JP2022515531A - 外来遺伝子を発現させるためのピキア・パストリス変異株 - Google Patents
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- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2465—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on alpha-galactose-glycoside bonds, e.g. alpha-galactosidase (3.2.1.22)
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
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- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
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- C12Y106/05—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6) with a quinone or similar compound as acceptor (1.6.5)
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- C12Y106/00—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6)
- C12Y106/05—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6) with a quinone or similar compound as acceptor (1.6.5)
- C12Y106/0501—NADPH dehydrogenase (quinone) (1.6.5.10)
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- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12Y301/01003—Triacylglycerol lipase (3.1.1.3)
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- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
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- C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
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Abstract
Description
本発明は、外来遺伝子を発現させるためのピキア変異株に関する。
ピキア・パストリス(Pichia pastoris)発現系は、1980年代初期に開発された新しいタイプの外因性タンパク質発現系である。操作が容易、培養が容易、成長が速い、高発現および低費用などの原核生物発現系の利点があり、またグリコシル化、タンパク質リン酸化など、原核生物発現系が有しない外因性タンパク質の翻訳後修飾などの特徴も有する。同時に、分泌効率が悪い、発現株が十分に安定ではないおよび発現プラスミドを失いやすいなどのサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)の欠点も回避する。それ故に、この発現系は今日では、急速に、最良かつ最も広く使用される外来遺伝子発現系の一つとなっている。
本発明は、種々のタンパク質、特にホスホリパーゼおよびリパーゼの効率的発現のために使用できるピキアを得るためにピキアCICC32806を遺伝子操作した。
(1)ピキアで変異誘発を実施し、スクリーニングしてウラシル栄養要求性変異体を得る;
(2)工程(1)で得たウラシル栄養要求性変異体からHIS4遺伝子をノックアウトし、スクリーニングして、ヒスチジン欠損変異体を得る;
(3)工程(2)で得たヒスチジン欠損変異体に外来遺伝子およびHIS4遺伝子をノック員して、スクリーニングして、外来遺伝子を発現する変異体を得る;
(4)工程(3)で得た変異体で変異誘発を実施し、スクリーニングして、工程(3)でノックインした外来遺伝子は変異されていないが、該外来遺伝子の発現が比較的高いまたはその発現産物の活性が比較的高い変異体を得る;および
(5)工程(4)で得た変異体から工程(3)でノックインしたHIS4遺伝子をノックアウトし、スクリーニングしてヒスチジン欠損変異体を得る;および所望により、
(6)工程(5)で得たヒスチジン欠損変異体におけるURA3遺伝子をノックアウトし、スクリーニングして、ヒスチジンおよびウラシル二重変異された変異体を得る
ことを含む。
(1)ピキアで変異誘発を実施し、スクリーニングしてウラシル栄養要求性変異体を得る;
(2)工程(1)で得たウラシル栄養要求性変異体からHIS4遺伝子をノックアウトし、スクリーニングして、ヒスチジン欠損変異体を得る;
(3)工程(2)で得たヒスチジン欠損変異体に外来遺伝子およびHIS4遺伝子をノックインして、スクリーニングして、外来遺伝子を発現する変異体を得る;
(4)工程(3)で得た変異体で変異誘発を実施し、スクリーニングして、工程(3)でノックインした外来遺伝子は変異されていないが、該外来遺伝子の発現が比較的高いまたはその発現産物の活性が比較的高い変異体を得る;および
(5)工程(4)で得た変異体から工程(3)でノックインしたHIS4遺伝子をノックアウトし、スクリーニングしてヒスチジン欠損変異体を得る;および所望により、
(6)工程(5)で得たヒスチジン欠損変異体におけるURA3遺伝子をノックアウトし、スクリーニングして、ヒスチジンおよびウラシル二重変異された変異体を得る;
(7)工程(6)で得た二重変異体に増殖促進遺伝子およびURA3遺伝子をノックインして、スクリーニングしてヒスチジン欠損変異体を得る;および
(8)工程(6)で得た二重変異体に液胞プロテアーゼA遺伝子およびURA3遺伝子をノックインして、スクリーニングしてヒスチジン欠損変異体を得る。
本発明の範囲内で、本発明の上記技術的特徴および下に具体的に記載される技術的特徴(例えば実施例)を互いに組み合わせて、好ましい技術的解決策を構築できることは理解されるべきである。
本明細書において使用する用語「遺伝子操作」は、遺伝子スプライシング技術およびDNA組換え技術とも称される。理論的に分子遺伝学に基づき、予め設計された青写真に従って、インビトロで種々の起源からの遺伝子でハイブリッドDNA分子を構築するための手段として、分子生物学および微生物学の現代的方法を使用する。次いで、ハイブリッドDNA分子が生物の元の遺伝的特性を変える、新規変種を得るおよび新規産物を産生するように生存細胞に導入される。
BQ9382_C1-2260、308EKKdel、仮説タンパク質、ここで、BQ9382_C1-2260はGENEBANKにより付与された番号であり、ここで、C1:第一染色体、2260は遺伝子番号であり、308~310位のEKKが欠失される。
BQ9382_C1-3800、E129K、60Sリボソームサブユニット組立/輸送タンパク質LOC1。BQ9382_C1-3800はGENEBANKにより付与された番号であり、ここで、C1:第一染色体、3800は遺伝子番号であり、129位のEがKに変異される。
BQ9382_C1-5700、I312M、ミトコンドリア外NADHデヒドロゲナーゼ、クラスII NAD(P)H:キノンオキシドレダクターゼ。BQ9382_C1-5700はGENEBANKにより付与された番号であり、ここで、C1:第一染色体、5700は遺伝子番号であり、312位のIがMに変異される。
BQ9382_C2-3950、Q145X、結合対Psr1pを有し、一般的ストレスの完全活性化に使用される必須タンパク質。BQ9382_C2-3950はGENEBANKにより付与された番号であり、ここで、C2:第二染色体、3950は遺伝子番号であり、145位のQが停止コドンに変わる。
BQ9382_C3-2220、E188K、仮説タンパク質。BQ9382_C3-2220はGENEBANKにより付与された番号であり、ここで、C3:第三染色体および2220は遺伝子番号である。
BQ9382_C3-4370、W196X、オロチジン5'-リン酸脱炭酸酵素。BQ9382_C3-4370はGENEBANKにより付与された番号であり、ここで、C3:第三染色体、4370は遺伝子番号であり、196位のWは停止コドンに変異される。当業者は、相同組換え、遺伝子ノックアウトおよび相補性、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALEヌクレアーゼ、Crisp/Cas9などを含むが、これらに限定されない戦略を使用して、目的のピキア株に本明細書に開示する上記6変異の1以上を導入できる。
10μLのCICC-32806株を、10mL YPD(2%ペプトン、1%酵母粉末、1%グリセロール)培地に接種し、一夜、30℃で、240rpmで培養した。酵母溶液のOD600値を確認した。200OD培養溶液を吸引し、4000rpmで室温で遠心分離した。次いで、上清を除き、細胞を滅菌水で2回洗浄した。最後に酵母溶液を20OD/mLの濃度で再懸濁した。2mLの酵母溶液をペトリ皿表面に均一に分散させ、これを、90秒間、紫外線光下超クリーンワークベンチに置いた。100μLを取り、YNB-ウラシル-FOA(13.4g/L YNB、1%グリセロール、2%アガロース、50μg/mL ウラシル、0.75mg/mL 5-フルオロオロト酸(5-FOA))固形培地に塗布し、30℃で暗所(復帰突然変異を防止するため、全工程を赤色光下で操作した)で7日間培養した。前工程でYNB-ウラシル-FOA固形培地で増殖した単一コロニーをYNB固形培地およびYNB-ウラシル固形培地に導入し、YNB-ウラシル固形培地でのみ増殖できた株を選択して、ウラシル栄養要求性ピキアCICC32806-U7株を得た。
CICC32806ゲノムを鋳型として使用して、HIS-AフラグメントをHIS-AF/Rで増幅し、HIS-BフラグメントをHIS-BF/Rで増幅し、URA3フラグメントをURA3-1F/2Rで増幅した。増幅フラグメントを逐次的にpSP72プラスミドにライゲートし、ヒスチジンノックアウトベクターpHISA-URA3-HISBを構築した。プライマー配列は次のとおりである。
HIS-A-F:5'CCGCTCGAGTCACCTCAGCCAGATCAAAGT 3'(配列番号10);
HIS-A-R:5'ACATGCATGCCTTTGGACAACTCTTTCTGCC 3'(配列番号11);
HIS-B-F:5'CGGGGTACCCCTGGTTGATAAAGTTGCAT 3'(配列番号12);
HIS-B-R:5'GGCGAGCTCAGGTGTCTTCAAAGCGACTC 3'(配列番号13);
URA3-1F:ACATGCATGCCTGCAGAAATGGGGAGATAACCACC(配列番号14);
URA3-2R:CGGGGTACCACTAGTGGTTTTCTGGGGGTATTTGCTG(配列番号15)。
ノックアウトベクターをXhoIおよびSacIで線形化し、エレクトロポレーションによりCICC32806-U7に導入し、ヒスチジン(20μg/mL)含有MDSスクリーニングプレートに塗布した。増殖した単一コロニーをそれぞれYNB固形培地およびYNB-HIS固形培地に導入した。ヒスチジン栄養要求性変異体はYNB固形培地では増殖できないが、YNB-HIS固形培地で増殖できた。正しい表現型を有する株を、再び、YNB固形培地およびYNB-HIS固形培地に単一コロニー線条接種し、YNB-HIS固形培地でのみ増殖できた単一コロニー株を選択した。最後に、ヒスチジン欠損ピキアCICC32806-7H3株を得た。
コドン最適化され、生物工学(上海)株式会社により合成されたホスホリパーゼPLCヌクレオチド配列は次のとおりである。
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTTGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTGGTCAGCTGAGGACAAGCATAAGGAAGGTGTGAATAGTCACTTATGGATCGTGAACCGTGCCATTGATATAATGTCTAGGAATACAACTCTGGTTAAGCAAGATAGAGTTGCTCAATTGAATGAATGGCGTACAGAGCTAGAGAATGGCATCTACGCTGCTGATTATGAAAACCCCTATTACGATAACAGTACCTTCGCTTCTCACTTTTACGATCCAGACAACGGAAAGACATATATCCCATTCGCCAAGCAAGCTAAGGAGACTGGAGCTAAGTACTTCAAGTTGGCTGGAGAGTCATACAAGAATAAAGACATGAAGCAGGCCTTCTTTTATCTTGGGTTGTCATTGCATTATTTGGGCGATGTCAACCAACCTATGCATGCCGCAAACTTTACGAACCTGTCCTATCCACAGGGTTTTCACTCCAAGTACGAGAACTTTGTCGATACTATTAAAGACAACTACAAAGTTACCGATGGGAACGGATATTGGAATTGGAAAGGCACCAACCCTGAAGAATGGATTCACGGTGCAGCAGTAGTTGCAAAACAGGACTACTCTGGAATTGTCAATGACAATACCAAAGATTGGTTTGTGAAAGCCGCAGTCTCCCAGGAATATGCAGATAAATGGAGAGCTGAAGTTACACCTATGACTGGTAAACGACTAATGGATGCCCAAAGAGTTACTGCTGGTTACATTCAATTATGGTTCGACACTTACGGTGACAGGTAA(配列番号1)
PLCのアミノ酸配列は次のとおりである。
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAWSAEDKHKEGVNSHLWIVNRAIDIMSRNTTLVKQDRVAQLNEWRTELENGIYAADYENPYYDNSTFASHFYDPDNGKTYIPFAKQAKETGAKYFKLAGESYKNKDMKQAFFYLGLSLHYLGDVNQPMHAANFTNLSYPQGFHSKYENFVDTIKDNYKVTDGNGYWNWKGTNPEEWIHGAAVVAKQDYSGIVNDNTKDWFVKAAVSQEYADKWRAEVTPMTGKRLMDAQRVTAGYIQLWFDTYGDR(配列番号2)
PCR産物を、AxygenのPCR産物精製キット(AP-PCR-50)で精製し、NEBのSnaBIおよびAvrII制限エンドヌクレアーゼで消化し、再びAxygenのPCR産物精製キットで精製した。同時に、pPIC9Kプラスミドを同じ制限エンドヌクレアーゼで消化し、消化産物を同じ方法で精製した。FermentasのT4 DNAリガーゼを使用して、製品指示書に従い、PCR産物の消化フラグメントおよびpPIC9kベクターの消化フラグメントをライゲートした。ライゲート産物を、ヒートショック法により大腸菌DH5αに導入し、アンピシリン含有LBプレートで一夜培養した。翌日、単一クローンを選択し、LB液体培地で培養した。プラスミドをAxygenのプラスミド抽出キットを使用して抽出し、シークエンシングのために上海生物工学に送った。
7H3-SPLCコロニーを5mL YPD培地に選択して入れ、一夜、30℃、240rpm振動盤上で培養した。酵母溶液のOD600値を確認した。200OD培養溶液を吸引し、4000rpmで室温で遠心分離した。次いで、上清を除き、細胞を滅菌水で2回洗浄した。最後に、酵母溶液を20OD/mLの濃度で再懸濁した。2mLの酵母溶液をペトリ皿表面に均一に分散させ、これを、90秒間、紫外線光下超クリーンワークベンチに置いた。100μLを取り、リン脂質プレートに塗布し、30℃のインキュベーターで暗所(復帰突然変異を防止するため、全工程を赤色光下で操作した)で4日間培養した。大きな加水分解円を有する変異体を選択し、そのコロニーをKOD-FX酵素およびピキア発現シークエンシングユニバーサル5'AOXおよび3'AOXプライマーを、該酵素の使用指示に従い使用して、PCR増幅した。PCR産物をシークエンシングのために上海生物に送った。酵母に人工的に導入した核酸部分、すなわち、AOXプロモーター、シグナルペプチド、PLC遺伝子、転写ターミネーターなどは変異を有さないことが判明した。それ故に、変異体の変化は、株自体の変異であった。該株をm314-SPLCと命名した。
実施例2および実施例3により、3つの株7H3-SPLC、m314-SPLCおよびSMD1168-SPLCに含まれるPLC遺伝子のアミノ酸配列は完全に同一であり、コピー数は1コピーであることが判明し得る。これら3つの株を、50mLのBMGY培地に接種し、一夜、30℃および240rpmで培養し、200ODの細胞を遠心分離により集めた。細胞を滅菌水で2回再懸濁および洗浄し、次いでBMMY培地に再懸濁した。2%メタノールをBMMY培地に加え、30℃および240rpmで発現を誘導した。0.5mLメタノールを50mL培地に12時間毎に加えた。3日間の誘導後、発酵ブロスを8000rpm、4℃で遠心分離し、発酵ブロスの上清を酵素活性測定およびタンパク質電気泳動検出のために採った。
pNPPC方法ホスホリパーゼ酵素活性単位の定義:37℃の温度および7.6のpH値の条件下、基質から1分間で1μmolのホスホコリンの放出を触媒する酵素の量が1ホスホリパーゼ活性単位(U)である。
酵素活性測定の結果を図1に示す。結果は、m314-SPLCのホスホリパーゼ活性が、出発株7H3-SPLCに比して127%およびSMD1168-SPLCに比して152%増加したことを示す。
電気泳動の結果を図2に示す。結果は、3レーンに、35~40KDaバンドに位置する明らかな標的バンドがあることを示す。各レーンの標的タンパク質含量は、測定されたホスホリパーゼ活性に一致する。
PLC遺伝子のノックアウトに使用したヌクレオチド配列(AOX-His)は次のとおりである。
CTCGAGATTCAGGTGAACCCACCTAACTATTTTTAACTGGGATCCAGTGAGCTCGCTGGGTGAAAGCCAACCATCTTTTGTTTCGGGGAACCGTGCTCGCCCCGTAAAGTTAATTTTTTTTTCCCGCGCAGCTTTAATCTTTCGGCAGAGAAGGCGTTTTCATCGTAGCGTGGGAACAGAATAATCAGTTCATGTGCTATACAGGCACATGGCAGCAGTCACTATTTTGCTTTTTAACCTTAAAGTCGTTCATCAATCATTAACTGACCAATCAGATTTTTTGCATTTGCCACTTATCTAAAAATACTTTTGTATCTCGCAGATACGTTCAGTGGTTTCCAGGACAACACCCAAAAAAAGGTATCAATGCCACTAGGCAGTCGGTTTTATTTTTGGTCACCCACGCAAAGAAGCACCCACCTCTTTTAGGTTTTAAGTTGTGGGAACAGTAACACCGCCTAGAGCTTCAGGAAAAACCAGTACCTGTGACCGCAATTCACCATGATGCAGAATGTTAATTTAAACGAGTGCCAAATCAAGATTTCAACAGACAAATCAATCGATCCATAGTTACCCATTCCAGCCTTTTCGTCGTCGAGCCTGCTTCATTCCTGCCTCAGGTGCATAACTTTGCATGAAAAGTCCAGATTAGGGCAGATTTTGAGTTTAAAATAGGAAATATAAACAAATATACCGCGAAAAAGGTTTGTTTATAGCTTTTCGCCTGGTGCCGTACGGTATAAATACATACTCTCCTCCCCCCCCTGGTTCTCTTTTTCTTTTGTTACTTACATTTTACCGTTCCGTCACTCGCTTCACTCAACAACAAAATAAACTAGTGGTACCGTCAGCCACCAAAGTAGTGAATAGACCATCGGGGCGGTCAGTAGTCAAAGACGCCAACAAAATTTCACTGACAGGGAACTTTTTGACATCTTCAGAAAGTTCGTATTCAGTAGTCAATTGCCGAGCATCAATAATGGGGATTATACCAGAAGCAACAGTGGAAGTCACATCTACCAACTTTGCGGTCTCAGAAAAAGCATAAACAGTTCTACTACCGCCATTAGTGAAACTTTTCAAATCGCCCAGTGGAGAAGAAAAAGGCACAGCGATACTAGCATTAGCGGGCAAGGATGCAACTTTATCAACCAGGGTCCTATAGATAACCCTAGCGCCTGGGATCATCCTTTGGACAACTCTTTCTGCCAAATCTAGGTCCAAAATCACTTCATTGATACCATTATTGTACAACTTGAGCAAGTTGTCGATCAGCTCCTCAAATTGGTCCTCTGTAACGGATGACTCAACTTGCACATTAACTTGAAGCTCAGTCGATTGAGTGAACTTGATCAGGTTGTGCAGCTGGTCAGCAGCATAGGGAAACACGGCTTTTCCTACCAAACTCAAGGAATTATCAAACTCTGCAACACTTGCGTATGCAGGTAGCAAGGGAAATGTCATACTTGAAGTCGGACAGTGAGTGTAGTCTTGAGAAATTCTGAAGCCGTATTTTTATTATCAGTGAGTCAGTCATCAGGAGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAATTC(配列番号5)
RMLリパーゼ遺伝子を使用して、m314H株の他のタンパク質の発現レベルを増強する効果を評価した。使用したRML遺伝子はコドン最適化され、生物工学(上海)株式会社により合成された。ヌクレオチド配列は次のとおりである。
GTTCCAATCAAGAGACAATCTAATTCCACTGTCGATTCTTTGCCTCCATTGATTCCTTCTAGAACTAGTGCACCTTCATCCTCTCCATCTACAACTGACCCTGAGGCTCCAGCTATGTCAAGAAATGGTCCACTTCCTTCTGATGTTGAGACCAAGTACGGAATGGCCCTGAATGCTACTTCTTATCCAGATTCTGTCGTTCAAGCTATGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCCATCGACGGAGGTATTAGAGCCGCTACTTCTCAGGAAATCAACGAACTTACTTACTATACAACTTTGTCAGCTAATTCTTACTGTAGAACTGTTATTCCTGGTGCTACTTGGGATTGCATACATTGTGACGCCACTGAAGATTTAAAGATAATTAAAACCTGGTCTACTTTGATTTACGACACTAACGCTATGGTTGCTAGAGGAGATTCCGAGAAGACTATTTATATCGTGTTTAGAGGTTCTTCATCTATTCGTAATTGGATCGCTGATTTGACATTCGTTCCAGTCTCTTACCCTCCAGTTTCTGGTACTAAGGTTCACAAAGGATTTCTTGATTCTTATGGTGAAGTTCAAAACGAGTTGGTTGCTACTGTCTTGGATCAGTTTAAACAATACCCATCTTATAAGGTTGCTGTCACTGGTCACTCTTTGGGAGGTGCTACTGCCTTGCTGTGTGCTTTAGGTTTATACCAGAGAGAGGAAGGATTGTCTTCAAGTAACCTATTCTTGTACACTCAAGGTCAGCCTAGAGTTGGAGATCCAGCATTTGCTAATTATGTGGTTTCTACTGGTATTCCATATAGACGTACTGTTAACGAAAGAGACATAGTACCACACTTGCCTCCAGCTGCCTTCGGATTTCTGCATGCCGGTGAAGAGTACTGGATCACAGATAATTCTCCTGAAACCGTTCAAGTGTGTACATCTGATTTAGAGACTTCCGACTGCTCTAACAGTATTGTTCCATTTACTTCAGTTCTTGATCATTTGTCTTATTTTGGAATTAACACCGGTTTGTGTACTTAA(配列番号6)
RMLのアミノ酸配列は次のとおりである。
VPIKRQSNSTVDSLPPLIPSRTSAPSSSPSTTDPEAPAMSRNGPLPSDVETKYGMALNATSYPDSVVQAMKREAEASIDGGIRAATSQEINELTYYTTLSANSYCRTVIPGATWDCIHCDATEDLKIIKTWSTLIYDTNAMVARGDSEKTIYIVFRGSSSIRNWIADLTFVPVSYPPVSGTKVHKGFLDSYGEVQNELVATVLDQFKQYPSYKVAVTGHSLGGATALLCALGLYQREEGLSSSNLFLYTQGQPRVGDPAFANYVVSTGIPYRRTVNERDIVPHLPPAAFGFLHAGEEYWITDNSPETVQVCTSDLETSDCSNSIVPFTSVLDHLSYFGINTGLCT(配列番号7)
酵素活性測定の結果を図3に示す。結果は、m314-SRMLにより発現されたRMLリパーゼの活性が出発株7H3-SRMLより92%高かったことを示した。
電気泳動の結果を図4に示す。両レーンに、35~40KDaバンドに位置する明らかな標的バンドがある。各レーンの標的タンパク質含量は、測定されたホスホリパーゼ活性に一致する。
CICC32806ゲノムを鋳型として使用して、HIS-AフラグメントをHIS-AF/Rで増幅し、HIS-BフラグメントをHIS-BF/Rで増幅した。増幅フラグメントを逐次的にpSP72プラスミドにライゲートし、ヒスチジンノックアウトベクターpHISA-HISBを構築した。ノックアウトベクターをXhoIおよびSacIで線形化し、エレクトロポレーションによりm314Hへ形質転換し、ヒスチジン、ウラシルおよび5-FOAを含むMDSスクリーニングプレートに塗布した。増殖した単一コロニーをそれぞれYNB-HIS固形培地、YNB-ウラシルおよびYNB-ウラシル-HIS固形培地に導入した。ヒスチジンおよびウラシル二重栄養要求性形質転換体は、YNB-ウラシル-HISでしか増殖できない単一コロニー株であった。こうして、ヒスチジンおよびウラシル二重栄養要求性ピキアm314HU株が最後に得られた。
CICC32806ゲノムを鋳型として使用して、URA3フラグメントをプライマーURA3-1F/2Rで増幅させた。3つの増殖促進フラグメントである一般的ストレス応答に必要なタンパク質(Genbank no: XM_002491428.1)、ミトコンドリア外NADHデヒドロゲナーゼ(Genbank no: XM_002490375.1)およびプロテイナーゼA(Genbank no: XM_002493288.1)は生物工学(上海)株式会社により合成された。次いで、これら3つの遺伝子フラグメントおよびURA3フラグメントをそれぞれpSP72プラスミドに逐次的にライゲートし、過発現ベクターpURA3-ストレス、pURA3-NADHおよびpURA3-ProAを構築した。ノックアウトベクターをXhoIおよびBglIIで線形化した。3つの増殖促進遺伝子過発現ベクターフラグメントを共エレクトロポレーションによりm314Hへ形質転換し、ヒスチジン含有MDSスクリーニングプレートに塗布した。PCR検証を使用して、全過発現遺伝子のm315H株への導入が成功したことを保証した。株m315Hを、2018年10月31日に中国普通微生物菌種保管センター(CGMCC、北京市朝陽区北辰西路1号院3号、100101)に寄託し、受託番号CGMCC No. 16669を有するピキア・パストリスとして分類および命名された。
TLリパーゼ遺伝子を使用して、m315H株の他のタンパク質の発現レベルを増強する効果を評価した。使用したTL遺伝子はコドン最適化され、生物工学(上海)株式会社により合成された。ヌクレオチド配列は次のとおりである。
GAAGTCTCTCAAGACTTGTTCAACCAGTTCAACTTGTTCGCTCAATACTCTGCCGCTGCCTACTGTGGTAAGAACAATGATGCTCCAGCTGGTACTAACATTACCTGTACTGGTAACGCTTGTCCAGAAGTTGAGAAGGCTGATGCTACCTTCCTGTACTCCTTCGAAGACTCTGGAGTTGGAGATGTTACTGGTTTCCTGGCCTTGGATAACACTAACAAGTTGATCGTTCTGTCCTTCAGAGGTTCCAGATCCATCGAGAACTGGATTGGTAACTTGAACTTTGACTTGAAGGAGATCAACGACATCTGTTCTGGATGTCGTGGTCACGATGGATTTACCTCCTCTTGGAGATCTGTTGCTGATACCTTGAGACAGAAGGTCGAAGATGCTGTCAGAGAACATCCAGACTATAGAGTTGTCTTCACTGGTCACTCCTTGGGAGGTGCCTTGGCTACTGTTGCTGGTGCTGACTTGCGTGGTAATGGTTATGACATTGATGTCTTCTCCTACGGTGCTCCAAGAGTTGGTAATCGTGCCTTCGCTGAGTTTCTGACCGTCCAAACTGGAGGTACTTTGTACAGAATTACCCATACTAACGACATTGTTCCAAGATTGCCACCACGTGAGTTCGGATACTCTCATTCCTCTCCAGAGTACTGGATCAAGTCTGGAACCTTGGTTCCAGTCACTCGTAACGACATCGTCAAGATTGAAGGTATTGATGCCACTGGAGGTAACAATCAACCAAACATTCCAGACATTCCAGCTCACTTGTGGTACTTTGGTCTGATTGGTACTTGCTTGTAA(配列番号8);
TLアミノ酸配列は次のとおりである。
EVSQDLFNQFNLFAQYSAAAYCGKNNDAPAGTNITCTGNACPEVEKADATFLYSFEDSGVGDVTGFLALDNTNKLIVLSFRGSRSIENWIGNLNFDLKEINDICSGCRGHDGFTSSWRSVADTLRQKVEDAVREHPDYRVVFTGHSLGGALATVAGADLRGNGYDIDVFSYGAPRVGNRAFAEFLTVQTGGTLYRITHTNDIVPRLPPREFGYSHSSPEYWIKSGTLVPVTRNDIVKIEGIDATGGNNQPNIPDIPAHLWYFGLIGTCL(配列番号9)。
酵素活性測定の結果を図5に示す。結果は、m315-STLにより発現されるTLリパーゼ活性が、m314-STLに比して39%増加したことを示す。
電気泳動の結果を図6に示す。3レーンに、35~40KDaバンドに位置する明らかな標的バンドがある。各レーンの標的タンパク質含量は、測定されたTLリパーゼ活性に一致する。
CICC32806ゲノムを鋳型として使用して、URA3フラグメントをプライマーURA3-1F/2Rで増幅させた。液胞プロテアーゼA(Genbank no: XM_002493288.1)遺伝子フラグメントは生物工学(上海)株式会社により合成され、プロテイナーゼA遺伝子フラグメントはプライマーproAF:CGAGTTTCTCCGTATCTAATおよびproAR:TCCTCATCTATACCCCAGGで増幅させた。増幅したURA3フラグメントおよびプロテイナーゼAフラグメントを実施例8で得られたm314HUにエレクトロポレーションにより共形質転換した。電気導入された材料をヒスチジン含有MDSスクリーニングプレートに塗布した。PCR検証を使用して、全形質転換遺伝子の導入が成功し、m316H株が得られたことを保証した。株m316Hは、2019年12月19日に中国普通微生物菌種保管センター(CGMCC、北京市朝陽区北辰西路1号院3号、100101)に寄託され、受託番号CGMCC No. 19221を有するピキア・パストリスとして分類および命名された。
ゲノムシークエンシング後、3コピーのプロテイナーゼAがm316H株にあり、そのうち2つは元のプロテイナーゼAゲノム位置に位置し、他のコピーは後期促進複合体/サイクロソームコード領域のサブユニットであるBQ9382_C2-3700遺伝子に挿入された。
実施例9で構築したpPIC9K-TL発現ベクターを制限エンドヌクレアーゼBglIIにより線形化し、次いで電気穿孔してm316H株を形質転換した。リパーゼプレートスクリーニング後、加水分解円および1コピーのTL遺伝子を有する形質転換体を選択し、m316-STLと番号付けした。選択した形質転換体を、振盪フラスコ発酵で実施例9で得られた7H3-STL、m314-STLおよびm315-STLと比較した。限外濾過により発酵ブロスを濃縮後、同じ体積の濃縮酵素溶液を採り、リパーゼ活性測定およびポリアクリルアミドゲル電気泳動分析をpNPP方法リパーゼ測定法により実施した。
酵素活性測定の結果を図7に示す。結果は、m316-STLにより発現されるTLリパーゼ活性がm315-STLに類似し、m314-STLより45%高いことを示す。
電気泳動の結果を図8に示す。4レーンに、35~40KDaバンドに位置する、明らかな標的バンドがある。各レーンの標的タンパク質含量は測定されたTLリパーゼ活性に一致する。
本明細書に記載する31806、m314、m315およびm316株を、ゲノムシークエンシングのために蘇州金維智生物科技有限会社に提供した。株のゲノムが金維智により抽出された後、それを切断し、3'末端にAを加え、次いで、Index配列を含むリンカーとライゲートとした。この戦略に従い構築したシークエンシングライブラリーを、シークエンシングチップに結合させ、次いでIllumina Hiseqシークエンシングに付した。再配列したシークエンサーからのデータを処理した後、元のデータを得て、リンカーを除去するために濾過し、汚染物を除去し、次いで対照ゲノムと比較した。結果の比較により、各ライブラリーにおけるPCR増幅によりもたらされた反復配列を除去し、次いで、対照ゲノムに対するシークエンシング深度(sequencing depth)およびカバー率(coverage)、一塩基多様性(SNV)、挿入/欠失(InDels)などを計算した。対照遺伝子セットおよびSNVデータセットについて、変異注釈および機能的濃縮などのある標準的生物学的情報分析も実施できた。99.99%以上のカバー率、400倍以上の平均深度および200倍を超える深度分布が99.95%超を占めた。
Claims (11)
- ピキア株GS115またはCICC32806と比較して、次のBQ9382_C1-2260(308~310位でEKK欠失、仮説タンパク質);BQ9382_C1-3800(E129K、60Sリボソームサブユニット組立/輸送タンパク質LOC1);BQ9382_C1-5700(I312M、ミトコンドリア外NADHデヒドロゲナーゼ、クラスII NAD(P)H:キノンオキシドレダクターゼ);BQ9382_C2-3950(Q145X、結合対Psr1pを有し、一般的ストレス応答の完全活性化に使用される必須タンパク質);BQ9382_C3-2220(E188K、仮説タンパク質);およびBQ9382_C3-4370(W196X、オロチジン5'-リン酸脱炭酸酵素)の6つの変異の1以上を含む、好ましくは上記6変異全てを含むことを特徴とする、ピキア株。
- 受託番号CGMCC No. 16670であるピキア・パストリス株、受託番号CGMCC No. 16669であるピキア・パストリス株および受託番号CGMCC No. 19221であるピキア・パストリス株であることを特徴とする、請求項1のピキア株。
- 受託番号CGMCC No. 16670のピキア・パストリス株。
- 請求項3のピキア・パストリス株の遺伝子操作または変異誘発により得られ、(a)ヒスチジン欠損株であり;および/または(b)増殖促進因子を発現するプラスミドを含むおよび/またはゲノムに増殖促進因子のコード化配列が統合されているおよび/または増殖促進因子を発現し、ここで、該増殖促進因子が好ましくは一般的ストレス応答に必要なタンパク質(Genbank no: XM_002491428.1)、ミトコンドリア外NADHデヒドロゲナーゼ(Genbank no: XM_002490375.1)、液胞プロテアーゼA(Genbank no: XM_002493288.1)を含むが、これらに限定されない酵母自体に由来する増殖促進遺伝子であり、好ましくは受託番号CGMCC No. 16669であるピキア・パストリス株であることを特徴とする、ピキア株。
- 請求項3のピキア・パストリス株の遺伝子操作または変異誘発により得られ、(a)ヒスチジン欠損株である;および/または(b)液胞プロテアーゼA遺伝子を発現するプラスミドを含みおよび/またはゲノムに液胞プロテアーゼA遺伝子のコード配列が統合されるおよび/または液胞プロテアーゼA遺伝子を発現し、好ましくは受託番号CGMCC No. 19221であるピキア・パストリス株であることを特徴とする、ピキア株。
- 請求項1~5の何れかのピキア株の遺伝子操作または変異誘発により得られ、ここで、該遺伝子操作により該ピキア株が外来遺伝子または外来遺伝子を含むベクターを含むようになり;好ましくは、該外来遺伝子が該株のゲノムに統合され、該外来遺伝子が好ましくは工業、飼料または食品の分野で使用されるタンパク質のコード配列であり;好ましくは、該外来遺伝子が酵素のコード配列であり、該酵素が次の酵素群リパーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、フィターゼ、エステラーゼ、ペクチナーゼ、ガラクトシダーゼおよびホスホリパーゼから選択される少なくとも1つであることを特徴とする、遺伝子操作または変異誘発により得られたピキア株。
- 該酵素がリパーゼまたはホスホリパーゼから選択され、好ましくは、リパーゼのアミノ酸配列が配列番号7または9と少なくとも80%、90%、95%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列であり;好ましくは、リパーゼのアミノ酸配列が配列番号7または9に示され;ホスホリパーゼのアミノ酸配列が配列番号2と少なくとも80%、90%、95%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列であり;好ましくは、ホスホリパーゼのアミノ酸配列が配列番号2に示される、請求項6のピキア株。
- 請求項1~7の何れかのピキア株および所望により、培養培地を含み、好ましくは、培地が種培地または発酵培地である;より好ましくは、培地がYPD培地またはBMMY培地である、培養物。
- 該酵素をコードする外来遺伝子、発酵により得た細胞のライセートまたは該発酵ブロスもしくはライセートの濃縮物を含む請求項6のピキアの発酵ブロスを含む;好ましくは、ピキアが酵素のコード配列を含む発現ベクターを含み、骨格ベクターとしてpPIC9Kプラスミドで構築されていることを特徴とする、酵素調製物。
- エステル交換または油脂の脱ガムにおける請求項9の酵素調製物の使用であって、該酵素調製物がリパーゼまたはホスホリパーゼを含み、好ましくは、リパーゼのアミノ酸配列が配列番号7または9と少なくとも80%、90%、95%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列であり;より好ましくは、リパーゼのアミノ酸配列が配列番号7または9に示され;好ましくは、ホスホリパーゼのアミノ酸配列が配列番号2と少なくとも80%、90%、95%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列である;より好ましくは、ホスホリパーゼのアミノ酸配列は配列番号2に示されるものである、使用。
- 外来遺伝子を発現するための株の構築における、請求項1~7の何れかのピキア・パストリス株の使用。
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