CN112522233B - 一种米曲霉磷脂酶c及其编码基因与应用 - Google Patents

一种米曲霉磷脂酶c及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种米曲霉磷脂酶C及其编码基因与应用。本发明提供了一种蛋白质，为磷脂酶C或重组磷脂酶C，是如下1)或2)或3)或4)所述的蛋白质：1)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)序列表中序列2第20至464位组成氨基酸的蛋白质；3)在1)或2)的N端或/和C端连接分子伴侣标签得到的共表达蛋白质；4)将1)或2)或3)中的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。本研究致力于从米曲霉中发掘来源新颖、酶活力高、性质独特的磷脂酶C具有巨大的市场前景。

Description

一种米曲霉磷脂酶C及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于食品生物技术领域，尤其涉及一种米曲霉磷脂酶C及其编码基因与应用。
背景技术
磷脂酶C(phospholipase C，EC 3.1.4.3)是一种专一作用于甘油磷脂C3位上甘油磷酸酯键的酯类水解酶，生成同为油脂成分的甘油二酯(DAG)及磷脂化合物(Sebastián,Industrial uses of phospholipases:current state and futureapplications.Applied Microbiology and Biotechnology(2019)103:2571–2582)。磷脂酶C因其在食品、药品、保健品、生物能源等工业领域具有巨大的应用前景而受到广泛关注。在食品工业中，磷脂酶C可以增加脂质稳定性而改善乳制品质量；在面包烘焙过程中水解面包中固有的磷脂成分可以提高食品的乳化性能；以及在淀粉加工过程中能够降低磷脂的含量使淀粉更加匀质等。应用于毛油脱胶过程，不仅能减少油脂中磷脂含量，还能提高精炼油得率(余榛榛,常明,刘睿杰等.单增李斯特氏菌磷脂酶C(lm-plcB)基因的克隆表达及其在油脂脱胶中的应用.食品与发酵工业,2013,39(12):44-49)。
磷脂酶C的来源广泛，存在于动物、植物和微生物中(Cocco L,Follo M Y,ManzoliL.Phosphoinositide-specific phospholipase C in health and disease.Journal oflipid research,2015,56:1853-1860)。相较于动植物来源的磷脂酶C，微生物来源的磷脂酶C容易培养、纯化和提取，具备更大的应用潜力(刘菲菲,张梁,顾正华等.蜡状芽孢杆菌磷脂酶C基因在大肠杆菌中的异源表达.食品科学,2013,34(11):182-187；任龙,杨宁,陈福生等.蜡样芽胞杆菌深圳株754-1PLC基因的克隆及表达.武汉工业学院学报,2007,02:19-21+35)。目前，已从多种不同来源微生物中分离纯化出磷脂酶C，包括梭菌属(Diner BA.Purification and properties of Clostridium welchii phospholipaseC.Biochimica et biophysica acta,1970,198:514-&)、芽孢杆菌属(Levine L,Xiao D M,Little C.Increased arachidonic acid metabolites from cells in culture aftertreatment with the phosphatidylcholine-hydrolyzing phospholipase C fromBacillus cereus.Prostaglandins,1998,34:633–642)、假单胞菌属(Mo S,Kim J H,Cho KW.A novel extracellular phospholipase C purified from a marine bacterium,Pseudoalteromonas sp.J937.Biotechnology letter,2009,31:89-94)、链霉菌属(Iwasaki Y,Niwa S,Nakano H,et al.Purification and properties ofphosphatidylinositol-specific phospholipase C from Streptomycesantibioticus.Biochimica biophysica acta–lipids and lipid metabolism,1994,1214:221-228)、不动杆菌属(Lehmann V.Production of phospholipase C inAcinetobacter calcoacetius.Acta pathologica et microbiologica scandinavicasection a-pathology,1971,79:789-&)等。但是由于天然微生物磷脂酶C产量低，工业化应用价值不能很好地体现(赵金星,张梁,顾正华等.大肠杆菌重组表达磷脂酶C的发酵工艺优化.食品科学,2013,34(9):143-149)。
利用基因工程的手段可提高酶的产量，从而满足大规模工业化应用的要求。迄今，已有不少磷脂酶C基因在大肠杆菌(Escherichia coli)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)等中成功表达。球形芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)磷脂酶C在大肠杆菌中表达，经1L发酵罐分批补料发酵后，磷脂酶C产量最高为14g/L(未显示酶活力)(Cerminati S,EberhardtF,Elena C E,et al.Development of a highly efficient oil degumming processusing a novel phosphatidylinositol-specific phospholipase C enzyme.Appliedmicrobiology biotechnology,2017,101:4471-4479)。蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)磷脂酶C在谷氨酸棒状杆菌中表达，产量最高为5.5g/L(Ravasi P,Braia M,Eberhardt F,et al.High-level production of Bacillus cereus phospholipase C inCorynebacterium glutamicum.Journal of biotechnology,2015,216:142-148)。另一来源于蜡样芽胞杆菌的磷脂酶C在毕赤酵母中表达，产量最高为4.5g/L(酶活较低)(Elena C,Ravasi P,Cerminati S,et al.Pichia pastoris engineering for the production ofa modified phospholipase C.Process biochemistry,2016,51:1935-1944)。虽然已有一些磷脂酶C基因异源表达的研究报道，但是目前磷脂酶C产量仍然较低，底物特异性高度集中，稳定性较差(余榛榛,常明,刘睿杰等.磷脂酶C在酶法脱胶中研究进展.中国油脂,2013,38(7):19-22)。因此，开发一些新型、表达量高和具有特殊特性的磷脂酶C仍具有重要的研究意义和应用价值。
目前分子伴侣共表达方法常被用来提高异源蛋白的产量和酶活力。因为分子伴侣与其他伴侣系统协同作用可以增强核糖体的新生蛋白折叠和蛋白质跨膜转运，从而使目的蛋白能够正确折叠并全部转移至胞外(Johannes Buchner,Molecular chaperones andprotein quality control:an introduction to the JBC Reviews thematic series,J.Biol.Chem.(2019)294(6)2074–2075)。但是并非所有的蛋白均可用分子伴侣提高表达量和功能。
米曲霉作为传统的发酵菌株能产生具有优异特性的酶制剂(Haiying Cai,YangLi.Immobilization,Regiospecificity Characterization and Application ofAspergillus oryzae Lipase in the Enzymatic Synthesis of the StructuredLipid1,3-Dioleoyl-2-Palmitoylglycerol.DOI:10.1371/journal.pone.0133857)。不仅如此，米曲霉在食品和医药行业已经被列为“Generally Recognized as Safe(GRAS)”菌株，米曲霉作为食品安全级别的菌株已经被世界卫生组织(WHO)认可(He,B.；Zeng,B.Transcriptome analysis of different growth stages of Aspergillus oryzaereveals dynamic changes of distinct classes of genes during growth.BMCMicrobiol.2018,18,12.)。据加拿大卫生部发布NOM/ADM-0146号文件修订允许使用的食品酶列表中，批准非标准烘焙产品中使用来自米曲霉的磷脂酶(Phospholipase)。
因此，立足于现有的磷脂酶C研究，积极发掘新型微生物磷脂酶C资源和拓展新型磷脂酶C应用具有重要意义。
发明内容
本发明目的在于提供一种米曲霉(Aspergillus oryzae)来源的磷脂酶C及其编码基因。本发明所述的磷脂酶C在食品、医药和生物能源等领域具有应用潜力。
本发明一个目的是提供一种蛋白质，为磷脂酶C或重组磷脂酶C，是如下1)或2)或3)或4)所述的蛋白质：
1)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2)序列表中序列2第20至464位组成氨基酸的蛋白质；
3)在1)或2)的N端或/和C端连接分子伴侣标签得到的共表达蛋白质；
4)将1)或2)或3)中的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。
其中，序列表中序列2由464个氨基酸残基组成。
为了使1)或2)中的蛋白质便于纯化，可在1)或2)所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签序列或其他分子伴侣标签。
表1标签的序列
Figure BDA0002829548610000031
上述分子伴侣标签为HAC1蛋白或PDI蛋白。
上述4)中的蛋白质，所属一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述4)中的蛋白质可人工合成，也可先合成所述蛋白质的编码基因，在进行生物表达得到。
上述4)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的核苷酸序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5＇端和3＇端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。
上述核酸分子为如下1)-5)任一所述的DNA分子：
1)序列表中序列1所示的核苷酸序列组成的DNA分子；
2)序列表中序列1的第58-1395位核苷酸组成的DNA分子；
3)在1)或2)序列的末端连接分子伴侣标签编码基因得到的共表达核酸分子；
4)与1)或2)或3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述蛋白质的DNA分子；
5)在严格条件下与1)或2)或3)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为在0.1×SSPE，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
其中，所述核酸分子可以使DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，序列表中序列1由1395个核苷酸组成，序列2由464个氨基酸组成，序列表中序列1的核苷酸序列编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。
本领域普通技术人员可以很容易地采取已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明编码所述蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，与本发明分离得到的编码所述蛋白质的核苷酸序列具有75％或者更高同一性的核苷酸序列，只要编码所述蛋白质且具有磷脂酶C活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的核苷酸序列。
所述同一性是指与天然核苷酸序列的序列相似性。同一性包括与本发明编码序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机进行评价时，两个或多个核苷酸序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，数值可以用来评价相关核苷酸序列之间的同一性。
含有编码所述蛋白质的核酸分子的表达盒、重组载体、转基因细胞或重组菌也属本发明的保护范围。
上述表达盒包括AoPC蛋白编码基因和分子伴侣蛋白编码基因。
上述重组载体可为在载体pPIC9K的多克隆位点插入上述核酸分子得到的重组质粒；具体可以如下：
上述重组载体pPIC9K-AoPC为将序列1所示的基因AoPC替换酵母表达载体pPIC9K的SnaBI和NotI双酶切位点间的DNA分子。
上述重组载体pPIC9K-AoPC-PDI为将融合蛋白AoPC-PDI基因同源重组到pPIC9K载体上，得到的载体，该载体表达融合蛋白AoPC-PDI。
上述重组载体pPIC9K-AoPC-HAC1为将融合蛋白AoPC-HAC1基因同源重组到pPIC9K载体上，得到的载体，该载体表达融合蛋白AoPC-HAC1。
融合蛋白AoPC-PDI的氨基酸序列依次由序列2所示的AoPC蛋白氨基酸序列和序列4所示的分子伴侣PDI的氨基酸序列组成。
融合蛋白AoPC-PDI基因的核苷酸序列依次由序列1所示的AoPC蛋白氨基酸序列和序列3所示的分子伴侣PDI基因的核苷酸序列组成。
融合蛋白AoPC-HAC1的氨基酸序列依次由序列2所示的AoPC蛋白氨基酸序列和序列6所示的分子伴侣HAC1的氨基酸序列组成。
融合蛋白AoPC-HAC1基因的核苷酸序列依次由序列1所示的AoPC蛋白氨基酸序列和序列5所示的分子伴侣HAC1基因的核苷酸序列组成。
上述重组菌可通过将所属重组载体导入宿主微生物中得到。
上述宿主微生物可为酵母、细菌、藻类或真菌，在本发明的实施例中，所述酵母为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115。
将所述的重组载体导入巴斯德毕赤酵母中，得到重组巴斯德毕赤酵母。
上述蛋白质在作为磷脂酶C中的应用也是本发明的保护范围；
上述蛋白质在水解磷脂酰胆碱pNPPC中的应用也是本发明的保护范围；
上述蛋白质在毛油脱胶中的应用也是本发明的保护范围；
上述蛋白质在降低毛油中的磷含量中的应用也是本发明的保护范围。
上述核酸分子或上述的表达盒、重组载体、转基因细胞或重组菌在如下1)-4)中至少一种中的应用也是本发明的保护范围：
1)制备磷脂酶C；
2)水解磷脂酰胆碱pNPPC；
3)毛油脱胶；
4)毛油中的磷含量。
在本发明的实施例中，毛油具体为大豆毛油。
本发明还提供了一种制备磷脂酶C的方法，包括如下步骤：将上述重组菌用甲醇诱导培养，即得到磷脂酶C。
所述方法具体依次经过如下步骤：
1)种子液培养：将重组菌接种到150mL YPD培养基中，在30℃，200rpm条件下振荡过夜培养至OD600为2-6，得到种子液；
2)基础培养：将步骤1)的种子液接种于含有1.35L基本培养基的5L发酵罐中培养，培养基温度为30℃，pH为4.0，转速为600rpm，待甘油消耗完全，进行甘油流加培养；
3)甘油流加培养：流加质量浓度为50％(w/v)的甘油，温度为30℃，pH为5.0，通过调整流加速度保持溶氧在20％-70％，流加时间4-8h；待菌体湿重达到180-220g/L，停止流加甘油；
4)甲醇流加培养：停止流加甘油后，饥饿30min，流加100％甲醇诱导，转速为800rpm，培养温度为30℃，pH为6.0，溶氧在20％-70％。
本发明还提供了一种水解磷脂酰胆碱pNPPC的方法，包括如下步骤：用上述蛋白质水解磷脂酰胆碱pNPPC；
上述水解的pH值为5-10，优选为8；
上述水解的温度为15℃-55℃，优选为25℃。
本发明还提供了一种大豆毛油磷脂脱胶的方法，包括如下步骤：用上述蛋白质水解大豆毛油。
上述方法中，在水解前，还包括如下步骤：将大豆毛油加入柠檬酸预处理的步骤。
水解时，所述水解的温度为15℃-55℃、pH为5-10；所述蛋白质加入量为每kg大豆毛油加入0-10000U且非0U的蛋白质；所述水解时间为0-10h。上述蛋白磷脂酶C AoPC最适pH为8.0、最适温度为25℃，蛋白质加入量为每kg大豆毛油加入4000U蛋白质；水解时间为4h；
本发明还提供了一种具有如下a-c至少一种功能产品，其包括上述蛋白质或上述的核酸分子或上述的表达盒、重组载体、转基因细胞或重组菌：
a)水解磷脂酰胆碱pNPPC；
b)毛油脱胶；
c)降低毛油中的磷含量。
上述产品还包括柠檬酸水溶液，浓度可以为0-50％(g/ml)，在本发明的实施例中优选为25％-50％。
本发明发现了一种来源于米曲霉的磷脂酶C及其编码基因，通过共表达方式将其导入毕赤酵母中，得到重组毕赤酵母。重组毕赤酵母在5L发酵罐中高密度发酵，得到磷脂酶C(AoPC)，酶活力可达82782U/mL，蛋白质含量达7.3mg/mL，菌体湿重为399g/L。纯化得到重组磷脂酶C纯酶，比酶活为304.5U/mg，回收率为86.5％，纯化倍数为1.3。AoPC的最适pH为8.0，在pH 4.5-9.0之间保持稳定；最适温度为25℃，在40℃以下保持稳定。AoPC是来源于米曲霉的磷脂酶C，属于食品安全级别的酶制剂。因此将该酶应用于大豆毛油的磷脂脱胶，该酶在最适条件下(4000U/Kg，反应4h)协同25％柠檬酸(w/w)能够脱去大豆毛油93.3％的磷脂。因此本发明的磷脂酶C在毛油磷脂脱胶方面具有应用潜力。本研究致力于从米曲霉中发掘来源新颖、酶活力高、性质独特的磷脂酶C具有巨大的市场前景。
附图说明
图1为利用分子伴侣共表达方法检测不同分子伴侣产磷脂酶C酶活示意图。
图2为重组菌GS115/pPIC9K-AoPC-PDI在5L发酵罐高密度发酵的产酶历程图(酶活■，蛋白浓度●，细胞湿重▲)。
图3为重组菌GS115/pPIC9K-AoPC-PDI在5L发酵罐高密度发酵过程的SDS-PAGE电泳图。
图4为重组磷脂酶C AoPC纯化电泳图。
图5为重组磷脂酶C AoPC的最适pH测定曲线图(■：MES；●：MOPS；▲：HEPES；▼：CHES；◆：Tris-HCl；)。
图6为磷脂酶C AoPC的pH稳定性测定曲线图(□：柠檬酸-柠檬酸钠；■：MES；●：MOPS；▲：HEPES；▼：CHES；◆：Tris-HCl；)。
图7为重组磷脂酶C AoPC AoPC最适温度的测定曲线图。
图8为重组磷脂酶C AoPC AoPC温度稳定性的测定曲线图。
图9为重组磷脂酶C AoPC AoPC半衰期的测定曲线图(■：35℃；●：40℃；▲：45℃)。
图10为磷脂酶C AoPC磷脂脱胶加酶量优化图(加酶量为0-10000U/Kg)。
图11为磷脂酶C AoPC磷脂脱胶反应时间优化图(反应时间为0-10h)。
图12为磷脂酶C AoPC磷脂脱胶加酸量优化图(加酸量为0-50％(w/w))。
图13为磷脂酶C AoPC磷脂脱胶对比图(对照组、只加酶处理组、只加酸处理组和酸酶协同处理组)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
本发明的实施例中，磷脂酶C的酶活力测定方法参考Xiang等的方法(Xiang,M.,etal.,High-level expression and characterization of a novel phospholipase Cfrom Thielavia terrestris suitable for oil degumming.International Journal ofBiological Macromolecules,2020.156:p.740-748.)，具体如下：
磷脂酶C酶活力以(p-NPPC)为底物测定，p-NPPC法测定磷脂酶C酶活：20μL适当稀释的酶液加入到96孔板中，再加入180μL含10mM p-NPPC(p-硝基苯基磷酸胆碱)的50mM pH8.0Tris-HCl缓冲溶液(三羟甲基氨基甲烷，一般称为Tris；称取6.057g Tris置于1L烧杯中，加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解，再加入合适体积的浓HCl调节pH至pH8.0，定容至1L即可)于25℃培养箱静置，反应30min后，使用酶标仪于410nm波长测定吸光值。磷脂酶C酶活力单位(U)定义为在上述条件下，每分钟反应产生1μmol对硝基苯酚所需酶量；
计算公式为：酶活力(U)＝(y+0.004)/0.0022*稀释倍数*0.5/10/0.05
y为OD410nm吸光值
比酶活力定义为1mg蛋白所具有的酶活力单位，表示为U/mg。
下面实施例中的w/v为质量体积比g/ml，v/v为体积百分比，w/w为质量百分比。
实施例1、米曲霉磷脂酶C基因AoPC的克隆与表达
一、基因AoPC的扩增
1、提取米曲霉的RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，用如下引物进行PCR扩增：
上游引物：5＇-AAATACGTAAGCCCTGTCACGTCCGAG-3＇(下划线表示SnaBI酶切位点)
下游引物：5＇-AAAGCGGCCGCTTATACCGAAAAGGTATGGGGAGTCTTG-3＇(下划线表示NotI酶切位点)。
2、步骤1中的PCR条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，30次循环；72℃延伸5min。
扩增得到的PCR产物具有序列表中序列表1所示的核苷酸序列，该核苷酸所示的基因命名为基因AoPC，其中，序列1中第58-1395位为基因AoPC编码序列，第1-57位为信号肽编码的基因序列；该基因编码的蛋白质命名为蛋白质AoPC，该蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2，其中，序列2第1-19位为信号肽序列，第20-464位为蛋白AoPC的序列。
二、重组载体及重组载体的构建
1、重组载体pPIC9K-AoPC及含有其的重组菌的构建
重组载体pPIC9K-AoPC为将序列1所示的基因AoPC替换酵母表达载体pPIC9K(美国Invitrogen，货号V17520)的SnaBI和NotI双酶切位点间的DNA分子。
将重组载体pPIC9K-AoPC以限制性内切酶SacI线性化后，电转入巴斯德毕赤酵母GS115(购于美国Invitrogen公司，货号C18100)，构成重组菌GS115/pPIC9K-AoPC。
2、重组载体pPIC9K-AoPC-PDI和pPIC9K-AoPC-HAC1及含有其的重组菌的构建
1)重组载体pPIC9K-AoPC-PDI的制备
以重组载体pPIC9K-AoPC为模板，用同源重组引物AoPCF1：GTATTGCTATTAGAAGCCCTGTCACGTCCGAG和AoPCR：tgcga GCGGCCGC TTATACCGAAAAGGTATGGGGAGTCTTG进行PCR扩增，得到10600bp的pPIC9K-AoPC的PCR扩增产物；
以序列3所示的PDI基因为模板，用PDIF：AAATACGTAATGACTAACTGGAAGGCTATTTTGAC和PDIR：GGACGTGACAGGGCTATTTTCCTCTTCACCTTG进行PCR扩增，得到381bp的PDI基因的PCR扩增产物；
以pPIC9K-AoPC的PCR扩增产物和PDI基因的PCR扩增产物为模板，用同源重组引物AoPCF1和PDIR进行Overlap拼接PCR，得到PCR产物，再自连，得到重组质粒pPIC9K-AoPC-PDI。
上述重组载体pPIC9K-AoPC-PDI为将融合蛋白AoPC-PDI基因同源重组到pPIC9K载体上，得到的载体，该载体表达融合蛋白AoPC-PDI。
融合蛋白AoPC-PDI的氨基酸序列依次由序列2所示的AoPC蛋白氨基酸序列和序列4所示的分子伴侣PDI的氨基酸序列组成。
融合蛋白AoPC-PDI基因的核苷酸序列依次由序列1所示的AoPC蛋白氨基酸序列和序列3所示的分子伴侣PDI基因的核苷酸序列组成。
2)重组载体pPIC9K-AoPC-HAC1的制备
以重组载体pPIC9K-AoPC为模板，用同源重组引物AoPCF2：GGTGAAGAGGAAAATAGCCCTGTCACGTCCGAG和AoPCR：tgcga GCGGCCGC TTATACCGAAAAGGTATGGGGAGTCTTG进行PCR扩增，得到10600bp的pPIC9K-AoPC的PCR扩增产物；
以序列5所示的HAC1基因为模板，用HAC1F：AAATACGTAATGCCAGTTGATTCTTCTCATAAGAC和HAC1R：GGACGTGACAGGGCTTCTAATAGCAATACAAG进行PCR扩增，得到993bp的HAC1基因的PCR扩增产物；
以pPIC9K-AoPC的PCR扩增产物和HAC1基因的PCR扩增产物为模板，用同源重组引物AoPCF2和HAC1R进行Overlap拼接PCR，得到PCR产物，再自连，得到重组质粒pPIC9K-AoPC-HAC1。
上述重组载体pPIC9K-AoPC-HAC1为将融合蛋白AoPC-HAC1基因同源重组到pPIC9K载体上，得到的载体，该载体表达融合蛋白AoPC-HAC1。
融合蛋白AoPC-HAC1的氨基酸序列依次由序列2所示的AoPC蛋白氨基酸序列和序列6所示的分子伴侣HAC1的氨基酸序列组成。
融合蛋白AoPC-HAC1基因的核苷酸序列依次由序列1所示的AoPC蛋白氨基酸序列和序列5所示的分子伴侣HAC1基因的核苷酸序列组成。
3)重组菌的制备
将上述重组载体pPIC9K-AoPC、重组载体pPIC9K-AoPC-PDI和重组载体pPIC9K-AoPC-HAC1分别用限制性内切酶SacI线性化后，电转入巴斯德毕赤酵母GS115(购于美国Invitrogen公司，货号C18100)，构成重组菌GS115/pPIC9K-AoPC、重组菌GS115/pPIC9K-AoPC-PDI和GS115/pPIC9K-AoPC-HAC1。
3、空载体及含有其的重组菌的构建
将空载体pPIC9K导入巴斯德毕赤酵母GS115中，得到对照重组菌GS115/pPIC9K。
三、重组菌表达磷脂酶C AoPC
1、将上述二中得到的重组菌GS115/pPIC9K-AoPC、GS115/pPIC9K-AoPC-PDI、GS115/pPIC9K-AoPC-HAC分别接种于MD平板(1.34％YNB w/v，4×10-5％生物素w/v，2％葡萄糖w/v)中，30℃下培养3-5d，得到His+转化子。
2、完成步骤1后，将转化子用灭菌水刮取后取100μL涂布于不同G418浓度的YPD平板(1％酵母提取物w/v，2％胰蛋白胨w/v，2％葡萄糖w/v，G418浓度分别为1、2、3和4mg/mL)上，30℃下培养5d。
3、完成步骤2后，取转化子接种于BMGY培养基(1％酵母提取物w/v，2％胰蛋白胨w/v，100mM pH 6.0的磷酸盐缓冲溶液，1.34％YNB w/v，4×10-5％生物素w/v，1％甘油v/v)，于30℃，200rpm摇床培养18h。
4、完成步骤3后，将培养液8000rpm离心5min，收集菌体，用BMMY培养基(1％酵母提取物w/v，2％胰蛋白胨w/v，100mM pH 6.0的磷酸盐缓冲溶液，1.34％YNB w/v，4×10-5％生物素w/v，0.5％甲醇v/v)重悬菌体至OD600为1.0左右，于30℃，200rpm培养，每24h补加甲醇至终浓度为0.5％(v/v)，72h后吸取1mL培养液于10000rpm离心10min。
5、完成步骤4后，取其上清液进行磷脂酶C活力测定(每ml上清液中的酶活力单位)。
结果如图1所示，对照为GS115/pPIC9K-AoPC、HAC1为GS115/pPIC9K-AoPC-HAC1、PDI为GS115/pPIC9K-AoPC-PDI；可以看出，这些菌培养液的上清液中均含有磷脂酶C，磷脂酶C的酶活力为依次为69U/mL(重组菌GS115/pPIC9K-AoPC)、150U/mL(重组菌GS115/pPIC9K-AoPC-HAC1)和630U/mL(重组菌GS115/pPIC9K-AoPC-PDI)。
上述结果可以看出，采用分子伴侣融合AoPC表达提高酶活，且PDI融合AoPC酶活更高。
采用同样的方法检测对照重组菌GS115/pPIC9K，结果没有酶活，表明AoPC为磷脂酶C。
四、重组巴斯德毕赤酵母高密度发酵产磷脂酶C
1、将上述步骤三获得的产酶水平最高的重组菌GS115/pPIC9K-AoPC-PDI菌株接种到150mL BMGY培养基(1％酵母提取物w/v，2％胰蛋白胨w/v，100mM pH 6.0的磷酸盐缓冲溶液，1.34％YNB w/v，4×10-5％生物素w/v，1％甘油v/v)中，在30℃，200rpm条件下振荡过夜培养至OD600为6，得到种子液。
2、将步骤1获得的种子液接种到装有1.35L发酵基本培养基BSM(85％磷酸26.7ml/L，CaSO4·2H2O 0.93g/L，K2SO4 18.2g/L，MgSO4·2H2O 14.9g/L，KOH 4.13，甘油40g/L，PMT14ml/L)的5L发酵罐中，将发酵罐灭菌，用28％浓氨水调节pH至4.0，加入PMT1痕盐(CuSO4·5H2O 6.0g/L，KI 0.088g/L，MnSO4·H2O 3.0g/L，Na2MoO4·2H2O 0.2g/L，H3BO4 0.02g/L，CoCl2·6H2O 0.5g/L，ZnCl2 20.0g/L，FeSO4·7H2O 65.0g/L，浓H2SO4 5.0mL)6.25mL，接种量为10％，转速600rpm，温度30℃。待甘油消耗完全(溶氧值迅速上升)，开始进行甘油流加。
3、完成步骤2后，流加50％(w/v)的甘油，控制温度30℃，pH 5.0，始终监测溶氧，通过调整流加速度保持溶氧>20％。流加时间为4-8h，菌体湿重达到180-220g/L后停止甘油流加。
4、完成步骤3后，停止甘油流加后饥饿30min左右，流加100％甲醇进行诱导(1％，v/v)，控制转速800rpm，监测并控制溶氧>20％，控制温度30℃，pH 6.0。
5、在步骤4流加甲醇过程的不同时间点取样，测定菌体湿重、蛋白质含量(Lowry试剂盒)和酶活力。
结果如图2所示，甲醇诱导培养144h时，酶活力达到最高，发酵上清液酶活力为82782U/mL，蛋白质浓度达7.3mg/mL，菌体湿重为399g/L。
SDS-PAGE电泳检测上清液，结果如图3所示，列M：低分子量标准蛋白；列1-9：分别为诱导12,24,48,72,96,120,144和168h的发酵上清液，可以看出，目的蛋白(65KD)条带密度随着诱导时间的增加而增加，利用软件Image J分析发现，目的蛋白约占总蛋白含量的90％，仅有少量的杂蛋白分泌到培养基中。
上述结果表明，得到目的融合蛋白AoPC-PDI，命名为重组磷脂酶C AoPC。
采用同样的SDS-PAGE电泳检测对照重组菌GS115/pPIC9K上清液，结果没有得到目的融合蛋白AoPC-PDI。
实施例2、重组磷脂酶C AoPC的纯化及酶学性质测定
一、重组磷脂酶C AoPC的纯化
1、将上述实施例1的四中甲醇诱导144h的重组菌GS115/pPIC9K-AoPC-PDI发酵上清液用5L 20mM Tris-HCl pH 7.5的缓冲溶液(缓冲溶液A)透析12h，并于4℃，10000rpm冷冻离心10min，留上清备用，得到粗酶液(浓度为7.3mg/mL)。
2、将步骤1获得的粗酶液经QSFF强阴离子交换柱(1.0×10cm)纯化，使用AKTA蛋白纯化系统(购于美国GE Healthcare公司)，上样流速为0.5mL/min。
3、完成步骤2后，设置流速为1mL/min，使用缓冲溶液A洗脱至洗脱液OD280<0.05。
4、完成步骤3后，使用含150mM NaCl的缓冲溶液A洗脱至洗脱液OD280<0.05。
5、收集步骤4获得的洗脱液，即为纯酶液，浓度14.8mg/mL。
用SDS-PAGE检验蛋白纯度，结果如图4所示，列M：低分子量标准蛋白；列1：粗酶液；列2：纯酶液；可以看出，重组磷脂酶C AoPC为电泳级纯酶。
二、检测纯酶液的总酶活、总蛋白、比酶活、纯化倍数和回收率
1、总酶活检测方法
p-NPPC法测定磷脂酶C酶活：将20μL适当稀释的酶液加入到96孔板中，再加入180μL含10mM p-NPPC的50mM pH 8.0Tris-HCl缓冲溶液于25℃培养箱静置。反应30min后，使用酶标仪于410nm波长测定吸光值。磷脂酶C酶活力单位(U)定义为在上述条件下，每分钟反应产生1μmol对硝基苯酚所需酶量。
计算公式为：酶活力(U)＝(y+0.004)/0.0022*稀释倍数*0.5/10/0.05
其中，y：OD410nm吸光值。
2、总蛋白检测方法
蛋白浓度测定依据Lowry法，以BSA为标准蛋白。
准备1X的福林酚试剂，将2X的福林酚试剂用双蒸水稀释至1X。(1X的福林酚试剂不够稳定，配置后应尽快使用)
配置不同浓度的标准蛋白液(BSA)：1ug/ul,2.5ug/ul,5ug/ul,7.5ug/ul,10ug/ul(溶剂是水)。取各浓度的标准蛋白液40ul加入96孔板中，另取待测的蛋白样品40ul，加入96孔板。
向各孔的蛋白液中加入200ul的试剂甲(碱性铜溶液)，混匀，室温静置10分钟。(此处尽量用排枪加入试剂甲，保证反应时间相同)
静置结束后，用排枪向各孔中加入20ul的试剂乙，立即振荡混匀30s，接着室温放置30分钟。(该步骤混合速度要快，否则会使显色程度减弱)
用酶标仪测定波长650nm处的吸光度，再将各个点的吸光度减去空白值，绘制标准曲线，从而计算待测样品的蛋白浓度。
蛋白浓度(mg/ml)＝(y-0.017)/0.0011
y：OD650nm吸光值
3、比酶活
比酶活指的是每毫克酶的酶活；
纯酶比酶活为纯酶总酶活比纯酶蛋白浓度(U/14.8 mg/mL)；
粗酶比酶活为粗酶总酶活比粗酶蛋白浓度(U/7.3 mg/mL)；
得到比酶活。
4、纯化倍数和回收率
纯化倍数为纯酶比酶活与粗酶比酶活的比值；
回收率指的是纯酶的总酶活力占粗酶液总酶活力的百分含量；
结果如表2所示，重组磷脂酶C AoPC纯酶液与粗酶液相比，比酶活力由175.1 U/mg提高到304.5 U/mg；纯化倍数为1.3，回收率为86.5％。
表2为磷脂酶C AoPC纯化结果
Figure BDA0002829548610000131
注：纯化倍数指的是纯酶比酶活与粗酶比酶活的比值；回收率指的是纯酶的总酶活力占粗酶液总酶活力的百分含量。
二、重组磷脂酶C AoPC的酶学性质
1、最适反应pH的测定
将上述步骤一中获得的14.8 mg/mL重组磷脂酶C AoPC纯酶液作为待测液，将其分别在不同缓冲溶液体系中，于25℃下测定酶活力，以最高酶活力为100％计算相对酶活力。各种缓冲溶液体系如下：柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液(Citrate，pH 3.0-6.0)、MES(pH5.0-7.0)、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(Tris-HCl，pH 7.0-9.0)、MOPS(pH 6.0-7.5)、N-(2-环己基氨基)乙磺酸缓冲溶液(CHES，pH 8.0-10.0)、HEPES(pH6.0-8.5)。
上述各种缓冲液配方如下：
柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液(Citrate，pH 3.0-6.0)：各自配制50mM的柠檬酸和柠檬酸钠溶液适当体积，用柠檬酸溶液去调柠檬酸钠溶液，得到相应pH的缓冲液。
MES(pH 5.0-7.0)：配制适当体积50mM的MES缓冲液，用6M盐酸去调节pH，得到相应pH缓冲液。
三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(Tris-HCl，pH 7.0-9.0)、MOPS(pH 6.0-7.5)、N-(2-环己基氨基)乙磺酸缓冲溶液(CHES，pH 8.0-10.0)、HEPES(pH 6.0-8.5)同MES缓冲液。
结果如图5所示，重组磷脂酶C AoPC最适pH为8.0，最适缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液(Tris-HCl，pH 8.0)。
2、pH稳定性的测定
将上述步骤一中获得的14.8mg/mL重组磷脂酶C AoPC纯酶液用步骤1中所述的缓冲溶液进行稀释，置于25℃水浴锅中处理30min，将其迅速置于冰水中冷却30min，于25℃测定残余酶活力。以未经处理的酶液酶活力为100％，计算残余酶活力所占百分比。
结果如图6所示，重组磷脂酶C AoPC具有较好的pH稳定性，在pH 4.0-9.0范围内保温30min后仍残留80％以上的酶活力。
3、最适温度的测定
将上述步骤一中获得的14.8mg/mL重组磷脂酶C AoPC纯酶液用50mM Tris-HCl pH8.0的缓冲溶液适当稀释后，分别在不同温度(15、20、25、30、35、40、45、50和55℃)下测定酶活力。以最高酶活力为100％，计算相对酶活力。
结果如图7所示，重组磷脂酶C AoPC的最适温度为25℃，为低温磷脂酶C。
4、温度稳定性的测定
将上述步骤一中获得的14.8mg/mL重组磷脂酶C AoPC纯酶液用50mM Tris-HCl pH8.0的缓冲溶液适当稀释后，分别在不同温度(0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55和60℃)下保温30min，将其迅速置于冰水中冷却30min，然后于25℃测定残余酶活力。以未经处理的酶液酶活力为100％，计算残余酶活力所占百分比。
结果如图8所示，重组磷脂酶C AoPC在40℃以下具有良好的稳定性。
5、半衰期的测定
将上述步骤一中获得的14.8mg/mL重组磷脂酶C AoPC纯酶液用50mM Tris-HCl pH8.0的缓冲溶液适当稀释，分别于35℃、50℃和55℃保温8h，定时取样，并于最适条件下测定残余酶活力。以未经处理的酶液酶活力为100％，计算残余酶活力所占百分比。以时间为横坐标，以相对酶活力的自然对数值Ln(相对酶活力(％))为纵坐标作图，计算酶活力降至一半时所需要的时间。
结果如图9所示，重组磷脂酶C AoPC在35、40和45℃下的半衰期分别为537、210和42min。
实施例3、重组磷脂酶C AoPC在大豆毛油脱胶中的应用
一、重组磷脂酶C AoPC在大豆毛油脱胶最优条件筛选
1、重组磷脂酶C AoPC磷脂脱胶加酸量优化
AoPC+Crtric acid：称取300g大豆毛油(没有进行后期脱胶处理的油)于100mL具塞三角瓶中水浴加热至70℃，加入0.3mL的柠檬酸溶液(用水配制浓度为0-50％的柠檬酸溶液，定容即可，w/w)，在200rpm条件下预处理20min。处理完成后，冷却至预设温度(20-50℃，可以为25℃)，加入0.6mL的4％(g:ml)NaOH水溶液调节pH为8，再加入1％的蒸馏水和一定量的实施例2的一制备的步骤一中获得的14.8mg/mL重组磷脂酶C AoPC纯酶液(使其在反应体系中的终浓度为4000U/kg)，均匀混合后，在200rpm摇床中25℃酶解反应(0-10h)。反应结束后，将油样置于沸水浴中灭活10min，并于10000rpm离心10min，取油样上清按照国标方法(GB/T 5537-2008)测定磷含量。
Crtric acid：与AoPC+Crtric acid区别仅在于，不加入磷脂酶C。
结果如图12所示，重组磷脂酶C AoPC AoPC磷脂脱胶加酸量优化图(加酸量为0-50％(w/w)，可以看出，25％柠檬酸预处理最优，AoPC+Crtric acid效果优于Crtric acid。
2、磷脂酶C AoPC磷脂脱胶加酶量
称取300g大豆毛油(没有进行后期脱胶处理的油)于100mL具塞三角瓶中水浴加热至70℃，加入0.3mL的柠檬酸溶液(用水溶解柠檬酸配制浓度为25％的柠檬酸溶液，定容即可，w/w)，在200rpm条件下预处理20min。处理完成后，冷却至预设温度(20-50℃，可以为25℃)，加入0.6mL的4％(g:ml)NaOH水溶液调节pH为8，再加入1％的蒸馏水和一定量的实施例2的一制备的步骤一中获得的14.8mg/mL重组磷脂酶C AoPC纯酶液(使其在反应体系中的终浓度为0-10000U/kg)，均匀混合后，在200rpm摇床中25℃酶解反应4h。反应结束后，将油样置于沸水浴中灭活10min，并于10000rpm离心10min，取油样上清按照国标方法(GB/T 5537-2008)测定磷含量。
结果如图10所示，重组磷脂酶C AoPC磷脂脱胶加酶量优化图(加酶量为0-10000U/Kg)，重组磷脂酶C AoPC应用于大豆毛油脱胶的加酶量最优为4000U/kg。
3、重组磷脂酶C AoPC磷脂脱胶反应时间优化
称取300g大豆毛油(没有进行后期脱胶处理的油)于100mL具塞三角瓶中水浴加热至70℃，加入0.3mL的柠檬酸溶液(用水配制浓度为25％的柠檬酸溶液，定容即可，w/w)，在200rpm条件下预处理20min。处理完成后，冷却至预设温度(20-50℃，可以为25℃)，加入0.6mL的4％(g:ml)NaOH水溶液调节pH为8，再加入1％的蒸馏水和一定量的实施例2的一制备的步骤一中获得的14.8mg/mL重组磷脂酶C AoPC(使其在反应体系中的终浓度为4000U/kg)，均匀混合后，在200rpm摇床中25℃酶解反应0-10h。反应结束后，将油样置于沸水浴中灭活10min，并于10000rpm离心10min，取油样上清按照国标方法(GB/T 5537-2008)测定磷含量。
结果如图11所示，重组磷脂酶C AoPC磷脂脱胶反应时间优化水解时间最优为4h。
二、脱胶实验
酸酶协同处理组(AoPC(4000U/kg)柠檬酸(25％))：称取300g大豆毛油于100mL具塞三角瓶中水浴加热至70℃，加入0.3mL(浓度为25％质量百分含量)的柠檬酸溶液，在200rpm条件下预处理20min。处理完成后，冷却至酶的最适温度(25℃)，加入0.6mL的4％(g:ml)NaOH水溶液调节pH为8，再加入1％的蒸馏水和一定量的实施例2的一制备的步骤一中获得的14.8mg/mL重组磷脂酶C AoPC纯酶液(使其在反应体系中的终浓度为4000U/kg)，均匀混合后，在200rpm摇床中25℃酶解反应(4h)。反应结束后，将油样置于沸水浴中灭活10min，并于10000rpm离心10min，取油样上清按照国标方法(GB/T 5537-2008)测定磷含量。
只加酶处理组(AoPC(4000U/kg))：称取300g大豆毛油加入0.6mL的4％(g:ml)NaOH水溶液调节pH为8，再加入1％的蒸馏水和一定量的实施例2的一制备的步骤一中获得的14.8mg/mL重组磷脂酶C AoPC纯酶液(使其在反应体系中的终浓度为4000U/kg)，均匀混合后，在200rpm摇床中25℃酶解反应(4h)。反应结束后，将油样置于沸水浴中灭活10min，并于10000rpm离心10min，取油样上清按照国标方法(GB/T5537-2008)测定磷含量。
只加酸处理组(柠檬酸(％))：称取300g大豆毛油于100mL具塞三角瓶中水浴加热至70℃，加入0.3mL(浓度为50％质量百分含量)的柠檬酸溶液，在200rpm条件下预处理20min。反应结束后，将油样置于沸水浴中灭活10min，并于10000rpm离心10min，取油样上清按照国标方法(GB/T 5537-2008)测定磷含量。
灭活酶液(对照组)：称取300g大豆毛油于100mL具塞三角瓶中水浴加热至70℃，加入0.3mL(浓度为25％质量百分含量)的柠檬酸溶液，在200rpm条件下预处理20min。处理完成后，冷却至预设温度(25℃)，加入0.6mL的4％(g:ml)NaOH水溶液调节pH为8，再加入1％的蒸馏水和一定量的实施例2的一制备的步骤一中获得14.8mg/mL重组磷脂酶C AoPC纯酶液的灭活酶液(使其在反应体系中的终浓度为4000U/kg)，均匀混合后，在200rpm摇床中25℃酶解反应(4h)。反应结束后，将油样置于沸水浴中灭活10min，并于10000rpm离心10min，取油样上清按照国标方法(GB/T5537-2008)测定磷含量。
纯酶液的灭活酶液为将纯酶液在沸水浴中放置10min。
结果如图13所示，酸酶协同处理组，上述优化条件下，磷含量由最初129.0mg/kg降低为8.6mg/kg，水解率为93.3％；25％柠檬酸协同4000U/Kg的磷脂酶C脱胶效率与只加50％酸脱胶处理效果一致。测定结果表明大豆脱胶油的含磷量<10mg/kg，符合工业脱胶油标准。
序列表
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atgaagtcca ccgctctgct tactggtctc ggcctcttgg cctctctcgg tcttgctagc 60
cctgtcacgt ccgagtatac gagcgtgcga gaagcccctt tcggatacaa gcctggctcc 120
aaggagtcca ttgagaactt gaaggacaag gtcgagaaca ttgtctggct tattctcgag 180
aacagatcct tcgataacat tctgggaggc gtgcgccgcc aaggactgga caacccgatc 240
aacaacggcc cgttctgcaa ctacaagaat gcgagcgacc catcctcggg caagtactgt 300
actcaggcca aggactatga ttccgtgttc aacgatccag accactccgt gactggtaat 360
aacttggagt tctacggaac ttacacccca aacaatggtg cgattgccag tggcaaggtc 420
gtcgccgacc agtctggctt cctcaacgca cagcttaacg actaccccaa actggcccca 480
gaagaggcga caaggcaagt gatgggatac tatacggagg aggaggttcc tacgctcgtg 540
gaccttgtgg atgagttcac tactttcaac agctggttct cgtgtgttcc tggccctacc 600
aaccccaacc gcttgtgcgc tctggcagga accgctgctg ggcatggcaa gaatgacgat 660
gacttcctga actatggtat ctctagcaag tccatcttcg aggccgccaa cgagaagggc 720
gtgtcctggc tcaactacga tggcaccaac ggagaattcg aaccggattc tctcttcttc 780
acctacgtca accagacctc ccggtccaac gtggtgcccg ttgaaaactt cttccaagac 840
gcctacctcg gtgtcctccc taaattctct tacattaacc cctcctgctg cggcaccaac 900
accaactcca tgcaccccac cggtaacgtc tcctacggtg aggtcttcgt caagcagatc 960
tatgatgcca ttcgccaggg ccctcagtgg gacaagaccc tgctcttcat tacctacgac 1020
gagaccggtg gcttctacga ccatgtccct tgctgctgct gttgttgccc ggacaacctg 1080
acctacactg agactgcgaa gaacggtcag aaatacactc ttcacttcga ccgtctgggt 1140
ggctgctgtt gcacctgggt tatctcccct tacagtaaga agggatacat cgagcagtac 1200
ggaacggatc ccgtcacggg caagcccgct ccctacagtt gcacctccgt cctcaagact 1260
ctcggatatc tctgggacat cgaggacttc acccctcgtg tcgcccactc tccatctttc 1320
gatcacctga tcggcacgac tttgcgtgag gatgctccta ttgctctcaa gactccccat 1380
accttttcgg tataa 1395
<210>2
<211>464
<212>PRT
<213>米曲霉（Aspergillus oryzae）
<400>2
Met Lys Ser Thr Ala Leu Leu Thr Gly Leu Gly Leu Leu Ala Ser Leu
1 5 10 15
Gly Leu Ala Ser Pro Val Thr Ser Glu Tyr Thr Ser Val Arg Glu Ala
20 25 30
Pro Phe Gly Tyr Lys Pro Gly Ser Lys Glu Ser Ile Glu Asn Leu Lys
35 40 45
Asp Lys Val Glu Asn Ile Val Trp Leu Ile Leu Glu Asn Arg Ser Phe
50 55 60
Asp Asn Ile Leu Gly Gly Val Arg Arg Gln Gly Leu Asp Asn Pro Ile
65 70 75 80
Asn Asn Gly Pro Phe Cys Asn Tyr Lys Asn Ala Ser Asp Pro Ser Ser
85 90 95
Gly Lys Tyr Cys Thr Gln Ala Lys Asp Tyr Asp Ser Val Phe Asn Asp
100 105 110
Pro Asp His Ser Val Thr Gly Asn Asn Leu Glu Phe Tyr Gly Thr Tyr
115 120 125
Thr Pro Asn Asn Gly Ala Ile Ala Ser Gly Lys Val Val Ala Asp Gln
130 135 140
Ser Gly Phe Leu Asn Ala Gln Leu Asn Asp Tyr Pro Lys Leu Ala Pro
145 150 155 160
Glu Glu Ala Thr Arg Gln Val Met Gly Tyr Tyr Thr Glu Glu Glu Val
165 170 175
Pro Thr Leu Val Asp Leu Val Asp Glu Phe Thr Thr Phe Asn Ser Trp
180 185 190
Phe Ser Cys Val Pro Gly Pro Thr Asn Pro Asn Arg Leu Cys Ala Leu
195 200 205
Ala Gly Thr Ala Ala Gly His Gly Lys Asn Asp Asp Asp Phe Leu Asn
210 215 220
Tyr Gly Ile Ser Ser Lys Ser Ile Phe Glu Ala Ala Asn Glu Lys Gly
225 230 235 240
Val Ser Trp Leu Asn Tyr Asp Gly Thr Asn Gly Glu Phe Glu Pro Asp
245 250 255
Ser Leu Phe Phe Thr Tyr Val Asn Gln Thr Ser Arg Ser Asn Val Val
260 265 270
Pro Val Glu Asn Phe Phe Gln Asp Ala Tyr Leu Gly Val Leu Pro Lys
275 280 285
Phe Ser Tyr Ile Asn Pro Ser Cys Cys Gly Thr Asn Thr Asn Ser Met
290 295 300
His Pro Thr Gly Asn Val Ser Tyr Gly Glu Val Phe Val Lys Gln Ile
305 310 315 320
Tyr Asp Ala Ile Arg Gln Gly Pro Gln Trp Asp Lys Thr Leu Leu Phe
325 330 335
Ile Thr Tyr Asp Glu Thr Gly Gly Phe Tyr Asp His Val Pro Cys Cys
340 345 350
Cys Cys Cys Cys Pro Asp Asn Leu Thr Tyr Thr Glu Thr Ala Lys Asn
355 360 365
Gly Gln Lys Tyr Thr Leu His Phe Asp Arg Leu Gly Gly Cys Cys Cys
370 375 380
Thr Trp Val Ile Ser Pro Tyr Ser Lys Lys Gly Tyr Ile Glu Gln Tyr
385 390 395 400
Gly Thr Asp Pro Val Thr Gly Lys Pro Ala Pro Tyr Ser Cys Thr Ser
405 410 415
Val Leu Lys Thr Leu Gly Tyr Leu Trp Asp Ile Glu Asp Phe Thr Pro
420 425 430
Arg Val Ala His Ser Pro Ser Phe Asp His Leu Ile Gly Thr Thr Leu
435 440 445
Arg Glu Asp Ala Pro Ile Ala Leu Lys Thr Pro His Thr Phe Ser Val
450 455 460
<210>3
<211>381
<212>DNA
<213> Artificial sequence
<400>3
atgactaact ggaaggctat tttgactcca gctcaatacc aagttttgag attgggtggt 60
actgaaagac cttacactgg tcaatacgtt aacttcaaga aaaatggtac ttacttgtgt 120
tctggttgtc aaactccatt gtacaagtct ggtactaagt tcgattcttc ttgtggttgg 180
ccagctttct atgaggcttt gcctggtgct gttaagagaa tcgaagataa ctctttgggt 240
atgagaagaa tcgagatcag atgttctaag tgtgatggtc atttgggtca cgtttttgag 300
ggtgaaggtt tcgatactcc tactgattct agacattgtg ttaactctat ctctttgaag 360
ttccaaggtg aagaggaaaa t 381
<210>4
<211>127
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400>4
Met Thr Asn Trp Lys Ala Ile Leu Thr Pro Ala Gln Tyr Gln Val Leu
1 5 10 15
Arg Leu Gly Gly Thr Glu Arg Pro Tyr Thr Gly Gln Tyr Val Asn Phe
20 25 30
Lys Lys Asn Gly Thr Tyr Leu Cys Ser Gly Cys Gln Thr Pro Leu Tyr
35 40 45
Lys Ser Gly Thr Lys Phe Asp Ser Ser Cys Gly Trp Pro Ala Phe Tyr
50 55 60
Glu Ala Leu Pro Gly Ala Val Lys Arg Ile Glu Asp Asn Ser Leu Gly
65 70 75 80
Met Arg Arg Ile Glu Ile Arg Cys Ser Lys Cys Asp Gly His Leu Gly
85 90 95
His Val Phe Glu Gly Glu Gly Phe Asp Thr Pro Thr Asp Ser Arg His
100 105 110
Cys Val Asn Ser Ile Ser Leu Lys Phe Gln Gly Glu Glu Glu Asn
115 120 125
<210>5
<211>993
<212>DNA
<213> Artificial sequence
<400>5
atgccagttg attcttctca taagactgct tctcctttgc cacctagaaa gagagctaaa 60
actgaagagg aaaaggaaca aagaagagtt gagagaatct tgagaaacag aagagctgct 120
cacgcttcta gagaaaagaa aagaagacat gttgaattct tggagaacca cgttgttgat 180
ttggaatctg ctttgcaaga gtctgctaag gctactaata agttgaagga aatccaagat 240
atcattgttt ctagattgga ggctttgggt ggtactgttt ctgatttgga tttgactgtt 300
ccagaagttg atttccctaa atcttctgat ttggagccaa tgtctgattt gtctacttct 360
tctaagtctg aaaaagcttc tacttctact agaagatctt tgactgaaga tttggatgag 420
gatgatgttg ctgagtacga tgatgaggaa gaggatgaag agttgcctag aaagatgaag 480
gttttgaacg ataagaacaa gtctacttct attaagcaag aaaagttgaa cgagttgcca 540
tctcctttgt cttctgattt ttctgatgtt gatgaagaga agtctacttt gactcatttg 600
aaattgcaac aacaacaaca acaaccagtt gataactacg tttctactcc attgtctttg 660
cctgaagatt ctgttgattt catcaaccct ggtaatttga agatcgaatc tgatgagaac 720
ttcttgttgt cttctaacac tttgcaaatt aaacatgaaa acgatactga ttacattact 780
actgctccat ctggttctat taacgatttc tttaactctt acgatatctc tgagtctaac 840
agattgcatc accctgctgt tatgactgat tcttctttgc acattactgc tggttctatt 900
ggtttctttt ctttgattgg tggtggtgaa tcctctgttg ctggtagaag atcttctgtt 960
ggtacttacc aattgacttg tattgctatt aga 993
<210>6
<211>331
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400>6
Met Pro Val Asp Ser Ser His Lys Thr Ala Ser Pro Leu Pro Pro Arg
1 5 10 15
Lys Arg Ala Lys Thr Glu Glu Glu Lys Glu Gln Arg Arg Val Glu Arg
20 25 30
Ile Leu Arg Asn Arg Arg Ala Ala His Ala Ser Arg Glu Lys Lys Arg
35 40 45
Arg His Val Glu Phe Leu Glu Asn His Val Val Asp Leu Glu Ser Ala
50 55 60
Leu Gln Glu Ser Ala Lys Ala Thr Asn Lys Leu Lys Glu Ile Gln Asp
65 70 75 80
Ile Ile Val Ser Arg Leu Glu Ala Leu Gly Gly Thr Val Ser Asp Leu
85 90 95
Asp Leu Thr Val Pro Glu Val Asp Phe Pro Lys Ser Ser Asp Leu Glu
100 105 110
Pro Met Ser Asp Leu Ser Thr Ser Ser Lys Ser Glu Lys Ala Ser Thr
115 120 125
Ser Thr Arg Arg Ser Leu Thr Glu Asp Leu Asp Glu Asp Asp Val Ala
130 135 140
Glu Tyr Asp Asp Glu Glu Glu Asp Glu Glu Leu Pro Arg Lys Met Lys
145 150 155 160
Val Leu Asn Asp Lys Asn Lys Ser Thr Ser Ile Lys Gln Glu Lys Leu
165 170 175
Asn Glu Leu Pro Ser Pro Leu Ser Ser Asp Phe Ser Asp Val Asp Glu
180 185 190
Glu Lys Ser Thr Leu Thr His Leu Lys Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln
195 200 205
Pro Val Asp Asn Tyr Val Ser Thr Pro Leu Ser Leu Pro Glu Asp Ser
210 215 220
Val Asp Phe Ile Asn Pro Gly Asn Leu Lys Ile Glu Ser Asp Glu Asn
225 230 235 240
Phe Leu Leu Ser Ser Asn Thr Leu Gln Ile Lys His Glu Asn Asp Thr
245 250 255
Asp Tyr Ile Thr Thr Ala Pro Ser Gly Ser Ile Asn Asp Phe Phe Asn
260 265 270
Ser Tyr Asp Ile Ser Glu Ser Asn Arg Leu His His Pro Ala Val Met
275 280 285
Thr Asp Ser Ser Leu His Ile Thr Ala Gly Ser Ile Gly Phe Phe Ser
290 295 300
Leu Ile Gly Gly Gly Glu Ser Ser Val Ala Gly Arg Arg Ser Ser Val
305 310 315 320
Gly Thr Tyr Gln Leu Thr Cys Ile Ala Ile Arg
325 330

Claims (8)

1.一种蛋白质，是序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的C端连接PDI蛋白得到的共表达蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。
3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为序列表中序列1所示的核苷酸序列组成的DNA分子的末端连接分子伴侣标签编码基因得到的共表达核酸分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体、转基因细胞或重组菌。
5.权利要求1所述蛋白质在作为磷脂酶C中的应用；
或权利要求1所述蛋白质在水解磷脂酰胆碱pNPPC中的应用；
或权利要求1所述蛋白质在毛油脱胶中的应用；
或权利要求1所述蛋白质在降低毛油中的磷含量中的应用。
6.权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的表达盒、重组载体、转基因细胞或重组菌在如下1)-4)中至少一种中的应用：
1)制备磷脂酶C；
2)水解磷脂酰胆碱pNPPC；
3)毛油脱胶；
4)降低毛油中的磷含量。
7.一种制备磷脂酶C的方法，包括如下步骤：将权利要求4所述的重组菌用甲醇诱导培养，即得到磷脂酶C；
或，一种水解磷脂酰胆碱pNPPC的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述蛋白质水解磷脂酰胆碱pNPPC；
或，一种大豆毛油磷脂脱胶的方法，包括如下步骤：用权利要求1所述蛋白质水解大豆毛油。
8.一种具有如下a-c至少一种功能产品，其包括权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4所述的表达盒、重组载体、转基因细胞或重组菌：
a)水解磷脂酰胆碱pNPPC；
b)毛油脱胶；
c)降低毛油中的磷含量。
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