CN113005110B

CN113005110B - 一种太瑞斯梭孢壳霉磷脂酶c及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN113005110B
Application number: CN201911316108.0A
Authority: CN
Inventors: 杨绍青; 江正强; 相曼; 闫巧娟; 王灵
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-12-19
Filing date: 2019-12-19
Publication date: 2022-10-04
Anticipated expiration: 2039-12-19
Also published as: CN113005110A

Abstract

本发明公开了一种太瑞斯梭孢壳霉磷脂酶C及其编码基因与应用。将本发明太瑞斯梭孢壳霉磷脂酶C编码基因导入毕赤酵母中进行异源表达，重组巴斯德毕赤酵母在5L发酵罐中高密度发酵，酶活力可达98970U/mL，蛋白质含量为4.9mg/mL，实现了高效表达。该磷脂酶C的最适pH为6.5，在pH 4.5‑8.0保持稳定；最适温度为55℃，在45℃以下较好的稳定性。该磷脂酶C应用于大豆毛油脱胶，脱胶油满足工业植物油脱胶要求。所述磷脂酶C在食品工业中具有良好的应用潜力。

Description

一种太瑞斯梭孢壳霉磷脂酶C及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及食品生物技术领域，具体涉及一种太瑞斯梭孢壳霉磷脂酶C及其编码基因与应用。

背景技术

磷脂酶C(phospholipase C，EC 3.1.4.3)是一种专一作用于甘油磷脂C₃位上甘油磷酸酯键的酯类水解酶，生成同为油脂成分的甘油二酯(DAG)及磷脂化合物(Vines CM.Phospholipase C.Advances in experimental medicine and biology,2012,740:235-254)。磷脂酶C因其在食品、药品、保健品、化妆品等工业领域具有巨大的应用前景而受到广泛关注。在食品工业中，磷脂酶C可以用来改善面包的冷冻保存时间、避免生面团烤制时面包表面的老化，以及减少面包表面梨皮状表皮等。应用于油脂精炼过程，不仅能减少油脂中磷脂含量，还能提高精炼油得率(余榛榛,常明,刘睿杰等. 单增李斯特氏菌磷脂酶C(lm-plcB)基因的克隆表达及其在油脂脱胶中的应用.食品与发酵工业,2013,39(12):44-49)。

磷脂酶C的来源广泛，存在于动物、植物和微生物中(Cocco L,Follo M Y,ManzoliL.Phosphoinositide-specific phospholipase C in health and disease.Journal oflipid research,2015,56:1853-1860)。相较于动植物来源的磷脂酶C，微生物来源的磷脂酶C 容易培养、纯化和提取，具备更大的应用潜力(刘菲菲,张梁,顾正华等.蜡状芽孢杆菌磷脂酶C基因在大肠杆菌中的异源表达.食品科学,2013,34(11):182-187；任龙,杨宁,陈福生等.蜡样芽胞杆菌深圳株754-1 PLC基因的克隆及表达.武汉工业学院学报, 2007,02:19-21+35)。目前，已从多种不同来源微生物中分离纯化出磷脂酶C，包括梭菌属(Diner BA.Purification and properties of Clostridium welchii phospholipase C.Biochimica etbiophysica acta,1970,198:514-&)、芽孢杆菌属(Levine L,Xiao D M,Little C.Increased arachidonic acid metabolites from cells in culture aftertreatment with the phosphatidylcholine-hydrolyzing phospholipase C fromBacillus cereus.Prostaglandins, 1998,34:633–642)、假单胞菌属(Mo S,Kim J H,ChoK W.A novel extracellular phospholipase C purified from a marine bacterium,Pseudoalteromonas sp.J937. Biotechnology letter,2009,31:89-94)、链霉菌属(Iwasaki Y,Niwa S,Nakano H,et al. Purification and properties ofphosphatidylinositol-specific phospholipase C from Streptomycesantibioticus.Biochimica biophysica acta–lipids and lipid metabolism,1994,1214:221-228)、不动杆菌属(Lehmann V.Production ofphospholipase CinAcinetobacter calcoacetius.Acta pathologica et microbiologica scandinavicasection a-pathology,1971,79: 789-&)等。但是由于天然微生物磷脂酶C产量低，工业化应用价值不能很好地体现。 (赵金星,张梁,顾正华等.大肠杆菌重组表达磷脂酶C的发酵工艺优化.食品科学, 2013,34(9):143-149)。

利用基因工程的手段可提高酶的产量，以满足大规模工业化应用的要求。迄今，已有不少磷脂酶C基因在大肠杆菌(Escherichia coli)、毕赤酵母(Pichiapastoris)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)等中成功表达，但是产酶量有待进一步提高。例如，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)来源的PLC基因克隆表达在毕赤酵母中，并与α-因子分泌信号肽融合，实现PLC的表达，但酶活力最高仅为360U/mL(Seo K H,Rhee J I.High-level expression ofrecombinant phospholipase Cfrom Bacillus cereus in Pichia pastoris and its characterization.Biotechnology Letters,2004,26(19):1475-1479)。另一来源于蜡样芽胞杆菌的磷脂酶C在毕赤酵母中表达，产量为4.5g/L(Elena C,Ravasi P,Cerminati S,etal.Pichiapastoris engineering for the production ofa modified phospholipaseC.Process biochemistry,2016, 51:1935-1944)。球形芽孢杆菌(Lysinibacillussphaericus)磷脂酶C在大肠杆菌中表达，经1L发酵罐分批补料发酵后，磷脂酶C产量达到14g/L，但是文献中未显示酶活力(Cerminati S,Eberhardt F,Elena C E,etal.Development of a highly efficient oil degumming process using a novelphosphatidylinositol-specific phospholipase C enzyme. Applied microbiologybiotechnology,2017,101:4471-4479)。蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)磷脂酶C在谷氨酸棒状杆菌中表达，产量为5.5g/L(Ravasi P,Braia M,Eberhardt F,et al.High-levelproduction of Bacillus cereus phospholipase C in Corynebacteriumglutamicum.Journal ofbiotechnology,2015,216:142-148)。虽然已有一些磷脂酶C基因异源表达的研究报道，但是目前磷脂酶C产量仍然较低，底物特异性高度集中，且稳定性较差(余榛榛,常明,刘睿杰等.磷脂酶C在酶法脱胶中研究进展.中国油脂,2013, 38(7):19-22)。因此，开发一些新型、酶活力高和具有特殊特性的磷脂酶C仍具有重要的研究意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种太瑞斯梭孢壳霉磷脂酶C及其编码基因与应用。

第一方面，本发明保护一种蛋白质，来源于太瑞斯梭孢壳霉，是如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

(a3)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白质中，蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

编码所述蛋白质的基因也属于本发明的保护范围。

所述基因为如下(b1)-(b4)中任一所述的DNA分子：

(b1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；

(b2)序列表中序列1所示的DNA分子；

(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

(b4)来源于太瑞斯梭孢壳霉且与(b1)或(b2)或(b3)限定的DNA序列具有 90％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

第二方面，本发明保护所述蛋白质在如下(c1)或(c2)中的应用：

(c1)作为磷脂酶C；

(c2)催化O-4-(硝基苯基磷脂酰基)胆碱制备硝基苯酚。

本发明还保护所述蛋白质，或，所述基因，或，所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在油脂脱胶中的应用。

第三方面，本发明保护一种制备磷脂酶C的方法，包括如下步骤：得到表达所述蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到磷脂酶C。

所述方法中，所述重组微生物为重组巴斯德毕赤酵母。

所述方法中，所述重组微生物具体可为将所述蛋白质的编码基因导入巴斯德毕赤酵母中得到的。所述巴斯德毕赤酵母具体可为巴斯德毕赤酵母GS115。

将所述蛋白质的编码基因导入巴斯德毕赤酵母具体可通过将含有所述编码基因的重组表达载体导入巴斯德毕赤酵母实现。所述重组表达载体具体可为采用序列表的序列1所示的DNA分子替换酵母表达载体pPIC9K的EcoR I和Not I酶切位点之间的片段得到的重组表达载体。

所述方法中，所述培养具体可分为种子液培养、基础培养、甘油流加培养和100％甲醇诱导培养四个阶段。

所述种子液培养具体包括如下步骤：将所述重组微生物接种于YPD培养基中， 30℃、200rpm条件下振荡过夜培养至菌液OD₆₀₀为2-6。所述YPD培养基中的溶质及其在所述YPD培养基中的浓度为：1％(质量百分含量)酵母提取物、2％(质量百分含量)胰蛋白胨和2％(质量百分含量)葡萄糖；所述溶剂为水。

所述基础培养具体包括如下步骤：将种子液培养得到的菌液接种于BSM培养基中，再加入PTM₁痕盐，进行发酵培养18-24h，待基础培养过程中甘油消耗完全(溶氧值迅速上升)时进入甘油流加培养阶段；所述发酵培养的参数设置为：通气量4L/min，转速600rpm，罐压0.03MPa，温度30℃，pH4.0，溶氧满度100％。所述BSM培养基配置方法为：1.4g CaSO₄，27.3g K₂SO₄，22.35g MgSO₄·7H₂O，6.2g KOH，60g 甘油和40.05mL 85％H₃PO₄溶于水中，待溶解完全后定容至1.35L。所述PTM₁痕盐配置方法为6g CuSO₄·7H₂O，0.08g NaI，3gMnSO₄·H₂O，0.2g Na₂MoO₄·2H₂O， 0.02g H₃BO₃，0.5g CoCl₂，20g ZnCl₂，65g FeSO₄·7H₂O，0.2g生物素，5mL浓硫酸溶于水中，待溶解完全后定容至1L。

所述甘油流加培养具体包括如下步骤：流加50％(w/v)的甘油，控制温度30℃、 pH5.0，保持溶氧>20％，流加时间为4-6h，待菌体湿重达到180-220g/L后停止甘油流加，饥饿30min后进入100％甲醇诱导培养阶段。

100％甲醇诱导培养：流加100％甲醇进行诱导，控制转速800rpm，监测并控制溶氧>20％，控制温度30℃，pH 6.0。100％甲醇诱导培养阶段的培养时间具体可为180h。

所述方法还包括采用QSFF强阴离子交换层析柱进行纯化的步骤。

本发明还保护所述方法制备得到的磷脂酶C。

第四方面，本发明还保护一种油脂脱胶方法，包括如下步骤：采用特定物质进行油脂脱胶；所述特定物质为如下(d1)或(d2)：

(d1)所述蛋白质；

(d2)所述磷脂酶C。

所述方法具体可包括如下步骤：取毛油加热至70℃，加入45％(w/w)的柠檬酸溶液，200rpm处理20min。处理完成后，冷却至一定温度，加入4％(w/v)NaOH溶液调节pH，再加入1％的蒸馏水和一定量的所述磷脂酶C，均匀混合后，在200rpm 摇床中进行水解反应。反应结束后，将油样置于沸水浴中灭活10min，并于10000rpm 离心10min，取油样上清，即为脱胶油。

所述一定温度具体可为30-55℃，优选为40℃。

所述柠檬酸溶液和NaOH溶液的体积比具体可为1:0.5-4，优选为1:2。

所述磷脂酶C的加入量具体可为0-10000U/kg毛油，优选为5000U/kg毛油。

所述水解反应的时间具体可为0-4h，优选为1h。

第五方面，本发明还保护用于制备植物脱胶油的产品，包括植物毛油和第四方面中所述的特定物质。

本发明提供了一种来源于太瑞斯梭孢壳霉磷脂酶C及其编码基因，将其导入毕赤酵母中进行异源表达。重组巴斯德毕赤酵母在5L发酵罐中高密度发酵，酶活力可达98970U/mL，蛋白质含量为4.9mg/mL，实现了高效表达。该磷脂酶C的最适pH为 6.5，在pH4.5-8.0保持稳定；最适温度为55℃，在45℃以下较好的稳定性。该磷脂酶 C应用于大豆毛油脱胶，脱胶油满足工业植物油脱胶要求。所述磷脂酶C在食品工业中具有良好的应用潜力。

附图说明

图1为磷脂酶C在5L发酵罐中高密度发酵过程中的产酶历程图(A)和SDS-PAGE 电泳图(B)(■：酶活力；○：蛋白浓度；▲：菌体湿重；列M：高分子量标准蛋白；列1-9：分别为诱导12、36、60、84、108、132、156、180和192h的发酵上清液)。

图2为磷脂酶C纯化电泳图(列M：高分子量标准蛋白；列1：粗酶液；列2：纯酶液；列3：去糖基化酶处理后)。

图3为SDS-PAGE法(A)和凝胶过滤法(B)测定磷脂酶C分子量曲线图(■：标准蛋白；●：目的蛋白)。

图4为磷脂酶C的最适pH(A)和pH稳定性(B)测定曲线图(▼：Citrate；□： PB；◆：MOPS；▲：HEPES；○：Tris-HCl)

图5为磷脂酶C最适温度(A)、温度稳定性(B)和半衰期(C)测定曲线图(■：45℃；●：50℃；▲：55℃)。

图6为酸碱比(A)、温度(B)、加酶量(C)和反应时间(D)对磷脂酶C脱胶效果的影响图。

图7为大豆毛油(A)和脱胶油(B)的³¹P核磁图(PC：磷脂酰胆碱；PE：磷脂酰乙醇胺；PI：磷脂酰肌醇；PA：磷脂酸；P-Cho：磷酸胆碱)。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

本发明的实施例中，磷脂酶C酶活力测定参考Kurlosa和Mstsuda的方法(KuriokaS,Matsura M.Phospholipase-C assay using para-nitrophenylphosphorylcholinetogether with sorbitol and its application to studying metal and detergentrequirement of enzyme. Analytical Biochemistry,1976,75:281-289)。将20μL适当稀释的酶液加入到96孔板，再加入180μL含10mM的O-4-(硝基苯基磷脂酰基)胆碱(p-NPPC)的50mM pH 6.5 的4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)缓冲溶，于37℃培养箱静置30min后，于410nm 波长下测定吸光度。磷脂酶C酶活力单位(U)定义为在以上条件下，每分钟反应产生1μmol对硝基苯酚(pNP)所需要的酶量。比酶活力定义为1mg蛋白所具有的酶活力单位，表示为U/mg。

实施例1、太瑞斯梭孢壳霉磷脂酶C及其编码基因的发现

对太瑞斯梭孢壳霉进行大量序列分析和功能验证，从太瑞斯梭孢壳霉CAU709中克隆得到一个磷脂酶C的编码基因，全长1344bp，如序列表的序列1所示。序列表的序列1所示的DNA分子编码序列2所示的磷脂酶C。

实施例2、太瑞斯梭孢壳霉磷脂酶C在重组巴斯德毕赤酵母中的表达

一、重组菌的构建

1、重组表达载体构建：采用序列表的序列1所示的DNA分子替换酵母表达载体pPIC9K(美国Invitrogen公司)的EcoR I和Not I酶切位点之间的片段，得到重组表达载体pPIC9K-TtPLC(已经测序验证)。

2、将步骤1得到的重组表达载体pPIC9K-TtPLC以限制性内切酶SalI线性化后，转化巴斯德毕赤酵母GS115(美国Invitrogen公司)，构成重组菌。

二、高拷贝筛选

1、将步骤一中得到的重组菌接种于MD平板(1.34％YNB，4×10^-5％生物素，2％葡萄糖)中，30℃下培养3-5d，得到His⁺转化子。

2、完成步骤1后，将转化子经灭菌水刮取后取100μL涂布于不同浓度的 YPD-G418平板(1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，2％葡萄糖，G418浓度分别为1、2、 3和4mg/mL)中，30℃下培养3-5d。

3、完成步骤2后，取转化子接种于BMGY培养基(1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，100mM pH 6.0的磷酸盐缓冲溶液，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，1％甘油)，30℃、 200rpm摇瓶培养16-18h。

4、完成步骤3后，将培养体系8000rpm离心5min，收集菌体，用BMMY培养基(1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，100mM pH 6.0的磷酸盐缓冲溶液，1.34％YNB， 4×10^-5％生物素，0.5％甲醇)重悬菌体至OD₆₀₀至1.0左右，然后30℃、200rpm培养，每24h补加甲醇至终浓度为0.5％(v/v)，72h后吸取1mL培养液于10000rpm离心 10min，取其上清检测酶活力。经检测，高拷贝克隆产物酶活可达最高358U/mL。

三、重组巴斯德毕赤酵母高密度发酵产酶

将步骤二的重组巴斯德毕赤酵母菌株在5L发酵罐中进行高密度发酵。发酵方法参照Pichia Fermentation Process Guidelines(Version B，053002，Invitrogen)。整个发酵过程包括种子液培养、基础培养、甘油流加培养和100％甲醇诱导培养四个阶段。

1)种子液培养：选择摇瓶发酵中产酶水平较高的重组菌株，接种到150mL YPD 培养基中，在30℃，200rpm条件下振荡过夜培养至OD₆₀₀为2-6。

YPD培养基：1％(质量百分含量)酵母提取物，2％(质量百分含量)胰蛋白胨， 2％(质量百分含量)葡萄糖，溶剂为水。

2)基础培养：将1.35L BSM培养基加入发酵罐(镇江东方生物工程设备技术有限责任公司，5L)，校正pH电极和溶氧电极，连接冷却水进出口、空气进出口、冷凝水进出口、取样口、溶氧电极、pH电极和三个补料口，于121℃灭菌锅灭菌21min。灭菌结束后，检查所有管路，并与对应的发酵罐连接口相连；打开空气压缩机，通气量调至4L/min，转速设为600rpm，罐压调至0.03MPa；发酵罐设置自动控温，温度设为30℃；自动调节pH，使用浓氨水调pH为4.0；校正溶氧满度100％。接种150mL 的种子液，加入6.52mL PTM₁痕盐进行发酵，发酵时间为18-24h。

BSM培养基：1.4g CaSO₄，27.3g K₂SO₄，22.35g MgSO₄·7H₂O，6.2g KOH， 60g甘油和40.05mL 85％H₃PO₄溶于水中，待溶解完全后定容至1.35L。

PTM₁痕盐：6g CuSO₄·7H₂O，0.08g NaI，3g MnSO₄·H₂O，0.2g Na₂MoO₄·2H₂O，0.02g H₃BO₃，0.5g CoCl₂，20g ZnCl₂，65g FeSO₄·7H₂O，0.2g生物素，5mL浓硫酸溶于水中，待溶解完全后定容至1L。

3)甘油流加培养：待甘油消耗完全(溶氧值迅速上升)，开始流加50％(w/v) 的甘油，控制温度30℃，pH 5.0，始终监测溶氧，通过调整流加速度保持溶氧>20％。菌体湿重达到180-220g/L后停止甘油流加(流加时间约为4-6h)。

4)100％甲醇诱导培养：停止甘油流加后饥饿30min左右，流加100％甲醇进行诱导，控制转速800rpm，监测并控制溶氧>20％，控制温度30℃，pH 6.0。

100％甲醇诱导培养阶段开始后，间隔12h取样测定菌体湿重、蛋白质含量(LowryO H,Rosebrough N J,Farr A L,et al.Protein measurement with the folin phenolreagent. Journal of Biological Chemistry,1951,193:265-275)和酶活力。

结果如图1所示，结果显示，甲醇诱导培养180h时，酶活力达到最高，发酵上清液酶活力为98970U/mL，蛋白质浓度4.91mg/mL(图1A)。发酵过程中蛋白的 SDS-PAGE电泳检测分析图如图1B所示。

实施例3、磷脂酶C的纯化及酶学性质

一、磷脂酶C的纯化

取实施例2中180h的高密度发酵液于4℃，10000rpm离心10min，取上清10mL 置于20mM pH 7.0 Tris-HCl缓冲溶液(缓冲溶液A)中透析16h，然后4℃、10000rpm 离心10min后取上清液备用。透析后的样品采用QSFF强阴离子交换层析柱分离纯化。用缓冲溶液A平衡层析柱，以0.5mL/min流速上样，用缓冲溶液A洗脱至OD₂₈₀<0.05 以洗去杂蛋白。然后分别用含30、60、100和300mM NaCl的缓冲溶液A梯度洗脱，收集有酶活力的洗脱组分。依照去糖基化试剂盒(购于美国NEB公司)说明书，对纯酶进行去糖基化处理，并用SDS-PAGE检测蛋白纯度和去糖基化结果。

重组太瑞斯梭孢壳霉磷脂酶C粗酶液经QSFF强阴离子柱交换层析纯化后得到电泳级纯酶(图2)，该酶比酶活力由19437.5U/mL提高到22909.5U/mL，纯化倍数为 1.2，回收率为59.1％(表1 )。

表1 磷脂酶C纯化表

二、磷脂酶C分子量的测定

采用SDS-PAGE凝胶电泳法测定磷脂酶C分子量，分离胶浓度为7.5％，浓缩胶浓度为4.5％。将高分子量标准蛋白和步骤一得到的纯化后酶液一起进行电泳，电泳结束后分别测定溴酚蓝、标准蛋白中各条带以及纯酶距离分离胶顶端的距离，计算各自Rf值(各蛋白条带距离分离胶顶端的距离/溴酚蓝距离分离胶顶端的距离)，然后以分子量的负对数Lg(MW)为纵坐标，迁移率Rf值为横坐标作图，根据目标蛋白的迁移率计算出目标蛋白的分子量。

采用Sephacryl S-100HR(1×100cm,GE Healthcare)凝胶过滤法测定磷脂酶C活性状态下的分子量。测定条件：缓冲溶液为含150mM NaCl的20mM pH 7.2的磷酸钠缓冲溶液，流速为0.3mL/min。标准蛋白含量为2mg/mL，上样量为0.4mL，标准蛋白包括醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，150kDa)、磷酸酶b(phosphorylase b，97.2 kDa)、牛血清蛋白(bovine serum albumin，66.2kDa)、卵清蛋白(albumin from chicken egg white，44.3kDa)和α-胰凝乳蛋白酶原A(α-chymotrypsinogenA，25.6kDa)。计算标准蛋白及目标蛋白的洗脱体积，然后以分子量的负对数Lg(MW)为纵坐标，洗脱体积为横坐标作图，根据目标蛋白的洗脱体积计算目标蛋白的分子量。

结果如图3所示，通过SDS-PAGE测得蛋白分子量为63.3kDa(图3A)，Sephacryl S-100凝胶层析柱测得蛋白分子量为61.1kDa(图3B)。

三、磷脂酶C的酶学性质

1)最适反应pH及pH稳定性

在55℃，50mM不同缓冲条件下测定纯酶的酶活力以确定最适pH，所使用缓冲溶液包括柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶(Citrate，pH 4.0-6.0)、2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲溶(MES，pH5.0-7.0)、3-(N-吗啉)丙磺酸缓冲溶(MOPS，pH 6.0-7.5)、HEPES 缓冲溶(pH 6.0-8.0)和Tris-HCl缓冲溶(pH 6.0-8.0)；pH稳定性的测定是用上述不同pH值缓冲溶液分别稀释酶液，并于45℃水浴中保温30min后，迅速置于冰水浴冷却30min后测定残余酶活力。以未处理酶液的酶活力作为100％，计算残余酶活力所占百分比。

结果表明，重组磷脂酶C最适pH为6.5(图4A)，在pH 4.5-8.0范围内保温30min 后残余酶活力高于80％(图4B)。

2)最适反应温度、温度稳定性及半衰期

将纯酶液用50mM pH 6.5的HEPES缓冲溶液稀释适当倍数，分别在20-75℃下测定酶活力以确定最适温度。温度稳定性的测定是将酶液分别在20-55℃温度下处理30 min，迅速置于冰水浴中冷却30min后测定残余酶活力。半衰期的测定是将酶液分别在45℃、50℃和55℃温度下保温7h，定时取样，测定残余酶活力。

结果表明，重组磷脂酶C最适温度为55℃(图5A)，在45℃以下保温30min后残余酶活力高于80％(图5B)，在45℃、50℃和55℃的半衰期分别为866、72和21min (图5C)。

实施例4、磷脂酶C在大豆毛油脱胶中的应用

称取300g大豆毛油于1L烧杯中水浴加热至70℃，加入0.3mL浓度为45％(w/w) 的柠檬酸溶液，在200rpm条件下预处理20min。处理完成后，冷却至预设温度 (30-55℃)，加入一定量的4％(w/v)NaOH溶液(0.15-1.2mL)调节pH，再加入1％的蒸馏水和一定量的磷脂酶C(0-10000U/kg毛油)，均匀混合后，在200rpm摇床中反应(0-4h)。反应结束后，将油样置于沸水浴中灭活10min，并于10000rpm离心 10min，取油样上清按照国标方法(GB/T 5537-2008)测定磷含量。以加入灭活酶液 (沸水浴煮沸10min以达到灭活酶的目的)的处理组作为对照组。

分别称取300mg大豆毛油和脱胶油，加入900μL的NMR溶液(100mM Tris-HCl pH10.5，50mM EDTA，2.5％脱氧胆酸钠)，于37℃搅拌提取1h后，加入600μL正己烷，混匀。最后，加入50μL D₂O，静置，取其水相。使用Bruker 300 Ultrashield设备获得³¹P NMR磷脂核磁谱图。

磷脂酶C应用于大豆毛油脱胶的优化条件是NaOH和柠檬酸的体积比为2:1，温度为40℃，加酶量为5000U/kg，水解时间为1h(图6)。在优化条件下，磷含量由最初135.4mg/kg降低为7.9mg/kg，水解率为94.2％。与大豆毛油相比，脱胶油中PC和 PI已被完全除去，仅有极少部分的PE残留(图7)。测定结果表明大豆脱胶油的含磷量<10mg/kg，符合工业脱胶油标准。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种太瑞斯梭孢壳霉磷脂酶C及其编码基因与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1344

<212> DNA

<213> 太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)

<400> 1

atgcgtgttt ctactctcca cagcctgctc gcccttgcgg tggcagcgca ggctgccccg 60

acgcgcggcg gcagcgagtt tgccaatttg aaagcccaca tcaagaacgt cgtcatcctg 120

gtcatggaga accgctcgct tgacaatctc ctgggcggac agaagctgaa gggcctcgac 180

aaccccatcc agaagggccc gttctgcaac ccgtacaatc tgaccaaccc ggccgccggc 240

tcggtgtgct ccgccgccaa cgactttgac tccattaccg atgatccgga ccacgccgtc 300

tatggcaaca acattgagtt ttacggcacc tttacgccgg acaacaacgc cattgcgtcc 360

ggccacctga cgcccaccca gaagggcttc gtgcatgagc agctccgtct ctacagctcc 420

aaggccaacc ggtccacgct ggcccagcag gtcatgaact actacaccga ggagcaggtg 480

cccgtgctca ccgcgctggt caagaacttc gtgaccttca accactggca ctcggccatt 540

cccggcccca ccgaccccaa ccgtctggcc cttgtttcgg gcagctccta tggtcacggc 600

tccaacgacg cctccttcac ggccaagggc ttcaaccaga agtccatctt tcagtcgctg 660

actgagggtg gctaccactg gaggaactac catgaccccg ccggcggcac cggacccgag 720

gcctcgtggt tccagtggac ctacgatgcc ggcctggagg gcaacgtcgt cgacatctca 780

cagttcttcg tcgacgctgc tgccggcaac ctcacctcgc tcagcttcat caacccttcg 840

tgctgcggcg tcggcaccac ctcgatgcac ccctccggcc tgatctctgc cggcgaggcc 900

ctcatcaagc aggtctacga ggccctgcgc gccggccccc agtgggagca gacgctcttc 960

atcctcacct tcgacgagac cggcggcttc cacgaccacg tgcctccccc gctcgccccc 1020

aggcccgacg acctgacgta cacggccaag acgccgtcgg gcgccaacta caccttcccc 1080

ttcaaccgcc tcggcggccg tatccccacc ctcctcatct ccccctgggt gagcaagggc 1140

tacgtcgagc agcagcacgc caactccgcc ggccaggtcg tctcgtactc ggccacctcc 1200

atcctgcgca cgctgggcta cctcttcgac ttcgagccct acaatccccg cgtcgaatgg 1260

tcgccctcgt tcgcgcacct catcaactcg cgcgcgcgca acaccccgaa gaagctccct 1320

gcggctaatc ccttcaagga gtga 1344

<210> 2

<211> 447

<212> PRT

<213> 太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)

<400> 2

Met Arg Val Ser Thr Leu His Ser Leu Leu Ala Leu Ala Val Ala Ala

1 5 10 15

Gln Ala Ala Pro Thr Arg Gly Gly Ser Glu Phe Ala Asn Leu Lys Ala

20 25 30

His Ile Lys Asn Val Val Ile Leu Val Met Glu Asn Arg Ser Leu Asp

35 40 45

Asn Leu Leu Gly Gly Gln Lys Leu Lys Gly Leu Asp Asn Pro Ile Gln

50 55 60

Lys Gly Pro Phe Cys Asn Pro Tyr Asn Leu Thr Asn Pro Ala Ala Gly

65 70 75 80

Ser Val Cys Ser Ala Ala Asn Asp Phe Asp Ser Ile Thr Asp Asp Pro

85 90 95

Asp His Ala Val Tyr Gly Asn Asn Ile Glu Phe Tyr Gly Thr Phe Thr

100 105 110

Pro Asp Asn Asn Ala Ile Ala Ser Gly His Leu Thr Pro Thr Gln Lys

115 120 125

Gly Phe Val His Glu Gln Leu Arg Leu Tyr Ser Ser Lys Ala Asn Arg

130 135 140

Ser Thr Leu Ala Gln Gln Val Met Asn Tyr Tyr Thr Glu Glu Gln Val

145 150 155 160

Pro Val Leu Thr Ala Leu Val Lys Asn Phe Val Thr Phe Asn His Trp

165 170 175

His Ser Ala Ile Pro Gly Pro Thr Asp Pro Asn Arg Leu Ala Leu Val

180 185 190

Ser Gly Ser Ser Tyr Gly His Gly Ser Asn Asp Ala Ser Phe Thr Ala

195 200 205

Lys Gly Phe Asn Gln Lys Ser Ile Phe Gln Ser Leu Thr Glu Gly Gly

210 215 220

Tyr His Trp Arg Asn Tyr His Asp Pro Ala Gly Gly Thr Gly Pro Glu

225 230 235 240

Ala Ser Trp Phe Gln Trp Thr Tyr Asp Ala Gly Leu Glu Gly Asn Val

245 250 255

Val Asp Ile Ser Gln Phe Phe Val Asp Ala Ala Ala Gly Asn Leu Thr

260 265 270

Ser Leu Ser Phe Ile Asn Pro Ser Cys Cys Gly Val Gly Thr Thr Ser

275 280 285

Met His Pro Ser Gly Leu Ile Ser Ala Gly Glu Ala Leu Ile Lys Gln

290 295 300

Val Tyr Glu Ala Leu Arg Ala Gly Pro Gln Trp Glu Gln Thr Leu Phe

305 310 315 320

Ile Leu Thr Phe Asp Glu Thr Gly Gly Phe His Asp His Val Pro Pro

325 330 335

Pro Leu Ala Pro Arg Pro Asp Asp Leu Thr Tyr Thr Ala Lys Thr Pro

340 345 350

Ser Gly Ala Asn Tyr Thr Phe Pro Phe Asn Arg Leu Gly Gly Arg Ile

355 360 365

Pro Thr Leu Leu Ile Ser Pro Trp Val Ser Lys Gly Tyr Val Glu Gln

370 375 380

Gln His Ala Asn Ser Ala Gly Gln Val Val Ser Tyr Ser Ala Thr Ser

385 390 395 400

Ile Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Leu Phe Asp Phe Glu Pro Tyr Asn Pro

405 410 415

Arg Val Glu Trp Ser Pro Ser Phe Ala His Leu Ile Asn Ser Arg Ala

420 425 430

Arg Asn Thr Pro Lys Lys Leu Pro Ala Ala Asn Pro Phe Lys Glu

435 440 445

Claims

1.蛋白质在作为磷脂酶C中的应用；所述蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

2.蛋白质在油脂脱胶中的应用；所述蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

3.一种油脂脱胶方法，包括如下步骤：采用特定物质进行油脂脱胶；所述特定物质为蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列2所示。