＬのタンパク質電気泳動の比較図。
詳細な記載
本発明の範囲内で、本発明の上記技術的特徴および下に具体的に記載される技術的特徴(例えば実施例)を互いに組み合わせて、好ましい技術的解決策を構築できることは理解されるべきである。
定義：
本明細書において使用する用語「遺伝子操作」は、遺伝子スプライシング技術およびＤＮＡ組換え技術とも称される。理論的に分子遺伝学に基づき、予め設計された青写真に従って、インビトロで種々の起源からの遺伝子でハイブリッドＤＮＡ分子を構築するための手段として、分子生物学および微生物学の現代的方法を使用する。次いで、ハイブリッドＤＮＡ分子が生物の元の遺伝的特性を変える、新規変種を得るおよび新規産物を産生するように生存細胞に導入される。
本明細書において使用する用語「変異誘発」は、株の遺伝子に変異を誘導し、次いで、必要に応じて新規かつ優れた変種を該変異株を選択する、人工的手段をいう、当分野における一般的意味を有する。変異誘発育種に一般的に使用される物理的および化学的因子がある。種々の光線、マイクロ波またはレーザーなどの物理的因子が変異誘発材料の処理に使用され、習慣的に放射線育種と称される；化学的因子は、遺伝子材料に変化をもたらし得るある化学的薬物の使用 － 多様性を導入するための変異原性材料の変異原処理 － であり、しばしば化学的変異誘発と称される。
本明細書において使用する用語「変異体」は、酵母株ＣＩＣＣ３２８０６に由来し、１か所以上に修飾または変化、すなわち、置換、挿入および／または欠失を含むピキア株をいう。ピキア株変異体は、当分野で周知の種々の技術により得ることができる。特に、酵母株ＣＩＣＣ３２８０６の配列を改変する技術の例は、部位特異的変異誘発、無作為変異誘発および遺伝子操作を含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用する用語「相同性」および「同一性」は、２以上のアミノ酸配列間の類似性の程度をいう。２つの配列間の「配列同一性」パーセンテージは、次の方法で決定される：２つの最良にアラインされた配列を、比較ウィンドウ内の配列の一部が、対照配列(付加または欠失を含まない)と比較して、付加または欠失(ギャップ)を含み得るように、比較ウィンドウ内で比較する。そうして、２つの配列の最適アライメントが実施され得る。パーセンテージを次のとおり計算する：２配列で同じアミノ酸残基が出現する位置の数を決定して、マッチング位置数を得て、該マッチング位置数を比較ウィンドウにおける総数で除し、結果を１００倍して、配列同一性のパーセンテージを得る。対照配列と比較して各位置で同じである配列は対照配列と同じとみなし、逆もそうである。
本明細書において使用する用語「遺伝子ノックアウト」は、ある既知配列を含むＤＮＡフラグメントを使用して、レシピエント細胞のゲノムにおける同じまたは類似する配列を有する遺伝子との相同組換えに付し、それをレシピエント細胞のゲノムと統合させ、発現させる、外因性ＤＮＡを導入するための技術をいう。配列は知られているが、機能が未知である配列に対して、生物の遺伝子を変化させ、特定の遺伝子の機能を喪失させ、よって当該機能の一部を遮断し、さらに生物に影響を与えて、こうして遺伝子の生物学的機能を推測することができる。
本発明において、ピキアを変異誘発に付し、次いで栄養要求性変異体をスクリーニングし、それにより外来遺伝子を発現するためのピキア株を得た。具体的に、本発明は、出発株として中国工業微生物菌株収集センター(ＣＩＣＣ)から購入したＣＩＣＣ３２８０６を使用した。紫外線変異誘発、ウラシル栄養要求株Ｕ７をスクリーニングにより得た。次いで、遺伝子ノックアウトを経て、Ｕ７株におけるＨＩＳ４遺伝子を不活性化し、ヒスチジン栄養要求株７Ｈ３を得た。次いで、ＰＬＣコード配列を７Ｈ３に導入し、組み換えピキア７Ｈ３－ＳＰＬＣをスクリーニングにより得た。本発明は、７Ｈ３－ＳＰＬＣでさらに変異誘発を実施し、変異体ｍ３１４－ＳＰＬＣをスクリーニングにより得た。ｍ３１４－ＳＰＬＣからＰＬＣ遺伝子およびＨＩＳ４遺伝子をノックアウトすることにより、ｍ３１４Ｈ株を得た。さらに、ヒスチジンノックアウトベクターを構築し、本発明の株ｍ３１４Ｈに導入することができた。株を、ＹＮＢおよびヒスチジンを含む培地、ＹＮＢおよびウラシルを含む培地ならびにＹＮＢ、ヒスチジンおよびウラシルを含む培地でスクリーニングした。ＹＮＢ、ヒスチジンおよびウラシルを含む培地でのみ増殖できたスクリーニングした株はヒスチジンおよびウラシル二重栄養要求株であり、株ｍ３１４ＨＵと名付けた。さらに、本発明はまたｍ３１４ＨＵ株で３つの増殖促進遺伝子を過剰発現させ、ＵＲＡ３遺伝子をノックインして、株ｍ３１５Ｈを構築した。さらに、本発明は、ｍ３１４ＨＵ株で液胞プロテアーゼＡ遺伝子を過剰発現させ、ＵＲＡ３遺伝子をノックインして、株ｍ３１６Ｈを構築した。
完全遺伝子シークエンシングを、蘇州金維智生物科技有限会社で実施した。金維智により該株のゲノムが抽出された後、それを切断し、３'末端にＡを加え、次いで、Ｉｎｄｅｘ配列を含むリンカーとライゲートとした。この戦略に従い構築したシークエンシングライブラリーを、シークエンシングチップに結合させ、次いで、Illumina Hiseqシークエンシングに付した。再配列したシークエンサーからのデータを処理した後、元のデータを得て、リンカーを除去するために濾過し、汚染物を除去し、次いで対照ゲノムと比較した。結果の比較により、各ライブラリーにおけるＰＣＲ増幅によりもたらされた反復配列を除去し、次いで、対照ゲノムに対するシークエンシング深度および被覆度、一塩基多様性(ＳＮＶ)、挿入／欠失(ＩｎＤｅｌｓ)などを計算した。対照遺伝子セットおよびＳＮＶデータセットについて、変異注釈および機能的濃縮などのある標準的生物学的情報分析も実施できた。９９.９９％以上の被覆率、４００倍以上の平均深度および２００倍を超える深度分布が９９.９５％超を占めた。シークエンシングを介して、Ｍ３１４Ｈ、Ｍ３１５ＨおよびＭ３１６Ｈにおいて、ＧＳ１１５またはＣＩＣＣ３２８０６と比較して、少なくとも次の６か所における差異が含まれた。上記部位の遺伝子コード配列および遺伝子機能アノテーションは次のとおりである。
ＢＱ９３８２＿Ｃ１－２２６０、３０８ＥＫＫｄｅｌ、仮説タンパク質、ここで、ＢＱ９３８２＿Ｃ１－２２６０はGENEBANKにより付与された番号であり、ここで、Ｃ１：第一染色体、２２６０は遺伝子番号であり、３０８～３１０位のＥＫＫが欠失される。
ＢＱ９３８２＿Ｃ１－３８００、Ｅ１２９Ｋ、６０Ｓリボソームサブユニット組立／輸送タンパク質ＬＯＣ１。ＢＱ９３８２＿Ｃ１－３８００はGENEBANKにより付与された番号であり、ここで、Ｃ１：第一染色体、３８００は遺伝子番号であり、１２９位のＥがＫに変異される。
ＢＱ９３８２＿Ｃ１－５７００、Ｉ３１２Ｍ、ミトコンドリア外ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、クラスII ＮＡＤ(Ｐ)Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ。ＢＱ９３８２＿Ｃ１－５７００はGENEBANKにより付与された番号であり、ここで、Ｃ１：第一染色体、５７００は遺伝子番号であり、３１２位のＩがＭに変異される。
ＢＱ９３８２＿Ｃ２－３９５０、Ｑ１４５Ｘ、結合対Ｐｓｒ１ｐを有し、一般的ストレスの完全活性化に使用される必須タンパク質。ＢＱ９３８２＿Ｃ２－３９５０はGENEBANKにより付与された番号であり、ここで、Ｃ２：第二染色体、３９５０は遺伝子番号であり、１４５位のＱが停止コドンに変わる。
ＢＱ９３８２＿Ｃ３－２２２０、Ｅ１８８Ｋ、仮説タンパク質。ＢＱ９３８２＿Ｃ３－２２２０はGENEBANKにより付与された番号であり、ここで、Ｃ３：第三染色体および２２２０は遺伝子番号である。
ＢＱ９３８２＿Ｃ３－４３７０、Ｗ１９６Ｘ、オロチジン５'－リン酸脱炭酸酵素。ＢＱ９３８２＿Ｃ３－４３７０はGENEBANKにより付与された番号であり、ここで、Ｃ３：第三染色体、４３７０は遺伝子番号であり、１９６位のＷは停止コドンに変異される。当業者は、相同組換え、遺伝子ノックアウトおよび相補性、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、Ｃｒｉｓｐ／Ｃａｓ９などを含むが、これらに限定されない戦略を使用して、目的のピキア株に本明細書に開示する上記６変異の１以上を導入できる。
本発明において、変異誘発は物理的変異誘発または化学的変異誘発であり得る。物理的変異誘発は、ピキア株を、紫外線光下に一定時間、例えば、６０～１２０秒間置くなどの紫外線変異誘発を含む。化学的変異誘発は、ピキア株と、ニトロソグアニジンなどの化学的変異原を、一定時間、例えば、１５～６０分間接触させることを含む。
本発明において、ＹＮＢ(アンモニア不含酵母窒素源)を含む培地などのウラシルおよび５－フルオロオロト酸(５－ＦＯＡ)を含む培地を使用して、変異誘発株およびウラシル欠損株をスクリーニングにより得ることができる。例えば、ある実施態様において、変異誘発株を、ＹＮＢ、グリセロール、アガロース、ウラシルおよび５－フルオロオロト酸を含む培地で、暗所、２５～３３℃で、３～８日間培養し、次いで、この培地で増殖した単一コロニーを選び、ＹＮＢおよびウラシルを含む培地(例えばＹＮＢ、グリセロール、アガロースおよびウラシルを含む)に導入できる。この培地でしか増殖できない株を選択して、ウラシル欠損株を得ることができる。これらの培地において、ＹＮＢの濃度は１０～２０ｇ／Ｌであってよく、グリセロール含量は０.５～２％であってよく、アガロース含量は１～３％であってよく、ウラシルの濃度は３０～１００μg／mLであってよく、５－ＦＯＡの濃度は、存在するならば、０.５～１.２mg／mLであってよい。
ある実施態様において、本発明は、変異誘発の出発株として受託番号ＣＩＣＣ３２８０６を有するピキアを使用する。それ故に、これら実施態様において、ウラシル欠損株は、受託番号ＣＩＣＣ３２８０６を有するピキアから、変異誘発およびウラシル栄養要求性についてのスクリーニング後に、得られる株である。
得られたウラシル欠損株を、遺伝子ノックアウト法によりヒスチジンデヒドロゲナーゼ遺伝子(ＨＩＳ４)をノックアウトし、ヒスチジンを含む培地でスクリーニングして、該ヒスチジンを含む培地で増殖できる株、すなわち、ヒスチジン欠損株をスクリーニングすることができる。通常、ヒスチジンノックアウトベクターが導入されているウラシル欠損株を、ヒスチジン(例えば１０～５０μg／mL)を含むＭＤＳスクリーニングプレートで培養し、得られた単一コロニーをそれぞれＹＮＢを含む培地およびＹＮＢとヒスチジンを含む培地に接種する。ヒスチジン欠損株を、比較として、ヒスチジン含有培地で増殖できるが、ヒスチジン不含培地で増殖できない株を選択することにより、スクリーニングできる。
本発明のある実施態様において、変異誘発およびヒスチジン栄養要求性スクリーニング後得られた株を、ＰＬＣを発現するに導入し、変異体７Ｈ３－ＳＰＬＣを得るためにスクリーニングし、該変異体７Ｈ３－ＳＰＬＣはリン脂質プレートで培養したとき大きな加水分解円を有し、導入されたＰＬＣ発現に使用される核酸配列(例えばＡＯＸプロモーター、シグナルペプチド、ＰＬＣ遺伝子、転写ターミネーターなど)は変異していない。通常、ＰＬＣの発現ベクターが導入されたとき、ＨＩＳ４遺伝子が同時に導入されているならば、このように構築された株はヒスチジン栄養要求株ではない。
さらなる実施態様において、変異体を変異体ｍ３１４－ＳＰＬＣをスクリーニングするために紫外線照射などのさらなる物理的変異誘発に付すことができ、該変異体ｍ３１４－ＳＰＬＣはリン脂質プレートで培養したとき大きな加水分解円を有し、導入されたＰＬＣ発現に使用される核酸配列(例えばＡＯＸプロモーター、シグナルペプチド、ＰＬＣ遺伝子、転写ターミネーターなど)は変異していない。
慣用の技術を使用して、ＰＬＣ遺伝子およびＨＩＳ４遺伝子などのマーカー遺伝子などを含む、予め導入された外来遺伝子を変異体ｍ３１４－ＳＰＬＣからノックアウトできる。例えば、本発明の株ｍ３１４Ｈは、ＡＯＸ－Ｈｉｓ遺伝子フラグメントを構築し、変異体ｍ３１４－ＳＰＬＣを電気的形質転換し、ヒスチジン含有ホスホリパーゼスクリーニングプレートで培養し、加水分解円がない形質転換体を選択し、ヒスチジン不含プレートおよびヒスチジン含有プレートそれぞれで線条接種し、そして正しい表現型を有する形質転換体(ヒスチジン含有プレートで増殖するが、ヒスチジン不含プレートでは増殖しない)を選択することにより得ることができる。上記変異体などのこの株の構築の過程で得られた種々の変異体も本発明により保護される権利範囲に入ることは理解される。
本発明の株ｍ３１４Ｈを、２０１８年１０月３１日に中国普通微生物菌種保管センター(ＣＧＭＣＣ、北京市朝陽区北辰西路１号院３号、１００１０１)に寄託し、受託番号CGMCC No. 16670を有するピキア・パストリスと命名した。
ある実施態様において、本発明はまたヒスチジンおよびウラシル二重栄養要求株も含む。具体的に、ヒスチジンノックアウトベクターを構築し、本発明の株ｍ３１４Ｈに導入できる。ＹＮＢおよびヒスチジンを含む培地、ＹＮＢおよびウラシルを含む培地ならびにＹＮＢ、ヒスチジンおよびウラシルを含む培地でスクリーニング後、ＹＮＢ、ヒスチジンおよびウラシルを含む培地でのみ増殖できる株をスクリーニングできる。これはｍ３１４ＨＵと名付けたヒスチジンおよびウラシル二重栄養要求株である。
増殖促進遺伝子を、株ｍ３１４ＨＵに導入でき、ＵＲＡ３遺伝子をノックアウトして、増殖促進遺伝子を発現する株を構築できる。ここで、増殖促進遺伝子は、好ましくは、一般的ストレス応答に必要なタンパク質(Genbank no: XM_002491428.1)、ミトコンドリア外ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ(Genbank no: XM_002490375.1)、液胞プロテアーゼＡ(Genbank no: XM_002493288.1)を含むが、これらに限定されない酵母自体由来の増殖促進遺伝子である。増殖促進遺伝子の１以上を導入し得る。本発明はまた増殖促進遺伝子が成功裏に導入されている単一ヒスチジン欠損株も含む。ある実施態様において、本発明において得られた単一ヒスチジン欠損株を、ここで、株ｍ３１５Ｈと名付ける。
本発明の株ｍ３１５Ｈを、２０１８年１０月３１日に中国普通微生物菌種保蔵管理中心(ＣＧＭＣＣ、北京市朝陽区北辰西路１号院３号、１００１０１)に寄託し、受託番号CGMCC No. 16669を有するピキア・パストリスとして分類および命名された。
液胞プロテアーゼＡ(Genbank no: XM_002493288.1)を株ｍ３１４ＨＵに導入し、ＵＲＡ３遺伝子をノックインして、液胞プロテアーゼＡ遺伝子を過発現する単一ヒスチジン欠損株を構築した。ある実施態様において、本発明において得られた単一ヒスチジン欠損株をここで株ｍ３１６Ｈと命名した。
本発明の株ｍ３１６Ｈを、２０１９年１２月１９日に中国普通微生物菌種保蔵管理中心(ＣＧＭＣＣ、北京市朝陽区北辰西路１号院３号、１００１０１)に寄託し、受託番号CGMCC No. 19221を有するピキア・パストリスとして分類および命名された。
本発明の栄養要求性ピキア、特に株ｍ３１４Ｈ、ｍ３１４ＨＵ、ｍ３１５Ｈおよびｍ３１６Ｈは、外来遺伝子を発現するための宿主株を構築するための基本株として使用され得る。ここで、外来遺伝子は、該遺伝子が他の種由来であるかまたは該宿主ゲノムに存在するかにかかわらず、宿主株に導入される目的の遺伝子をいう。外来遺伝子は、何らかの目的のタンパク質をコードする遺伝子であり得る。目的のタンパク質は、種々のリパーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、フィターゼ、エステラーゼ、ペクチナーゼ、ガラクトシダーゼおよびホスホリパーゼを含むが、これらに限定されない、工業、飼料または食品の分野で使用される種々のタンパク質を含むが、これらに限定されない。特に、ある実施態様において、ここに記載するヒスチジン栄養要求性ピキアを使用して、外因性ホスホリパーゼＣを発現する株を構築できる。好ましくは、ホスホリパーゼのアミノ酸配列は、配列番号２と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列である；または高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１、そのｃＤＮＡ配列またはその完全長補体とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列である。ある実施態様において、ホスホリパーゼのアミノ酸配列Ｃは配列番号２に示される。好ましくは、そのコード配列は配列番号１に示される。ある実施態様において、ここに記載するヒスチジン栄養要求性ピキアを使用して、外因性リパーゼを発現する株を構築できる。好ましくは、リパーゼのアミノ酸配列は、配列番号７または９と少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列；または高ストリンジェンシー条件下で、配列番号６または８、そのｃＤＮＡ配列またはその完全長補体とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列である。用語「高ストリンジェンシー条件」は、その条件下では、いわゆる特異的ハイブリッドが形成され、非特異的ハイブリッドが形成されない条件を意味する。高ストリンジェンシー条件の例は、サザンハイブリダイゼーションで典型的洗浄条件、すなわち、１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで６０℃、好ましくは０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで６０℃、より好ましくは０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで６８℃に対応する塩濃度および温度で１回、好ましくは２回または３回の洗浄を含む。ある実施態様において、リパーゼのアミノ酸配列は配列番号７または９に示すとおりであり、そのコード配列は好ましくは配列番号６または８に示すとおりである。あるいは、ある実施態様において、本発明の株を使用して、アミノ酸配列が、配列番号２、７または９と比較して、１以上のアミノ酸残基の置換、挿入または欠失を含み、１以上(例えば、１０以内)のアミノ酸残基変異を有する、ホスホリパーゼＣまたはリパーゼＣを発現できる。好ましくは、上記１以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失は、タンパク質の通常の機能を維持する保存的変異である(すなわち、変異体ホスホリパーゼＣまたはリパーゼの活性は実質的に変わらない)。保存的変異の典型例は、保存的置換であり、置換位置が芳香族アミノ酸であるならば、Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒ間の置換が起こり；疎水性アミノ酸であるならば、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＶａｌ間の置換が起こり；極性アミノ酸であるならば、ＧｌｎおよびＡｓｎ間の置換が起こり；塩基性アミノ酸であるならば、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓ間で起こり；酸性アミノ酸であるならば、ＡｓｐおよびＧｌｕ間で起こり；そしてヒドロキシル基を有するアミノ酸であるならば、ＳｅｒおよびＴｈｒ間で置換が起こる。保存的置換と考えられる置換の例は、特にＡｌａについてＳｅｒまたはＴｈｒの置換、ＡｒｇについてＧｌｎ、ＨｉｓまたはＬｙｓの置換、ＡｓｎについてＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＨｉｓまたはＡｓｐの置換、ＡｓｐについてＡｓｎ、ＧｌｕまたはＧｌｎの置換、ＣｙｓについてＳｅｒまたはＡｌａの置換、ＧｌｎについてＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ＡｓｐまたはＡｒｇの置換、ＧｌｕについてＧｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＬｙｓまたはＡｓｐの置換、ＧｌｙについてＰｒｏの置換、ＨｉｓについてＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＡｒｇまたはＴｙｒの置換、ＩｌｅについてＬｅｕ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＰｈｅの置換、ＬｅｕについてＩｌｅ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＰｈｅの置換、ＬｙｓについてＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＨｉｓまたはＡｒｇの置換、ＭｅｔについてＩｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＰｈｅの置換、ＰｈｅについてＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、ＩｌｅまたはＬｅｕの置換、ＳｅｒについてＴｈｒまたはＡｌａの置換、ＴｈｒについてＳｅｒまたはＡｌａの置換、ＴｒｐについてＰｈｅまたはＴｙｒの置換、ＴｙｒについてＨｉｓ、ＰｈｅまたはＴｒｐの置換およびＭｅｔについてＭｅｔ、ＩｌｅまたはＬｅｕの置換を含む。さらに、このようなアミノ酸残基置換、欠失、挿入または付加は、遺伝子が由来する細菌の個体差または種差が原因の天然に生じる変異(変異体またはバリアント)を含む。
ピキアにおける外来遺伝子の発現のための慣用の骨格ベクターを使用して、ここに記載するヒスチジン栄養要求性ピキアの形質転換のために、本発明で適する発現ベクターを構築できる。このような骨格ベクターは、ｐＰＩＣ３、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ９ｋ、ｐＨＩＬ－Ｄ１、ｐＡＯ８０４、ｐＡＯ８１５およびｐＰＳＣ３Ｋなどを含むが、これらに限定されない。典型的ピキア発現ベクターは、外来遺伝子が挿入できるマルチクローニングサイト(ＭＣＳ)により分離される、アルコールオキシダーゼ－１(ＡＯＸ１)遺伝子プロモーターおよび転写ターミネーター(５'ＡＯＸ１およびＡＯＸＴＴ)を含む。このようなベクターはまたヒスチジンアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(ＨＩＳ４)選択マーカーおよび３'ＡＯＸ１領域も含み得る。この種のベクターでピキアを形質転換するとき、ベクターの５'ＡＯＸ１、ＡＯＸＴＴ、３'ＡＯＸ１およびＨＩＳ４を、ベクター全体が発現される外来遺伝子と共にレシピエントの染色体に挿入され、外来遺伝子が５'ＡＯＸ１プロモーターの制御下に発現され得るように、個々にまたは共に染色体上の相同遺伝子と再結合される。当業者は、ＡＯＸ１プロモーターが置き換えられ得ることを周知している。適当なプロモーターは、誘導型および構成的プロモーターを含むが、これらに限定されない。
ベクターの構築法は当分野で周知である。例えば、標的遺伝子がＰＣＲ増幅により得られた後、ＰＣＲ産物および骨格ベクターを対応する制限酵素で消化し、ＰＣＲ産物の消化されたフラグメントを、ＤＮＡリガーゼによりベクターの消化されたフラグメントと結合させ、結合産物を大腸菌(Escherichia coli)に導入する。適当な培地で培養後、市販のプラスミド抽出キットを使用して、ここに記載するヒスチジン栄養要求性ピキアの形質転換のためのプラスミドを抽出する。
ピキアの形質転換法も当分野で周知である。例えば、構築された発現ベクターを制限酵素で消化して線形化ベクターを得て、次いで、標準的形質転換法(Shixuan Wu & Geoffrey J Letchworth, 2004)により、ピキアのコンピテント細胞をエレクトロポレーションにより形質転換し、次いで、適当なプレート(例えばＭＤＳスクリーニングプレート)に被覆し、数日間培養する。その後、形質転換体を適当なプレートに選び出し、必要な組み換え株を、発現された外因性タンパク質の生物学的活性に従い選択する。例えば、ある実施態様において、外因性タンパク質はホスホリパーゼ(例えばホスホリパーゼＣ)であり、形質転換体はリン脂質プレートで培養される。一般に、リン脂質プレートは１～３％ＹＮＢ、１～３％リン脂質および１～３％寒天を含む。ホスホリパーゼがリン脂質を加水分解できるため、形質転換体により発現されたホスホリパーゼの活性は、加水分解円のサイズにより決定され得る。比較的大きな加水分解円を有する形質転換体の選択により、優れたヒスチジン栄養要求性ピキアが得られ得る。
それ故に、ある実施態様において、本発明はまた発現される外来遺伝子を含むヒスチジン栄養要求性ピキアも含む。外来遺伝子は、通常ピキアのゲノムに統合される。外来遺伝子を含むヒスチジン栄養要求性ピキアは、該外来遺伝子を安定に発現できる。ある実施態様において、外来遺伝子は、ホスホリパーゼまたはリパーゼのコード配列である。ある実施態様において、外来遺伝子は、ホスホリパーゼＣ、ＲＭＬリパーゼまたはＴＬリパーゼのコード配列である。ある実施態様において、ヒスチジン栄養要求性ピキアは、ｐＰＩＣ９で構築した外来遺伝子を含む発現ベクターで形質転換される。ある実施態様において、ｐＰＩＣ９で構築した外来遺伝子を含む発現ベクターは、配列番号１、６または８に示すヌクレオチド配列を含む。
ここでのヒスチジン栄養要求性ピキアを、当分野において慣用の培養培地および方法を使用して培養できる。例えば、培地は慣用のＢＭＧＹ培地であり得る。２８～３２℃および１８０～３００rpmで培養され得る。外来遺伝子の発現を誘導するとき、一定量のメタノールを培養培地に加えて、発現を誘導し得る。発現誘導後、発酵ブロスを遠心分離し、上清を濾過して、外来遺伝子により発現された標的タンパク質を含む発酵ブロスを得る。発酵ブロスを、慣用法によりさらに濃縮し得る。
ある実施態様において、発酵中、上部タンク中の初期培地は基礎的発酵培地であってよく、これは、硫酸カルシウム、リン酸二水素カリウム、無水硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、乳化シリコーン油消泡剤およびグリセリンを含み、ＰＴＭ、すなわち硫酸銅(II)五水和物、ヨウ化ナトリウム、硫酸マンガン(II)一水和物、モリブデン酸ナトリウム二水和物、塩化コバルト六水和物、塩化亜鉛五水和物、硫酸第一鉄七水和物、ホウ酸、濃硫酸およびビオチンが添加される。基礎的発酵培地中の成分の濃度または含量は当分野で周知である。例えば、硫酸カルシウムの濃度は０.５～１.５ｇ／Ｌであってよく、リン酸二水素カリウムの濃度は３０～４０ｇ／Ｌであってよく、無水硫酸マグネシウムの濃度は１０～１３ｇ／Ｌであってよく、硫酸アンモニウムの濃度は６～１２ｇ／Ｌであってよく、ｔｈｅ乳化シリコーン油消泡剤の濃度は０.１～０.５ml／Ｌおよびグリセリンの濃度は３０～７０ｇ／Ｌ。ＰＴＭにおいて、硫酸銅(II)五水和物の濃度は５～６.５ｇ／Ｌであってよく、ヨウ化ナトリウムの濃度は６０～１００mg／Ｌであってよく、硫酸マンガン(II)一水和物の濃度は２.０～４.０ｇ／Ｌであってよく、モリブデン酸ナトリウム二水和物の濃度は０.２～０.４ｇ／Ｌであってよく、塩化コバルト六水和物の濃度は０.４～０.６ｇ／Ｌであってよく、塩化亜鉛五水和物の濃度は１８～２２ｇ／Ｌであってよく、硫酸第一鉄七水和物の濃度は６０～７０ｇ／Ｌであってよく、ホウ酸の濃度は０.０１～０.０３ｇ／Ｌであってよく、濃硫酸の濃度は１９.０～１９.５ml／Ｌおよびビオチンの濃度は０.３～０.５ｇ／Ｌであってよい。
グリセリン、ＰＴＭ、消泡剤およびアンモニアを、細胞の増殖期中に加える。発酵が特定段階に達したら、例えば、細胞の湿重量が２００～２２０ｇ／Ｌに達したら、グリセリン供給を停止する。飢餓期後、メタノールを発酵のために加える。外来遺伝子発現を誘導するための発酵用メタノールを加えている間、発酵法のｐＨ、温度、溶解酸素およびメタノール流速は必要に応じて調節され得る。当業者は、ピキアがＧＡＰプロモーター、ＴＥＦプロモーターなどの構成的プロモーターも使用できることを周知している。対応するプロモーターおよび対応する発酵条件が使用される。
発酵ブロスを遠心処理に付すかまたは板枠式圧濾機処理して細胞を除去することができ、上清を精密濾過および限外濾過処理に付すことができ、さらに緩衝液置換および濃縮に付すことができる。さらに、適切な保護剤を加えてよい。適切な保護剤が完全に溶解した後、溶液を４℃で酵素調製物として保存する。
それ故に、本出願は、ここでの実施態様の何れかに記載の酵素をコードする外来遺伝子を含むピキア株の発酵ブロスまたは発酵により得た細胞のライセートまたは発酵ブロスもしくはライセートの濃縮物を含む、酵素調製物に関する。ある好ましい実施態様において、ピキア株は、ｐＰＩＣ９で構築した酵素のコード配列を含む発現ベクターを含む。ある実施態様において、酵素調製物はまたグリセリンおよび防腐剤も含み得る。防腐剤は、ソルビン酸カリウムなどの慣用の防腐剤であり得る。グリセリンおよび防腐剤の量は、当分野で慣用の量であり得る。例えば、酵素調製物の重量で４０～７０％グリセロールおよび０.１～０.８％ソルビン酸カリウムを加えてよい。ある実施態様において、酵素調製物はホスホリパーゼＣまたはリパーゼを含む。
ここに記載するホスホリパーゼＣを含む酵素調製物は、油脂の脱ガムのために使用され得る。脱ガムは、脱ガムする油と、ここに記載するホスホリパーゼＣを含む酵素調製物を接触させる工程を含む、慣用の方法により実施され得る。例えば、原油を一定温度(例えば５０±５℃)に加熱し、一定量の純水および酵素溶液を加え、高速剪断(例えば１００００ｒ／分)し、次いで一定温度で撹拌し(例えば７５０ｒ／分)、１～５時間反応させる。最後に、酵素を不活化するために反応混合物を８０～９０℃に加熱し、一定時間維持し、遠心分離して、脱ガム油を得る。
それ故に、本出願は、脱ガムする油と、ここに記載するホスホリパーゼＣを含む酵素調製物を接触させる工程を含む脱ガム法；および油の脱ガムにおけるここに記載するホスホリパーゼＣを含む酵素調製物の使用を提供する。
ある実施態様において、本出願は、エステル交換におけるここに記載するホスホリパーゼを含む酵素調製物の使用に関する。例えば、ここに提供されるのは、反応基質と、本発明のホスホリパーゼを含む酵素調製物を接触させる工程を含む、エステル交換法である。
本出願はまた、宿主細胞における外来遺伝子の発現の改善における、Genbank accession number XM_002491428.1に示す配列、Genbank accession number XM_002490375.1に示す配列、Genbank accession number XM_002493288.1に示す配列およびXM_002491428.1、XM_002490375.1またはXM_002493288.1と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％同一性を有する配列またはその発現ベクターの何れか１以上の使用または外来遺伝子を含む宿主細胞の増殖促進におけるその使用または外来遺伝子の発現能が増加したまたは増殖能が増加した宿主細胞の調製におけるその使用も提供する。好ましくは、一定配列同一性を有する配列は、酵母、より好ましくはピキアに由来する。好ましくは、宿主細胞は酵母、より好ましくはピキア、より好ましくはここに記載するｍ３１４Ｈ株またはそのヒスチジンおよびウラシル二重欠損変異体または単一ヒスチジン欠損変異体である。当分野で周知のツールを使用して、２以上の配列間の配列同一性を計算でき、これらのツールはＮＣＢＩにより提供される種々のオンラインツールに由来する。
次に、本発明を具体的実施例の形態で説明する。これらの実施例は単なる説明であり、本発明の保護範囲を限定しないことは理解される。実施例において使用される方法および材料は、特に断らない限り、全て当分野で慣用の方法および材料である。
実施例１：ウラシル栄養要求性ピキアＣＩＣＣ３２８０６－Ｕ７株の取得
１０μLのＣＩＣＣ－３２８０６株を、１０mL ＹＰＤ(２％ペプトン、１％酵母粉末、１％グリセロール)培地に接種し、一夜、３０℃で、２４０rpmで培養した。酵母溶液のＯＤ６００値を確認した。２００ＯＤ培養溶液を吸引し、４０００rpmで室温で遠心分離した。次いで、上清を除き、細胞を滅菌水で２回洗浄した。最後に酵母溶液を２０ＯＤ／mLの濃度で再懸濁した。２mLの酵母溶液をペトリ皿表面に均一に分散させ、これを、９０秒間、紫外線光下超クリーンワークベンチに置いた。１００μLを取り、ＹＮＢ－ウラシル－ＦＯＡ(１３.４ｇ／Ｌ ＹＮＢ、１％グリセロール、２％アガロース、５０μg／mL ウラシル、０.７５mg／mL ５－フルオロオロト酸(５－ＦＯＡ))固形培地に塗布し、３０℃で暗所(復帰突然変異を防止するため、全工程を赤色光下で操作した)で７日間培養した。前工程でＹＮＢ－ウラシル－ＦＯＡ固形培地で増殖した単一コロニーをＹＮＢ固形培地およびＹＮＢ－ウラシル固形培地に導入し、ＹＮＢ－ウラシル固形培地でのみ増殖できた株を選択して、ウラシル栄養要求性ピキアＣＩＣＣ３２８０６－Ｕ７株を得た。
実施例２：ヒスチジン欠損ピキアＣＩＣＣ３２８０６－７Ｈ３株の取得
ＣＩＣＣ３２８０６ゲノムを鋳型として使用して、ＨＩＳ－ＡフラグメントをＨＩＳ－ＡＦ／Ｒで増幅し、ＨＩＳ－ＢフラグメントをＨＩＳ－ＢＦ／Ｒで増幅し、ＵＲＡ３フラグメントをＵＲＡ３－１Ｆ／２Ｒで増幅した。増幅フラグメントを逐次的にｐＳＰ７２プラスミドにライゲートし、ヒスチジンノックアウトベクターｐＨＩＳＡ－ＵＲＡ３－ＨＩＳＢを構築した。プライマー配列は次のとおりである。
ＨＩＳ－Ａ－Ｆ：5'CCGCTCGAGTCACCTCAGCCAGATCAAAGT 3'(配列番号１０)；
ＨＩＳ－Ａ－Ｒ：5'ACATGCATGCCTTTGGACAACTCTTTCTGCC 3'(配列番号１１)；
ＨＩＳ－Ｂ－Ｆ：5'CGGGGTACCCCTGGTTGATAAAGTTGCAT 3'(配列番号１２)；
ＨＩＳ－Ｂ－Ｒ：5'GGCGAGCTCAGGTGTCTTCAAAGCGACTC 3'(配列番号１３)；
ＵＲＡ３－１Ｆ：ACATGCATGCCTGCAGAAATGGGGAGATAACCACC(配列番号１４)；
ＵＲＡ３－２Ｒ：CGGGGTACCACTAGTGGTTTTCTGGGGGTATTTGCTG(配列番号１５)。
ノックアウトベクターをＸｈｏＩおよびＳａｃＩで線形化し、エレクトロポレーションによりＣＩＣＣ３２８０６－Ｕ７に導入し、ヒスチジン(２０μg／mL)含有ＭＤＳスクリーニングプレートに塗布した。増殖した単一コロニーをそれぞれＹＮＢ固形培地およびＹＮＢ－ＨＩＳ固形培地に導入した。ヒスチジン栄養要求性変異体はＹＮＢ固形培地では増殖できないが、ＹＮＢ－ＨＩＳ固形培地で増殖できた。正しい表現型を有する株を、再び、ＹＮＢ固形培地およびＹＮＢ－ＨＩＳ固形培地に単一コロニー線条接種し、ＹＮＢ－ＨＩＳ固形培地でのみ増殖できた単一コロニー株を選択した。最後に、ヒスチジン欠損ピキアＣＩＣＣ３２８０６－７Ｈ３株を得た。
実施例３：ホスホリパーゼ産生株７Ｈ３－ＰＬＣの構築
コドン最適化され、生物工学(上海)株式会社により合成されたホスホリパーゼＰＬＣヌクレオチド配列は次のとおりである。
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTTGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTGGTCAGCTGAGGACAAGCATAAGGAAGGTGTGAATAGTCACTTATGGATCGTGAACCGTGCCATTGATATAATGTCTAGGAATACAACTCTGGTTAAGCAAGATAGAGTTGCTCAATTGAATGAATGGCGTACAGAGCTAGAGAATGGCATCTACGCTGCTGATTATGAAAACCCCTATTACGATAACAGTACCTTCGCTTCTCACTTTTACGATCCAGACAACGGAAAGACATATATCCCATTCGCCAAGCAAGCTAAGGAGACTGGAGCTAAGTACTTCAAGTTGGCTGGAGAGTCATACAAGAATAAAGACATGAAGCAGGCCTTCTTTTATCTTGGGTTGTCATTGCATTATTTGGGCGATGTCAACCAACCTATGCATGCCGCAAACTTTACGAACCTGTCCTATCCACAGGGTTTTCACTCCAAGTACGAGAACTTTGTCGATACTATTAAAGACAACTACAAAGTTACCGATGGGAACGGATATTGGAATTGGAAAGGCACCAACCCTGAAGAATGGATTCACGGTGCAGCAGTAGTTGCAAAACAGGACTACTCTGGAATTGTCAATGACAATACCAAAGATTGGTTTGTGAAAGCCGCAGTCTCCCAGGAATATGCAGATAAATGGAGAGCTGAAGTTACACCTATGACTGGTAAACGACTAATGGATGCCCAAAGAGTTACTGCTGGTTACATTCAATTATGGTTCGACACTTACGGTGACAGGTAA(配列番号１)
ＰＬＣのアミノ酸配列は次のとおりである。
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAWSAEDKHKEGVNSHLWIVNRAIDIMSRNTTLVKQDRVAQLNEWRTELENGIYAADYENPYYDNSTFASHFYDPDNGKTYIPFAKQAKETGAKYFKLAGESYKNKDMKQAFFYLGLSLHYLGDVNQPMHAANFTNLSYPQGFHSKYENFVDTIKDNYKVTDGNGYWNWKGTNPEEWIHGAAVVAKQDYSGIVNDNTKDWFVKAAVSQEYADKWRAEVTPMTGKRLMDAQRVTAGYIQLWFDTYGDR(配列番号２)
プライマーＰＬＣ＿Ｆ：TACGTATGGTCAGCTGAGGACAAGC(配列番号３)およびＰＬＣ＿Ｒ：CCTAGGTTACCTGTCACCGTAAGTGTCGAAC(配列番号４)を使用して、ＰＬＣの成熟ペプチド部分を増幅した。ＰＣＲをタカラのPrimeSTAR HS (DRR010A)ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施した。反応系は、水３３μL、５×PrimeSTAR緩衝液１０μL、ｄＮＴＰ混合物(各２.５mM)４μL、プライマー各１μL、プラスミド鋳型０.５μL、PrimeSTAR酵素０.５μLである。ＰＣＲ反応プログラムは９８℃で１０秒間および６８℃で１分間の３０サイクルであった。
ＰＣＲ産物を、AxygenのＰＣＲ産物精製キット(AP-PCR-50)で精製し、ＮＥＢのＳｎａＢＩおよびＡｖｒII制限エンドヌクレアーゼで消化し、再びAxygenのＰＣＲ産物精製キットで精製した。同時に、ｐＰＩＣ９Ｋプラスミドを同じ制限エンドヌクレアーゼで消化し、消化産物を同じ方法で精製した。FermentasのＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、製品指示書に従い、ＰＣＲ産物の消化フラグメントおよびｐＰＩＣ９ｋベクターの消化フラグメントをライゲートした。ライゲート産物を、ヒートショック法により大腸菌ＤＨ５αに導入し、アンピシリン含有ＬＢプレートで一夜培養した。翌日、単一クローンを選択し、ＬＢ液体培地で培養した。プラスミドをAxygenのプラスミド抽出キットを使用して抽出し、シークエンシングのために上海生物工学に送った。
正しく配列決定された組み換え発現ベクターをＢｇｌ II制限エンドヌクレアーゼで消化および線形化し、ピキアの標準的形質転換法によりピキアＣＩＣＣ３２８０６－７Ｈ３、ＳＭＤ１１６８コンピテント細胞に電気穿孔し(Shixuan Wu & Geoffrey J Letchworth, 2004)、選択培地ＭＤＳスクリーニングプレートに線条接種し、２８℃で３日間培養した。形質転換体を選択し、リン脂質プレート(１％ＹＮＢ、２％リン脂質、２％アガロース、１％グリセロール)に塗布し、３０℃で２日間培養した。加水分解円およびホスホリパーゼ遺伝子の単一コピーを有する形質転換体を選択し、７Ｈ３－ＳＰＬＣおよびＳＭＤ１１６８－ＳＰＬＣ組み換え株と番号付けした。
実施例４：ＵＶ変異誘発によるｍ３１４－ＳＰＬＣ株の取得
７Ｈ３－ＳＰＬＣコロニーを５mL ＹＰＤ培地に選択して入れ、一夜、３０℃、２４０rpm振動盤上で培養した。酵母溶液のＯＤ６００値を確認した。２００ＯＤ培養溶液を吸引し、４０００rpmで室温で遠心分離した。次いで、上清を除き、細胞を滅菌水で２回洗浄した。最後に、酵母溶液を２０ＯＤ／mLの濃度で再懸濁した。２mLの酵母溶液をペトリ皿表面に均一に分散させ、これを、９０秒間、紫外線光下超クリーンワークベンチに置いた。１００μLを取り、リン脂質プレートに塗布し、３０℃のインキュベーターで暗所(復帰突然変異を防止するため、全工程を赤色光下で操作した)で４日間培養した。大きな加水分解円を有する変異体を選択し、そのコロニーをＫＯＤ－ＦＸ酵素およびピキア発現シークエンシングユニバーサル５'ＡＯＸおよび３'ＡＯＸプライマーを、該酵素の使用指示に従い使用して、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をシークエンシングのために上海生物に送った。酵母に人工的に導入した核酸部分、すなわち、ＡＯＸプロモーター、シグナルペプチド、ＰＬＣ遺伝子、転写ターミネーターなどは変異を有さないことが判明した。それ故に、変異体の変化は、株自体の変異であった。該株をｍ３１４－ＳＰＬＣと命名した。
実施例５：７Ｈ３－ＳＰＬＣ、ｍ３１４－ＳＰＬＣおよびＳＭＤ１１６８－ＳＰＬＣの振盪フラスコ発酵
実施例２および実施例３により、３つの株７Ｈ３－ＳＰＬＣ、ｍ３１４－ＳＰＬＣおよびＳＭＤ１１６８－ＳＰＬＣに含まれるＰＬＣ遺伝子のアミノ酸配列は完全に同一であり、コピー数は１コピーであることが判明し得る。これら３つの株を、５０mLのＢＭＧＹ培地に接種し、一夜、３０℃および２４０rpmで培養し、２００ＯＤの細胞を遠心分離により集めた。細胞を滅菌水で２回再懸濁および洗浄し、次いでＢＭＭＹ培地に再懸濁した。２％メタノールをＢＭＭＹ培地に加え、３０℃および２４０rpmで発現を誘導した。０.５mLメタノールを５０mL培地に１２時間毎に加えた。３日間の誘導後、発酵ブロスを８０００rpm、４℃で遠心分離し、発酵ブロスの上清を酵素活性測定およびタンパク質電気泳動検出のために採った。
ｐＮＰＰＣホスホリパーゼ測定法：
ｐＮＰＰＣ方法ホスホリパーゼ酵素活性単位の定義：３７℃の温度および７.６のｐＨ値の条件下、基質から１分間で１μmolのホスホコリンの放出を触媒する酵素の量が１ホスホリパーゼ活性単位(Ｕ)である。
反応緩衝液の調製：０.１Ｍホウ酸－ホウ酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７.６)、２０mM ｐＮＰＰＣ、１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００、１mM ＣａＣｌ２。
測定のための具体的工程：２つの清潔な遠心管を取り、一方をサンプルチューブとして使用し、他方をブランク対照チューブとして使用した。６００μLの反応緩衝液を各遠心管に採った。２５μLの試験する酵素溶液をサンプルチューブに加え、ブランクチューブはそのままにした。２本のチューブを、一緒に３７℃一定温度の水浴に１５分間入れ、次いですぐに５００μL ０.５Ｍ水酸化ナトリウム溶液を加えて反応を停止させた。２５μLの試験する酵素溶液をブランクチューブに加えた。吸光度を４０５nmで測定した。ブランクチューブを０点の補正に使用した。
酵素活性測定の結果を図１に示す。結果は、ｍ３１４－ＳＰＬＣのホスホリパーゼ活性が、出発株７Ｈ３－ＳＰＬＣに比して１２７％およびＳＭＤ１１６８－ＳＰＬＣに比して１５２％増加したことを示す。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析：０.２２μm濾過膜を使用して上清を濾過した。Milipore 10KDa限外濾過濃縮タンクを使用して同量の上清を同じ体積まで濃縮した後、同じ体積の濃縮酵素溶液をポリアクリルアミドゲル電気泳動分析のために採った。
電気泳動の結果を図２に示す。結果は、３レーンに、３５～４０KDaバンドに位置する明らかな標的バンドがあることを示す。各レーンの標的タンパク質含量は、測定されたホスホリパーゼ活性に一致する。
それ故に、ＵＶ変異誘発により得られたｍ３１４－ＳＰＬＣ株のタンパク質発現能は、変異誘発前と比較して１２７％増加した。
実施例６：ｍ３１４－ＳＰＬＣ株からのＰＬＣ遺伝子およびＨｉｓ遺伝子のノックアウト
ＰＬＣ遺伝子のノックアウトに使用したヌクレオチド配列(ＡＯＸ－Ｈｉｓ)は次のとおりである。
CTCGAGATTCAGGTGAACCCACCTAACTATTTTTAACTGGGATCCAGTGAGCTCGCTGGGTGAAAGCCAACCATCTTTTGTTTCGGGGAACCGTGCTCGCCCCGTAAAGTTAATTTTTTTTTCCCGCGCAGCTTTAATCTTTCGGCAGAGAAGGCGTTTTCATCGTAGCGTGGGAACAGAATAATCAGTTCATGTGCTATACAGGCACATGGCAGCAGTCACTATTTTGCTTTTTAACCTTAAAGTCGTTCATCAATCATTAACTGACCAATCAGATTTTTTGCATTTGCCACTTATCTAAAAATACTTTTGTATCTCGCAGATACGTTCAGTGGTTTCCAGGACAACACCCAAAAAAAGGTATCAATGCCACTAGGCAGTCGGTTTTATTTTTGGTCACCCACGCAAAGAAGCACCCACCTCTTTTAGGTTTTAAGTTGTGGGAACAGTAACACCGCCTAGAGCTTCAGGAAAAACCAGTACCTGTGACCGCAATTCACCATGATGCAGAATGTTAATTTAAACGAGTGCCAAATCAAGATTTCAACAGACAAATCAATCGATCCATAGTTACCCATTCCAGCCTTTTCGTCGTCGAGCCTGCTTCATTCCTGCCTCAGGTGCATAACTTTGCATGAAAAGTCCAGATTAGGGCAGATTTTGAGTTTAAAATAGGAAATATAAACAAATATACCGCGAAAAAGGTTTGTTTATAGCTTTTCGCCTGGTGCCGTACGGTATAAATACATACTCTCCTCCCCCCCCTGGTTCTCTTTTTCTTTTGTTACTTACATTTTACCGTTCCGTCACTCGCTTCACTCAACAACAAAATAAACTAGTGGTACCGTCAGCCACCAAAGTAGTGAATAGACCATCGGGGCGGTCAGTAGTCAAAGACGCCAACAAAATTTCACTGACAGGGAACTTTTTGACATCTTCAGAAAGTTCGTATTCAGTAGTCAATTGCCGAGCATCAATAATGGGGATTATACCAGAAGCAACAGTGGAAGTCACATCTACCAACTTTGCGGTCTCAGAAAAAGCATAAACAGTTCTACTACCGCCATTAGTGAAACTTTTCAAATCGCCCAGTGGAGAAGAAAAAGGCACAGCGATACTAGCATTAGCGGGCAAGGATGCAACTTTATCAACCAGGGTCCTATAGATAACCCTAGCGCCTGGGATCATCCTTTGGACAACTCTTTCTGCCAAATCTAGGTCCAAAATCACTTCATTGATACCATTATTGTACAACTTGAGCAAGTTGTCGATCAGCTCCTCAAATTGGTCCTCTGTAACGGATGACTCAACTTGCACATTAACTTGAAGCTCAGTCGATTGAGTGAACTTGATCAGGTTGTGCAGCTGGTCAGCAGCATAGGGAAACACGGCTTTTCCTACCAAACTCAAGGAATTATCAAACTCTGCAACACTTGCGTATGCAGGTAGCAAGGGAAATGTCATACTTGAAGTCGGACAGTGAGTGTAGTCTTGAGAAATTCTGAAGCCGTATTTTTATTATCAGTGAGTCAGTCATCAGGAGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAATTC(配列番号５)
ＡＯＸ－Ｈｉｓ遺伝子フラグメントをＰＣＲにより増幅した。ｍ３１４－ＳＰＬＣ株をエレクトロポレーションにより形質転換し、ヒスチジン含有スホリパーゼスクリーニングプレートに塗布した。加水分解円がない形質転換体を選択し、ヒスチジン不含およびヒスチジン含有プレートに線条接種した。正しい表現型(ヒスチジン含有プレートで増殖し、ヒスチジン不含プレートで増殖しない)を有する形質転換体を選択し、ｍ３１４Ｈと命名した。株ｍ３１４Ｈを、２０１８年１０月３１日に中国普通微生物菌種保管センター(ＣＧＭＣＣ、北京市朝陽区北辰西路１号院３号、１００１０１)に寄託し、受託番号CGMCC No. 16670を有するピキア・パストリスとして分類および命名された。
実施例７：レポーター遺伝子としてＲＭＬ遺伝子を使用するｍ３１４Ｈ株の評価
ＲＭＬリパーゼ遺伝子を使用して、ｍ３１４Ｈ株の他のタンパク質の発現レベルを増強する効果を評価した。使用したＲＭＬ遺伝子はコドン最適化され、生物工学(上海)株式会社により合成された。ヌクレオチド配列は次のとおりである。
GTTCCAATCAAGAGACAATCTAATTCCACTGTCGATTCTTTGCCTCCATTGATTCCTTCTAGAACTAGTGCACCTTCATCCTCTCCATCTACAACTGACCCTGAGGCTCCAGCTATGTCAAGAAATGGTCCACTTCCTTCTGATGTTGAGACCAAGTACGGAATGGCCCTGAATGCTACTTCTTATCCAGATTCTGTCGTTCAAGCTATGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCCATCGACGGAGGTATTAGAGCCGCTACTTCTCAGGAAATCAACGAACTTACTTACTATACAACTTTGTCAGCTAATTCTTACTGTAGAACTGTTATTCCTGGTGCTACTTGGGATTGCATACATTGTGACGCCACTGAAGATTTAAAGATAATTAAAACCTGGTCTACTTTGATTTACGACACTAACGCTATGGTTGCTAGAGGAGATTCCGAGAAGACTATTTATATCGTGTTTAGAGGTTCTTCATCTATTCGTAATTGGATCGCTGATTTGACATTCGTTCCAGTCTCTTACCCTCCAGTTTCTGGTACTAAGGTTCACAAAGGATTTCTTGATTCTTATGGTGAAGTTCAAAACGAGTTGGTTGCTACTGTCTTGGATCAGTTTAAACAATACCCATCTTATAAGGTTGCTGTCACTGGTCACTCTTTGGGAGGTGCTACTGCCTTGCTGTGTGCTTTAGGTTTATACCAGAGAGAGGAAGGATTGTCTTCAAGTAACCTATTCTTGTACACTCAAGGTCAGCCTAGAGTTGGAGATCCAGCATTTGCTAATTATGTGGTTTCTACTGGTATTCCATATAGACGTACTGTTAACGAAAGAGACATAGTACCACACTTGCCTCCAGCTGCCTTCGGATTTCTGCATGCCGGTGAAGAGTACTGGATCACAGATAATTCTCCTGAAACCGTTCAAGTGTGTACATCTGATTTAGAGACTTCCGACTGCTCTAACAGTATTGTTCCATTTACTTCAGTTCTTGATCATTTGTCTTATTTTGGAATTAACACCGGTTTGTGTACTTAA(配列番号６)
ＲＭＬのアミノ酸配列は次のとおりである。
VPIKRQSNSTVDSLPPLIPSRTSAPSSSPSTTDPEAPAMSRNGPLPSDVETKYGMALNATSYPDSVVQAMKREAEASIDGGIRAATSQEINELTYYTTLSANSYCRTVIPGATWDCIHCDATEDLKIIKTWSTLIYDTNAMVARGDSEKTIYIVFRGSSSIRNWIADLTFVPVSYPPVSGTKVHKGFLDSYGEVQNELVATVLDQFKQYPSYKVAVTGHSLGGATALLCALGLYQREEGLSSSNLFLYTQGQPRVGDPAFANYVVSTGIPYRRTVNERDIVPHLPPAAFGFLHAGEEYWITDNSPETVQVCTSDLETSDCSNSIVPFTSVLDHLSYFGINTGLCT(配列番号７)
プライマーを合成ＲＭＬ遺伝子配列に基づき設計して、ｐＰＩＣ９Ｋ－ＲＭＬ発現ベクターを構築した。制限エンドヌクレアーゼＢｇｌIIで線形化後、７Ｈ３およびｍ３１４Ｈ株をそれぞれエレクトロポレーションにより形質転換した。リパーゼプレートによる選択後、加水分解円および１コピーのＲＭＬ遺伝子を有する形質転換体を選択し、７Ｈ３－ＳＲＭＬおよびｍ３１４－ＳＲＭＬと番号付けした。選択した形質転換体を振盪フラスコ発酵に付した(発酵条件は実施例５に記載した)。限外濾過により発酵ブロスを濃縮後、同じ体積の濃縮酵素溶液をリパーゼ活性測定およびポリアクリルアミドゲル電気泳動分析のために採った。
ｐＮＰＰリパーゼ測定法：ｐＮＰＰ方法リパーゼ酵素活性単位の定義：４０℃の温度および８.０のｐＨ値の条件下、基質パルミチン酸ｐ－ニトロフェニルの加水分解から１分間で１μmolのｐ－ニトロフェノール(ｐＮｐ)の放出を触媒する酵素の量が１酵素活性単位(Ｕ)である。
基質緩衝液：５.３mL ０.２mol／Ｌ ＮａＨ２ＰＯ４溶液および９４.７mL ０.２mol／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４溶液を取り、混合し、次いで約２８０mL水を加え、０.９２ｇデオキシコール酸ナトリウム、０.４４ｇアラビアガム粉末を加え、撹拌して溶解させ、Ｈ３ＰＯ４またはＮａＯＨでｐＨ８.０に調節し、４００mLに希釈し、４℃で保存した。
基質ｐＮＰＰ溶液(０.０７９５mol／Ｌ、３mg／Ｌ)：０.０３ｇのパルミチン酸ｐ－ニトロフェニル(ｐＮＰＰ)を量り、１０mLのイソプロパノールを加え、撹拌して溶解させ、４℃で保存した。
測定のための具体的工程：１mL ｐＮＰＰ溶液および９mL基質緩衝液を取り、混合した。２つの清潔な遠心管を取り、その一方をサンプルチューブとして使用し、他方をブランク対照チューブとして使用した。６００μLの反応緩衝液を各遠心管に加えた。２５μLの試験する酵素溶液をサンプルチューブに加え、ブランクチューブはそのままにした。２本のチューブを一緒に４０℃一定温度の水浴に１５分間入れ、次いで５００μL無水エタノールをすぐに加えて反応を停止させた。２５μLの試験する酵素溶液をブランクチューブに加え、１２０００rpmで２分間遠心分離した。吸光度を４０５nmで測定した。ブランクチューブを０点の補正に使用した。
酵素活性測定の結果を図３に示す。結果は、ｍ３１４－ＳＲＭＬにより発現されたＲＭＬリパーゼの活性が出発株７Ｈ３－ＳＲＭＬより９２％高かったことを示した。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析：０.２２μm濾過膜を使用して上清を濾過した。Milipore 10KDa限外濾過濃縮タンクを使用して同量の上清を同じ体積まで濃縮した後、同じ体積の濃縮酵素溶液をポリアクリルアミドゲル電気泳動分析のために採った。
電気泳動の結果を図４に示す。両レーンに、３５～４０KDaバンドに位置する明らかな標的バンドがある。各レーンの標的タンパク質含量は、測定されたホスホリパーゼ活性に一致する。
実施例５および実施例７の結果をまとめると、ＵＶ変異誘発により得られたｍ３１４Ｈ株を使用してＰＬＣおよびＲＭＬを発現させたとき、そのタンパク質発現能は、出発株７Ｈ３と比較して、それぞれ１２７％および９２％増加した。
実施例８：ｍ３１４Ｈ株における増殖促進遺伝子過発現
ＣＩＣＣ３２８０６ゲノムを鋳型として使用して、ＨＩＳ－ＡフラグメントをＨＩＳ－ＡＦ／Ｒで増幅し、ＨＩＳ－ＢフラグメントをＨＩＳ－ＢＦ／Ｒで増幅した。増幅フラグメントを逐次的にｐＳＰ７２プラスミドにライゲートし、ヒスチジンノックアウトベクターｐＨＩＳＡ－ＨＩＳＢを構築した。ノックアウトベクターをＸｈｏＩおよびＳａｃＩで線形化し、エレクトロポレーションによりｍ３１４Ｈへ形質転換し、ヒスチジン、ウラシルおよび５－ＦＯＡを含むＭＤＳスクリーニングプレートに塗布した。増殖した単一コロニーをそれぞれＹＮＢ－ＨＩＳ固形培地、ＹＮＢ－ウラシルおよびＹＮＢ－ウラシル－ＨＩＳ固形培地に導入した。ヒスチジンおよびウラシル二重栄養要求性形質転換体は、ＹＮＢ－ウラシル－ＨＩＳでしか増殖できない単一コロニー株であった。こうして、ヒスチジンおよびウラシル二重栄養要求性ピキアｍ３１４ＨＵ株が最後に得られた。
ＣＩＣＣ３２８０６ゲノムを鋳型として使用して、ＵＲＡ３フラグメントをプライマーＵＲＡ３－１Ｆ／２Ｒで増幅させた。３つの増殖促進フラグメントである一般的ストレス応答に必要なタンパク質(Genbank no: XM_002491428.1)、ミトコンドリア外ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ(Genbank no: XM_002490375.1)およびプロテイナーゼＡ(Genbank no: XM_002493288.1)は生物工学(上海)株式会社により合成された。次いで、これら３つの遺伝子フラグメントおよびＵＲＡ３フラグメントをそれぞれｐＳＰ７２プラスミドに逐次的にライゲートし、過発現ベクターｐＵＲＡ３－ストレス、ｐＵＲＡ３－ＮＡＤＨおよびｐＵＲＡ３－ＰｒｏＡを構築した。ノックアウトベクターをＸｈｏＩおよびＢｇｌIIで線形化した。３つの増殖促進遺伝子過発現ベクターフラグメントを共エレクトロポレーションによりｍ３１４Ｈへ形質転換し、ヒスチジン含有ＭＤＳスクリーニングプレートに塗布した。ＰＣＲ検証を使用して、全過発現遺伝子のｍ３１５Ｈ株への導入が成功したことを保証した。株ｍ３１５Ｈを、２０１８年１０月３１日に中国普通微生物菌種保管センター(ＣＧＭＣＣ、北京市朝陽区北辰西路１号院３号、１００１０１)に寄託し、受託番号CGMCC No. 16669を有するピキア・パストリスとして分類および命名された。
使用されたGenbank no: XM_002491428.1、Genbank no: XM_002490375.1およびGenbank no: XM_002493288.1の配列は以下のとおりである:
>XM_002491428.1 Komagataella phaffii GS115 Protein required, with binding partner Psr1p, for full activation of the general stress response (PAS_chr2-1_0559), partial mRNA （一般的ストレス応答の完全活性化に使用される、結合対Ｐｓｒ１ｐを有する、Komagataella phaffii GS115タンパク質 (PAS_chr2-1_0559)、部分的ｍＲＮＡ）
ATGAATAGCGTCATCACTCAAGTTGAAGAGAACAGGTCTGATAGCCATCTGTCCAGTGAAGCACAGCAGTTTGACGATGACTATAACACTGAGATCCGGCTCAACATACGCGGAACTAGCGCAACCATTACCAGAGATGAACTGATGGCACTACCAGAAAGCATTCTACTGTGTTTGTTTCCCAACGGAGTGTTTGTAGATATCGAAGGAAATGTCATCACAAACCTTACAGAGGAGGATGTTGTGTACGTAAATTTCTCACCAGAGTGCTTCAACTATATAGTGGATACTTTCAACGAAGCAGCAGCCTCCGATATCAATAGAGTCCACGACGAAAGGCTAGTGATCGAAGATGGTGCCGACCTGTTGCAGAGCAAGCCTTCAGTTATCGTTCTTCGTGAGGATCTCGACTACTATTGTATCCCGCCCGTCCAAGGAATGAGCAAAGAACAGATGATTCAAGTCAAAATAGAAGTTGGACATTCACTAGTCAATGAGGCACACATATTTAAGGGTCTTGGCCATCAACAGAATAAGACTTTGGGTCCTGCTGAGCAGCACCTTGCGGATATGCTGTGCTCATCGGGATTCGTTGCTGACGGTTGCTGGGGCCACCGGTCTTTAGAACCTGATAAGACAGTTGTGTTCTCCCTAGCATTGGTGCGATTGAAGCCAGACAGCCCTGAAGATACTACCAACACCAAGAAATCTAAATTCAACACATTGCAATACCGTAACTCCCGAAAAAAGGCCAAAGAAAACACTACAGCCACAAAACTTCTGCTATTTTGGAGGAAGCCAGCTCGTAAATGTTGGTGGGCCAGTGAAATGATCAAAACCGATCTCTCAAGACTTAATTTGAAAGACAGCAATGGAAATCCCATTTCAACGGTGGAAATTAAAGTTCACATTAGAAGAGTTTGGACTTTGGAGTTGTCAGTGATTGGAGTGCAATAA (配列番号１８)

>XM_002490375.1 Komagataella phaffii GS115 Mitochondrial external NADH dehydrogenase, a type II NAD(P)H:quinone oxidoreductase (PAS_chr1-4_0299), partial mRNA （Komagataella phaffii GS115 ミトコンドリア外ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、クラスII ＮＡＤ(Ｐ)Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ(PAS_chr1-4_0299)、部分的ｍＲＮＡ）
ATGTTTTCTAGAAGCGCTAGGCAATTGGGTAGTGGGAGCATATTGAGGAGTCCACTTCGTTCTGCGTTCCGTCGGGCTGCTTCTACCACCCCAACTACTCCAGTCCCACCACCACCCCCTCCAATTCCAGCTACTACTCCAGTGGTTAAGAAGAAGAGAATCGGCTTTTTCCGTTTGACTTGGAGACTGACCTGGCTATCGTTGTTGGGTAGTGCTGCGTACTTGACTTACGAGGTTTACAAGGAAGTCAATCCTTCTCCACAGATCCCACAAAGTCCTCTGAAGCCAAATGGAAACCGTCGGAAAACCGTCGTCATCTTGGGTTCCGGTTGGGGTGCAATTTCCACTTTGAAACATTTGGATACTTCCCTGTACAACGTGGTCGTCGTCTCTCCAAGAAACTACTTTTTGTTCACCCCATTGCTTCCTTCCGTTCCGACCGGAACTATCGACTTGAAATCGATTATAGACCCTGTGAGAACTATCGCCAAGTCAACCCCAGGTGAGGTGACATATTTGGAAGCTGAGGCTACTGATATCGATATTGCTAAGAAACAACTGACTATCCAACATTCGTCTTACTCTGCCACTTCTGGTGTTCACCACGTCACTATTGGCGGAGATGAAGCCAAGCCTATTGTCGCAACTATTGAATATGACTATCTGGTCTTCGCCATTGGTGCACAAACTGCAACCTTCGGAATTCCAGGAATTGAGAAGTATGCCTACTACCTGAAGGAAACTGATGATGCTGCCAGAATCCGTCGTTCTCTGTTTGAAACCATTGAAGCCTCTCAATTGCTTCCAAAGGACTCCGAAGAGAGAAAACGTTTGTTGTCTGTCGTCGTCTGTGGTGGAGGCCCAACTGGCGTTGAGTTGGCTGCCGAGATCAAGGACTACATTGATGAAGACCTTTCCAGATTTGTGCCAGGAATTGAGAACGAAATGTCCGTTACTCTAGTCGAAGCCCTTCCAAATGTTCTGAACGCTTTTAACCACAAGTTAATTGAGTACACTGAGTCTATTTTTGAGAAGCAGCAATTGGACCTTAGAGTTAACACCATGGTCAAAAAGGTTGATGACAAGAACGTTTACGCTACAGTCAAGAAATCTGGTGGTGACACTGAAAATGTTACAATTCCATATGGAACTTTAGTTTGGGCCACCGGTAATGGTCCTCGTCCTTTGACGAAAGCTGTTGCTGCCCAAATTGAAGAGCAGAAAACTGCAAGAAGAGGCCTGCTTATCGGCGAACATTTGTTAGTCGATGGCACTGACTCCGTGTTTGCCCTTGGAGATTGTACCTTCACGAAGAACCCACCTACCGCCCAAGTTGCTCACCAAGAGGGTATTTATTTAGCATCTCATTTGGCCAAACTCTCCAAGATTGACGACCTCAAGTATGAAATTGGTCAGAACACCGATCCTGAGCAATTAGTCCGCTTGCAGCGCCGTTTGGACAGAACCCAAGCTTCGATTCTGCCTTTCAAGTACACTCACCAAGGTGCTCTCGCATACATTGGTTCCGAACGTGCTGTTGCCGATTTAGTTTGGGGTGACTGGTCCAACGTTTCCACTGGAGGATCGCTTACGTTCCTGTTCTGGAGATCCGCCTATGTATCCATGATGTTGGGAGTTCGTACCAAGATTTTGGTCGTCTCTGATTGGATCAAGGTCAAAGTCTTTGGAAGAGATTGTTCCAAGGAATAA (配列番号１９)

>XM_002493288.1 Komagataella phaffii GS115 Vacuolar aspartyl protease (proteinase A) (PAS_chr3_1087), partial mRNA （Komagataella phaffii GS115液胞アスパラギンプロテアーゼ(プロテイナーゼＡ) (PAS_chr3_1087)、部分的ｍＲＮＡ）
ATGATATTTGACGGTACTACGATGTCAATTGCCATTGGTTTGCTCTCTACTCTAGGTATTGGTGCTGAAGCCAAAGTTCATTCTGCTAAGATACACAAGCATCCAGTCTCAGAAACTTTAAAAGAGGCCAATTTTGGGCAGTATGTCTCTGCTCTGGAACATAAATATGTTTCTCTGTTCAACGAACAAAATGCTTTGTCCAAGTCGAATTTTATGTCTCAGCAAGATGGTTTTGCCGTTGAAGCTTCGCATGATGCTCCACTTACAAACTATCTTAACGCTCAGTATTTTACTGAGGTATCATTAGGTACCCCTCCACAATCGTTCAAGGTGATTCTTGACACAGGATCCTCCAATTTATGGGTTCCTAGCAAAGATTGTGGATCATTAGCTTGCTTCTTGCATGCTAAGTATGACCATGATGAGTCTTCTACTTATAAGAAGAATGGTAGTAGCTTTGAAATTAGGTATGGATCCGGTTCCATGGAAGGGTATGTTTCTCAGGATGTGTTGCAAATTGGGGATTTGACCATTCCCAAAGTTGATTTTGCTGAGGCCACATCGGAGCCGGGGTTGGCCTTCGCTTTTGGCAAATTTGACGGAATTTTGGGGCTTGCTTATGATTCAATATCAGTAAATAAGATTGTTCCTCCAATTTACAAGGCTTTGGAATTAGATCTCCTTGACGAACCAAAATTTGCCTTCTACTTGGGGGATACGGACAAAGATGAATCCGATGGCGGTTTGGCCACATTTGGTGGTGTGGACAAATCTAAGTATGAAGGAAAGATCACCTGGTTGCCTGTCAGAAGAAAGGCTTACTGGGAGGTCTCTTTTGATGGTGTAGGTTTGGGATCCGAATATGCTGAATTGCAAAAAACTGGTGCAGCCATCGACACTGGAACCTCATTGATTGCTTTGCCCAGTGGCCTAGCTGAAATTCTCAATGCAGAAATTGGTGCTACCAAGGGTTGGTCTGGTCAATACGCTGTGGACTGTGACACTAGAGACTCTTTGCCAGACTTAACTTTAACCTTCGCCGGTTACAACTTTACCATTACTCCATATGACTATACTTTGGAGGTTTCTGGGTCATGTATTAGTGCTTTCACCCCCATGGACTTTCCTGAACCAATAGGTCCTTTGGCAATCATTGGTGACTCGTTCTTGAGAAAATATTACTCAGTTTATGACCTAGGCAAAGATGCAGTAGGTTTAGCCAAGTCTATTTAG（配列番号２０）
実施例９：レポーター遺伝子としてＴＬ遺伝子を使用するｍ３１５Ｈ株の評価
ＴＬリパーゼ遺伝子を使用して、ｍ３１５Ｈ株の他のタンパク質の発現レベルを増強する効果を評価した。使用したＴＬ遺伝子はコドン最適化され、生物工学(上海)株式会社により合成された。ヌクレオチド配列は次のとおりである。
GAAGTCTCTCAAGACTTGTTCAACCAGTTCAACTTGTTCGCTCAATACTCTGCCGCTGCCTACTGTGGTAAGAACAATGATGCTCCAGCTGGTACTAACATTACCTGTACTGGTAACGCTTGTCCAGAAGTTGAGAAGGCTGATGCTACCTTCCTGTACTCCTTCGAAGACTCTGGAGTTGGAGATGTTACTGGTTTCCTGGCCTTGGATAACACTAACAAGTTGATCGTTCTGTCCTTCAGAGGTTCCAGATCCATCGAGAACTGGATTGGTAACTTGAACTTTGACTTGAAGGAGATCAACGACATCTGTTCTGGATGTCGTGGTCACGATGGATTTACCTCCTCTTGGAGATCTGTTGCTGATACCTTGAGACAGAAGGTCGAAGATGCTGTCAGAGAACATCCAGACTATAGAGTTGTCTTCACTGGTCACTCCTTGGGAGGTGCCTTGGCTACTGTTGCTGGTGCTGACTTGCGTGGTAATGGTTATGACATTGATGTCTTCTCCTACGGTGCTCCAAGAGTTGGTAATCGTGCCTTCGCTGAGTTTCTGACCGTCCAAACTGGAGGTACTTTGTACAGAATTACCCATACTAACGACATTGTTCCAAGATTGCCACCACGTGAGTTCGGATACTCTCATTCCTCTCCAGAGTACTGGATCAAGTCTGGAACCTTGGTTCCAGTCACTCGTAACGACATCGTCAAGATTGAAGGTATTGATGCCACTGGAGGTAACAATCAACCAAACATTCCAGACATTCCAGCTCACTTGTGGTACTTTGGTCTGATTGGTACTTGCTTGTAA(配列番号８)；
ＴＬアミノ酸配列は次のとおりである。
EVSQDLFNQFNLFAQYSAAAYCGKNNDAPAGTNITCTGNACPEVEKADATFLYSFEDSGVGDVTGFLALDNTNKLIVLSFRGSRSIENWIGNLNFDLKEINDICSGCRGHDGFTSSWRSVADTLRQKVEDAVREHPDYRVVFTGHSLGGALATVAGADLRGNGYDIDVFSYGAPRVGNRAFAEFLTVQTGGTLYRITHTNDIVPRLPPREFGYSHSSPEYWIKSGTLVPVTRNDIVKIEGIDATGGNNQPNIPDIPAHLWYFGLIGTCL(配列番号９)。
プライマーを合成合成ＴＬ遺伝子配列に基づき設計して、ｐＰＩＣ９Ｋ－ＴＬ発現ベクターを構築した。制限エンドヌクレアーゼＢｇｌIIで線形化後、７Ｈ３、ｍ３１４Ｈおよびｍ３１５Ｈ株をそれぞれエレクトロポレーションにより形質転換した。リパーゼプレートによるスクリーニング後、加水分解円および１コピーのＴＬ遺伝子を有する形質転換体を選択し、７Ｈ３－ＳＴＬ、ｍ３１４－ＳＴＬおよびｍ３１５－ＳＴと番号付けした。選択した形質転換体を振盪フラスコ発酵に付した。限外濾過により発酵ブロスを濃縮後、同じ体積の濃縮酵素溶液を採り、リパーゼ活性測定およびポリアクリルアミドゲル電気泳動分析をｐＮＰＰ方法リパーゼ測定法により実施した。
酵素活性測定の結果を図５に示す。結果は、ｍ３１５－ＳＴＬにより発現されるＴＬリパーゼ活性が、ｍ３１４－ＳＴＬに比して３９％増加したことを示す。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析：０.２２μm濾過膜を使用して上清を濾過した。Milipore 10KDa限外濾過濃縮タンクを使用して同量の上清を同じ体積まで濃縮した後、同じ体積の濃縮酵素溶液をポリアクリルアミドゲル電気泳動分析のために採った。
電気泳動の結果を図６に示す。３レーンに、３５～４０KDaバンドに位置する明らかな標的バンドがある。各レーンの標的タンパク質含量は、測定されたＴＬリパーゼ活性に一致する。
実施例５、実施例７および実施例９の結果をまとめると、株７Ｈ３のＵＶ変異誘発により得られたｍ３１４Ｈを使用してＰＬＣ、ＲＭＬおよびＴＬを発現するとき、タンパク質発現能は、出発株７Ｈ３に比してそれぞれ１２７％、９２％および８６％増加し、これは、株ｍ３１４Ｈが外因性タンパク質を発現する能力が出発株７Ｈ３より有意に優れ、優れた特徴を有することを証明した。３種の増殖促進遺伝子を、さらにｍ３１４Ｈで過発現させ、株ｍ３１５Ｈを構築した。株ｍ３１５ＨがＴＬを発現するとき、タンパク質発現レベルはｍ３１４Ｈに比してさらに３９％増加することが判明した。ｍ３１５Ｈのタンパク質発現レベルはさらに増加した。
実施例１０：ｍ３１４Ｈ株における液胞プロテアーゼＡの過発現
ＣＩＣＣ３２８０６ゲノムを鋳型として使用して、ＵＲＡ３フラグメントをプライマーＵＲＡ３－１Ｆ／２Ｒで増幅させた。液胞プロテアーゼＡ(Genbank no: XM_002493288.1)遺伝子フラグメントは生物工学(上海)株式会社により合成され、プロテイナーゼＡ遺伝子フラグメントはプライマーｐｒｏＡＦ：CGAGTTTCTCCGTATCTAAT（配列番号１６）およびｐｒｏＡＲ：TCCTCATCTATACCCCAGG（配列番号１７）で増幅させた。増幅したＵＲＡ３フラグメントおよびプロテイナーゼＡフラグメントを実施例８で得られたｍ３１４ＨＵにエレクトロポレーションにより共形質転換した。電気導入された材料をヒスチジン含有ＭＤＳスクリーニングプレートに塗布した。ＰＣＲ検証を使用して、全形質転換遺伝子の導入が成功し、ｍ３１６Ｈ株が得られたことを保証した。株ｍ３１６Ｈは、２０１９年１２月１９日に中国普通微生物菌種保管センター(ＣＧＭＣＣ、北京市朝陽区北辰西路１号院３号、１００１０１)に寄託され、受託番号CGMCC No. 19221を有するピキア・パストリスとして分類および命名された。
ゲノムシークエンシング後、３コピーのプロテイナーゼＡがｍ３１６Ｈ株にあり、そのうち２つは元のプロテイナーゼＡゲノム位置に位置し、他のコピーは後期促進複合体／サイクロソームコード領域のサブユニットであるＢＱ９３８２＿Ｃ２－３７００遺伝子に挿入された。
実施例１１：レポーター遺伝子としてＴＬ遺伝子を使用するｍ３１６Ｈ株の評価
実施例９で構築したｐＰＩＣ９Ｋ－ＴＬ発現ベクターを制限エンドヌクレアーゼＢｇｌIIにより線形化し、次いで電気穿孔してｍ３１６Ｈ株を形質転換した。リパーゼプレートスクリーニング後、加水分解円および１コピーのＴＬ遺伝子を有する形質転換体を選択し、ｍ３１６－ＳＴＬと番号付けした。選択した形質転換体を、振盪フラスコ発酵で実施例９で得られた７Ｈ３－ＳＴＬ、ｍ３１４－ＳＴＬおよびｍ３１５－ＳＴＬと比較した。限外濾過により発酵ブロスを濃縮後、同じ体積の濃縮酵素溶液を採り、リパーゼ活性測定およびポリアクリルアミドゲル電気泳動分析をｐＮＰＰ方法リパーゼ測定法により実施した。
酵素活性測定の結果を図７に示す。結果は、ｍ３１６－ＳＴＬにより発現されるＴＬリパーゼ活性がｍ３１５－ＳＴＬに類似し、ｍ３１４－ＳＴＬより４５％高いことを示す。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析：０.２２μm濾過膜を使用して上清を濾過した。Milipore 10KDa限外濾過濃縮タンクを使用して同量の上清を同じ体積まで濃縮した後、同じ体積の濃縮酵素溶液をポリアクリルアミドゲル電気泳動分析のために採った。
電気泳動の結果を図８に示す。４レーンに、３５～４０KDaバンドに位置する、明らかな標的バンドがある。各レーンの標的タンパク質含量は測定されたＴＬリパーゼ活性に一致する。
実施例１２：本発明のピキア株のゲノムシークエンシングおよび既存ピキアゲノムとの比較
本明細書に記載する３１８０６、ｍ３１４、ｍ３１５およびｍ３１６株を、ゲノムシークエンシングのために蘇州金維智生物科技有限会社に提供した。株のゲノムが金維智により抽出された後、それを切断し、３'末端にＡを加え、次いで、Ｉｎｄｅｘ配列を含むリンカーとライゲートとした。この戦略に従い構築したシークエンシングライブラリーを、シークエンシングチップに結合させ、次いでIllumina Hiseqシークエンシングに付した。再配列したシークエンサーからのデータを処理した後、元のデータを得て、リンカーを除去するために濾過し、汚染物を除去し、次いで対照ゲノムと比較した。結果の比較により、各ライブラリーにおけるＰＣＲ増幅によりもたらされた反復配列を除去し、次いで、対照ゲノムに対するシークエンシング深度(sequencing depth)およびカバー率(coverage)、一塩基多様性(ＳＮＶ)、挿入／欠失(ＩｎＤｅｌｓ)などを計算した。対照遺伝子セットおよびＳＮＶデータセットについて、変異注釈および機能的濃縮などのある標準的生物学的情報分析も実施できた。９９.９９％以上のカバー率、４００倍以上の平均深度および２００倍を超える深度分布が９９.９５％超を占めた。
ゲノムシークエンシングおよび既存ピキアゲノムとの比較後、本発明の出発株ＣＩＣＣ３２８０６およびＧＳ１１５で、ゲノムで１１２５のＳＮＶ事象および８３０のＩＮＤＥＬ事象が報告された。明らかに、本発明の出発株はＧＳ１１５と顕著に異なった。比較後、本発明のｍ３１４Ｈ、ｍ３１５Ｈおよびｍ３１６Ｈ株ならびにＧＳ１１５またはＣＩＣＣ３２８０６株のゲノムは、少なくともゲノムに次の変化があった：ＢＱ９３８２＿Ｃ１－２２６０(３０８～３１０位でＥＫＫ欠失、仮説タンパク質)；ＢＱ９３８２＿Ｃ１－３８００(Ｅ１２９Ｋ、６０Ｓリボソームサブユニット組立／輸送タンパク質ＬＯＣ１)；ＢＱ９３８２＿Ｃ１－５７００(Ｉ３１２Ｍ、ミトコンドリア外ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、クラスII ＮＡＤ(Ｐ)Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ)；ＢＱ９３８２＿Ｃ２－３９５０(Ｑ１４５Ｘ、結合対Ｐｓｒ１ｐを有し、一般的ストレス応答の完全活性化に使用される必須タンパク質)；ＢＱ９３８２＿Ｃ３－２２２０(Ｅ１８８Ｋ、仮説タンパク質)；およびＢＱ９３８２＿Ｃ３－４３７０(Ｗ１９６Ｘ、オロチジン５'－リン酸脱炭酸酵素)。

Claims (25)

  1. 受託番号CGMCC No. 16670のピキア株。
  2. 受託番号CGMCC No. 16669のピキア株。
  3. 受託番号CGMCC No. 19221のピキア株。
  4. 請求項１～３の何れかに記載のピキア株の遺伝子操作により得られ、ここで、該遺伝子操作により該ピキア株が外来遺伝子または外来遺伝子を含むベクターを含むようになる、遺伝子操作により得られたピキア株。
  5. 該外来遺伝子が該株のゲノムに統合される、請求項４に記載のピキア株。
  6. 該外来遺伝子が工業、飼料または食品の分野で使用されるタンパク質のコード配列である、請求項４または５に記載のピキア株。
  7. 該外来遺伝子が酵素のコード配列である、請求項６に記載のピキア株。
  8. 該酵素が次の酵素群リパーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、フィターゼ、エステラーゼ、ペクチナーゼ、ガラクトシダーゼおよびホスホリパーゼから選択される少なくとも１つであることを特徴とする、請求項７に記載のピキア株。
  9. 該酵素がリパーゼまたはホスホリパーゼから選択される、請求項８に記載のピキア株。
  10. リパーゼのアミノ酸配列が配列番号７または９と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列である、請求項９に記載のピキア株。
  11. リパーゼのアミノ酸配列が配列番号７または９と少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列である、請求項１０に記載のピキア株。
  12. リパーゼのアミノ酸配列が配列番号７または９と少なくとも９８％同一性を有するアミノ酸配列である、請求項１１に記載のピキア株。
  13. リパーゼのアミノ酸配列が配列番号７または９と少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列である、請求項１２に記載のピキア株。
  14. リパーゼのアミノ酸配列が配列番号７または９に示される、請求項１３に記載のピキア株。
  15. ホスホリパーゼのアミノ酸配列が配列番号２と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列である、請求項９に記載のピキア株。
  16. ホスホリパーゼのアミノ酸配列が配列番号２と少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列である、請求項１５に記載のピキア株。
  17. ホスホリパーゼのアミノ酸配列が配列番号２と少なくとも９８％同一性を有するアミノ酸配列である、請求項１６に記載のピキア株。
  18. ホスホリパーゼのアミノ酸配列が配列番号２と少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列である、請求項１７に記載のピキア株。
  19. ホスホリパーゼのアミノ酸配列が配列番号２に示される、請求項１８に記載のピキア株。
  20. 請求項１～１９の何れかに記載のピキア株および所望により、培養培地を含む、培養物。
  21. 培地が種培地または発酵培地である、請求項２０に記載の培養物。
  22. 培地がＹＰＤ培地またはＢＭＭＹ培地である、請求項２１に記載の培養物。
  23. 請求項４～１９の何れかに記載のピキア株を含む発酵ブロス、発酵により得た請求項４～１９の何れかに記載のピキア株のライセートまたは該発酵ブロスもしくはライセートの濃縮物を含むことを特徴とする、酵素調製物。
  24. エステル交換または油脂の脱ガムにおける請求項２３に記載の酵素調製物の使用であって、酵素調製物がリパーゼまたはホスホリパーゼを含む、使用。
  25. 外来遺伝子を発現するための株の構築における、請求項１～１９の何れかに記載のピキア株の使用。
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