CN111699251A

CN111699251A - 磷脂在食品中的改善的酶促修饰

Info

Publication number: CN111699251A
Application number: CN201880088955.3A
Authority: CN
Inventors: 张可亚; L·B·米勒; L·克拉格; T·L·乔根森
Original assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS
Priority date: 2017-12-19
Filing date: 2018-12-17
Publication date: 2020-09-22
Also published as: AU2018387151B2; EP3728573A1; US20240081351A1; MX2020006432A; CA3086023A1; EP4248757A3; PE20211298A1; ZA202003781B; BR112020012431A2; CL2020001692A1; WO2019121585A1; EP4248757A2; US20210076688A1; US11744254B2; MX2022004506A; JP2021508446A; AU2018387151A1

Abstract

呈现了特征在于具有约5/45或更高的sn1/sn2特异性比的磷脂酶A1，其中所述磷脂酶A1的溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.02，连同用于在含脂质食品基质中使用的方法，使用所述磷脂酶烘焙和制作面团的方法，并且还包括使用公开的磷脂酶A1制得的烘焙改良剂。

Description

磷脂在食品中的改善的酶促修饰

技术领域

本发明涉及磷脂酶及其在制造食品中的用途。本发明进一步涉及使用磷脂酶制作面团和烘焙产品的方法。

背景技术

在面包面团中使用脂肪酶是众所周知的。例如，EP 0585988中显示向面团中添加脂肪酶可为由其烘焙的面包提供抗陈化效果。WO 94/04035教导了可以通过向面团中添加脂肪酶来获得改善的柔软度。还显示外源脂肪酶可以改变面包体积。

尽管已经描述了包括磷脂酶在内的脂肪酶在制备面团和烘焙产品中的积极特性，但是现有技术的脂肪酶的性能仍具有许多缺点，因为现有技术的脂肪酶通常具有多种活性，从而降低或消除了所述脂肪酶的潜在有益作用。因此，现今，在一些食品应用中(特别是在烘焙中)仍需要具有更高特异性的改善的脂肪酶。

发明内容

根据本发明的一个方面，呈现了分离的多肽，所述分离的多肽包含特征在于具有约55/45或更高的sn1/sn2特异性比的磷脂酶A1，其中所述磷脂酶A1的溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.02和/或NALPE/NAPE活性比小于0.12。任选地，所述sn1/sn2特异性比为约60/40、70/30、80/20、90/10、95/5或99/1。任选地，所述sn1/sn2特异性比在65-85/20-30之间或在75-95/5-15之间。任选地，所述sn1/sn2特异性比为约74/26或89/11。

任选地，所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.009、0.008、0.007、0.006、0.005、0.004、0.003、0.002或0.001。任选地，所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.001，且所述sn1/sn2特异性比在65-85/15-35之间。任选地，所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.001，且所述sn1/sn2特异性比为约60/40、70/30、80/20、90/10、95/5或99/1。任选地，所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.001，且所述sn1/sn2特异性比为约74/26。任选地，所述NALPE/NAPE活性比小于0.12，且所述sn1/sn2特异性比在75-95/5-25之间。任选地，所述NALPE/NAPE活性比小于0.12，且所述sn1/sn2特异性比为约89/11。

任选地，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16具有至少80％序列同一性的蛋白质序列的酶。任选地，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:6具有至少80％序列同一性的蛋白质序列的酶。

任选地，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16具有至少90％序列同一性的蛋白质序列的酶。任选地，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:6具有至少90％序列同一性的蛋白质序列的酶。

任选地，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16具有至少95％序列同一性的蛋白质序列的酶。任选地，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:6具有至少95％序列同一性的蛋白质序列的酶。

任选地，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16具有100％序列同一性的蛋白质序列的酶。任选地，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:6具有100％序列同一性的蛋白质序列的酶。

在本发明的另一个方面，呈现了制作面团的方法，所述方法包括使选自由面粉、盐、水、糖、脂肪、卵磷脂、油、乳化剂和酵母组成的组的面团组分与分离的多肽相混合，所述分离的多肽包含特征在于具有约55/45或更高的sn1/sn2特异性比的磷脂酶A1，其中所述磷脂酶A1的溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.02，优选地小于0.01，和/或NALPE/NAPE活性比小于0.12。任选地，所述sn1/sn2特异性比在65-85/15-35之间或在75-95/5-25之间。任选地，所述sn1/sn2特异性比为约60/40、70/30、80/20、90/10、95/5或99/1。任选地，所述sn1/sn2特异性比为约74/26或89/11。任选地，所述乳化剂选自由以下组成的组：i)磷脂乳化剂如卵磷脂或溶血卵磷脂；或ii)非磷脂乳化剂如DATEM、甘油单酯或甘油二酯。

任选地，所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.009、0.008、0.007、0.006、0.005、0.004、0.003、0.002或0.001。任选地，所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.001，且所述sn1/sn2特异性比在70-80/20-30之间。任选地，所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.001，且所述sn1/sn2特异性比为约60/40、70/30、80/20、90/10、95/5或99/1。任选地，所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.001，且所述sn1/sn2特异性比为约74/26。任选地，所述NALPE/NAPE活性比小于0.12，且所述sn1/sn2特异性比在85-95/5-15之间。任选地，所述NALPE/NAPE活性比小于0.12，且所述sn1/sn2特异性比为约89/11。

在本发明的另一个方面，呈现了面团，其包含特征在于具有约55/45或更高的sn1/sn2特异性比的磷脂酶A1酶，其中所述磷脂酶A1的溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.02，优选地小于0.01，和/或NALPE/NAPE活性比小于0.12。任选地，例如当与不包含本发明的磷脂酶A1酶的面团相比时，所述面团具有改善的拉伸性和/或稳定性。在另一个方面，提供了面团，其包含如本文所述的酶。

在本发明的另一个方面，呈现了制备烘焙产品的方法，其中烘焙如上所述的面团。在本发明的另一个方面，呈现了烘焙产品。任选地，所述烘焙产品具有选自由以下组成的组的至少一种改善的特性：改善的面包心孔径、改善的气泡的均匀性、外皮和面包心之间无分离、增加的体积、增加的外皮脆度和改善的烤焙弹性。任选地，所述改善的特性为增加的外皮脆度。任选地，当与制备自不包含本发明的磷脂酶A1酶的面团的烘焙产品相比时，所述特性是改善的。在另一个方面，提供了烘焙产品，其包含如本文所述的酶或制备自包含如本文所述的酶的面团。

在本发明的另一个方面，呈现了用于烘焙的预混合物，其包含面粉和特征在于具有约55/45或更高的sn1/sn2特异性比的磷脂酶A1酶，其中所述磷脂酶A1的溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.02，优选地小于0.01，和/或NALPE/NAPE活性比小于0.12。在另一个方面，提供了用于烘焙的预混合物，其包含如本文所述的酶。在本发明的另一个方面，呈现了烘焙改良剂，其包含含有特征在于具有约55/45或更高的sn1/sn2特异性比的磷脂酶A1酶的颗粒或团聚粉末，其中所述磷脂酶A1的溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.02，优选地小于0.01，和/或NALPE/NAPE活性比小于0.12。在另一个方面，提供了烘焙改良剂，其包含含有如本文所述的酶的颗粒或团聚粉末。

在本发明的另一个方面，呈现了如上所述的制作面团的方法，但是其中包括用于改善面团和/或由其制得的烘焙产品的至少一种额外的酶。任选地，所述额外的酶选自由以下组成的组：淀粉酶、环糊精葡聚糖转移酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、脂肪酶、半乳糖脂酶、与所述磷脂酶A1不同的磷脂酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、蛋白质二硫键异构酶、糖基转移酶、过氧化物酶、脂加氧酶、漆酶和氧化酶。任选地，所述淀粉酶为外切淀粉酶。任选地，所述外切淀粉酶为生麦芽糖淀粉酶。任选地，所述外切淀粉酶为非生麦芽糖淀粉酶。任选地，所述非生麦芽糖淀粉酶通过以下方式水解淀粉：从支链淀粉侧链的非还原端切下一种或多种直链麦芽低聚糖，所述直链麦芽低聚糖主要包含四个至八个D-吡喃葡萄糖基单元。任选地，所述额外的酶为磷脂酶。任选地，所述额外的酶具有半乳糖脂酶活性。任选地，所述额外的酶为包含SEQ ID NO:17和/或SEQ ID NO:18的磷脂酶。

在本发明的另一个方面，用于修饰磷脂乳化剂的方法包括用特征在于具有约55/45或更高的sn1/sn2特异性比的磷脂酶A1酶处理所述乳化剂，其中所述磷脂酶A1的溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.01。任选地，所述磷脂乳化剂为卵磷脂或溶血卵磷脂。

在本发明的另一个方面，呈现了在含脂质食品基质中产生溶血磷脂的方法，其包括向所述含脂质食品基质中添加特征在于具有约55/45或更高的sn1/sn2特异性比的磷脂酶A1酶，其中所述磷脂酶A1的溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.01。任选地，所述含脂质食品基质选自由以下组成的组：鸡蛋和含鸡蛋的食物产品、用于烘焙甜品的面团、加工肉、基于奶的产品、植物油和烘焙甜品(包括蛋糕和饼干)。

任选地，所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.019、0.018、0.017、0.016、0.015、0.014、0.013、0.012、0.011或0.010。

任选地，所述NALPE/NAPE活性比活性比小于0.11、0.10、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.009、0.008、0.007、0.006、0.005、0.004、0.003。0.002或0.001。

在本发明的另一个方面，如上呈现了制作面团的方法，但所述方法进一步具有添加乳化剂的步骤。任选地，所述乳化剂选自由以下组成的组：i)磷脂乳化剂如卵磷脂或溶血卵磷脂；或ii)非磷脂乳化剂如DATEM、甘油单酯或甘油二酯。DATEM可以例如以商标名

获得。

在本发明的另一个方面，提供了分离的多肽，所述分离的多肽包含含有与SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16具有至少80％序列同一性的蛋白质序列的磷脂酶A1酶。任选地，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:6具有至少80％序列同一性的蛋白质序列的酶。

任选地，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16具有100％序列同一性的蛋白质序列的酶。任选地，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:6具有100％序列同一性的蛋白质序列的酶。任选地，所述磷脂酶A1酶可由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16。

生物学序列简述

SEQ ID NO:1示出了来自哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的磷脂酶变体的全长氨基酸序列(全长CRC08310)。

SEQ ID NO:2示出了来自哈茨木霉的磷脂酶变体的预测的成熟氨基酸序列(预测的成熟CRC08310)。

SEQ ID NO:3示出了来自无花果拟盘多毛孢(Pestalotiopsis fici)的磷脂酶变体的全长氨基酸序列(全长CRC08316)。

SEQ ID NO:4示出了来自无花果拟盘多毛孢的磷脂酶变体的预测的成熟氨基酸序列(预测的成熟CRC08316)。

SEQ ID NO:5-示出了来自贵州绿僵菌(Metarhizium guizhouense)(也称为金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae))的磷脂酶变体的全长氨基酸序列(全长CRC08319)。

SEQ ID NO:6示出了来自贵州绿僵菌(也称为金龟子绿僵菌)的磷脂酶变体的预测的成熟氨基酸序列(预测的成熟CRC08319)。

SEQ ID NO:7-示出了来自葡萄间座壳(Diaporthe ampelina)的磷脂酶变体的全长氨基酸序列(全长CRC08405)。

SEQ ID NO:8：示出了来自葡萄间座壳的磷脂酶变体的预测的成熟氨基酸序列(预测的成熟CRC08405)。

SEQ ID NO:9-示出了来自稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)的磷脂酶变体的全长氨基酸序列(全长CRC08418)。

SEQ ID NO:10示出了来自稻瘟病菌的磷脂酶变体的预测的成熟氨基酸序列(预测的成熟CRC08418)。

SEQ ID NO:11-示出了来自鲜红新丛赤壳菌(Neonectria ditissima)的磷脂酶变体的全长氨基酸序列(全长CRC08826)。

SEQ ID NO:12示出了来自鲜红新丛赤壳菌的磷脂酶变体的预测的成熟氨基酸序列(预测的成熟CRC08826)。

SEQ ID NO:13-示出了来自盖姆斯木霉(Trichoderma gamsii)的磷脂酶变体的全长氨基酸序列(全长CRC08833)。

SEQ ID NO:14示出了来自盖姆斯木霉的磷脂酶变体的预测的成熟氨基酸序列(预测的成熟CRC08833)。

SEQ ID NO:15：-示出了来自金龟子绿僵菌的磷脂酶变体的全长氨基酸序列(全长CRC08845)。

SEQ ID NO:16示出了来自金龟子绿僵菌的磷脂酶变体的预测的成熟氨基酸序列(预测的成熟CRC08845)。

SEQ ID NO:17-示出了用于商业产品Powerbake 4080中的磷脂酶A1的成熟氨基酸序列。

SEQ ID NO:18-示出了用于商业产品Lipopan F中的磷脂酶A1的全长氨基酸序列。

SEQ ID NO:19-示出了全长CRC08310的密码子优化的合成核酸序列。

SEQ ID NO:20-示出了全长CRC08316的密码子优化的合成核酸序列。

SEQ ID NO:21-示出了全长CRC08319的密码子优化的合成核酸序列。

SEQ ID NO:22-示出了全长CRC08405的密码子优化的合成核酸序列。

SEQ ID NO:23-示出了全长CRC08418的密码子优化的合成核酸序列。

SEQ ID NO:24-示出了全长CRC08826的密码子优化的合成核酸序列。

SEQ ID NO:25-示出了全长CRC08833的密码子优化的合成核酸序列。

SEQ ID NO:26-示出了全长CRC08845的密码子优化的合成核酸序列。

附图说明

图1A描绘了呈现为Lipopan F的最佳剂量(基于mg蛋白质/kg面粉的相对剂量)的函数的硬皮面包卷比容(ccm/g)。

图1B描绘了呈现为CRC08319的剂量的函数的硬皮面包卷比容(ccm/g)。

错误！找不到参考源。A描绘了使用Lipopan F的面团脂质特征。

错误！找不到参考源。B描绘了使用CRC08319的面团脂质特征。

图3描绘了在存在和不存在SOLEC F的情况下，作为‘CRC08319+Powerbake 4080’的影响的海绵酵头和面团的相对比容

具体实施方式

除非另有说明，本发明教导的实践将使用在本领域技术范围内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学和生物化学的常规技术。此类技术在以下文献中得到充分解释，例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第二版(Sambrook等人,1989)；Oligonucleotide Synthesis[寡核苷酸合成](M.J.Gait编辑,1984；Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学当前方案](F.M.Ausubel等人,编辑,1994)；PCR:The Polymerase Chain Reaction[PCR：聚合酶链式反应](Mullis等人,编辑,1994)；Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual[基因转移和表达：实验室手册](Kriegler,1990)，和The Alcohol Textbook[醇教科书](Ingledew等人,编辑,第五版,2009)，以及Essentials of Carbohydrate Chemistry and Biochemistry [碳水化合物化学与生物化学基础](Lindhorste,2007)。

除非在本文中另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本发明教导所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。Singleton等人,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology[微生物学和分子生物学词典]，第二版,JohnWiley and Sons[约翰威利父子公司],纽约(1994)，以及Hale&Markham,The Harper Collins Dictionary of Biology[哈珀柯林斯生物学词典],Harper Perennial[哈珀永久出版社],纽约(1991)为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的通用词典。与本文所述的那些类似或等效的任何方法和材料可用于本发明教导的实践或测试中。

本文提供的数值范围包括限定所述范围的数值在内。

缩写

NAPE-N-酰基磷脂酰乙醇胺

NALPE-N-酰基溶血磷脂酰乙醇胺

NAGPE-N-酰基甘油磷酸乙醇胺

DGDG-二半乳糖甘油二酯

DGMG-二半乳糖甘油单酯

MGDG-单半乳糖甘油二酯

MGMG-单半乳糖甘油单酯

PC-磷脂酰胆碱

LPC-溶血磷脂酰胆碱

PLA-磷脂酶A

DATEM-甘油单酯和甘油二酯的二乙酰酒石酸酯

定义

关于多肽，术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指在一个或多个氨基酸位置处不包含人为取代、插入或缺失的天然存在的多肽。类似地，关于多核苷酸，术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指不包含人为核苷变化的天然存在的多核苷酸。然而，注意编码野生型、亲本、或参考多肽的多核苷酸不限于天然存在的多核苷酸，并且涵盖编码野生型、亲本、或参考多肽的任何多核苷酸。

参考野生型多肽应理解为包括多肽的成熟形式。“成熟”多肽或其变体是其中不存在信号序列的多肽或变体，例如，在多肽表达期间或之后从未成熟形式的多肽切割。

关于多肽，术语“变体”是指与指定的野生型、亲本或参考多肽不同的多肽，因为它包括一种或多种天然存在的或人为的氨基酸取代、插入或缺失。类似地，关于多核苷酸，术语“变体”是指在核苷酸序列中与指定的野生型、亲本或参考多核苷酸不同的多核苷酸。野生型、亲本或参考多肽或多核苷酸的身份将从上下文中显而易见。

术语“重组”当用于提及主题细胞、核酸、蛋白质或载体时，表明受试者已经从其天然状态被修饰。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞中未发现的基因，或以不同于自然界发现的水平或在不同于自然界发现的条件下表达天然基因。重组核酸与天然序列不同在于一个或多个核苷酸，和/或有效地连接到异源序列，例如表达载体中的异源启动子。重组蛋白质可以与天然序列不同在于一个或多个氨基酸，和/或与异源序列融合。包含编码磷脂酶的核酸的载体是重组载体。

术语“回收的”、“分离的”和“单独的”是指从如天然存在的与其天然相关的至少一种其他材料或组分中除去的化合物、蛋白质(多肽)、细胞、核酸、氨基酸、或者其他指定材料或组分。其“分离的”多肽包括但不限于含有在异源宿主细胞中表达的分泌多肽的培养液。

术语“纯化的”是指处于相对纯状态的材料(例如，分离的多肽或多核苷酸)，例如，至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯或甚至至少约99％纯。

术语“富集的”是指处于约50％纯、至少约60％纯、至少约70％纯或甚至至少约70％纯的材料(例如，分离的多肽或多核苷酸)。

关于酶的“pH范围”是指在其下酶显示催化活性的pH值的范围。

关于酶的术语“pH稳定”和“pH稳定性”涉及在一个宽范围内的pH值下，酶保持预定时间段(例如，15min.、30min.、1小时)的活性的能力。

术语“氨基酸序列”与术语“多肽”“蛋白质”和“肽”同义，并且可互换地使用。在此类氨基酸序列展现出活性时，它们可被称为“酶”。使用针对氨基酸残基的常规单字母或三字母密码，采用标准氨基端-至-羧基端取向(即N→C)表示氨基酸序列。

术语“核酸”涵盖能够编码多肽的DNA、RNA、异源双链体、以及合成分子。核酸可以是单链的或双链的，并且可以是化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”可互换地使用。由于遗传密码是简并的，可以使用多于一个密码子来编码具体的氨基酸，并且本发明的组合物和方法涵盖编码具体氨基酸序列的核苷酸序列。除非另有说明，核酸序列以5′-至-3′取向呈现。

“杂交”是指如在印迹杂交技术和PCR技术期间发生的，一条核酸链与互补链形成双链体(即碱基对)的过程。严格杂交条件通过在以下条件下杂交来例证：65℃和0.1X SSC(其中1X SSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸三钠，pH 7.0)。杂交的双链核酸的特征在于熔融温度(T_m)，其中一半杂交的核酸与互补链不配对。双链体内错配的核苷酸降低T_m。非常严格杂交条件涉及68℃和0.1X SSC。

“合成”分子是通过体外化学或酶促合成而不是通过生物体产生的。

关于细胞使用的术语“转化”，“稳定转化”和“转基因”意指细胞包含整合到其基因组中或作为通过多代维系的附加体的非天然(例如异源)核酸序列。

在将核酸序列插入细胞的上下文中，术语“引入”意指本领域已知的“转染”、“转化”或“转导”。

“宿主菌株”或“宿主细胞”是已经引入了表达载体、噬菌体、病毒或其他DNA构建体，包括编码目的多肽(例如，磷脂酶)的多核苷酸的生物体。示例性宿主菌株是能够表达目的多肽的微生物细胞(例如，细菌、丝状真菌和酵母)。术语“宿主细胞”包括从细胞产生的原生质体。

关于多核苷酸或蛋白质的术语“异源”是指不是天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。

关于多核苷酸或蛋白质的术语“内源”是指天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。

术语“表达”是指基于核酸序列产生多肽的过程。所述过程包括转录和翻译两者。

“选择性标记”或“可选择标记”是指能够在宿主中被表达以促进选择携带所述基因的宿主细胞的基因。可选择标记的实例包括但不限于在宿主细胞上赋予代谢优势(如营养优势)的抗微生物剂(例如，潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或基因。

“载体”是指设计用于将核酸引入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒等。

“表达载体”是指包含编码目的多肽的DNA序列的DNA构建体，所述编码序列与能够在适合的宿主中影响DNA表达的适合控制序列有效地连接。此类控制序列可以包括影响转录的启动子，控制转录的任选的操纵子序列，编码mRNA上适合的核糖体结合位点的序列，增强子以及控制转录和翻译终止的序列。

术语“有效地连接”意指：指定组分处于允许它们以预期方式起作用的关系(包括但不限于并列)。例如，调控序列与编码序列有效地连接，使得编码序列的表达受调控序列的控制。

“信号序列”是与蛋白质的N-末端部分附接的氨基酸序列，所述氨基酸序列有利于蛋白质在细胞外的分泌。细胞外的蛋白质的成熟形式缺乏在分泌过程中被切除的信号序列。

“生物学活性的”是指具有指定生物活性，例如酶活性的序列。

术语“比活性”是指在特定条件下每单位时间通过酶或酶制剂可转化为产物的底物的摩尔数。比活性通常表示为单元(U)/mg蛋白质。可替代地，比活性可以是指在特定条件下每单位时间通过酶或酶制剂转化为产物的摩尔数。

如本文所用，“序列同一性百分比”是指当使用具有默认参数的CLUSTAL W算法比对时，具体序列具有与指定参考序列中的氨基酸残基相同的至少一定百分比的氨基酸残基。参见Thompson等人,(1994)Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680。CLUSTAL W算法的默认参数是：

与参考序列相比，缺失被视为不同一的残基。包括在任一末端发生的缺失。例如，相对于成熟多肽，具有成熟617残基多肽的C-末端的五个氨基酸缺失的变体将具有99％的序列同一性百分比(612/617相同的残基x 100，四舍五入到最接近的整数)。此类变体将被与成熟多肽具有“至少99％序列同一性”的变体所涵盖。

“融合”多肽序列通过两个受试多肽序列之间的肽键连接，即有效地连接。

术语“丝状真菌”是指所有丝状形式的真菌亚门(Eumycotina)，特别是子囊菌亚门(Pezizomycotina)物种。

如本文所用，单数形式“一种/一个(a/an)”和“所述(the)”包括单数个指示物和复数个指示物两者，除非上下文中另外明确指明。

如本文所用的术语“包含”(“comprising”、“comprises”和“comprised of”)与“包括”(“including”、“includes”)或“含有”(“containing”、“contains”)同义，并且是包括性的或开放式的，并且不排除额外的、未列举的成员、元素或方法步骤。应当理解，如本文所用的术语“包含”(“comprising”、“comprises”和“comprised of”)包括术语“由…组成”(“consisting of”、“consists”和“consists of”)。

端点对数值范围的列举包括各个范围内纳入的所有数字和分数，以及所列举的端点。

当指代诸如参数、量、时距等可测量值时，如本文所用的术语“约”(“about”或“approximately”)意指涵盖指定值和距指定值的+/-10％或更小，优选地+1％-5％或更小，更优选地+/-1％或更小，并且仍更优选地为+/-0.1％或更小的变化，只要此类变化适用于所公开的发明即可。应当理解，修饰语“约”(“about”或“approximately”)所指的值本身也是具体地并且优选地是公开的。

尽管术语“一个或多个”或“至少一个”(例如一组成员中的一个或多个或至少一个)本身是清楚的，但通过进一步举例说明，所述术语尤其涵盖对所述成员中任一个的引用，或对所述成员中任两个或更多个的引用，例如像，对所述成员中的任何>3个、>4个、>5个、>6个或>7个等，并且多达所有所述成员的引用。

本说明书中引用的所有参考文献均通过引用以其全文特此并入。特别地，本文具体参考的所有参考文献的教导均通过引用并入。

除非另有定义，否则用于公开本发明的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。通过进一步的指导，包括术语定义以更好地理解本发明的教导。

如本文所用，术语“脂肪酶”是指如酶条目EC 3.1.1.3所定义的三酰甘油脂肪酶。脂肪酶催化三酰甘油的水解以产生游离脂肪酸(饱和的或不饱和的)、二酰甘油、单酰甘油和甘油。

如本文所用，术语“磷脂酶”是指根据水解位点将磷脂水解成脂肪酸(饱和的或不饱和的)、溶血磷脂、二酰甘油、磷酸胆碱和磷脂酸的酶。磷脂酶进一步被分类为A、B、C和D型。

如本文所用，术语“磷脂酶A”是指催化磷脂的脂肪酸组分的酯键水解的酶。存在可区分的两种不同类型的磷脂酶A活性。如酶条目EC 3.1.1.32中定义的磷脂酶A1和如酶条目EC 3.1.1.4中定义的磷脂酶A2，分别催化来自二酰甘油磷脂的、在sn1和sn2位置的一个脂肪酰基基团的脱酰作用，以产生溶血磷脂。

磷脂酶A1和A2分别催化sn1和sn2位置的一个脂肪酸基团的脱酰作用。因此，磷脂酶A1(在本文有时也称为PLA1)水解磷脂的1-酰基基团，从而水解在一个位置处的脂肪酸和甘油残基之间的键。磷脂酶A2(在本文有时也称为PLA2)催化2-酰基基团的水解。

通过磷脂酶水解磷脂可产生称为溶血磷脂的化合物。因此，用磷脂酶A1选择性水解磷脂可产生2-酰基溶血磷脂。用磷脂酶A2水解磷脂可产生1-酰基溶血磷脂。另一种磷脂酶是“溶血磷脂酶”，其催化溶血磷脂中剩余的脂肪酰基基团的水解。

如本文所用，短语“sn1/sn2特异性比”在本文定义为相对PLA1活性除以相对PLA2活性，如下文更充分地示出。

如本文所用，短语“溶血磷脂酶/磷脂酶活性比”意指(LPC-U/mg蛋白质)/(PC-U/mg蛋白质)，如下文更充分地示出。

如本文所用，短语“NALPE/NAPE活性比”意指(NALPE-U/mg蛋白质)/(NAPE-U/mg蛋白质)，如下文更充分地示出。

其他定义如下文示出。

额外的突变

在一些实施例中，本发明的磷脂酶进一步包括可提供另外的性能或稳定性益处的一个或多个突变。示例性的性能益处包括但不限于：增加的热稳定性，增加的储存稳定性，增加的溶解性，改变的pH曲线、增加的比活性、经修饰的底物特异性、经修饰的底物结合、经修饰的pH依赖性活性、经修饰的pH依赖性稳定性、增加的氧化稳定性、和增加的表达。在一些情况下，性能益处是在相对较低的温度下实现的。在一些情况下，性能益处是在相对较高的温度下实现的。

此外，本发明的磷脂酶可以包含任何数量的保守氨基酸取代。示例性保守氨基酸取代列于表1中。

表1.保守氨基酸取代

读者将理解，一些前述保守突变可以通过遗传操作产生，而其他通过用遗传或其他方式将合成的氨基酸引入多肽中产生。

本发明的磷脂酶可以是“前体”、“不成熟的”或“全长”，在这种情况下它们包括信号序列，或“成熟的”，在这种情况下它们缺乏信号序列并且可以通过蛋白水解和/或非蛋白水解加工在N-末端和/或C-末端处进一步截短。一般而言，成熟形式的多肽通常是最有用的。除非另有说明，本文使用的氨基酸残基编号是指相应磷脂酶多肽的成熟形式。只要所得的多肽保留磷脂酶活性，本发明的磷脂酶多肽也可被截短以除去N-末端或C-末端。此外，磷脂酶可以是来源于更长的氨基酸序列的活性片段。活性片段的特征在于保留全长酶的一些或全部活性，但具有来自N-末端、来自C-末端或其内部或组合的缺失。

本发明的磷脂酶可以是“嵌合”或“杂合”多肽，因为其包括第一磷脂酶多肽的至少一部分和第二磷脂酶多肽的至少一部分。本发明的磷脂酶可进一步包含异源信号序列，即允许跟踪或纯化等的表位。示例性异源信号序列来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)淀粉酶(LAT)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(AmyE或AprE)和链霉菌属(Streptomyces)CelA。

变体磷脂酶的生产

本发明的磷脂酶可以在宿主细胞中产生，例如通过分泌或细胞内表达。在将磷脂酶分泌到细胞培养基中后，可以获得包含磷脂酶的培养细胞材料(例如，全细胞培养液)。任选地，磷脂酶可以从宿主细胞中分离，或甚至从细胞培养液中分离，这取决于最终磷脂酶所需的纯度。可以根据本领域熟知的方法克隆和表达编码磷脂酶的基因。合适的宿主细胞包括细菌、真菌(包括酵母和丝状真菌)和植物细胞(包括藻类)。特别有用的宿主细胞包括黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)或里氏木霉(Trichodermareesei)。其他宿主细胞包括细菌细胞，例如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌，以及链霉菌属、大肠杆菌(E.Coli)。

宿主细胞还可以表达编码同源或异源磷脂酶(即，与宿主细胞不同物种的磷脂酶)或一种或多种其他酶的核酸。所述磷脂酶可以是变体磷脂酶。另外，宿主可以表达一种或多种辅酶、蛋白质、肽。

载体

可以构建包含编码磷脂酶的核酸的DNA构建体以在宿主细胞中表达。由于遗传密码中熟知的简并性，编码相同氨基酸序列的变体多核苷酸可以用常规技术进行设计和制备。优化用于特定宿主细胞的密码子也是本领域熟知的。可以将编码磷脂酶的核酸掺入载体。可以使用熟知的转化技术(例如以下公开的那些)将载体转移至宿主细胞中。

载体可以是可以转化到宿主细胞中并在宿主细胞内复制的任何载体。例如，包含编码磷脂酶的核酸的载体可以在作为繁殖和扩增载体的手段的细菌宿主细胞中转化并复制。载体也可以被转化到表达宿主中，使得编码核酸可以被表达为功能性磷脂酶。用作表达宿主的宿主细胞可以包括，例如，丝状真菌。美国真菌遗传学库存中心(FGSC)的菌株目录列出了适合在真菌宿主细胞中表达的载体。参见FGSC，菌株目录，密苏里大学，网址为www.fgsc.net(最新修改时间为2007年1月17日)。代表性的载体是pJG153，其是可在细菌宿主中复制的无启动子Cre表达载体。参见Harrison等人,(2011年6月)AppliedEnviron.Microbiol[应用和环境微生物学]77:3916-22。pJG153可以用常规技术进行修饰以包含并表达编码磷脂酶的核酸。

可以将编码磷脂酶的核酸有效地连接到适合的启动子，其允许在宿主细胞中转录。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，并且可以来源于编码与宿主细胞同源抑或异源的蛋白质的基因。用于指导编码磷脂酶的DNA序列的转录(特别是在细菌宿主中)的示例性启动子是大肠杆菌的乳糖操纵子的启动子、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂酶基因dagA或celA启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。对于在真菌宿主中的转录，有用的启动子的实例是来源于编码米曲霉TAKA淀粉酶、米氏根瘤菌(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米氏根瘤菌脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉三糖磷酸异构酶或构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶的基因的启动子。当编码磷脂酶的基因在细菌物种(如大肠杆菌)中表达时，可以从，例如，包括T7启动子和噬菌体λ启动子的噬菌体启动子中选择适合的启动子。用于在酵母物种中表达的适合的启动子的实例包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Gal 1和Gal 10启动子以及毕赤酵母(Pichia pastoris)AOX1或AOX2启动子。cbh1是来自里氏木霉的内源诱导型启动子。参见Liu等人(2008)“Improved heterologous gene expression inTrichoderma reesei by cellobiohydrolase I gene(cbh1)promoter optimization[纤维二糖水解酶I基因(cbh1)启动子优化改善里氏木霉中的异源基因表达],”ActaBiochim.Biophys.Sin(Shanghai)[生物化学与生物物理学报(上海)]40(2):158-65。

编码序列可以有效地连接到信号序列。编码信号序列的DNA可以是与待表达的磷脂酶基因天然相关或来自不同属或物种的DNA序列。可以将包含DNA构建体或载体的信号序列和启动子序列引入真菌宿主细胞，并且可以来源于相同的来源。例如，信号序列是有效地连接到cbh1启动子的cbh1信号序列。

表达载体还可以包含适合的转录终止子，并且在真核生物中，聚腺苷酸化序列有效地连接到编码变体磷脂酶的DNA序列。终止序列和聚腺苷酸化序列可以适当地来源于与启动子相同的来源。

所述载体可以进一步包含使得所述载体能够在宿主细胞中复制的DNA序列。此类序列的实例是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。

载体还可以包含可选择标记，例如其产物弥补分离的宿主细胞中的缺陷的基因，例如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。此外，载体可以包含曲霉属选择标记，例如amdS、argB、niaD和xxsC，引起潮霉素抗性的标记，或者选择可以通过共转化(如本领域已知的)实现。参见，例如，国际PCT申请WO 91/17243。

细胞内表达在某些方面可能是有利的，例如，当使用某些细菌或真菌作为宿主细胞产生大量磷脂酶用于随后的富集或纯化时。磷脂酶的细胞外分泌至培养基中还可用于制备包含分离的磷脂酶的培养的细胞材料。

表达载体典型地包括克隆载体的组分，例如像允许载体在选择的宿主生物体中自主复制的元件和用于选择目的一个或多个表型可检测的标记。表达载体通常包含控制核苷酸序列，例如启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号以及任选地抑制子基因或一个或多个激活子基因。另外，表达载体可包含编码氨基酸序列的序列，所述氨基酸序列能够将磷脂酶靶向宿主细胞细胞器(如过氧化物酶体)或靶向具体宿主细胞区室。这样的靶向序列包括但不限于序列SKL。对于在控制序列的指导下进行表达，将磷脂酶的核酸序列以关于表达的适当方式与控制序列有效地连接。

用于分别连接编码磷脂酶的DNA构建体、启动子、终止子和其他元件，并将它们插入到含有复制所需信息的适合的载体中的程序是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等人,M_OLECULAR C_LONING:A L_ABORATORY M_ANUAL[分子克隆：实验室手册],第二版,冷泉港实验室(Cold Spring Harbor),1989,和第三版,2001)。

宿主细胞的转化和培养

包含DNA构建体或表达载体的分离的细胞有利地用作重组产生磷脂酶的宿主细胞。通过将DNA构建体(以一或多个拷贝)整合到宿主染色体中，可以方便地用编码酶的DNA构建体转化细胞。通常认为这种整合是有利的，因为DNA序列更可能在细胞中稳定保持。可以根据常规方法，例如，通过同源或异源重组，将DNA构建体整合到宿主染色体中。可替代地，可以用如上所述的与不同类型的宿主细胞相关的表达载体转化细胞。

适合的细菌宿主生物体的实例是革兰氏阳性细菌物种，如芽孢杆菌属(Bacillaceae)，包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)(原嗜热脂肪芽孢杆菌)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)；链霉菌属物种如鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)，乳酸细菌物种包括乳球菌属物种(Lactococcussp.)，如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；乳杆菌属物种(Lactobacillus sp.)包括罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuterv)，明串珠菌属物种(Leuconostoc sp.)；片球菌属物种(Pediococcus sp.)；和链球菌属物种(Streptococcus sp.)。可替代地，可以选择属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(包括大肠杆菌)或假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的革兰氏阴性细菌物种的菌株作为宿主生物体。

适合的酵母宿主生物体可以选自生物技术相关的酵母物种，例如但不限于酵母物种，如毕赤酵母属物种(Pichia sp.)、汉逊酵母属物种(Hansenula sp.)或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowinia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种或者酵母属(Saccharomyces)物种，包括酿酒酵母，或者属于裂殖酵母属的物种，例如像，粟酒裂殖酵母(S.pombe)物种。甲基营养酵母菌株毕赤酵母可以作为宿主生物体使用。可替代地，宿主生物体可以是汉逊酵母属物种。丝状真菌中适合的宿主生物体包括曲霉属的物种，例如，黑曲霉、米曲霉、塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)或构巢曲霉。可替代地，镰刀菌属(Fusarium)物种(例如，尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum))或根瘤菌属(Rhizomucor)物种(如米氏根瘤菌)的菌株可以用作宿主生物体。其他适合的菌株包括嗜热菌属(Thermomyces)和毛霉菌属(Mucor)物种。此外，木霉属物种(Trichoderma sp.)可以用作宿主。转化曲霉属宿主细胞的适合的程序包括，例如，EP238023中描述的程序。真菌宿主细胞表达的磷脂酶可以被糖基化，即，将包含糖基部分。糖基化模式可以与野生型磷脂酶中存在的相同或不同。糖基化的类型和/或程度可能改变酶和/或生化特性。

从表达宿主缺失基因可以是有利的，其中可以通过转化的表达载体治愈基因缺陷。已知方法可用于获得具有一种或多种失活基因的真菌宿主细胞。可以通过完全或部分缺失，通过插入失活或通过使基因对其预期目的不起作用的任何其他方式使得所述基因被阻止表达功能性蛋白来完成基因灭活。已克隆的、来自木霉属物种或其他丝状真菌宿主的任何基因均可以缺失，例如，cbh1、cbh2、egl1和egl2基因。基因缺失可通过本领域已知方法通过将待失活的所需基因的形式插入质粒中来完成。

将DNA构建体或载体引入宿主细胞中包括技术例如转化；电穿孔；核显微注射；转导；转染，例如脂质转染介导的和DEAE-糊精介导的转染；与磷酸钙DNA沉淀一起孵育；用DNA包被的微粒高速轰击；和原生质体融合。通用转化技术是本领域已知的。参见，例如Sambrook等人(2001),同上。异源蛋白质在木霉属中的表达描述于例如美国专利号6,022,725。对于曲霉属菌株的转化，还参考了Cao等人(2000)Science[科学]9:991-1001。可以用载体系统构建遗传稳定的转化体，由此编码磷脂酶的核酸被稳定整合到宿主细胞染色体中。然后通过已知技术选择并纯化转化体。

用于转化的木霉属物种的制备例如可以涉及从真菌菌丝体制备原生质体。参见Campbell等人(1989)Curr.Genet.[当代遗传学]16:53-56。菌丝体可以从发芽的营养孢子获得。使用消化细胞壁的酶处理菌丝体，产生原生质体。通过悬浮培养基中渗透稳定剂的存在来保护原生质体。这些稳定剂包括山梨糖醇、甘露糖醇、氯化钾、硫酸镁等。通常这些稳定剂的浓度在0.8M与1.2M之间变化，例如山梨糖醇的1.2M溶液可以用于悬浮培养基中。

取决于钙离子浓度，将DNA摄取到宿主木霉属物种菌株中。一般情况下，在摄取溶液中使用在约10mM至50mM之间的CaCl₂。额外的合适的化合物包括缓冲系统，例如TE缓冲液(10mM Tris，pH 7.4；1mM EDTA)或10mM MOPS(pH 6.0)和聚乙二醇。据信聚乙二醇使细胞膜融合，从而允许培养基的内容物被递送至木霉属物种菌株的细胞质中。该融合时常留下整合到宿主染色体中的多个拷贝的质粒DNA。

通常，使用已经进行了渗透性处理的原生质体或细胞转化木霉属的物种，通常以10⁵至10⁷/mL、特别是2x 10⁶/mL的密度进行。可以将100μL体积的在合适的溶液(例如1.2M山梨糖醇和50mM CaCl₂)中的这些原生质体或细胞与所希望的DNA混合。一般情况下，向摄取溶液中添加高浓度的PEG。可以将从0.1至1体积的25％PEG 4000添加到原生质体悬浮液中；然而，向原生质体悬浮液中添加约0.25体积是有用的。也可以将添加剂例如二甲亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾等添加到摄取溶液中以促进转化。类似的程序可用于其他真菌宿主细胞。参见，例如美国专利号6,022,725。

表达

产生磷脂酶的方法可以包括在有利于产生所述酶的条件下如上所述培养宿主细胞，并从细胞和/或培养基中回收所述酶。

用于培养细胞的培养基可以是适合于所考虑的宿主细胞生长并获得磷脂酶表达的任何常规培养基。合适的培养基和培养基组分可从商业供应商获得或可以根据公开的配方(例如，如在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中所述)来制备。

从宿主细胞中分泌的酶可以用于全培养液制剂中。在本发明的方法中，可以使用本领域已知的任何培养方法来实现重组微生物的所消耗的全发酵液的制备，从而导致磷脂酶的表达。因此，发酵可以理解为包括在实验室或工业发酵罐中在合适的培养基和磷脂酶能够被表达或分离的条件下进行的摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、补料分批发酵或固态发酵)。术语“所消耗的全发酵液”在本文中定义为包括培养基、胞外蛋白质(例如，酶)和细胞生物质的发酵材料的未分级内容物。应当理解，术语“所消耗的全发酵液”还涵盖已经使用本领域熟知的方法裂解或透化的细胞生物质。

从宿主细胞中分泌的酶可方便地通过熟知的程序从培养基中回收，所述程序包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，并借助于盐(例如硫酸铵)沉淀培养基的蛋白质组分，然后使用色谱法，例如离子交换色谱法、亲和色谱法等。可以将在载体中编码磷脂酶的多核苷酸有效地连接到控制序列，所述控制序列能够通过宿主细胞提供编码序列的表达，即所述载体是表达载体。可以例如通过添加其他转录调控元件来修饰控制序列，以使由控制序列指导的转录水平对转录调节因子更有应答。控制序列尤其可以包含启动子。

宿主细胞可以在允许表达磷脂酶的合适条件下培养。所述酶的表达可以是组成型的，使得它们能被连续产生，或诱导型的，需要刺激来启动表达。在诱导型表达的情况下，当需要时可通过例如向培养基中添加诱导物质，例如地塞米松或IPTG或槐糖来启动蛋白质生产。多肽也可以在体外无细胞系统(例如TNT^TM(普洛麦格公司(Promega))兔网织红细胞系统)中重组生产。

表达宿主也可以在有氧条件下在对于宿主来说适当的培养基中培养。可以提供摇动或搅动和通气的组合，其中生产在对所述宿主来说适当的温度下(例如从约25℃至约75℃(例如30℃至45℃)，这取决于宿主的需要和所需磷脂酶的生产)发生。培养可以发生从约12至约100小时或更长时间(以及其间的任何小时值，例如从24至72小时)。典型地，培养液的pH为约4.0至约8.0，同样取决于宿主相对于磷脂酶的生产所需的培养条件。

富集和纯化磷脂酶的方法

发酵、分离和浓缩技术是本领域熟知的，并且可使用常规方法来制备含磷脂酶多肽的溶液。

发酵后，获得发酵液，通过常规分离技术去除微生物细胞和各种悬浮固体(包括剩余的粗发酵材料)，以便获得磷脂酶溶液。通常使用过滤、离心、微滤、旋转真空鼓式过滤、超滤、离心然后超滤、提取或色谱法等。

期望浓缩含磷脂酶多肽的溶液以优化回收。使用未浓缩的溶液需要增加孵育时间以收集富集或纯化的酶沉淀物。

使用常规浓缩技术浓缩含酶溶液，直至获得所需的酶水平。含酶溶液的浓缩可以通过在本文中所讨论的技术中的任一种来实现。富集和纯化的示例性方法包括但不限于旋转真空过滤和/或超滤。

将酶溶液浓缩成浓缩的酶溶液，直至浓缩的含磷脂酶多肽的溶液的酶活性达到所需的水平。

可以使用例如沉淀剂，如金属卤化物沉淀剂进行浓缩。金属卤化物沉淀剂包括但不限于碱金属氯化物、碱金属溴化物和这些金属卤化物中的两种或更多种的共混物。示例性金属卤化物包括氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾和这些金属卤化物中的两种或更多种的共混物。金属卤化物沉淀剂，氯化钠，也可用作防腐剂。

金属卤化物沉淀剂以有效沉淀磷脂酶的量使用。常规测试后，选择至少有效量和最佳量的金属卤化物以有效引起酶的沉淀，连同为了最大化回收的沉淀的条件，包括孵育时间、pH、温度和酶浓度，对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。

一般情况下，向浓缩的酶溶液中添加至少约5％w/v(重量/体积)至约25％w/v的金属卤化物，并且通常为至少8％w/v。一般情况下，向浓缩的酶溶液中添加不超过约25％w/v的金属卤化物，并且通常不超过约20％w/v。金属卤化物沉淀剂的最佳浓度除其他事项之外，将取决于特定磷脂酶多肽的性质和其在浓缩的酶溶液中的浓度。

沉淀酶的另一种替代方式是使用有机化合物。示例性有机化合物沉淀剂包括：4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸的碱金属盐、4-羟基苯甲酸的烷基酯、以及这些有机化合物中的两种或更多种的共混物。有机化合物沉淀剂的添加可以在添加金属卤化物沉淀剂之前、与之同时或之后进行，并且添加两种沉淀剂，有机化合物和金属卤化物的添加可以依次或同时进行。

一般情况下，有机沉淀剂选自由以下组成的组：4-羟基苯甲酸的碱金属盐(例如钠盐或钾盐)，和4-羟基苯甲酸的直链或支链烷基酯，其中所述烷基基团含有1至12个碳原子，以及这些有机化合物中的两种或更多种的共混物。有机化合物沉淀剂可以是例如4-羟基苯甲酸的直链或支链烷基酯，其中所述烷基基团含有1至10个碳原子，以及这些有机化合物中的两种或更多种的共混物。示例性有机化合物是4-羟基苯甲酸的直链烷基酯，其中所述烷基基团含有1至6个碳原子，以及这些有机化合物中的两种或更多种的共混物。还可以使用4-羟基苯甲酸的甲酯、4-羟基苯甲酸的丙酯、4-羟基苯甲酸的丁酯、4-羟基苯甲酸的乙酯和这些有机化合物中的两种或更多种的共混物。额外的有机化合物还包括但不限于4-羟基苯甲酸甲酯(称为对羟基苯甲酸甲酯)、4-羟基苯甲酸丙酯(称为对羟基苯甲酸丙酯)，它们也都是防腐剂。有关进一步的描述，参见例如美国专利号5,281,526。

有机化合物沉淀剂的添加提供了沉淀条件在pH、温度、磷脂酶浓度、沉淀剂浓度和孵育时间方面的高度灵活性的优点。

有机化合物沉淀剂以有效地通过金属卤化物沉淀剂的方式改善酶的沉淀的量使用。常规测试后，根据本公开，选择至少有效量和最佳量的有机化合物沉淀剂，连同为了最大化回收的沉淀的条件，包括孵育时间、pH、温度和酶浓度，对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。

一般情况下，向浓缩的酶溶液中添加至少约0.01％w/v的有机化合物沉淀剂，并且通常至少约0.02％w/v。一般情况下，向浓缩的酶溶液中添加不超过约0.3％w/v的有机化合物沉淀剂，并且通常不超过约0.2％w/v。

可以将含有金属卤化物沉淀剂和有机化合物沉淀剂的浓缩多肽溶液调节至某一pH，这将必然取决于待富集或纯化的酶。一般情况下，将pH调节至接近磷脂酶的等电点的水平。可以在从低于等电点(pI)约2.5个pH单位上至高于等电点约2.5个pH单位的pH范围内调节pH。

获得富集或纯化的酶沉淀物所需的孵育时间取决于特定酶的性质、酶的浓度和一种或多种特定的沉淀剂及其浓度。一般情况下，有效沉淀酶的时间在约1至约30小时之间；通常不超过约25小时。在有机化合物沉淀剂存在下，孵育时间仍可减少至小于约10小时，并且在大多数情况下甚至约6小时。

一般情况下，孵育期间的温度在约4℃和约50℃之间。通常，所述方法在约10℃和约45℃之间(例如，在约20℃和约40℃之间)的温度下进行。用于诱导沉淀的最佳温度根据溶液条件和所用的酶或一种或多种沉淀剂而变化。

通过搅拌包含所述酶、添加的金属卤化物和添加的有机化合物的溶液来改善富集或纯化的酶沉淀物的总体回收率以及用其进行该工艺的效率。在添加金属卤化物和有机化合物期间以及随后的孵育期间均进行搅拌步骤。适合的搅拌方法包括机械搅拌或摇动、剧烈通气或任何类似技术。

孵育期后，然后通过常规分离技术(例如过滤、离心、微滤、旋转真空过滤、超滤、压滤、交叉膜微滤、交叉流膜微滤等)，将富集或纯化的酶与解离的色素和其他杂质分离，并且收集。通过用水洗涤沉淀物可以获得酶沉淀物的进一步富集或纯化。例如，用含有金属卤化物沉淀剂的水，或用含有金属卤化物和有机化合物沉淀剂的水洗涤富集或纯化的酶沉淀物。

在发酵过程中，磷脂酶多肽在培养液中积累。为了分离、富集或纯化所需的磷脂酶，将培养液离心或过滤以消除细胞，并且将所得的无细胞液体用于酶富集或纯化。在一个实施例中，使用硫酸铵以约70％饱和度对无细胞培养液进行盐析；然后将70％饱和度的沉淀级分溶解在缓冲液中并施加到柱(如Sephadex G-100柱)上，并且洗脱以回收酶活性级分。为了进一步富集或纯化，可以使用常规程序，例如离子交换色谱法。

富集或纯化的酶可以制成为液体(溶液，浆料)或固体(颗粒，粉末)的最终产品。

优选实施例的描述

根据本发明的一个方面，呈现了分离的多肽，所述分离的多肽包含特征在于具有约55/45或更高的sn1/sn2特异性比的磷脂酶A1，其中所述磷脂酶A1的溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.02和/或NALPE/NAPE活性比小于0.12。优选地，所述sn1/sn2特异性比在65-85/15-35之间，优选地在65-80/20-35之间，更优选地在70-85/15-30之间，更优选地在70-80/20-30之间；或在75-95/5-25之间，优选地在80-95/5-20之间，更优选地在85-95/5-15之间。优选地，所述sn1/sn2特异性比为约60/40、70/30、80/20、90/10、95/5或99/1。在其他优选的实施例中，所述sn1/sn2特异性比为约74/26或89/11。在另一个实施例中，本发明的分离的多肽可以由本文呈现的磷脂酶A1组成或基本上由其组成。相对于磷脂酰胆碱(PC)底物，所述sn1/sn2特异性比在65-85/15-35之间，优选地在65-80/20-35之间，更优选地在70-85/15-30之间，更优选地在70-80/20-30之间；并且相对于NAPE底物，所述sn1/sn2特异性比在75-95/5-25之间，优选地在80-95/5-20之间，更优选地在85-95/5-15之间。相对于磷脂酰胆碱(PC)底物，所述sn1/sn2特异性比为74/26，并且相对于NAPE底物，所述sn1/sn2特异性比为89/11。

优选地，所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.009、0.008、0.007、0.006、0.005、0.004、0.003、0.002或0.001。在还更优选的实施例中，所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.001，且所述sn1/sn2特异性比在65-85/15-35之间，优选地在65-80/20-35之间，更优选地在70-85/15-30之间，更优选地在70-80/20-30之间。在其他还优选的实施例中，所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.001，且所述sn1/sn2特异性比为约60/40、70/30、80/20、90/10、95/5或99/1。在其他还优选的实施例中，所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.001，且所述sn1/sn2特异性比为约74/26。

优选地，所述NALPE/NAPE活性比活性比小于0.11、0.10、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.009、0.008、0.007、0.006、0.005、0.004、0.003、0.002或0.001。

优选地，所述NALPE/NAPE活性比活性比小于0.11、0.10、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.009、0.008、0.007、0.006、0.005、0.004、0.003、0.002或0.001，且所述且所述sn1/sn2特异性比在75-95/5-25之间，优选地在80-95/5-20之间，更优选地在85-95/5-15之间。

优选地，所述NALPE/NAPE活性比活性比小于0.11、0.10、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.009、0.008、0.007、0.006、0.005、0.004、0.003、0.002或0.001，且所述且所述sn1/sn2特异性比为约89/11。

在其他优选的实施例中，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16具有至少80％序列同一性的蛋白质序列的酶。更优选地，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:6具有至少80％序列同一性的蛋白质序列的酶。

在其他优选的实施例中，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16具有至少90％序列同一性的蛋白质序列的酶。更优选地，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:6具有至少90％序列同一性的蛋白质序列的酶。

在其他优选的实施例中，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16具有至少95％序列同一性的蛋白质序列的酶。更优选地，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:6具有至少95％序列同一性的蛋白质序列的酶。

在其他优选的实施例中，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16具有100％序列同一性的蛋白质序列的酶。更优选地，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:6具有100％序列同一性的蛋白质序列的酶。

在本发明的另一个方面，呈现了具有编码如上所述的分离的多肽的核酸序列的分离的多核苷酸。也呈现了具有分离的多核苷酸的重组表达载体。还呈现了具有重组表达载体的宿主细胞。

在本发明的另一个方面，呈现了制作面团的方法，所述方法包括使选自由面粉、盐、水、糖、脂肪、卵磷脂、油、乳化剂和酵母组成的组的面团组分与分离的多肽相混合，所述分离的多肽包含特征在于具有约55/45或更高的sn1/sn2特异性比的磷脂酶A1，其中所述磷脂酶A1的溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.01，和/或NALPE/NAPE活性比小于0.12。优选地，所述sn1/sn2特异性比在65-85/15-35之间，优选地在65-80/20-35之间，更优选地在70-85/15-30之间，更优选地在70-80/20-30之间；或在75-95/5-25之间，优选地在80-95/5-20之间，更优选地在85-95/5-15之间。优选地，所述sn1/sn2特异性比为约60/40、70/30、80/20、90/10、95/5或99/1。在其他优选的实施例中，所述sn1/sn2特异性比为约74/26或89/11。任选地，所述乳化剂选自由以下组成的组：i)磷脂乳化剂如卵磷脂或溶血卵磷脂；或ii)非磷脂乳化剂如DATEM、甘油单酯或甘油二酯。

优选地，所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.009、0.008、0.007、0.006、0.005、0.004、0.003、0.002或0.001。在还更优选的实施例中，所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.001，且所述sn1/sn2特异性比在65-85/15-35之间，优选地在65-80/20-35之间，更优选地在70-85/15-30之间，更优选地在70-80/20-30之间。在其他还优选的实施例中，所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.001，且所述sn1/sn2特异性比为约60/40、70/30、80/20、90/10、95/5或99/1。在其他还优选的实施例中，所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.001，且所述sn1/sn2特异性比为约74/26。在其他还优选的实施例中，所述NALPE/NAPE活性比活性比小于0.11、0.10、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.009、0.008、0.007、0.006、0.005、0.004、0.003、0.002或0.001，且所述sn1/sn2特异性比在75-95/5-25之间，优选地在80-95/5-20之间，更优选地在85-95/5-15之间。在其他还优选的实施例中，所述NALPE/NAPE活性比活性比小于0.11、0.10、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.009、0.008、0.007、0.006、0.005、0.004、0.003、0.002或0.001，且所述sn1/sn2特异性比为约89/11。

在其他优选的实施例中，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16具有至少80％序列同一性的蛋白质序列的酶。更优选地，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:6具有至少80％序列同一性的蛋白质序列的酶。

在其他优选的实施例中，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16具有至少90％序列同一性的蛋白质序列的酶。更优选地，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:6具有至少90％序列同一性的蛋白质序列的酶。

在其他优选的实施例中，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16具有至少95％序列同一性的蛋白质序列的酶。更优选地，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:6具有至少95％序列同一性的蛋白质序列的酶。

在其他优选的实施例中，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16具有100％序列同一性的蛋白质序列的酶。更优选地，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:6具有100％序列同一性的蛋白质序列的酶。

在本发明的另一个方面，呈现了包含特征在于具有约55/45或更高的sn1/sn2特异性比的磷脂酶A1酶的面团，其中所述磷脂酶A1的溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.01。优选地，所述面团具有改善的拉伸性和/或稳定性。在本发明的另一个方面，所述面团进一步具有选自由以下组成的组的至少一种额外的酶：淀粉酶、环糊精葡聚糖转移酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、脂肪酶、半乳糖脂酶、与所述磷脂酶A1不同的磷脂酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、蛋白质二硫键异构酶、糖基转移酶、过氧化物酶、脂加氧酶、漆酶和氧化酶。优选地，所述淀粉酶为外切淀粉酶。优选地，所述外切淀粉酶为生麦芽糖淀粉酶。优选地，所述外切淀粉酶为非生麦芽糖淀粉酶。更优选地，所述非生麦芽糖淀粉酶通过以下方式水解淀粉：从支链淀粉侧链的非还原端切下一种或多种直链麦芽低聚糖，所述直链麦芽低聚糖主要包含四个至八个D-吡喃葡萄糖基单元。在另一个优选的实施例中，所述额外的酶为磷脂酶。更优选地，所述磷脂酶具有半乳糖脂酶活性。在另一个优选的实施例中，所述磷脂酶为SEQ ID NO:17和/或SEQ ID NO:18。

在本发明的另一个方面，呈现了制备烘焙产品的方法，其中烘焙如上所述的面团。在本发明的另一个方面，呈现了烘焙产品。优选地，所述烘焙产品具有选自由以下组成的组的至少一种改善的特性：改善的面包心孔径、改善的气泡的均匀性、外皮和面包心之间无分离、增加的体积、增加的外皮脆度和改善的烤焙弹性。更优选地，所述改善的特性为增加的外皮脆度。

在本发明的另一个方面，呈现了用于烘焙的预混合物，其包含面粉和特征在于具有约55/45或更高的sn1/sn2特异性比的磷脂酶A1酶，其中所述磷脂酶A1的溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.01。在本发明的另一个方面，所述用于烘焙的预混合物具有选自由以下组成的组的至少一种额外的酶：淀粉酶、环糊精葡聚糖转移酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、脂肪酶、半乳糖脂酶、与所述磷脂酶A1不同的磷脂酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、蛋白质二硫键异构酶、糖基转移酶、过氧化物酶、脂加氧酶、漆酶和氧化酶。优选地，所述淀粉酶为外切淀粉酶。优选地，所述外切淀粉酶为生麦芽糖淀粉酶。优选地，所述外切淀粉酶为非生麦芽糖淀粉酶。更优选地，所述非生麦芽糖淀粉酶通过以下方式水解淀粉：从支链淀粉侧链的非还原端切下一种或多种直链麦芽低聚糖，所述直链麦芽低聚糖主要包含四个至八个D-吡喃葡萄糖基单元。优选地，所述额外的酶为磷脂酶。更优选地，所述磷脂酶具有半乳糖脂酶活性。在另一个优选的实施例中，所述磷脂酶为SEQ ID NO:17和/或SEQ ID NO:18。

在本发明的另一个方面，呈现了烘焙改良剂，其包含含有特征在于具有约55/45或更高的sn1/sn2特异性比的磷脂酶A1酶的颗粒或团聚粉末，其中所述磷脂酶A1的溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.01。在本发明的另一个方面，所述烘焙改良剂具有选自由以下组成的组的至少一种额外的酶：淀粉酶、环糊精葡聚糖转移酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、脂肪酶、半乳糖脂酶、与所述磷脂酶A1不同的磷脂酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、蛋白质二硫键异构酶、糖基转移酶、过氧化物酶、脂加氧酶、漆酶和氧化酶。优选地，所述淀粉酶为外切淀粉酶。优选地，所述外切淀粉酶为生麦芽糖淀粉酶。优选地，所述外切淀粉酶为非生麦芽糖淀粉酶。更优选地，所述非生麦芽糖淀粉酶通过以下方式水解淀粉：从支链淀粉侧链的非还原端切下一种或多种直链麦芽低聚糖，所述直链麦芽低聚糖主要包含四个至八个D-吡喃葡萄糖基单元。优选地，所述额外的酶为磷脂酶。更优选地，所述磷脂酶具有半乳糖脂酶活性。在另一个优选的实施例中，所述磷脂酶为SEQ ID NO:17和/或SEQ ID NO:18。

在本发明的另一个方面，呈现了如上所述的制作面团的方法，但是其中包括用于改善面团和/或由其制得的烘焙产品的至少一种额外的酶。优选地，所述额外的酶选自由以下组成的组：淀粉酶、环糊精葡聚糖转移酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、脂肪酶、半乳糖脂酶、与所述磷脂酶A1不同的磷脂酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、蛋白质二硫键异构酶、糖基转移酶、过氧化物酶、脂加氧酶、漆酶和氧化酶。优选地，所述淀粉酶为外切淀粉酶。优选地，所述外切淀粉酶为生麦芽糖淀粉酶。优选地，所述外切淀粉酶为非生麦芽糖淀粉酶。更优选地，所述非生麦芽糖淀粉酶通过以下方式水解淀粉：从支链淀粉侧链的非还原端切下一种或多种直链麦芽低聚糖，所述直链麦芽低聚糖主要包含四个至八个D-吡喃葡萄糖基单元。优选地，所述额外的酶为磷脂酶。更优选地，所述磷脂酶具有半乳糖脂酶活性。在另一个优选的实施例中，所述磷脂酶为SEQ ID NO:17和/或SEQ ID NO:18。

在本发明的另一个方面，用于修饰磷脂乳化剂的方法包括用特征在于具有约55/45或更高的sn1/sn2特异性比的磷脂酶A1酶处理所述乳化剂，其中所述磷脂酶A1的溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.01。任选地，所述磷脂乳化剂为卵磷脂或溶血卵磷脂。任选地，所述磷脂乳化剂为磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱或磷脂酰丝氨酸。

在本发明的另一个方面，呈现了在含脂质食品基质中产生溶血磷脂的方法，其包括向所述含脂质食品基质中添加特征在于具有约55/45或更高的sn1/sn2特异性比的磷脂酶A1酶，其中所述磷脂酶A1的溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.01。优选地，所述含脂质食品基质选自由以下组成的组：鸡蛋和含鸡蛋的食物产品、用于烘焙甜品的面团、加工肉、基于奶的产品、植物油和烘焙甜品(包括蛋糕和饼干)。

在其他还优选的实施例中，所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.019、0.018、0.017、0.016、0.015、0.014、0.013、0.012、0.011或0.010。

在又其他优选的实施例中，所述NALPE/NAPE活性比活性比小于0.11、0.10、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.009、0.008、0.007、0.006、0.005、0.004、0.003、0.002或0.001。

在本发明的另一个方面，如上呈现了制作面团的方法，但所述方法进一步具有添加乳化剂的步骤。优选地，所述乳化剂选自由以下组成的组：i)磷脂乳化剂如卵磷脂或溶血卵磷脂；或ii)非磷脂乳化剂如DATEM、甘油单酯或甘油二酯。

在本发明的另一个方面，提供了分离的多肽，所述分离的多肽包含磷脂酶A1酶、由其组成或基本上由其组成，所述磷脂酶A1酶包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16具有至少80％序列同一性的蛋白质序列，由其组成或基本上由其组成。优选地，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:6具有至少80％序列同一性的蛋白质序列，由其组成或基本上由其组成的酶。

在其他优选的实施例中，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16具有至少90％序列同一性的蛋白质序列，由其组成或基本上由其组成的酶。更优选地，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:6具有至少90％序列同一性的蛋白质序列，由其组成或基本上由其组成的酶。

在其他优选的实施例中，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16具有至少95％序列同一性的蛋白质序列，由其组成或基本上由其组成的酶。更优选地，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:6具有至少95％序列同一性的蛋白质序列，由其组成或基本上由其组成的酶。

在其他优选的实施例中，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16具有100％序列同一性的蛋白质序列，由其组成或基本上由其组成的酶。更优选地，所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:6具有100％序列同一性的蛋白质序列，由其组成或基本上由其组成的酶。

在本发明的另一个方面，提供了分离的多肽，所述分离的多肽包含磷脂酶A1酶、由其组成或基本上由其组成，所述磷脂酶A1酶包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的活性片段，由其组成或基本上由其组成。

在一个实施例中，所述SEQ ID NO:2的片段是SEQ ID NO:1的氨基酸28至149，或SEQ ID NO:1的Gln28至Gly149，或与其具有80％、85％、90％、95％或100％同一性的序列。

在一个实施例中，所述SEQ ID NO:4的片段是SEQ ID NO:3的氨基酸26至149，或SEQ ID NO:3的Gln26至Lys149，或与其具有80％、85％、90％、95％或100％同一性的序列。

在一个实施例中，所述SEQ ID NO:6的片段是SEQ ID NO:5的氨基酸28至146，或SEQ ID NO:5的Gln28至Thr146，或与其具有80％、85％、90％、95％或100％同一性的序列。

在一个实施例中，所述SEQ ID NO:8的片段是SEQ ID NO:7的氨基酸28至146，或SEQ ID NO:7的Gln28至Thr149，或与其具有80％、85％、90％、95％或100％同一性的序列。

在一个实施例中，所述SEQ ID NO:10的片段是SEQ ID NO:9的氨基酸34至157，或SEQ ID NO:9的Gln34至Gly157，或与其具有80％、85％、90％、95％或100％同一性的序列。

在一个实施例中，所述SEQ ID NO:12的片段是SEQ ID NO:11的氨基酸30至146，或SEQ ID NO:11的Ala30至Asp146，或与其具有80％、85％、90％、95％或100％同一性的序列。

在一个实施例中，所述SEQ ID NO:12的片段是SEQ ID NO:11的氨基酸30至151，或SEQIDNO:11的Ala30至Lys151，或与其具有80％、85％、90％、95％或100％同一性的序列。

在一个实施例中，所述SEQ ID NO:14的片段是SEQ ID NO:13的氨基酸28至124，或SEQ ID NO:13的Gln28至Gln124，或与其具有80％、85％、90％、95％或100％同一性的序列。

在一个实施例中，所述SEQ ID NO:14的片段是SEQ ID NO:13的氨基酸28至141，或SEQ ID NO:13的Gln28至Phe141，或与其具有80％、85％、90％、95％或100％同一性的序列。

在一个实施例中，所述SEQ ID NO:14的片段是SEQ ID NO:13的氨基酸28至145，或SEQ ID NO:13的Gln28至Asp145，或与其具有80％、85％、90％、95％或100％同一性的序列。

在一个实施例中，所述SEQ ID NO:14的片段是SEQ ID NO:13的氨基酸28至149，或SEQ ID NO:13的Gln28至Gly149，或与其具有80％、85％、90％、95％或100％同一性的序列。

在一个实施例中，所述SEQ ID NO:16的片段是SEQ ID NO:15的氨基酸29至138、29至139、29至140、29至141、29至142、29至143、29至144、29至145、29至146、29至147或29至148，或与其具有80％、85％、90％、95％或100％同一性的序列。

测定和方法

酶表征测定-活性测定和用于确定磷脂酶位置特异性的测定

PC-P测定：

磷脂酶活性(PC-U)可以使用以下测定来确定：

底物：将1.71％L-α-磷脂酰胆碱大豆(95％)(Avanti 441601G，Avanti极性脂质有限公司(Avanti Polar Lipids)，美国)、6.25％TRITON^TM-X 100(Sigma X-100)和5mM CaCl₂溶解于0.05M HEPES缓冲液(pH 7)中。

测定程序：

将样品、校准样品和对照样品在含有0.1％TRITON^TM X-100的10mM HEPES(pH 7.0)中稀释。使用96孔微量滴定板和ThermoMixcer C(艾本德公司(Eppendorf)，德国)进行分析。测定在30℃下进行。在添加50μL酶样品之前，将200μL底物在30℃下恒温180秒。将酶化持续600秒。使用NEFA套装件(获得自WakoChemicals股份有限公司(WakoChemicals GmbH)，德国)测量在酶化期间释放的游离脂肪酸的量。

该测定套装件由两种试剂组成

NEFA-HR(1)：

50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，其含有

0.53U/mL酰基-辅酶A合酶(ACS)

0.31mM辅酶A(CoA)

4.3mM腺苷5-三磷酸二钠盐(ATP)

1.5mM 4-氨基-安替比林(4-AA)

2.6U/mL抗坏血酸氧化酶(AOD)

0.062％叠氮化钠

NEFA-HR(2)：

2.4mM 3-甲基-N-乙基-N-(E-羟乙基)-苯胺(MEHA)

12U/mL酰基-辅酶A氧化酶(ACOD)

14U/mL过氧化物酶(POD)

孵育后，将10μl酶化混合物转移到含有150μL NEFA-HR(1)的新微量滴定板中，并在30℃下孵育240秒。此后，添加75μL NEFA-HR(2)，并将混合物在30℃下孵育240秒。然后测量OD 540nm。

基于由油酸制作的校准曲线来计算酶活性(μmol FFA/(min-mL))。将酶活性PC-U计算为在测定条件下产生的微摩尔脂肪酸/毫升体积酶样品/分钟。

OD＝取出盲样OD的样品OD

250μl＝底物和酶的总体积

50μl＝酶溶液的体积

D＝样品的稀释

S＝校准曲线的斜率(OD/(μmol/mL))

10＝酶化的反应时间(分钟(min))

LPC-P测定：

溶血磷脂酶活性(LPC-U)可以使用以下测定来确定：

底物：将1.18％1-油酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(Avanti 845875P，Avanti极性脂质有限公司，美国)、6.25％TRITON^TM-X 100(Sigma X-100)和5mM CaCl₂溶解于0.05MHEPES缓冲液(pH 7)中。

测定程序：

将样品、校准样品和对照样品在含有0.1％TRITON^TM X-100的10mM HEPES(pH 7.0)中稀释。使用96孔微量滴定板和ThermoMixcer C(艾本德公司，德国)进行分析。测定在30℃下进行。在添加50μL酶样品之前，将200μL底物在30℃下恒温180秒。将酶化持续600秒。使用NEFA套装件(获得自WakoChemicals股份有限公司(WakoChemicals GmbH)，德国)测量在酶化期间释放的游离脂肪酸的量。

该测定套装件由两种试剂组成

NEFA-HR(1)：

50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，其含有

0.53U/mL酰基-辅酶A合酶(ACS)

0.31mM辅酶A(CoA)

4.3mM腺苷5-三磷酸二钠盐(ATP)

1.5mM 4-氨基-安替比林(4-AA)

2.6U/mL抗坏血酸氧化酶(AOD)

0.062％叠氮化钠

NEFA-HR(2)：

2.4mM 3-甲基-N-乙基-N-(E-羟乙基)-苯胺(MEHA)

12U/mL酰基-辅酶A氧化酶(ACOD)

14U/mL过氧化物酶(POD)

基于由油酸制作的校准曲线来计算酶活性(μmol FFA/(min-mL))。将酶活性LPC-U计算为在测定条件下产生的微摩尔脂肪酸/毫升体积酶样品/分钟。

OD＝取出盲样OD的样品OD

250μl＝底物和酶的总体积

50μl＝酶溶液的体积

D＝样品的稀释

S＝校准曲线的斜率(OD/(μmol/mL))

10＝酶化的反应时间(分钟(min))

NAPE-P测定：

NAPE磷脂酶活性(NAPE-U)可以使用以下测定来确定：

底物：将2.25％棕榈酰基-2-亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-亚油酰基(16:0-18:2PE-N18:2)(Avanti 792003，Avanti极性脂质有限公司，美国)、6.25％TRITON^TM-X100(Sigma X-100)和5mM CaCl₂溶解于0.05M HEPES缓冲液(pH 7)中。

测定程序：

该测定套装件由两种试剂组成

NEFA-HR(1)：

50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，其含有

0.53U/mL酰基-辅酶A合酶(ACS)

0.31mM辅酶A(CoA)

4.3mM腺苷5-三磷酸二钠盐(ATP)

1.5mM 4-氨基-安替比林(4-AA)

2.6U/mL抗坏血酸氧化酶(AOD)

0.062％叠氮化钠

NEFA-HR(2)：

2.4mM 3-甲基-N-乙基-N-(E-羟乙基)-苯胺(MEHA)

12U/mL酰基-辅酶A氧化酶(ACOD)

14U/mL过氧化物酶(POD)

基于由油酸制作的校准曲线来计算酶活性(μmol FFA/min-mL)。将酶活性NAPE-UpH 7计算为在测定条件下产生的微摩尔脂肪酸/分钟。

基于由油酸制作的校准曲线来计算酶活性(nmol FFA/(min-mL))。将酶活性NAPE-U计算为在测定条件下产生的微摩尔脂肪酸/毫升体积酶样品/分钟。

OD＝取出盲样OD的样品OD

250μl＝底物和酶的总体积

50μl＝酶溶液的体积

D＝样品的稀释

S＝校准曲线的斜率(OD/(μmol/mL))

10＝酶化的反应时间(分钟(min))

NALPE-P测定：

NALPE磷脂酶活性(NALPE-U)可以使用以下测定来确定：底物：将1.68％1-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-亚油酰基(16:0-NALPE-N18:2)(Avanti 791759，Avanti极性脂质有限公司，美国)、6.25％TRITON^TM-X 100(Sigma X-100)和5mM CaCl₂溶解于0.05MHEPES缓冲液(pH 7)中。

测定程序：

该测定套装件由两种试剂组成

NEFA-HR(1)：

50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，其含有

0.53U/mL酰基-辅酶A合酶(ACS)

0.31mM辅酶A(CoA)

4.3mM腺苷5-三磷酸二钠盐(ATP)

1.5mM 4-氨基-安替比林(4-AA)

2.6U/mL抗坏血酸氧化酶(AOD)

0.062％叠氮化钠

NEFA-HR(2)：

2.4mM 3-甲基-N-乙基-N-(E-羟乙基)-苯胺(MEHA)

12U/mL酰基-辅酶A氧化酶(ACOD)

14U/mL过氧化物酶(POD)

基于由油酸制作的校准曲线来计算酶活性(μmol FFA/(min-mL))。将酶活性NALPE-U计算为在测定条件下产生的微摩尔脂肪酸/毫升体积酶样品/分钟。

OD＝取出盲样OD的样品OD

250μl＝底物和酶的总体积

50μl＝酶溶液的体积

D＝样品的稀释

S＝校准曲线的斜率(OD/(μmol/mL))

10＝酶化的反应时间(分钟(min))

用于确定对PC(磷脂酰胆碱)的磷脂酶活性和sn1和sn2位置特异性的测定

底物：将0.6％16:0-18:1PC 1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(Avanti850457，Avanti极性脂质有限公司，美国)、0.4％TRITON^TM-X 100(Sigma，X-100)和5mMCaCl₂溶解于0.05M HEPES缓冲液(pH 7)中。

测定程序：

将2mL底物在30℃下孵育并添加在0.05M HEPES缓冲液中的0.1ml酶稀释(其对应于在10分钟反应后消耗2％-10％底物的酶稀释)(磁力搅拌)。

添加40μL 4M HC1来终止反应并使游离脂肪酸质子化。添加1mL99％乙醇并在涡旋混合器上混合。添加含有0.5mg C17:0脂肪酸(十七烷酸)的5mL MTBE(甲基叔丁基醚)。将样品再次在涡旋混合器上混合5秒，并在旋转混合器(rotamixer)(Stuart Rotartor SB2)上以25rpm提取30分钟。将样品在1520g下离心10分钟。

将一个500mg胺(NH2)-Bond Elut SPE柱(安捷伦公司(Agilent))置于Bond Elut真空系统上。将所述柱用8mL石油醚调节。将来自提取的MTBE相施用到柱上并用以下洗脱：

1.馏分 8mL溶剂A：MTBE：2-丙醇(2:1)

2.馏分 8mL溶剂B：丙酮：甲酸(100:2)

将溶剂以大约0.25mL/min洗脱。

将收集的脂肪酸馏分(馏分2)蒸发至干，并通过GLC分析脂肪酸。基于内标脂肪酸C17:0，确定C16:0和C18:1脂肪酸的量。

将酶活性计算为在测定条件下产生的μmol脂肪酸/分钟。

其中

A＝％C16:0脂肪酸+％C18:1脂肪酸

2＝mL底物

1000000＝mol转化为μmol

D＝酶稀释因子

MW＝产生的C16:0和C18:1脂肪酸的平均分子量

10＝分钟反应时间

0.1＝添加到测定中的mL酶

将相对PLA1酶活性计算为：

将相对PLA2酶活性计算为：

将sn1/sn2特异性比呈现为：

Sn1/sn2特异性比＝相对PLA1活性/相对PLA2活性

用于确定对NAPE(N-酰基磷脂酰乙醇胺)的磷脂酶活性和sn1和sn2位置特异性的测定

底物：将0.79％16:0-18:2(PE-N18:2)NAPE棕榈酰基-2-亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-亚油酰基(Avanti 792003，Avanti极性脂质有限公司，美国)、0.4％TRITON^TM-X100(Sigma，X-100)和5mM CaCl₂溶解于0.05M HEPES缓冲液(pH 7)中。

测定程序：

将一个500mg胺(NH2)-Bond Elut SPE柱(安捷伦公司)置于Bond Elut真空系统上。将所述柱用8mL石油醚调节。将来自提取的MTBE相施用到柱上并用以下洗脱：

1.馏分 8mL溶剂A：MTBE：2-丙醇(2:1)

2.馏分 8mL溶剂B：丙酮：甲酸(100:2)

将溶剂以大约0.25mL/min洗脱。

将收集的脂肪酸馏分(馏分2)蒸发至干，并通过GLC分析脂肪酸。基于内标脂肪酸C17:0，确定C16:0和C18:2脂肪酸的量。

将酶活性计算为在测定条件下产生的μmol脂肪酸/分钟。

其中

A＝％C16:0脂肪酸+％C18:2脂肪酸

2＝mL底物

1000000＝mol转化为μmol

D＝酶稀释因子

MW＝产生的C16:0和C18:1脂肪酸的平均分子量

10＝分钟反应时间

0.1＝添加到测定中的mL酶

将相对PLA1酶活性计算为：

将相对PLA2酶活性计算为：

将sn1/sn2特异性比呈现为：

Sn1/sn2特异性比＝相对PLA1活性/相对PLA2活性

气相色谱法(GLC)：

通过GLC分析游离脂肪酸作为三甲基甲硅烷基衍生物(TMS)。

仪器

·Perkin Elmer Clarus 600毛细管气相色谱仪，其配备有WCOT熔合硅胶柱12.5mx 0.25mm ID x 0.1μ膜厚度5％苯基-甲基-硅酮(来自Chrompack的CP Sil 8CB)。

·载气：氦。

·注射器：PSSI冷分割注射(初始温度90℃，加热至395℃)，体积1.0μl

·检测器FID：395℃

样品制备：

将蒸发的样品溶解于1.5ml庚烷:吡啶(2:1)中。将500μl样品溶液转移到弯曲小瓶中，添加100μl MSTFA(N-甲基-N-三甲基甲硅烷基-三氟甲酰胺)并在60℃下反应15分钟。

烘焙应用

硬皮面包卷烘焙设置

在Diosna螺旋混合器上揉捏。根据分析，面粉吸水率为：400BU-2％

程序

将所有配料混合在一个碗中，慢速添加水1分钟，并缓慢揉捏2分钟，并

快速揉捏6.5分钟。面团温度必须接近26℃。将1350g面团称量并手工模制成圆形。将面团在30℃下放置在加热箱中10分钟。

将面团用“GLIMIK^TM搓圆机”(根据机器上的表格进行设置)模制成30个面团球。

将面团在34℃、85％RH下醒发45分钟，并在200℃/2l蒸汽+5分钟风门打开(MIWE烤箱程序1)下烘焙13分钟。烘焙后，在环境温度下将面包卷冷却25分钟，然后称重并测量体积。

由本领域技术人员评估面团和面包的特征

海绵酵头和面团的烘焙设置

在Hobart混合器(Hobart mixer)上揉捏。

程序

海绵酵头：将所有配料以第一速度1分钟-以第二速度3分钟混合在一个碗中。海绵酵头温度必须接近25.5℃。在未加盖的碗中于30℃、85％RH下发酵海绵酵头3小时。

面团：将海绵酵头和所有剩余配料(除盐之外)以低速混合2分钟，再以中速混合3分钟(使用冰水)。添加盐并以中速混合3分钟。称量450g面团块并模制(称量不足-正常称量550g面团)。将面团在环境温度下放置10分钟。在具有以下设置的Benier MS500上模制：

前端宽度为330，后端宽度为290

将面团放入油脂罐中，并在43℃、95％RH下醒发70分钟(延长醒发-正常醒发60min)。将含面团的罐从6.5cm高的地方摔落到桌子上两次，以使一半的面包震动。在200℃下烘焙26分钟(MIWE烤箱程序4)。从罐中取出面包并冷却70分钟，然后称重和测量体积。由本领域技术人员评估面团和面包的特征

面团脂质的提取。

将完全醒发的面团样品冷冻并冻干。将干面团磨碎并筛分。将1.5g磨碎、筛分的样品与1.5g载体(硅藻土，赛默科技公司(Thermo Scientific)，P/N:60-033854)混合，并转移至ASE 10ml样品管中。使用Dionex ASE350(赛默科技公司)在40℃下进行提取，其中将水饱和的丁醇作为溶剂且静态运行时间为10分钟。提取后，在60℃和1000rpm下使用Scan Speed40(Scanvac，Labogene公司(Labogene APS))蒸发溶剂。将干燥的脂质溶解于3.75ml庚烷:异丙醇(3:2)中。

从面团提取的磷脂的HPLC分析：

使用带电荷的气溶胶检测器通过液相色谱法分析面团脂质样品。柱为正相柱(DIOL)，并且流动相为梯度A：丙酮/甲醇96/4(添加1mM甲酸铵)和梯度B：丙酮/甲醇/H₂O60/34/6(添加1mM甲酸铵)。

NALPE被用作定量标准。

仪器：

Dionex Ultimate 3000UHPLC，赛默科技公司

VANQOISH检测器，赛默科技公司

柱：Fortis HILIC Diol，1.7μm，50x 2.1mm

色谱：

时间(min)	流动相A	流动相B
			0	100％	0％
20	0％	100％
			30	0％	100％

柱温度为30℃，并且注射体积为4μL。

样品制备：

如“面团脂质的提取”中所述从面团中提取脂质，并在注入前通过0.45μM过滤器进行过滤。

计算：

使用Cromeleon软件对色谱图进行整合，并基于NALPE标准曲线计算NAPE、NALPE和NAGPE的摩尔浓度。

结果呈现：

通过首先将各组分的各自摩尔水平标准化为所有面团中的“平均总摩尔脂质(NAPE+NALPE+NAGPE)”来获得NAPE、NALPE和NAGPE的相应脂质水平。随后，呈现相对于阴性对照(未添加酶)中NAPE水平的相应脂质水平。因此，NAPE起始(阴性对照)于1。NALPE和NAGPE呈现为相对于NAPE起始水平所生成的水平。

化学结构

在下面的结构中，R1、R2和R3是C12-C24烃类。所述C12-24烃类是饱和的或不饱和的。R1、R2和R3可以是相同或不同的烃类。

PC

LPC

或

NAPE

NALPE

或

应记住的是，以下描述的一个或多个实施例仅通过举例的方式呈现，并且不应被解释为将本发明的概念限制于任何具体的酶。

实例

实例1-CRC08310-ThaPla1

哈茨木霉磷脂酶ThaPla1(CRC08310)的克隆

在哈茨木霉中鉴定出推定的磷脂酶基因(命名为CRC08310)，所述磷脂酶基因编码如下蛋白质，所述蛋白质与可从NCBI数据库(NCBI登录号：KKO98756.1)获得的序列具有100％同源性，如从BLAST搜索确定的(Altschul等人,J Mol Biol[分子生物学杂志],215:403-410,1990)。全长CRC08310的密码子优化的合成核酸序列在SEQ ID NO:19中提供。由全长CRC08310基因编码的相应蛋白质在SEQ ID NO:1中示出。在N-末端，蛋白质具有如通过SignalP 4.0版本(Nordahl Petersen等人(2011)Nature Methods[自然方法],8:785-786)预测的长度为16个氨基酸的信号肽。信号序列的存在表明CRC08310是分泌的酶。CRC08310的预测的、成熟蛋白质序列在SEQ ID NO:2中示出。

实例2-CRC08310的表达

合成编码全长CRC08310蛋白质(SEQ ID NO:19)的密码子优化的合成DNA序列，并将其插入到里氏木霉表达载体pGXT(与公开的PCT申请WO 2015/017256中描述的pTTTpyr2载体相同，其通过引用并入本文)中，得到质粒pGXT-CRC08310。在pGXT载体中，构巢曲霉pyrG基因被里氏木霉pyr2基因替代。构巢曲霉amdS和pyr2选择性标记赋予乙酰胺作为唯一氮源的转化体的生长，并且里氏木霉端粒区域允许在真菌细胞中维持非染色体质粒。pGXT-CRC08310含有里氏木霉cbhI衍生的启动子(cbhI)和cbhI终止子区域，这允许目的基因的强烈诱导型表达。

然后使用原生质体转化(Te’o等人(2002)J.Microbiol.Methods[微生物学方法期刊]51:393-99)将pGXT-CRC08310质粒转化到适合的里氏木霉菌株中(在公开的PCT申请WO05/001036中描述的方法)。在含有乙酰胺作为唯一氮源的固体培养基上选择转化体(乙酰胺0.6g/L；氯化铯1.68g/L；葡萄糖20g/L；磷酸二氢钾15g/L；七水硫酸镁0.6g/L；二水合氯化钙0.6g/L；硫酸铁(II)5mg/L；硫酸锌1.4mg/L；氯化钴(II)1mg/L；硫酸锰(II)1.6mg/L；琼脂20g/L；pH 4.25)。约1周内出现转化的菌落。在乙酰胺平板上生长后，挑取转化体并分别转移到乙酰胺琼脂平板上。在乙酰胺平板上生长5天后，将表现出稳定形态的转化体接种到96孔微量滴定板中的200μL葡萄糖/槐糖确定成分培养基中。将微量滴定板在氧气生长室中于28℃孵育5天。将来自这些培养物的上清液用于通过SDS-PAGE分析来确认蛋白质表达。选择具有最高蛋白质表达的稳定菌株，并在250-mL摇瓶中用葡萄糖/槐糖确定成分培养基对其进行发酵。

实例3-CRC08316–PfiPla1

无花果拟盘多毛孢W106-1磷脂酶PfiPla1(CRC08316)的克隆

在无花果拟盘多毛孢W 106-1中鉴定出推定的磷脂酶基因(命名为CRC08316)，所述磷脂酶基因编码如下蛋白质，所述蛋白质与可从NCBI数据库(NCBI登录号：ETS81250.1)获得的序列具有100％同源性，如从BLAST搜索确定的(Altschul等人,J Mol Biol[分子生物学杂志],215:403-410,1990)。全长CRC08316的密码子优化的合成核酸序列在SEQ IDNO:20中提供。由全长CRC08316基因编码的相应蛋白质在SEQ ID NO:3中示出。在N-末端，蛋白质具有如通过SignalP 4.0版本(Nordahl Petersen等人(2011)Nature Methods[自然方法],8:785-786)预测的长度为18个氨基酸的信号肽。信号序列的存在表明CRC08316是分泌的酶。CRC08316的预测的、成熟蛋白质序列在SEQ ID NO:4中示出。

实例4-CRC08316的表达

合成编码全长CRC08316蛋白质(SEQ ID NO:20)的密码子优化的合成DNA序列，并将其插入到里氏木霉表达载体pGXT(与公开的PCT申请WO 2015/017256中描述的pTTTpyr2载体相同，其通过引用并入本文)中，得到质粒pGXT-CRC08316。在pGXT载体中，构巢曲霉pyrG基因被里氏木霉pyr2基因替代。构巢曲霉amdS和pyr2选择性标记赋予乙酰胺作为唯一氮源的转化体的生长，并且里氏木霉端粒区域允许在真菌细胞中维持非染色体质粒。pGXT-CRC08316含有里氏木霉cbhI衍生的启动子(cbhI)和cbhI终止子区域，这允许目的基因的强烈诱导型表达。然后使用原生质体转化(Te’o等人(2002)J.Microbiol.Methods[微生物学方法期刊]51:393-99)将pGXT-CRC08316质粒转化到适合的里氏木霉菌株中(在公开的PCT申请WO 05/001036中描述的方法)。在含有乙酰胺作为唯一氮源的固体培养基上选择转化体(乙酰胺0.6g/L；氯化铯1.68g/L；葡萄糖20g/L；磷酸二氢钾15g/L；七水硫酸镁0.6g/L；二水合氯化钙0.6g/L；硫酸铁(II)5mg/L；硫酸锌1.4mg/L；氯化钴(II)1mg/L；硫酸锰(II)1.6mg/L；琼脂20g/L；pH 4.25)。约1周内出现转化的菌落。在乙酰胺平板上生长后，挑取转化体并分别转移到乙酰胺琼脂平板上。在乙酰胺平板上生长5天后，将表现出稳定形态的转化体接种到96孔微量滴定板中的200μL葡萄糖/槐糖确定成分培养基中。将微量滴定板在氧气生长室中于28℃孵育5天。将来自这些培养物的上清液用于通过SDS-PAGE分析来确认蛋白质表达。选择具有最高蛋白质表达的稳定菌株，并在250-mL摇瓶中用葡萄糖/槐糖确定成分培养基对其进行发酵。

使用VivaFlow 200超滤设备(赛多利斯斯泰迪生物技术公司(SartoriusStedim))将粗培养液浓缩至约80mL。然后将硫酸铵添加到浓缩的溶液中至终浓度为1M。过滤后，将所得可溶性级分施加到用含有20mM乙酸钠(pH 5.0)和1M硫酸铵的加载缓冲液预平衡的60mL Phenyl-FF琼脂糖柱上。用20mM乙酸钠(pH 5.0)和0.5-0.3M硫酸铵的梯度从柱洗脱靶蛋白。合并含有活性靶蛋白的级分，浓缩，并且随后加载到用20mM Tris缓冲液(pH8.0)预平衡的HiLoad Q_HP琼脂糖柱上。用20mM Tris缓冲液(pH 8.0)和0-0.4M的NaCl梯度从柱洗脱靶蛋白。然后合并含有活性靶蛋白的级分，并经由10K Amicon Ultra装置浓缩，并且在-20℃下在20mM Tris缓冲液(pH 8.0)和40％甘油中储存直至使用。

实例5-CRC08319–MguPla1

贵州绿僵菌ARSEF 977磷脂酶MguPla1(CRC08319)的克隆

在贵州绿僵菌ARSEF 977中鉴定出推定的磷脂酶基因(命名为CRC08319)，所述磷脂酶基因编码如下蛋白质，所述蛋白质与可从NCBI数据库(NCBI登录号：KID92477.1)获得的序列具有100％同源性，如从BLAST搜索确定的(Altschul等人,J Mol Biol[分子生物学杂志],215:403-410,1990)。全长CRC08319的密码子优化的合成核酸序列在SEQ ID NO:21中提供。由全长CRC08319基因编码的相应蛋白质在SEQ ID NO:5中示出。在N-末端，蛋白质具有如通过SignalP 4.0版本(Nordahl Petersen等人(2011)Nature Methods[自然方法],8:785-786)预测的长度为16个氨基酸的信号肽。信号序列的存在表明CRC08319是分泌的酶。CRC08319的预测的、成熟蛋白质序列在SEQ ID NO:6中示出。

实例6-CRC08319的表达

合成编码全长CRC08319蛋白质(SEQ ID NO:21)的密码子优化的合成DNA序列，并将其插入到里氏木霉表达载体pGXT(与公开的PCT申请WO 2015/017256中描述的pTTTpyr2载体相同，其通过引用并入本文)中，得到质粒pGXT-CRC08319。在pGXT载体中，构巢曲霉pyrG基因被里氏木霉pyr2基因替代。构巢曲霉amdS和pyr2选择性标记赋予乙酰胺作为唯一氮源的转化体的生长，并且里氏木霉端粒区域允许在真菌细胞中维持非染色体质粒。pGXT-CRC08319含有里氏木霉cbhI衍生的启动子(cbhI)和cbhI终止子区域，这允许目的基因的强烈诱导型表达。

然后使用原生质体转化(Te’o等人(2002)J.Microbiol.Methods[微生物学方法期刊]51:393-99)将pGXT-CRC08319质粒转化到适合的里氏木霉菌株中(在公开的PCT申请WO05/001036中描述的方法)。在含有乙酰胺作为唯一氮源的固体培养基上选择转化体(乙酰胺0.6g/L；氯化铯1.68g/L；葡萄糖20g/L；磷酸二氢钾15g/L；七水硫酸镁0.6g/L；二水合氯化钙0.6g/L；硫酸铁(II)5mg/L；硫酸锌1.4mg/L；氯化钴(II)1mg/L；硫酸锰(II)1.6mg/L；琼脂20g/L；pH 4.25)。约1周内出现转化的菌落。在乙酰胺平板上生长后，挑取转化体并分别转移到乙酰胺琼脂平板上。在乙酰胺平板上生长5天后，将表现出稳定形态的转化体接种到96孔微量滴定板中的200μL葡萄糖/槐糖确定成分培养基中。将微量滴定板在氧气生长室中于28℃孵育5天。将来自这些培养物的上清液用于通过SDS-PAGE分析来确认蛋白质表达。选择具有最高蛋白质表达的稳定菌株，并在250-mL摇瓶中用葡萄糖/槐糖确定成分培养基对其进行发酵。

使用VivaFlow 200超滤设备(赛多利斯斯泰迪生物技术公司)将粗培养液浓缩至约80mL。然后将硫酸铵添加到浓缩的溶液中至终浓度为1M。过滤后，将所得可溶性级分施加到用含有20mM磷酸钠(pH 7.0)和1M硫酸铵的加载缓冲液预平衡的60mL Phenyl-FF琼脂糖柱上。用20mM磷酸钠(pH 7.0)和0.25M硫酸铵从柱洗脱靶蛋白。合并含有活性靶蛋白的级分，浓缩，并且随后加载到用20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)(补充有额外的0.15M NaCl和10％甘油)预平衡的Superdex 75凝胶过滤柱上。然后合并含有活性靶蛋白的级分，并经由10KAmicon Ultra装置浓缩，并且在-20℃下在补充有0.15M NaCl和40％甘油的20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)中储存直至使用。

实例7-CRC08405–DamPla1

葡萄间座壳磷脂酶DamPla1(CRC08405)的克隆

在葡萄间座壳中鉴定出推定的磷脂酶基因(命名为CRC08405)，所述磷脂酶基因编码如下蛋白质，所述蛋白质与可从NCBI数据库(NCBI登录号：KKY36548.1)获得的序列具有100％同源性，如从BLAST搜索确定的(Altschul等人,J Mol Biol[分子生物学杂志],215:403-410,1990)。全长CRC08405的密码子优化的合成核酸序列在SEQ ID NO:22中提供。由全长CRC08405基因编码的相应蛋白质在SEQ ID NO:7中示出。在N-末端，蛋白质具有如通过SignalP 4.0版本(Nordahl Petersen等人(2011)Nature Methods[自然方法],8:785-786)预测的长度为18个氨基酸的信号肽。信号序列的存在表明CRC08405是分泌的酶。CRC08405的预测的、成熟蛋白质序列在SEQ ID NO:8中示出。

实例8-CRC08405的表达

合成编码全长CRC08405蛋白质(SEQ ID NO:22)的密码子优化的合成DNA序列，并将其插入到里氏木霉表达载体pGXT(与公开的PCT申请WO 2015/017256中描述的pTTTpyr2载体相同，其通过引用并入本文)中，得到质粒pGXT-CRC08405。在pGXT载体中，构巢曲霉pyrG基因被里氏木霉pyr2基因替代。构巢曲霉amdS和pyr2选择性标记赋予乙酰胺作为唯一氮源的转化体的生长，并且里氏木霉端粒区域允许在真菌细胞中维持非染色体质粒。pGXT-CRC08405含有里氏木霉cbhI衍生的启动子(cbhI)和cbhI终止子区域，这允许目的基因的强烈诱导型表达。

然后使用原生质体转化(Te’o等人(2002)J.Microbiol.Methods[微生物学方法期刊]51:393-99)将pGXT-CRC08405质粒转化到适合的里氏木霉菌株中(在公开的PCT申请WO05/001036中描述的方法)。在含有乙酰胺作为唯一氮源的固体培养基上选择转化体(乙酰胺0.6g/L；氯化铯1.68g/L；葡萄糖20g/L；磷酸二氢钾15g/L；七水硫酸镁0.6g/L；二水合氯化钙0.6g/L；硫酸铁(II)5mg/L；硫酸锌1.4mg/L；氯化钴(II)1mg/L；硫酸锰(II)1.6mg/L；琼脂20g/L；pH 4.25)。约1周内出现转化的菌落。在乙酰胺平板上生长后，挑取转化体并分别转移到乙酰胺琼脂平板上。在乙酰胺平板上生长5天后，将表现出稳定形态的转化体接种到96孔微量滴定板中的200μL葡萄糖/槐糖确定成分培养基中。将微量滴定板在氧气生长室中于28℃孵育5天。将来自这些培养物的上清液用于通过SDS-PAGE分析来确认蛋白质表达。选择具有最高蛋白质表达的稳定菌株，并在250-mL摇瓶中用葡萄糖/槐糖确定成分培养基对其进行发酵。

使用VivaFlow 200超滤设备(赛多利斯斯泰迪生物技术公司)将粗培养液浓缩至约80mL。然后将硫酸铵添加到浓缩的溶液中至终浓度为1M。过滤后，将所得可溶性级分施加到用含有20mM磷酸钠(pH 7.0)和1M硫酸铵的加载缓冲液预平衡的60mL Phenyl-FF琼脂糖柱上。用20mM磷酸钠(pH 7.0)从柱洗脱靶蛋白。合并含有活性靶蛋白的级分，浓缩，并且随后加载到用20mM Tris缓冲液(pH 8.0)预平衡的HiPrep Q-XL琼脂糖柱上。用20mM Tris缓冲液(pH 8.0)和0-0.5M的NaCl梯度洗脱靶蛋白。然后合并含有活性靶蛋白的级分，并经由10K Amicon Ultra装置浓缩，并且在-20℃下在补充有0.15M NaCl和40％甘油的20mM Tris缓冲液(pH 8.0)中储存直至使用。

实例9-CRC08418-MorPla3

稻瘟病菌Y34磷脂酶MorPla3(CRC08418)的克隆

在稻瘟病菌Y34中鉴定出推定的磷脂酶基因(命名为CRC08418)，所述磷脂酶基因编码如下蛋白质，所述蛋白质与可从NCBI数据库(NCBI登录号：ELQ41978.1)获得的序列具有100％同源性，如从BLAST搜索确定的(Altschul等人,J Mol Biol[分子生物学杂志],215:403-410,1990)。全长CRC08418的密码子优化的合成核酸序列在SEQ ID NO:23中提供。由全长CRC08418基因编码的相应蛋白质在SEQ ID NO:9中示出。在N-末端，蛋白质具有如通过SignalP 4.0版本(Nordahl Petersen等人(2011)Nature Methods[自然方法],8:785-786)预测的长度为25个氨基酸的信号肽。信号序列的存在表明CRC08418是分泌的酶。CRC08418的预测的、成熟蛋白质序列在SEQ ID NO:10中示出。

实例10-CRC08418的表达

合成编码全长CRC08418蛋白质(SEQ ID NO:23)的密码子优化的合成DNA序列，并将其插入到里氏木霉表达载体pGXT(与公开的PCT申请WO 2015/017256中描述的pTTTpyr2载体相同，其通过引用并入本文)中，得到质粒pGXT-CRC0418。在pGXT载体中，构巢曲霉pyrG基因被里氏木霉pyr2基因替代。构巢曲霉amdS和pyr2选择性标记赋予乙酰胺作为唯一氮源的转化体的生长，并且里氏木霉端粒区域允许在真菌细胞中维持非染色体质粒。pGXT-CRC08418含有里氏木霉cbhI衍生的启动子(cbhI)和cbhI终止子区域，这允许目的基因的强烈诱导型表达。

然后使用原生质体转化(Te’o等人(2002)J.Microbiol.Methods[微生物学方法期刊]51:393-99)将pGXT-CRC08418质粒转化到适合的里氏木霉菌株中(在公开的PCT申请WO05/001036中描述的方法)。在含有乙酰胺作为唯一氮源的固体培养基上选择转化体(乙酰胺0.6g/L；氯化铯1.68g/L；葡萄糖20g/L；磷酸二氢钾15g/L；七水硫酸镁0.6g/L；二水合氯化钙0.6g/L；硫酸铁(II)5mg/L；硫酸锌1.4mg/L；氯化钴(II)1mg/L；硫酸锰(II)1.6mg/L；琼脂20g/L；pH 4.25)。约1周内出现转化的菌落。在乙酰胺平板上生长后，挑取转化体并分别转移到乙酰胺琼脂平板上。在乙酰胺平板上生长5天后，将表现出稳定形态的转化体接种到96孔微量滴定板中的200μL葡萄糖/槐糖确定成分培养基中。将微量滴定板在氧气生长室中于28℃孵育5天。将来自这些培养物的上清液用于通过SDS-PAGE分析来确认蛋白质表达。选择具有最高蛋白质表达的稳定菌株，并在250-mL摇瓶中用葡萄糖/槐糖确定成分培养基对其进行发酵。

使用VivaFlow 200超滤设备(赛多利斯斯泰迪生物技术公司)将粗培养液浓缩至约80mL。然后将硫酸铵添加到浓缩的溶液中至终浓度为0.8M。过滤后，将所得可溶性级分施加到用含有20mM磷酸钠(pH 7.0)和1M硫酸铵的加载缓冲液预平衡的60mL Phenyl-FF琼脂糖柱上。用20mM磷酸钠(pH 7.0)从柱洗脱靶蛋白。合并含有活性靶蛋白的级分，浓缩，并且随后加载到用20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)(含0.15M NaCl(pH 7.0))预平衡的Superdex 75凝胶过滤柱上。然后合并含有活性靶蛋白的级分，并经由10K Amicon Ultra装置浓缩，并且在-20℃下在含0.15M NaCl(pH 7.0)和40％甘油的20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)中储存直至使用。

实例11-CRC08826–NdiPla1

鲜红新丛赤壳菌磷脂酶NdiPla1(CRC08826)的克隆

在鲜红新丛赤壳菌中鉴定出推定的磷脂酶基因(命名为CRC08826)，所述磷脂酶基因编码如下蛋白质，所述蛋白质与可从NCBI数据库(NCBI登录号：KPM45012.1)获得的序列具有100％同源性，如从BLAST搜索确定的(Altschul等人,J Mol Biol[分子生物学杂志],215:403-410,1990)。全长CRC08826的密码子优化的合成核酸序列在SEQ ID NO:24中提供。由全长CRC08826基因编码的相应蛋白质在SEQ ID NO:11中示出。在N-末端，蛋白质具有如通过SignalP 4.0版本(Nordahl Petersen等人(2011)Nature Methods[自然方法],8:785-786)预测的长度为16个氨基酸的信号肽。信号序列的存在表明CRC08826是分泌的酶。CRC08826的预测的、成熟蛋白质序列在SEQ ID NO:12中示出。

实例12-CRC08826的表达

合成编码全长CRC08826蛋白质(SEQ ID NO:24)的密码子优化的合成DNA序列，并将其插入到里氏木霉表达载体pGXT(与公开的PCT申请WO 2015/017256中描述的pTTTpyr2载体相同，其通过引用并入本文)中，得到质粒pGXT-CRC08826。在pGXT载体中，构巢曲霉pyrG基因被里氏木霉pyr2基因替代。构巢曲霉amdS和pyr2选择性标记赋予乙酰胺作为唯一氮源的转化体的生长，并且里氏木霉端粒区域允许在真菌细胞中维持非染色体质粒。pGXT-CRC08826含有里氏木霉cbhI衍生的启动子(cbhI)和cbhI终止子区域，这允许目的基因的强烈诱导型表达。

然后使用原生质体转化(Te’o等人(2002)J.Microbiol.Methods[微生物学方法期刊]51:393-99)将pGXT-CRC08826质粒转化到适合的里氏木霉菌株中(在公开的PCT申请WO05/001036中描述的方法)。在含有乙酰胺作为唯一氮源的固体培养基上选择转化体(乙酰胺0.6g/L；氯化铯1.68g/L；葡萄糖20g/L；磷酸二氢钾15g/L；七水硫酸镁0.6g/L；二水合氯化钙0.6g/L；硫酸铁(II)5mg/L；硫酸锌1.4mg/L；氯化钴(II)1mg/L；硫酸锰(II)1.6mg/L；琼脂20g/L；pH 4.25)。约1周内出现转化的菌落。在乙酰胺平板上生长后，挑取转化体并分别转移到乙酰胺琼脂平板上。在乙酰胺平板上生长5天后，将表现出稳定形态的转化体接种到96孔微量滴定板中的200μL葡萄糖/槐糖确定成分培养基中。将微量滴定板在氧气生长室中于28℃孵育5天。将来自这些培养物的上清液用于通过SDS-PAGE分析来确认蛋白质表达。选择具有最高蛋白质表达的稳定菌株，并在250-mL摇瓶中用葡萄糖/槐糖确定成分培养基对其进行发酵。

使用VivaFlow 200超滤设备(赛多利斯斯泰迪生物技术公司)将粗培养液浓缩至约80mL。然后将硫酸铵添加到浓缩的溶液中至终浓度为1M。过滤后，将所得可溶性级分施加到用含有20mM磷酸钠(pH 5.0)和1M硫酸铵的加载缓冲液预平衡的HiPrep Phenyl FF 16/10柱上。用20mM磷酸钠(pH 5.0)和0.5-0M硫酸铵的梯度从柱洗脱靶蛋白。合并含有活性靶蛋白的级分，浓缩，并且随后加载到用20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)预平衡的HiPrep Q FF16/10柱上。用20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)和0-0.5M的NaCl梯度洗脱靶蛋白。然后合并含有活性靶蛋白的级分，浓缩，并且随后加载到用20mM乙酸钠(pH 5.0)和150mM NaCl预平衡的HiLoad 26/60 Superdex 75 Prep柱上。合并含有活性靶蛋白的级分，浓缩，并且加载到用含有20mM磷酸钠(pH 5.0)和1M硫酸铵的加载缓冲液预平衡的HiPrep Phenyl HP 16/10柱上。用20mM磷酸钠(pH 5.0)和0.75-0M硫酸铵的梯度洗脱靶蛋白。合并含有活性靶蛋白的级分，经由10K Amicon Ultra装置浓缩，并且在-20℃下在20mM磷酸钠(pH 5.0)和40％甘油中储存直至使用。

实例13-CRC08833–TgaPla1

盖姆斯木霉磷脂酶TgaPla1(CRC08833)的克隆

在盖姆斯木霉中鉴定出推定的磷脂酶基因(命名为CRC08833)，所述磷脂酶基因编码如下蛋白质，所述蛋白质与可从NCBI数据库(NCBI登录号：KUF04745.1)获得的序列具有100％同源性，如从BLAST搜索确定的(Altschul等人,J Mol Biol[分子生物学杂志],215:403-410,1990)。全长CRC08833的密码子优化的合成核酸序列在SEQ ID NO:25中提供。由全长CRC08833基因编码的相应蛋白质在SEQ ID NO:13中示出。在N-末端，蛋白质具有如通过SignalP 4.0版本(Nordahl Petersen等人(2011)Nature Methods[自然方法],8:785-786)预测的长度为16个氨基酸的信号肽。信号序列的存在表明CRC08833是分泌的酶。CRC08826的预测的、成熟蛋白质序列在SEQ ID NO:14中示出。

实例14-CRC08833的表达

合成编码全长CRC08833蛋白质(SEQ ID NO:25)的密码子优化的合成DNA序列，并将其插入到里氏木霉表达载体pGXT(与公开的PCT申请WO 2015/017256中描述的pTTTpyr2载体相同，其通过引用并入本文)中，得到质粒pGXT-CRC08833。在pGXT载体中，构巢曲霉pyrG基因被里氏木霉pyr2基因替代。构巢曲霉amdS和pyr2选择性标记赋予乙酰胺作为唯一氮源的转化体的生长，并且里氏木霉端粒区域允许在真菌细胞中维持非染色体质粒。pGXT-CRC08833含有里氏木霉cbhI衍生的启动子(cbhI)和cbhI终止子区域，这允许目的基因的强烈诱导型表达。

然后使用原生质体转化(Te’o等人(2002)J.Microbiol.Methods[微生物学方法期刊]51:393-99)将pGXT-CRC08833质粒转化到适合的里氏木霉菌株中(在公开的PCT申请WO05/001036中描述的方法)。在含有乙酰胺作为唯一氮源的固体培养基上选择转化体(乙酰胺0.6g/L；氯化铯1.68g/L；葡萄糖20g/L；磷酸二氢钾15g/L；七水硫酸镁0.6g/L；二水合氯化钙0.6g/L；硫酸铁(II)5mg/L；硫酸锌1.4mg/L；氯化钴(II)1mg/L；硫酸锰(II)1.6mg/L；琼脂20g/L；pH 4.25)。约1周内出现转化的菌落。在乙酰胺平板上生长后，挑取转化体并分别转移到乙酰胺琼脂平板上。在乙酰胺平板上生长5天后，将表现出稳定形态的转化体接种到96孔微量滴定板中的200μL葡萄糖/槐糖确定成分培养基中。将微量滴定板在氧气生长室中于28℃孵育5天。将来自这些培养物的上清液用于通过SDS-PAGE分析来确认蛋白质表达。选择具有最高蛋白质表达的稳定菌株，并在250-mL摇瓶中用葡萄糖/槐糖确定成分培养基对其进行发酵。

使用VivaFlow 200超滤设备(赛多利斯斯泰迪生物技术公司)将粗培养液浓缩至约80mL。然后将硫酸铵添加到浓缩的溶液中至终浓度为1M。过滤后，将所得可溶性级分施加到用含有20mM磷酸钠(pH 7.0)和1M硫酸铵的加载缓冲液预平衡的60mL Phenyl-FF琼脂糖柱上。用20mM磷酸钠(pH 7.0)和0.5M硫酸铵从柱洗脱靶蛋白。合并含有活性靶蛋白的级分，浓缩，并且随后加载到用20mM Tris缓冲液(pH 8.0)预平衡的HiLoad Q_XL琼脂糖柱上。用20mM Tris缓冲液(pH 8.0)和0-0.5M的NaCl梯度洗脱靶蛋白。然后合并含有活性靶蛋白的级分，并经由10K Amicon Ultra装置浓缩，并且在-20℃下在20mM Tris缓冲液(pH 8.0)和40％甘油中储存直至使用。

实例15-CRC08845–ManPla1

金龟子绿僵菌BRIP 53293磷脂酶ManPla1(CRC08845)的克隆

在金龟子绿僵菌BRIP 53293中鉴定出推定的磷脂酶基因(命名为CRC08845)，所述磷脂酶基因编码如下蛋白质，所述蛋白质与可从NCBI数据库(NCBI登录号：KJK84204.1)获得的序列具有100％同源性，如从BLAST搜索确定的(Altschul等人,J Mol Biol[分子生物学杂志],215:403-410,1990)。全长CRC08845的密码子优化的合成核酸序列在SEQ ID NO:26中提供。由全长CRC08845基因编码的相应蛋白质在SEQ ID NO:15中示出。在N-末端，蛋白质具有如通过SignalP 4.0版本(Nordahl Petersen等人(2011)Nature Methods[自然方法],8:785-786)预测的长度为17个氨基酸的信号肽。信号序列的存在表明CRC08845是分泌的酶。CRC08845的预测的、成熟蛋白质序列在SEQ ID NO:16中示出。

实例16-CRC08845的表达

合成编码全长CRC08845蛋白质(SEQ ID NO:26)的密码子优化的合成DNA序列，并将其插入到里氏木霉表达载体pGXT(与公开的PCT申请WO 2015/017256中描述的pTTTpyr2载体相同，其通过引用并入本文)中，得到质粒pGXT-CRC08845。在pGXT载体中，构巢曲霉pyrG基因被里氏木霉pyr2基因替代。构巢曲霉amdS和pyr2选择性标记赋予乙酰胺作为唯一氮源的转化体的生长，并且里氏木霉端粒区域允许在真菌细胞中维持非染色体质粒。pGXT-CRC08845含有里氏木霉cbhI衍生的启动子(cbhI)和cbhI终止子区域，这允许目的基因的强烈诱导型表达。

然后使用原生质体转化(Te’o等人(2002)J.Microbiol.Methods[微生物学方法期刊]51:393-99)将pGXT-CRC08845质粒转化到适合的里氏木霉菌株中(在公开的PCT申请WO05/001036中描述的方法)。在含有乙酰胺作为唯一氮源的固体培养基上选择转化体(乙酰胺0.6g/L；氯化铯1.68g/L；葡萄糖20g/L；磷酸二氢钾15g/L；七水硫酸镁0.6g/L；二水合氯化钙0.6g/L；硫酸铁(II)5mg/L；硫酸锌1.4mg/L；氯化钴(II)1mg/L；硫酸锰(II)1.6mg/L；琼脂20g/L；pH 4.25)。约1周内出现转化的菌落。在乙酰胺平板上生长后，挑取转化体并分别转移到乙酰胺琼脂平板上。在乙酰胺平板上生长5天后，将表现出稳定形态的转化体接种到96孔微量滴定板中的200μL葡萄糖/槐糖确定成分培养基中。将微量滴定板在氧气生长室中于28℃孵育5天。将来自这些培养物的上清液用于通过SDS-PAGE分析来确认蛋白质表达。选择具有最高蛋白质表达的稳定菌株，并在250-mL摇瓶中用葡萄糖/槐糖确定成分培养基对其进行发酵。

使用VivaFlow 200超滤设备(赛多利斯斯泰迪生物技术公司)将粗培养液浓缩至约80mL。然后将硫酸铵添加到浓缩的溶液中至终浓度为1M。过滤后，将所得可溶性级分施加到用含有20mM乙酸钠(pH 5.0)和1M硫酸铵的加载缓冲液预平衡的Butyl FF柱上。用20mM乙酸钠(pH 5.0)和0.3-0M硫酸铵的梯度从柱洗脱靶蛋白。合并含有活性靶蛋白的级分，浓缩，并且随后加载到用20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)预平衡的Q HP柱上。用20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)和0-0.5M的NaCl梯度洗脱靶蛋白。然后合并含有活性靶蛋白的级分，浓缩，并且随后加载到用20mM Tris缓冲液(pH 8.0)预平衡的Q HP柱上。用20mM Tris缓冲液(pH 8.0)和0-0.5M的NaCl梯度洗脱靶蛋白。然后合并含有活性靶蛋白的级分，并经由10K AmiconUltra装置浓缩，并且在-20℃下在20mM Tris缓冲液(pH 8.0)(含0.15M NaCl和40％甘油)中储存直至使用。

实例17.相对于Powerbake 4080和Lipopan F的本发明的磷脂酶的表征

根据“测定和方法”中呈现的活性方法，通过使用不同的脂质底物确定比活性来进行酶表征。Powerbake 4080是杜邦公司的商业产品。Powerbake 4080在sn1位置处作用于极性脂质。Powerbake 4080的活性酶组分由美国专利号8,012,732(其通过引用特此并入)的SEQ ID NO:6示出(本文中也以SEQ ID NO:17示出)。已知该酶具有半乳糖脂酶和磷脂酶活性。Lipopan F是诺维信公司(Novozymes)的商业产品。Lipopan F中的活性酶在sn1位置处作用于极性脂质，并且在EP0869167B(其通过引用特此并入)的SEQ ID NO:2中(本文中也以SEQ ID NO:18示出)。还已知该酶具有半乳糖脂酶活性。

使用磷脂酰胆碱底物(PC-P测定)、溶血磷脂酰胆碱底物(LPC-P测定)、N-酰基磷脂酰乙醇胺底物(NAPE-P测定)和溶血-N-酰基磷脂酰乙醇胆碱底物(NALPE-P测定)确定比活性。活性相对于蛋白质浓度呈现，这表示使用不同底物的各种酶的比活性-参见表2。

表2.酶的比活性(活性单位/mg酶蛋白)

从表2可以看出，所有酶(除Powerbake 4080和Lipopan F之外)对LPC和NALPE底物的比活性都非常低。表3中呈现了LPC与PC的比率以及NALPE与NAPE活性的比率。

CRC0	SEQ ID NO:	LPC-U/PC-U	NALPE-U/NAPE-U
				8319	6	0.00072	0.00047
8405	8	0.00054	0.00070
				8418	10	0.00020	0.00018
8826	12	0.00059	0.00016
				8845	16	0.00199	0.00040
8316	4	0.00040	0.00126
				8310	2	0.00056	0.00021
8833	14	0.00174	0.00151
				Powerbake 4080	17	0.02009	0.19961
Lipopan F	18	0.02099	0.13745

表3.LPC与PC的比活性比率(LPC-U/PC-U)以及NALPE与NAPE的比活性比率(NALPE-U/NAPE-U)。更具体地，LPC-U/PC-U＝(LPC-U/mg蛋白质)/(PC-U/mg蛋白质)，且NALPE-U/NAPE-U＝(NALPE-U/mg蛋白质)/(NAPE-U/mg蛋白质)。

从表3清楚可见，相对于磷脂底物，所测试的候选物对溶血磷脂底物的活性显著低于现有的市售酶产品如Powerbake 4080和Lipopan F。

出人意料地，所评估的候选物代表了一组新的磷脂酶-“非溶血磷脂酶”-其特征是不具有或具有极低的溶血磷脂酶活性。

当前市售产品显示LPC-U/PC-U或NALPE-U/NAPE-U的比率分别高于0.02和0.13，然而相反地，“非溶血磷脂酶”显示比率分别低于0.002和0.0016。因此，“非溶血磷脂酶”的比率分别比当前市售产品低10倍和80倍。

“非溶血磷脂酶”活性的这一特征为在含脂质食品基质中生成乳化组分的更强大的系统提供了机会。“非溶血磷脂酶”通过消除超剂量的风险而提供了更强大的系统，正如当前市售的酶一样。“非溶血磷脂酶”能够生成乳化组分，且不会有所生成的乳化组分(溶血磷脂如LPC或NALPE)降解的风险。因此，消除了当前市售的酶观察到的“翻滚效应”(其中不仅生成了溶血磷脂组分，而且进一步水解/降解了所述溶血磷脂组分)，从而为总体上更高水平的乳化组分提供了潜力。

实例18.磷脂酶位置特异性的表征。

通过确定从特定设计的PC和NAPE底物中释放的游离脂肪酸(FFA)来表征酶的位置特异性。通过如“测定和方法”下的“用于确定对PC(磷脂酰胆碱)的磷脂酶活性和sn1和sn2位置特异性的测定”以及“用于确定对NAPE(N-酰基磷脂酰乙醇胺)的磷脂酶活性和sn1和sn2位置特异性的测定”之后，在“气相色谱法(GLC)”中呈现的GLC分析来进行FFA测定。

通过GLC分析测定游离脂肪酸(FFA)的释放，来确定特异性。基于内标(脂肪酸C17:0)，分别通过PC测定法确定C16:0和C18:1脂肪酸的量，并且通过NAPE测定法确定C16:0和C18:2脂肪酸的量。位置特异性表示为相对PLA1活性的％和相对PLA2活性的％。请参考表4和表4a，分别使用PC和NAPE位置特异性测定法对不同候选物进行特异性鉴定。

表4.如通过“用于确定对PC(磷脂酰胆碱)的磷脂酶活性和sn1和sn2位置特异性的测定”和sn1/sn2比率的呈现确定的磷脂酶的位置特异性。

表4a.如通过“用于确定对NAPE(N-酰基磷脂酰乙醇胺)的磷脂酶活性和sn1和sn2位置特异性的测定”和sn1/sn2比率的呈现确定的磷脂酶的位置特异性。

实例19.“非溶血磷脂酶”相比市售磷脂酶Lipopan F的烘焙实验测试应用效果和面团脂质特征

在该实验中，对当前市售的磷脂酶产品Lipopan F在硬皮面包卷实验设置中进行了测试，以显示通过增加剂量，面团基质的应用性能和相关脂质特征。另外，对比测试了“非溶血磷脂酶”CRC08319的应用性能和面团脂质特征。

根据上文“测定和方法”部分中对“硬皮面包卷”的描述，进行了硬皮面包卷烘焙。

分别在表5(A和B)、图1(A和B)和错误！找不到参考源(A和B)中呈现了应用试验的实验设置和烘焙评估的结果以及面团脂质特征。

表5A和表5B.在硬皮面包卷烘焙中酶剂量-应答测试的实验设置。

所有剂量均以相对于Lipopan F的最佳剂量(基于mg蛋白质/kg面粉的相对)的剂量呈现。Lipopan F的最佳剂量定义为在所呈现的烘焙设置中给出最高比容的剂量。最佳Lipopan F剂量用“1”表示，阴性对照用“0”表示。

例如，Lipopan F剂量响应试验2(表5A)：Lipopan F剂量为0.10反映该试验中的Lipopan F剂量为“0.10x Lipopan F的最佳剂量”-或换言之，该试验中的Lipopan F剂量为显示Lipopan F的最佳剂量的试验(显示最高比容的试验(试验4))中所用剂量的10％。

表5A：硬皮面包卷烘焙-Lipopan F剂量-响应

表5B：硬皮面包卷烘焙-CRC08319剂量-响应

图1A描绘了呈现为Lipopan F的最佳剂量的函数的硬皮面包卷比容(ccm/g)。

Lipopan F的最佳剂量定义为在所呈现的烘焙设置中给出最高比容的Lipopan F剂量-并且最佳Lipopan F剂量表示为“1”。呈现的所有其他剂量均相对于最佳Lipopan剂量(基于mg蛋白质/kg面粉)。0表示阴性对照。Lipopan F的剂量响应：0表示阴性对照(未添加酶)，并且“1”表示最佳Lipopan F剂量(＝最高比容)。

图1B描绘了‘CRC08319-非溶血磷脂酶’的剂量响应。0表示阴性对照(未添加酶)，并且CRC08319剂量以相对于最佳Lipopan F剂量(基于mg蛋白质/kg面粉的相对剂量)呈现。

Lipopan F显示出以‘1倍最佳剂量’表示的最佳剂量。随着剂量的增加，Lipopan F显示出以比容降低表示的超剂量。相反，CRC08319的剂量增加显示出比容持续增加或趋于平稳。

将完全发酵的面团冷冻、冻干，并将干面团中的脂质用水饱和的丁醇提取，并根据“测定和方法”中描述的程序通过HPLC进行分析。结果显示在错误！找不到参考源中。

脂质谱支持比容的应用效果。当前市售产品-Lipopan F-显示出与比容降低比对时，将NAPE水解成NALPE，并且在更高剂量下，将NALPE进一步水解成NAGPE。随着80％的NAPE水解(NAPE降低至起始水平的20％(起始水平＝0倍最佳剂量(阴性对照))，Lipopan F显示出约60％的NALPE生成。该80％的NAPE水解和60％的NALPE生成与Lipopan F的最佳剂量(最高比容＝1x最佳剂量)相关。Lipopan F显示出比容与NALPE水平峰值之间的比对。对于Lipopan F，显而易见的是，与NAGPE的形成比对时，在更高的测试剂量(高于最佳剂量(1)的剂量)下NALPE水平峰值为约60％，随后是NALPE的降低。在最高剂量的Lipopan F中观察到最高水平的NAGPE。

相反，“非溶血磷脂酶”-CRC08319-显示出NAPE向NALPE的完全转化。在80％的NAPE水解(NAPE降低至起始水平的20％)下，NALPE的水平为80％。随着NAPE的进一步水解，‘非溶血磷脂酶’显示出NALPE水平(其也与比容进行比对)持续增加或趋于平稳。

随着NAPE的完全水解(水解>90％-95％)，反应平衡开始显示出NALPE水平持续增加或趋于平稳。

即使当在呈现的烘焙设置中“非溶血磷脂酶”的剂量为Lipopan F体积的20x最佳剂量时，最佳Lipopan F剂量也表示为“1”。呈现的所有其他剂量均相对于最佳Lipopan剂量(基于mg蛋白质/kg面粉)。0表示阴性对照。Lipopan F的剂量响应：0表示阴性对照(未添加酶)，并且“1”表示最佳Lipopan F剂量(＝最高比容)。

即使当‘非溶血磷脂酶’的剂量为Lipopan F的20x最佳剂量时，这相当于‘非溶血磷脂酶’剂量的4-6倍，导致完全NAPE水解(约10％的残余NAPE)，NAGPE水平仍低于5％。

实例20.非溶血磷脂酶在含脂质食品基质中的应用

非溶血磷脂酶可例如用于蛋黄和全蛋、加工肉、植物油的脱胶、奶酪等奶制品、以及烘焙产品如面包和烘焙产品如烘焙甜品(包括蛋糕和饼干)。

含蛋黄产品

众所周知，蛋黄由于其乳化特性而用于食品工业中。蛋黄中大约30％的脂质是磷脂，这有助于蛋黄的乳化特性。在许多食品(包括蛋黄酱、调味酱、调味品和蛋糕)中均利用了蛋黄的乳化特性。然而，对于某些食品应用来说，蛋黄的乳化特性不足以获得均质产品而无需分离。例如，在蛋黄酱中，在高温下对产品进行巴氏消毒会导致产品分离。非溶血磷脂酶可用于将蛋黄(和含蛋黄的食物产品)中的磷脂修饰为溶血磷脂。使用酶修饰的蛋黄可以避免高温巴氏消毒法中的产品分离。

加工肉制品

非溶血磷脂酶可用于加工肉制品。非溶血磷脂酶将有助于改善加工肉制品的乳化作用，并有助于提高稠度并减少烹饪损失。添加到加工肉中的非溶血磷脂酶可将肉类磷脂转化为溶血磷脂。由于溶血磷脂的乳化特性，该成分通过改善肉中脂肪的乳化作用而有助于提高稠度并减少烹饪引起的损失。

植物油

粗制植物油(如大豆油)含有1％-2％的磷脂。将磷脂在精炼过程中从油中去除，以改善油的质量并防止在油中沉淀。在油精炼过程中，通过所谓的脱胶过程来去除磷脂。可以通过化学或酶促方法进行脱胶。在脱胶过程中，“非溶血磷脂酶”可被用于将磷脂转化为溶血磷脂，所述溶血磷脂的水溶性更高并且可通过用水洗涤从油中去除。与需要苛刻的碱性或酸性条件的化学脱胶相比，磷脂的酶促水解是一种较温和的过程。使用非溶血磷脂酶进行脱胶将减少流出物。

奶制品

非溶血磷脂酶可用于奶制品。非溶血磷脂酶将有助于奶酪生产过程中的产量增加。添加到奶中的非溶血磷脂酶可将奶类磷脂转化为溶血磷脂。由于溶血磷脂的乳化特性，通过截留奶酪凝乳中更多的脂质将有助于增加奶酪的产量。

烘焙甜品

鸡蛋是大多数蛋糕产品的重要部分。非溶血磷脂酶可用于通过产生溶血磷脂来修饰鸡蛋中的磷脂，从而有助于在蛋糕调制过程中改善乳化作用，并提供更柔软且更细腻的面包心。非溶血磷脂酶也可以直接用于蛋糕面团中以修饰面粉的磷脂。

实例21.补充底物-卵磷脂(SOLEC F)存在下的“非溶血磷脂酶”的烘焙效果

在该实例中，在处于SOLEC F形式的补充底物存在和不存在下，测试了“非溶血磷脂酶”CRC08319和Powerbake 4080的组合。SOLEC F是杜邦公司的商业产品。SOELC F是易于处理的脱油大豆卵磷脂。“非溶血磷脂酶”CRC08319和Powerbake 4080显示出在补充底物存在下，受震动的体积和未受震动的体积两者均有明显改善。在不存在CRC08319和Powerbake4080的情况下，补充底物的效果非常有限，并且就震动稳定性而言甚至可能为消极的。根据上文“测定和方法”部分中呈现的“海绵酵头和面团”的描述进行了海绵酵头和面团烘焙试验。

表6和图3分别呈现了应用试验的实验设置和来自烘焙评估的结果。

CRC08319的剂量以相对于Lipopan F的最佳剂量的剂量(基于mg蛋白质/kg面粉的相对)呈现，如实例19中所呈现。Lipopan F的最佳剂量定义为在实例19中呈现的硬皮面包卷烘焙设置中给出最高比容的剂量。最佳Lipopan F剂量用‘1’表示，阴性对照显示为‘0’。

例如，在该试验中，5x的CRC08319剂量为‘5x Lipopan F的最佳剂量’(基于mg蛋白质/kg面粉)，如实例19中的硬皮面包卷应用测试所呈现。

表6.在存在和不存在补充底物(SOLEC F)的情况下，对“CRC08319+Powerbake4080”进行海绵酵头和面团测试的实验设置。

图3显示了在存在和不存在SOLEC F的情况下，作为“CRC08319+Powerbake 4080”的影响的海绵酵头和面团的相对比容。

图3呈现了受震动的和未受震动的面包的相对比容(相对于未受震动的阴性对照)。海绵酵头和面团试验显示，在不存在SOLEC F的情况下，“CRC08319+Powerbake 4080”的比容(未受震动的和受震动的)相比阴性对照(Neg Ctrl)明显增加。与不存在补充SOLECF的“CRC08319+Powerbake 4080”相比，存在SOLEC F的“CRC08319+Powerbake 4080”的作用提供了进一步的比容增加。

虽然为了清楚理解的目的，已经通过说明和实例的方式对前述发明进行了详细描述，但是在所附权利要求的范围内可以实施某些改变和修改。此外，本文提供的每个参考文献出于所有目的通过引用以其全文并入，其程度如同每个参考文献通过引用单独并入一样。在任何引用文献(包括网站或登录号)可能会随时间而变化的程度上，有效版本是指在本申请提交之日有效的版本。除非从上下文另外可见，否则可以将任何步骤、要素、方面、实施例特征与任何其他组合使用。

Claims

1.一种分离的多肽，所述分离的多肽包含特征在于具有约55/45或更高的sn1/sn2特异性比的磷脂酶A1，其中所述磷脂酶A1的溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.02和/或NALPE/NAPE活性比小于0.12。

2.根据权利要求1所述的分离的多肽，其中所述sn1/sn2特异性比为约60/40、70/30、80/20、90/10、95/5或99/1。

3.根据权利要求1所述的分离的多肽，其中所述sn1/sn2特异性比为约74/26或89/11。

4.根据权利要求1所述的分离的多肽，其中所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.009。

5.根据权利要求4所述的分离的多肽，其中所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.008。

6.根据权利要求5所述的分离的多肽，其中所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.007。

7.根据权利要求6所述的分离的多肽，其中所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.006。

8.根据权利要求7所述的分离的多肽，其中所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.005。

9.根据权利要求8所述的分离的多肽，其中所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.004。

10.根据权利要求9所述的分离的多肽，其中所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.003。

11.根据权利要求10所述的分离的多肽，其中所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.002。

12.根据权利要求11所述的分离的多肽，其中所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.001。

13.根据权利要求12所述的分离的多肽，其中所述sn1/sn2特异性比为约60/40、70/30、80/20、90/10、95/5或99/1。

14.根据权利要求12所述的分离的多肽，其中所述sn1/sn2特异性比为约74/26或89/11。

15.根据权利要求1所述的分离的多肽，其中所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:2、SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:16具有至少80％序列同一性的蛋白质序列的酶。

16.根据权利要求15所述的分离的多肽，其中所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:6具有至少80％序列同一性的蛋白质序列的酶。

17.根据权利要求15所述的分离的多肽，其中所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:2、SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:16具有至少90％序列同一性的蛋白质序列的酶。

18.根据权利要求17所述的分离的多肽，其中所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:6具有至少90％序列同一性的蛋白质序列的酶。

19.根据权利要求15所述的分离的多肽，其中所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:2、SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:16具有至少95％序列同一性的蛋白质序列的酶。

20.根据权利要求19所述的分离的多肽，其中所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:6具有至少95％序列同一性的蛋白质序列的酶。

21.根据权利要求15所述的分离的多肽，其中所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:2、SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:16具有100％序列同一性的蛋白质序列的酶。

22.根据权利要求21所述的分离的多肽，其中所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:6具有100％序列同一性的蛋白质序列的酶。

23.一种制作面团的方法，所述方法包括使选自由面粉、盐、水、糖、脂肪、卵磷脂、油、乳化剂和酵母组成的组的面团组分与根据权利要求1-22、75-92或95-101中任一项所述的包含磷脂酶A1的分离的多肽相混合。

24.一种面团，其包含根据权利要求1-22、75-92或95-101中任一项所述的分离的多肽。

25.根据权利要求24所述的面团，其具有改善的面团拉伸性和/或稳定性。

26.根据权利要求24所述的面团，其进一步包含用于改善面团和/或由其制得的烘焙产品的至少一种额外的酶。

27.根据权利要求26所述的面团，其中所述额外的酶选自由以下组成的组：淀粉酶、环糊精葡聚糖转移酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、脂肪酶、半乳糖脂酶、与所述磷脂酶A1不同的磷脂酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、蛋白质二硫键异构酶、糖基转移酶、过氧化物酶、脂加氧酶、漆酶和氧化酶。

28.根据权利要求27所述的面团，其中所述淀粉酶为外切淀粉酶。

29.根据权利要求28所述的面团，其中所述外切淀粉酶为生麦芽糖淀粉酶。

30.根据权利要求28所述的面团，其中所述外切淀粉酶为非生麦芽糖淀粉酶。

31.根据权利要求30所述的面团，其中所述非生麦芽糖淀粉酶通过以下方式水解淀粉：从支链淀粉侧链的非还原端切下一种或多种直链麦芽低聚糖，所述直链麦芽低聚糖主要包含四个至八个D-吡喃葡萄糖基单元。

32.根据权利要求27所述的面团，其中所述额外的酶为磷脂酶。

33.根据权利要求32所述的面团，其中所述磷脂酶具有半乳糖脂酶活性。

34.根据权利要求33所述的面团，其中所述磷脂酶包含SEQ ID NO:17和/或SEQ ID NO:18。

35.一种制备烘焙产品的方法，其包括烘焙根据权利要求24-34中任一项所述的面团。

36.一种烘焙产品，其可通过根据权利要求35所述的方法获得。

37.根据权利要求36所述的烘焙产品，其具有选自由以下组成的组的至少一种改善的特性：改善的面包心孔径、改善的气泡的均匀性、外皮和面包心之间无分离、增加的体积、增加的外皮脆度和改善的烤焙弹性。

38.根据权利要求37所述的烘焙产品，其中所述改善的特性为外皮脆度。

39.一种用于烘焙的预混合物，其包含面粉和根据权利要求1-22、75-92或95-101中任一项所述的分离的多肽。

40.根据权利要求39所述的预混合物，其进一步包含用于改善面团和/或由其制得的烘焙产品的至少一种额外的酶。

41.根据权利要求40所述的预混合物，其中所述额外的酶选自由以下组成的组：淀粉酶、环糊精葡聚糖转移酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、脂肪酶、半乳糖脂酶、与所述磷脂酶A1不同的磷脂酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、蛋白质二硫键异构酶、糖基转移酶、过氧化物酶、脂加氧酶、漆酶和氧化酶。

42.根据权利要求41所述的预混合物，其中所述淀粉酶为外切淀粉酶。

43.根据权利要求42所述的预混合物，其中所述外切淀粉酶为生麦芽糖淀粉酶。

44.根据权利要求42所述的预混合物，其中所述外切淀粉酶为非生麦芽糖淀粉酶。

45.根据权利要求44所述的预混合物，其中所述非生麦芽糖淀粉酶通过以下方式水解淀粉：从支链淀粉侧链的非还原端切下一种或多种直链麦芽低聚糖，所述直链麦芽低聚糖主要包含四个至八个D-吡喃葡萄糖基单元。

46.根据权利要求41所述的预混合物，其中所述额外的酶为磷脂酶。

47.根据权利要求46所述的预混合物，其中所述磷脂酶具有半乳糖脂酶活性。

48.根据权利要求47所述的预混合物，其中所述磷脂酶包含SEQ ID NO:17和/或SEQ IDNO:18。

49.一种烘焙改良剂，其包含含有根据权利要求1-22、75-92或95-101中任一项所述的分离的多肽的颗粒或团聚粉末。

50.根据权利要求49所述的烘焙改良剂，其进一步包含用于改善面团和/或由其制得的烘焙产品的至少一种额外的酶。

51.根据权利要求50所述的烘焙改良剂，其中所述额外的酶选自由以下组成的组：淀粉酶、环糊精葡聚糖转移酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、脂肪酶、半乳糖脂酶、与所述磷脂酶A1不同的磷脂酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、蛋白质二硫键异构酶、糖基转移酶、过氧化物酶、脂加氧酶、漆酶和氧化酶。

52.根据权利要求51所述的烘焙改良剂，其中所述淀粉酶为外切淀粉酶。

53.根据权利要求52所述的烘焙改良剂，其中所述外切淀粉酶为生麦芽糖淀粉酶。

54.根据权利要求52所述的烘焙改良剂，其中所述外切淀粉酶为非生麦芽糖淀粉酶。

55.根据权利要求54所述的烘焙改良剂，其中所述非生麦芽糖淀粉酶通过以下方式水解淀粉：从支链淀粉侧链的非还原端切下一种或多种直链麦芽低聚糖，所述直链麦芽低聚糖主要包含四个至八个D-吡喃葡萄糖基单元。

56.根据权利要求51所述的烘焙改良剂，其中所述额外的酶为磷脂酶。

57.根据权利要求56所述的烘焙改良剂，其中所述磷脂酶具有半乳糖脂酶活性。

58.根据权利要求57所述的烘焙改良剂，其中所述磷脂酶包含SEQ ID NO:17和/或SEQID NO:18。

59.根据权利要求23所述的制作面团的方法，其进一步包括添加用于改善面团和/或由其制得的烘焙产品的至少一种额外的酶。

60.根据权利要求59所述的方法，其中所述额外的酶选自由以下组成的组：淀粉酶、环糊精葡聚糖转移酶、肽酶、转谷氨酰胺酶、脂肪酶、半乳糖脂酶、与所述磷脂酶A1不同的磷脂酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、蛋白质二硫键异构酶、糖基转移酶、过氧化物酶、脂加氧酶、漆酶和氧化酶。

61.根据权利要求60所述的方法，其中所述淀粉酶为外切淀粉酶。

62.根据权利要求61所述的方法，其中所述外切淀粉酶为生麦芽糖淀粉酶。

63.根据权利要求61所述的方法，其中所述外切淀粉酶为非生麦芽糖淀粉酶。

64.根据权利要求63所述的方法，其中所述非生麦芽糖淀粉酶通过以下方式水解淀粉：从支链淀粉侧链的非还原端切下一种或多种直链麦芽低聚糖，所述直链麦芽低聚糖主要包含四个至八个D-吡喃葡萄糖基单元。

65.根据权利要求60所述的方法，其中所述额外的酶为磷脂酶。

66.根据权利要求65所述的方法，其中所述磷脂酶具有半乳糖脂酶活性。

67.根据权利要求66所述的方法，其中所述磷脂酶SEQ ID NO:17和/或SEQ ID NO:18。

68.一种修饰磷脂乳化剂的方法，其包括用包含根据权利要求1-22、75-92或95-101中任一项所述的分离的多肽的酶处理所述乳化剂。

69.根据权利要求68所述的方法，其中所述磷脂乳化剂为卵磷脂或溶血卵磷脂。

70.一种在含脂质食品基质中产生溶血磷脂的方法，其包括向所述含脂质食品基质中添加根据权利要求1-22、75-92或95-101所述的分离的多肽。

71.根据权利要求70所述的在含脂质食品基质中产生溶血磷脂的方法，其中所述含脂质食品基质选自由以下组成的组：鸡蛋和含鸡蛋的食物产品、用于烘焙甜品的面团、加工肉、基于奶的产品和植物油。

72.一种分离的多核苷酸，其包含编码根据权利要求1-22、75-92或95-101中任一项所述的分离的多肽的核酸序列。

73.一种重组表达载体，其包含根据权利要求72所述的多核苷酸。

74.一种宿主细胞，其包含根据权利要求73所述的重组表达载体。

75.根据权利要求1所述的分离的多肽，其中所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.019。

76.根据权利要求1所述的分离的多肽，其中所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.018。

77.根据权利要求1所述的分离的多肽，其中所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.017。

78.根据权利要求1所述的分离的多肽，其中所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.016。

79.根据权利要求1所述的分离的多肽，其中所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.015。

80.根据权利要求1所述的分离的多肽，其中所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.014。

81.根据权利要求1所述的分离的多肽，其中所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.013。

82.根据权利要求1所述的分离的多肽，其中所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.012。

83.根据权利要求1所述的分离的多肽，其中所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.011。

84.根据权利要求1所述的分离的多肽，其中所述溶血磷脂酶/磷脂酶活性比小于0.01。

85.根据权利要求1所述的分离的多肽，其中所述NALPE/NAPE活性比活性比小于0.11。

86.根据权利要求85所述的分离的多肽，其中所述NALPE/NAPE活性比小于0.10。

87.根据权利要求86所述的分离的多肽，其中所述NALPE/NAPE活性比小于0.09。

88.根据权利要求87所述的分离的多肽，其中所述NALPE/NAPE活性比小于0.08，优选地小于0.07。

89.根据权利要求88所述的分离的多肽，其中所述NALPE/NAPE活性比小于0.06。

90.根据权利要求89所述的分离的多肽，其中NALPE/NAPE活性比小于0.05。

91.根据权利要求90所述的分离的多肽，其中所述NALPE/NAPE活性比小于0.04。

92.根据权利要求91所述的分离的多肽，其中所述NALPE/NAPE活性比小于0.03。

93.根据权利要求23所述的制作面团的方法，其进一步包括添加乳化剂。

94.根据权利要求93所述的制作面团的方法，其中所述乳化剂选自由以下组成的组：i)磷脂乳化剂如卵磷脂或溶血卵磷脂；或ii)非磷脂乳化剂如DATEM、甘油单酯或甘油二酯。

95.一种分离的多肽，所述分离的多肽包含含有与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16具有至少80％序列同一性的蛋白质序列的磷脂酶A1酶。

96.根据权利要求95所述的分离的多肽，其中所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:6具有至少80％序列同一性的蛋白质序列的酶。

97.根据权利要求95所述的分离的多肽，其中所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:2、SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:16具有至少90％序列同一性的蛋白质序列的酶。

98.根据权利要求97所述的分离的多肽，其中所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:6具有至少90％序列同一性的蛋白质序列的酶。

99.根据权利要求95所述的分离的多肽，其中所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:2、SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:16具有至少95％序列同一性的蛋白质序列的酶。

100.根据权利要求99所述的分离的多肽，其中所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:6具有至少95％序列同一性的蛋白质序列的酶。

101.根据权利要求95所述的分离的多肽，其中所述磷脂酶A1是包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16具有100％序列同一性的蛋白质序列的酶。