CN115521925A

CN115521925A - 具有溶血磷脂酶和/或磷脂酶活力的蛋白

Info

Publication number: CN115521925A
Application number: CN202110707919.4A
Authority: CN
Inventors: 宣姚吉; 徐正军; 牛其文; 王圣南
Original assignee: Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Current assignee: Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Priority date: 2021-06-24
Filing date: 2021-06-24
Publication date: 2022-12-27

Abstract

本发明提供了一种具有溶血磷脂酶和/或磷脂酶活力的蛋白。所述蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：12所示序列相比存在以下突变中的至少1个：L86I，G187D，E209K和A245D。本发明的蛋白不仅可以作为磷脂酶和/或溶血磷脂酶，而且，还可以用于同时需要磷脂酶和溶血磷脂酶的应用，例如，可以应用于L‑α‑甘油磷酸胆碱的制备。

Description

具有溶血磷脂酶和/或磷脂酶活力的蛋白

技术领域

本发明涉及生物化工技术领域，尤其涉及一种具有溶血磷脂酶和/或磷脂酶活力的蛋白。

背景技术

在黑曲霉中已报道了有两种脂肪酶，称为lipaseA和lipaseB，或者称为 lipase1和lipase2。其中lipaseB的性质比较特殊，Zhu Shu-sen从黑曲霉A733 中克隆表达了lipaseB，发现lipaseB的最适温度为15℃，最适pH在3.5-4.0，不能耐受超过40℃以上的温度，能够水解pNPC4-pNPC18链长的底物，其中 pNPC12为最适底物。但lipB的比酶活极低，经过纯化后的lipB比酶活仅为 6.8U/mg。

Jiangke Yang等人从黑曲霉CICC 4009中克隆表达了lipas2，虽然这个 lipase2和Zhu Shu-sen克隆的lipaseB高度同源，仅有两个氨基酸的差别，但是性质有一定程度的差异，最适底物为pNPC8和pNPC10，最适pH小于6.5，最适温度为50℃，不能耐受超过40℃以上的温度。

从上所述，黑曲霉来源的liapse2或者lipaseB的实用性不强，首先比酶活极低，温度耐受性不高，适用的最适底物短链脂肪酸的甘油三脂。不如用途较为广泛的脂肪酶TL和RML，比酶活能够达到12000或8000U/mg，TL能够耐受60℃的温度保持20小时不失活，RML能水解各种长链脂肪酸的甘油三脂。

发明内容

本发明在第一方面提供了一种具有溶血磷脂酶和/或磷脂酶活力的蛋白。

本发明提供的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：12所示序列相比存在以下突变中的至少1个：L86I，G187D，E209K和A245D。

在本发明的一些具体实施方案中，所述蛋白具有SEQ ID NO：13所示序列。

第二方面，本发明还提供了一种多核苷酸序列。

本发明提供的多核苷酸序列选自：(1)编码权利要求1或2所述的多肽的多核苷酸；(2)与(1)所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸；和(3)(1)或(2)所述的多核苷酸的长10-40个碱基的片段。

在本发明的一些具体实施方案中，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO：22 所示。

第三方面，本发明还提供了一种多核苷酸构建物。

本发明提供的多核苷酸构建物含有第二方面的多核苷酸序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述多核苷酸构建物是表达载体或克隆载体。

第四方面，本发明还提供了一种宿主细胞。

本发明提供的宿主细胞：(1)表达第一方面的多肽；和/或(2)含有第二方面的多核苷酸序列或第三方面的多核苷酸构建物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主细胞选自原核或真核微生物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主细胞优选选自黑曲霉、毕赤酵母、大肠杆菌、芽孢杆菌属、里氏木霉和/或米曲霉。

第五方面，本发明还提供了一种包含第一方面的蛋白的组合物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物为酶组合物。在本发明的一些具体实施方案中，所述酶组合物还包括磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶B、磷脂酶C、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶中的一种或多种。

在本发明的一些具体实施方案中，所述组合物为第四方面的宿主细胞的发酵表达物，例如，发酵液、发酵浓缩液、发酵上清液、发酵液制备的酶制剂。

第六方面，本发明还提供了一种组合物，其含有第一方面的蛋白和任选的辅料。

在本发明的一些具体实施方案中，所述辅料为选自活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃的吸附材料。

第七方面，本发明提供了制备第一方面的蛋白的方法，包括发酵第四方面的宿主细胞的步骤。

第八方面，本发明还提供了第一方面的多肽、第二方面的多核苷酸序列、第三方面的核酸构建体、第四方面的宿主细胞、第五方面的组合物或第六方面的组合物在植物油脱胶、面包面团改性、淀粉水解产物处理、溶血磷脂酶制备和/或L-α-甘油磷酸胆碱中的应用。

附图说明

图1为不同pH下，AN02-LPL和pic-AN02m1酶活稳定性结果。

图2为脂肪酶活力酸碱滴定法测定过程。

具体实施方式

应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。

虽然本申请含有许多细节，但这些不应被解释为对发明或要求保护的任何范围的限制，而应被解释为可对特定发明的特定实施方案具有特异性的特征的描述。在本申请的单独实施方案中描述的某些特征也可以在单个实施方案中组合实现。相反地，在单个实施方案中描述的各种特征也可以在多个实施方案中单独地或以任何合适的子组合来实现。此外，尽管特征可以在上文中被描述为以某些组合起作用并且甚至最初如此被要求保护，但是来自所要求保护的组合的一个或多个特征可以在一些情况下从组合中删除，并且所要求保护的组合可以涉及子组合或子组合的变型。

除非另外说明，本文中的术语的含义与本领域技术人员通常理解的含义相同，例如，涉及原料和产物、操作步骤、工艺参数、使用设备和工具以及数值单位中的术语。

在本文中，词语“包括”和“包含”表示开放式，也可以是封闭式。例如，所述“包括”或“包含”可以表示还可以包括或包含没有列出的其他组分或步骤或其他要素，也可以仅包括或包含列出的组分或步骤或其他要素。

在本文中，术语“约”(例如，在组分含量和处理参数中)以本领域技术人员通常能够理解的含义来解释。一般情况下，术语“约”可以理解为给定数值的正负5％范围内的任意数值，例如，约X可以代表95％X至105％X的范围中的任意数值。

还应当理解，本文中给出的具体数值(例如，在组分含量、温度和处理时间中)不仅可作为单独的数值理解，还应当认为提供了某一范围的端点值，并且可以相互组合提供其他范围。例如，当公开了处理可以进行30分钟或180 分钟的时候，也相应地公开了处理可以进行30分钟至180分钟。此外，本文给出的具体数值还可以理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此，除非有相反规定，本申请所记载的数值是可以根据要求改变的近似值。例如，处理的时间为30分钟可以被理解为处理的时间为约30分钟，处理的时间为30分钟至180分钟可以被理解为处理的时间为约30分钟至约180分钟或约30分钟至 180分钟。

本发明中，所述蛋白可以是“分离的”蛋白。本文中，“分离的”意指在自然界中不存在的一种形式或物质。分离的物质的非限制性例子包括任何非天然存在的物质和至少部分地从与其在自然界中相关联的一种或多种或全部天然存在的组分中除去的任何物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子。

本领域技术人员公知，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的蛋白末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的蛋白的活性。又如为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸序列添加至重组蛋白的N末端、C末端或该蛋白内的其它合适区域内，这类氨基酸序列包括但不限于接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、谷胱甘肽S-转移酶 (GST)、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、标签(如6His或Flag)、或合适的蛋白水解酶位点等。应理解，这些氨基酸序列的存在不会影响到所得多肽的活性。因此，本发明也包括在本发明多肽的C末端和/或N末端或其蛋白内合适的区域内具有一个或数个利于该多肽表达载体的构建、该多肽的表达和/或纯化的氨基酸的多肽，这些多肽仍具有本文所述的酶活性。

在本发明的一些实施例中，本领域的技术人员可以根据所使用的表达质粒和/或宿主，对多核苷酸序列进行密码子偏爱性优化。

本发明中，编码本发明多肽的序列包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。应当理解，由于真核生物本身所具有的性质，在本发明的多核苷酸序列中加入内含子序列，也是可以的，只要真核生物表达的酶属于本发明的第一方面的酶。

本发明也涉及包括与指导编码序列在合适宿主细胞中，在与该调控序列相适合的条件下表达的一个或多个调控序列可操作连接的本发明的分离多核苷酸的核酸构建体。术语“可操作连接”指调控序列位于适当的位置从而能控制、指导感兴趣的多核苷酸序列的表达。编码本发明多肽的多核苷酸可以多种方式被操作以保证该多肽的表达。

调控序列可以是合适的启动子序列，为用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列包含接到多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于指导本发明的核酸构建体，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从噬菌体T7启动子、大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌 (Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因等中获得的启动子序列。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞正转录的合适启动子的实例是从米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉糖化酶(glaA)、里氏木霉纤维二糖水解酶I、氏木霉纤维二糖水解酶II、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、里氏木霉葡聚糖内切酶等基因获得的启动子及其突变、截短和杂合(hybrid)启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子可获得自酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因、巴斯德毕赤酵母醇氧化酶基因。用于酵母宿主细胞的其它有用启动子由Romanos et al.，1992， Yeast8:423-488描述。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，为宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。

用于细菌宿主的优选终止子可以是来自T7噬菌体的终止子。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子获得自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶的基因。

用于酵母宿主细胞的优选终止子获得自酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C、酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶、巴斯德毕赤酵母醇氧化酶基因等。

调控序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。签到序列与编码该多肽的核苷酸序列的5′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。

调控序列也可以是编码与多肽的氨基酸末端连接的氨基酸序列并且指导该编码的多肽进入细胞分泌途径的信号肽编码区。核苷酸序列编码序列的5′端可固有地包含天然连接具有编码分泌多肽的编码区节段的翻译阅读框的信号肽编码区。备选地，编码序列的5′端可包含与该编码区外源的信号肽编码区。当编码序列非天然地包含信号肽编码区时，可能需要外来的信号肽编码区。备选地，外来的信号肽编码区可简单地替换天然的信号肽编码区以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入选择的宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区，即分泌进入培养基，都可用于本发明。

在某些实施方案中，本发明的核酸构建体为表达框。术语“表达框”是指表达一个基因所需的完整元件，包括启动子、基因编码序列、PolyA加尾信号序列。

表达载体可以是能够方便地经受重组DNA方法并且可导致感兴趣的核苷酸序列表达的任何载体(如质粒或病毒)。克隆载体通常在引入到宿主细胞中后能在宿主细胞中大量繁殖。

载体的选择一般取决于载体与其中被导入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性或闭合的环形质粒。

载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在，其复制不依赖于染色体复制的载体，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可包含用于保证自我复制的任何方式。备选地，载体可以是当被导入宿主细胞时，整合到基因组中并且与其已经被整合进入的染色体一起复制的载体。此外，可使用一起包含将被导入宿主细胞基因组的总DNA的单个载体或质粒或两个或多个载体或质粒，或转座子。

本发明的载体优选包含一个或多个容许容易选择转化、转染、转导等细胞的可选择标记。可选择的标记是基因，其产物提供对抗生素或病毒的抗性、对重金属的抗性、原养型至营养缺陷型等。

本发明的载体优选包含容许该载体整合进入宿主细胞基因组或该载体在细胞中独立于基因组自主个复制的元件。

一个以上拷贝的本发明的多核苷酸可被插入宿主细胞以增加该基因产物的产量。多核苷酸拷贝数的增加可通过将至少一个附加拷贝的序列整合进入宿主细胞基因组或通过包括可扩增的选择标记基因和该多核苷酸来获得，其中包含扩增拷贝的选择标记基因并且由此包含附加拷贝多核苷酸的细胞可通过在存在适当的选择剂时培养该细胞来筛选。

本发明的载体优选包含人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点，能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。

在本发明中，宿主细胞可以是单细胞微生物或非单细胞微生物。单细胞微生物例如革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌细胞，例如，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌等；或链霉菌细胞，例如钱青紫链霉菌；或革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌和假单胞菌属。在优选的方面，细菌宿主是枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和大肠杆菌细胞。

宿主细胞也可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物、酵母或真菌细胞。在优选的方面，宿主细胞是真核细胞，如在此使用的“真核”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门等。

在更优选的方面，宿主细胞是子囊菌门的细胞如酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)以及 Komagataella属等。

本发明磷脂酶可以被用于降低食用油的磷脂含量。这一方法可以被用于纯化任何含有磷脂的食用油，如植物油(如大豆油、菜籽油、向日葵籽油)。通常，在开始用磷脂酶处理之时，油中含有50-1000ppm以磷脂形式的磷，处理可以将磷值降到低于5-10ppm。磷脂酶处理是通过散布磷脂酶的水性溶液来完成，优选的为平均直径低于10um的小滴形式。优选的，水量占油重量的0.5-5％。可以加入乳化剂。可以使用机械搅动来保持乳化。磷脂酶处理可以在约3.5到 5的pH范围进行，以最大化酶的性能，或者可以使用约1.5到3(如2-3)的 pH范围，以抑制甘油三脂的碱水解(皂化)。可以通过加入柠檬酸、柠檬酸缓冲液或盐酸来调节pHo适合的温度通常是30-70℃(尤其是30-45℃，如35-40 ℃)反应时间通常是1-12个时(如2-6小时)。合适的酶剂量通常是0.1-10mg 每升(如0.5-5mg每升)。磷脂酶处理可以分批进行(如在一搅拌的容器中)，或者也可以连续进行(如在一系列搅拌的反应容器内)。磷脂酶处理之后是对水相和油相的分离。此分离可以通过传统的方式完成(如离心)。水相中含有磷脂酶，并且这些酶可以被重复利用以提高此过程的经济性。可以使用本领域已知的各种方法完成此处理。

烘焙产品是由生面团制成，生面团通常由基本成分面粉、水和可选的盐制成。依赖于烘焙产品的不同，其它选择性的成分包括糖、调味品等等。对于发酵产品，面包酵母主要在化学发酵系统(如酸(产生酸的化合物)和重碳酸盐的组合)之后被使用。为了提高生面团的操作特性和烘焙产品的最终性质，一直在努力发展有助于提高性质的手段。需要被提高的生面团性质包括可加工性、气体保留能力等等。可以被提高的烘焙产品的性质包括：面包体积、面包皮脆度、面包心质地和柔软性、味道和香味以及保质期。目前具有的加工辅助手段可以被分为两组：化学添加剂和酶。

改善性质的化学添加剂包括氧化剂(如抗坏血酸、澳酸盐、和偶氮碳酸盐)、还原剂(如L-半胱氨酸和谷胱甘肽)、作为生面团调节物的乳化剂(如二乙酰酒石酸单/双甘油酯(DATEM)、硬脂酰乳酸钠(SSL)或硬脂酰乳酸钙(CSL)), 或作为面包心软化剂的乳化剂(如单硬脂酸甘油脂(GMS)等)、脂肪材料(如甘油三脂(脂肪)或卵磷脂及其它)。

目前趋向于用酶来代替化学添加剂。后者被认为是更天然的化合物，因此更加被消费者接受。合适的酶可以选自淀粉酶、阿拉伯糖木聚糖及其它半纤维素降解酶、纤维素降解酶、氧化酶、脂肪解酶和蛋白质酶。

本发明也涉及制备生面团或烘焙产品的方法，该方法包括向生面团中整合入有效量的本发明磷脂酶，相对于没有加入多肽的生面团或烘焙产品而言，该磷脂酶改善生面团或来自此生面团的烘焙产品的一种或多种性质。

本发明磷脂酶可以被用于水性糖溶液或浆状物的脱胶，以提高其过滤性，尤其是淀粉水解产物，特别是难于过滤并产生浑浊滤液的小麦淀粉水解产物。此处理可以使用本领域所熟知的方法完成。

本发明磷脂酶可以被用于任何需要水解磷脂或获得它的特异切割产物的应用。例如应用本发明磷脂酶可以产生溶血磷脂、二酰甘油、胆碱-或乙醇胺磷酸、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺和各种磷脂酸。

在本发明的下述实施例中，所使用的

黑曲霉菌株GIM 3.24(AN02)，GIM 3.488(AN04)购自广东省微生物菌种保藏中心，

黑曲霉AS3.795菌株购自中科院微生物所。

pAOP-Eno载体由发明人构建，其构建过程如下：

合成外源的米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶(RML)，其核酸序列如SEQ IDNO:18所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)的方法，构建RML基因表达载体pAOP-Eno-E，过程如下：用SphI和 HindIII酶切位点将从生工生物工程(上海)股份有限公司全基因合成获得的RML基因(带米曲霉α-淀粉酶信号肽(NCBI序列号： XM_001821384.2，1-63bp序列))插入到以米曲霉烯醇化酶启动子 (NCBI序列号：D63941.1，215-734bp；含12拷贝增强子序列(SEQ ID NO:20)和黑曲霉糖化酶终止子(NCBI序列号：AF214480.1，其中终止子序列部分)的表达框中，将整个表达框以BglII和XhoI插入到克隆载体pSP72的多克隆位点，最后将米曲霉来源的PyrG表达基因 (NCBI序列号：AB017705.1)以XhoI酶切位点插入到载体上，从而构建好RML基因表达载体pAOP-Eno-E。

mini beadbeater购自美国Biospec；glass beads购自：美国Biospec。

HS DNA Polymerase购自Takara，货号：R010A。

Mighty TA-cloning Reagent Set for

试剂盒购自 Takara，货号：6019；

NEFA试剂盒购自日本和光纯药工业株式会社

黑曲霉发酵培养基配方为：

2％葡萄糖，10％麦芽糖，7％柠檬酸钠，1.5％硫酸铵，4％ Tryptic soy broth，0.1％磷酸二氢钠，0.1％硫酸镁，0.07％Tween 80，微量元素(KI 0.83g/L，H₃BO₃ 6.2g/L，MnSO₄·4H₂O 22.3g/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25g/L，CuSO₄·5H₂O 0.025g/L，CoCl₂·6H₂O 0.025g/L按1/1000比例添加；FeSO₄·7H₂O 2.78g/L，Na₂·EDTA 3.73g/L按1/100比例添加)。

lysis buffer配方为：100mM Tris-HCl pH 8.0；50mM Na·EDTA；1 ％SDS。

BMMY-大豆磷脂培养基：

组分A，BMMY固体培养基：1％yeast extract，2％peptone，100 mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,pH 6.6，1.34％YNB，4x10-5％biotin(倒平板前加)，2％methanol(倒平板前加)，2％琼脂溶于250ml去离子水中。

组分B，大豆磷脂底物溶液250ml：配4％大豆磷脂，用高速匀浆机8000rpm乳化3min，暂停1min后再乳化3min，制备底物溶液。

灭菌后将A和B组分混合，加入10ml甲醇，倒平板。

实施例1：黑曲霉lipaseB基因克隆

黑曲霉菌株GIM 3.24(AN02)和GIM 3.488(AN04)用黑曲霉发酵培养基30℃培养24小时。取发酵培养物，4000rpm离心5min，取菌体。用700ul lysis buffer重悬，转移至冻存管中，加入300ul glass beads，上mini beadbeater振动40s，12000rpm离心10min，取600ul上清加入 275ul 7M醋酸铵，65℃水浴10min，冰浴5min，加入等体积的酚氯仿异戊醇(24:25:1)，充分涡旋，12000rpm离心5min，取上清加入等体积的氯仿，充分涡旋，12000rpm离心5min，取上清加入2倍体积的无水乙醇，-80℃放置20min，12000rpm离心10min，得到白色DNA沉淀，用70％乙醇洗2次，待乙醇充分挥发后加入无菌水溶解DNA。

根据NCBI中的黑曲霉CBS513.88的lipaseB的基因序列设计引物 LPL-1(序列如SEQ ID NO:1所示)和LPL-2(序列如SEQ ID NO:2 所示)。

利用

HS DNA Polymerase克隆黑曲霉菌株GIM 3.24(AN02)，GIM3.488(AN04)的LPL DNA，用Mighty TA-cloning Reagent Set for

试剂盒进行TA克隆后转化DH5a大肠杆菌，送生工生物工程有限公司进行DNA测序，最终得到GIM3.24 (AN02)和GIM 3.488(AN04)的LPL DNA序列，分别如下：

GIM 3.24(AN02)LPL的DNA序列如SEQ ID NO:3所示，

GIM 3.488(AN04)的LPL DNA序列如SEQ ID NO:4所示，其与 CBS513.88的lipaseB的DNA序列相同。

根据CBS513.88的lipaseB的DNA序列的内含子序列，找出GIM 3.24(AN02)，GIM3.488(AN04)的内含子序列，去除后翻译成氨基酸序列，结果分别如下：

GIM 3.24(AN02)LPL的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示

GIM 3.488(AN04)LPL即CBS513.88的lipaseB氨基酸序列，如 SEQ ID NO:6所示。

实施例2：AN02-LPL和CBS-lipaseB的磷脂酶A1活力

设计并合成引物LPL-11C(SEQ ID NO:7)、LPL-12C(SEQ ID NO:8) 和LPL-2C(SEQID NO:9)。

以AN02，AN04的基因组为模板，先以LPL-12C和LPL-2C为引物对进行PCR，再以此PCR产物作为模板，以LPL-11C和LPL-2C进行PCR，获得AN02-LPL，AN04LPL(即CBS-lipaseB)的DNA序列，并在AN02-LPL，AN04LPL(即CBS-lipaseB)基因序列的5’端增加了TPI 5’ -UTR序列(SEQ ID NO:10)，Amylase signal peptide序列(SEQ ID NO:11)。PCR产物用HindIII和SphI进行酶切，通过HindIII和SphI 酶切位点连入pAOP-Eno载体中，测序正确的克隆，转化黑曲霉 AS3.795菌株，得到的菌株分别命名为AN02-LPL，和AN04LPL。

转化方法如下：

将培养在PDA固体培养基(购自BD公司，货号BD 213400)的黑曲霉菌株AS3.795的孢子用孢子洗液洗脱，将洗脱下来的孢子涡旋震荡1min后，通过mircloth过滤，制备成均一的孢子悬液；接种1× 10⁷个孢子悬液至发酵培养基(2％葡萄糖，6％麦芽糖，7％柠檬酸钠，1.5％硫酸铵，4％Tryptic soy broth，0.1％磷酸二氢钠，0.1％硫酸镁， 0.07％Tween 80，微量元素(KI 0.83g/L，H₃BO₃ 6.2g/L，MnSO₄.4H₂O 22.3g/L,ZnSO₄.7H₂O 8.6g/L,Na₂MoO₄.2H₂O 0.25g/L,CuSO₄.5H₂O 0.025g/L,CoCl₂.6H₂O 0.025g/L，按1/1000比例添加；FeSO₄.7H₂O 2.78g/L,Na₂.EDTA 3.73g/L按1/100比例添加))中，28℃，200rpm，培养42-48h；用灭菌Mircloth(购自Milliproe)过滤收集长出的菌丝；将收集的菌丝体用灭菌的渗透压稳定剂(0.6mol/L MgSO₄)冲洗三次，压干；菌丝转移至100mL三角瓶中，每0.8g菌丝体重悬在10mL的酶解液(1％纤维素酶(购自sigma，货号C1184-25KU)、1％溶壁酶(购自sigema，货号L1412-25G)、0.1％蜗牛酶(购自生工，货号 A600870-0005))中，分散；30℃，60rpm，60-90min(30min后每隔 10min观察一次)；用酶酶解的菌丝用Mircloth过滤，再用0.6mol/LMgSO₄冲洗，收集滤液；4℃，1000g离心10min，弃上清；5mL预冷 1.0mol/L山梨醇溶液重悬原生质体沉淀，800g，4℃离心10min，弃上清；原生质体重悬于1mL预冷1.0mol/L山梨醇，冰浴待用。取原生质体离心，用预冷的STC(1.0M Sorbitol，50mM CaCl₂，50mM Tris-HCl，pH＝7.5)溶液调整至1×10⁷个/mL；向200μL原生质体悬液中，加入5μg DNA和50L PTC(40％PEG4000，50mM CaCl₂， 50mM Tris-HCl，pH＝7.5)溶液，轻轻拍打混匀，冰浴30min；加0.2mLPTC溶液，混匀，再加入0.8mL PTC溶液，混匀，室温30min；将上述混合液加入到5ml再生培养基(0.2％KH₂PO₄，0.1％KCl， 0.05％MgSO₄·7H₂O，0.005％FeSO₄·7H₂O，1M蔗糖，10mM乙酰胺， 20mM氯化铯，0.6％琼脂)中，混匀；铺于再生培养基(成分同上，1.5％琼脂)上，28℃，培养3天以上。

将再生培养基上长出的阳性克隆涂布于3％的PDA固体培养基 (购自BD公司，货号BD 213400)上，28℃培养3天左右带有大量孢子形成，将洗脱下来的孢子涡旋震荡1min后，通过mircloth过滤，制备成均一的孢子悬液；接种1×10⁷个孢子悬液至发酵培养基(2％葡萄糖，10％麦芽糖，7％柠檬酸钠，1.5％硫酸铵，4％Tryptic soy broth， 0.1％磷酸二氢钠，0.1％硫酸镁，0.07％Tween 80，微量元素(KI 0.83g/L，H₃BO₃ 6.2g/L,MnSO₄.4H₂O22.3g/L,ZnSO₄.7H₂O 8.6g/L, Na₂MoO₄.2H₂O 0.25g/L,CuSO₄.5H₂O 0.025g/L,CoCl₂.6H₂O0.025g/L 按1/1000比例添加；FeSO₄.7H₂O 2.78g/L,Na₂.EDTA 3.73g/L按1/100 比例添加)))中，28℃，200rpm，培养8天，进行酶活测定。

酶活测定方法如下：

9ml底物：5ml 1％大豆磷脂，1ml 20％Triton X-100，2.5ml 0.1M 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

10ul稀释的酶液+90ul底物50℃反应10min，95℃5min灭活， 7000rpm离心5min，取1ul上清加NEFA试剂盒中的试剂A 80ul，37 ℃反应10min，加试剂B 160ul反应10min。测定550nm吸光值。

AN02-LPL和CBS-LipaseB的磷脂酶A1比酶活分别为20311U/mg 和19135U/mg。

实施例3：AN02-LPL和CBS-lipaseB的溶血磷脂酶活力

同样取AN02-LPL，AN04LPL(即CBS-lipaseB)的摇瓶发酵培养液，以1-棕榈酸甘油酰磷酸胆碱(溶血磷脂)作为底物测定溶血磷脂酶活力，酶活测定方法如下：

9ml底物：5ml 1％溶血磷脂，1ml 20％Triton X-100，2.5ml 0.1M 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

AN02-LPL和CBS-LipaseB的比酶活分别为22547U/mg和 22263U/mg。

实施例4：AN02-LPL和CBS-LipaseB的脂肪酶活力

同样取AN02-LPL和CBS-LipaseB的摇瓶发酵培养液，以橄榄油作为底物测定脂肪酶活力。

脂肪酶活力酸碱滴定法测定：具体过程如图2所示，其中：

底物溶液需现配现用，具体制备过程如下：量取4％PVA溶液 150ml，加橄榄油50ml，用高速匀浆机8000rpm乳化3min，暂停1min 后再乳化3min，制备底物溶液。

酶活定义及计算公式

脂肪酶酶活力单位定义为：每分钟催化底物释放出1μmol脂肪酸的酶量为1个脂肪酶活力单位(U)。

酶活计算公式：样品的酶活力(U/ml)＝(V-V₀)*M/t*n

式中：V：滴定样液所消耗的NaOH溶液体积(ml)

V₀：滴定空白样所消耗的NaOH溶液体积(ml)

t：反应时间(min)

n：酶液体积(ml)

M：滴定用的NaOH溶液的浓度(mmol/L)

AN02-LPL和CBS-LipaseB的脂肪酶比酶活分别为94U/mg和 74U/mg。可以看出AN02-LPL和CBS-LipaseB的脂肪酶比酶活极低，相比于溶血磷脂酶比酶活及磷脂酶A1比酶活有200倍的差距。作为脂肪酶AN02-LPL和CBS-LipaseB明显不具备实用性。

实施例5：AN02-LPL和CBS-LipaseB的脱胶测试

取大豆毛油60g摇匀，搅拌加热，温度稳定在55℃；加入50％CA ·H₂O 500ppm，于20000rpm剪切1.5min；55℃搅拌反应1h；将 AN02-LPL和CBS-LipaseB与水混合和后加入，剪切200000rpm， 1.5min；升温至55℃开始计时，反应4h，反应结束后，升温至85℃灭酶，至少保持＞8min，离心得到脱胶油后取样进行磷含量测试(按GB 5009.268-2016食品安全国家标准食品中多元素的测定)。

各组分添加量：

60g毛油；AN02-LPL或CBS-LipaseB(0.05mg/ml)加0.3ml；5％ CA.H₂O 0.3ml；H₂O1.2ml。

AN02-LPL和CBS-LipaseB的脱胶测试为AN02-LPL将含磷量降低至3.9ppm；CBS-LipaseB将含磷量降低至7.4ppm。AN02-LPL和 CBS-LipaseB均可以将毛油的含磷量降低至10ppm以下，实现酶法脱胶，可以符合进行下一步物理精炼的标准。

实施例5：AN02-LPL在毕赤酵母中表达及随机突变

选取AN02-LPL的成熟肽，并以该成熟肽前的前10个氨基酸作为前导肽，获得SEQID NO:12，其对应的DNA序列如SEQ ID NO:21 所示。

送生工生物工程有限公司合成基因序列，通过SacII和EcoRI酶切位点克隆至pET-pmAO-PLC-N63DN131SN134D-Y56H载体中，得到 pic-AN02质粒，其中，pET-pmAO-PLC-N63DN131SN134D-Y56H载体通过将pmAO-PLC-N63DN131SN134D-Y56H(制备过程见201680072289.5)连接在pET-28c载体上得到)。用BglII线性化后，用电转化法将载体转化至毕赤酵母GS115菌株的感受态细胞中。将转化物接种于MGYS平板上，30℃培养3天，得到毕赤酵母转化子。挑取平板上的单克隆，至BMM-大豆磷脂筛选平板上，选取白色沉淀圈大的克隆，命名为pic-AN02-LPL。

以pic-AN02-LPL作为模板使用TaKaRa Taq酶和引物对PLPL-1 (SEQ ID NO:16)/PLPL-2(SEQ ID NO:17)进行易错PCR(在PCR 时额外添加0.3mM的MnCl₂)，得到大小为约1000bp的突变扩增子片段集合。通过Sac-II和EcoRI酶切位点将得到的片段克隆至 pic-AN02质粒，并将得到的载体转化入大肠杆菌DH5α菌株。

将含pic-AN02突变体的平板用2ml的无菌水进行洗涤，抽提质粒，用SalI进行线性化，回收约8.5kb的片段，作为载体。取500ng 载体，用电转化法将载体转化至毕赤酵母GS115菌株的感受态细胞中。将转化物接种于BMM-大豆磷脂筛选培养基平板上，30℃培养3天，得到pic-AN02-LPL的毕赤酵母突变体文库。筛选得到一株突变体pic-AN02m1。

取pic-AN02m1和pic-AN02-LPL。先在液体YPD中活化，然后接种于BMGY培养基中，在30℃下，220rpm振荡培养过夜。将培养物转至BMMY培养基中，初始OD600为6。

首先，用2％甲醇进行诱导，在24h和32h后各补加1％甲醇， 48h和56h后各补加1％甲醇，72h取样。

将获得的发酵液用截留分子量为10kDa的超滤管进行超滤脱盐浓缩40倍。将处理后的样品加入缓冲液中(20mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH4.0))。

将pic-AN02-LPL和pic-AN02m1的发酵液分别用pH5.0,5.6,6.0, 6.6 0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和pH7.5 0.1M的Tris-HCl稀释600 倍后，放置于55℃的水浴中保温2小时后，进行磷脂酶活力测定，放置于4℃条件下的样品作为对照，测定方法如下：

结果如图1所示，pic-AN0m1的热稳定性明显优于pic-AN02-LPL， pic-AN0m155℃保温2小时后在pH5.6，6.0和6.6的条件下热稳定性较野生型AN02-LPL提高了3.9倍，30.8倍和28.7倍。

将pic-AN02m1菌株接种于3ml YPD液体培养基中，30℃培养过夜，抽提基因组DNA。以pic-AN0m1菌株的基因组DNA为模板，使用

HS DNA聚合酶和引物对AOX-5/3’-AOX1(分别如 SEQ ID NO:18和19所示)进行PCR扩增，得到pic-AN02m1菌株中 AN02突变体的DNA序列。将得到的序列送往上海生工生物工程公司，用引物对AOX-5/3’-AOX1进行测序。pic-AN02m1菌株的AN02突变体的DNA序列如SEQ ID NO:22所示，其编码的的氨基酸如SEQ ID NO:13所示，突变位点为L86I，G187D，E209K，A245D。

将pic-AN02m1四个突变位点中的L86I和E209K回复为L86和 E209，称为R1(氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，DNA序列如SEQ ID NO:23所示)(委托上海生工合成)。

送生工生物工程有限公司合成基因序列，通过SacII和EcoRI酶切位点克隆至pET-pmAO-PLC-N63DN131SN134D-Y56H载体中，得到 pic-R1质粒。用BglII线性化后，用电转化法将载体转化至毕赤酵母 GS115菌株的感受态细胞中。将转化物接种于MGYS平板上，30℃培养3天，得到pic-R1的毕赤酵母转化子。挑取平板上的单克隆，至 BMM-大豆磷脂筛选平板上，选取白色沉淀圈大的克隆，命名为R1。

将pic-AN02m1四个突变位点中的G187D和A245D回复为G187 和A245，称为R2(氨基酸序列如SEQ ID NO:15，DNA序列如SEQ ID NO:24所示)(委托上海生工合成)。

送生工生物工程有限公司合成基因序列，通过SacII和EcoRI酶切位点克隆至pET-pET-pmAO-PLC-N63DN131SN134D-Y56H载体中，得到pic-R2质粒。用BglII线性化后，用电转化法将载体转化至毕赤酵母GS115菌株的感受态细胞中。将转化物接种于MGYS平板上，30℃培养3天，得到pic-R2的毕赤酵母转化子。挑取平板上的单克隆，至 BMM-大豆磷脂筛选平板上，选取白色沉淀圈大的克隆，命名为R2。

取R1和R2。先在液体YPD中活化，然后接种于BMGY培养基中，在30℃下，220rpm振荡培养过夜。将培养物转至BMMY培养基中，初始OD600为6。

将R1和R2的浓缩发酵液分别用pH5.0,5.6,6.0,6.6 0.1M柠檬酸- 柠檬酸钠缓冲液和pH7.5 0.1M的Tris-HCl稀释600倍后，放置于55 ℃的水浴中保温2小时后，进行磷脂酶活力测定，以放置于4℃条件下的样品作为对照，测定方法如下：

结果如图1所示，R1和R2的热稳定性均不如pic-AN02m1，说明 L86I，G187D，E209K，A245D四个突变位点组合在一起，才能达到热稳定性的最优效果。

序列表

<110> 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司

<120> 具有溶血磷脂酶和/或磷脂酶活力的蛋白

<130> 111

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

atgtttctcc gcagggaatt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

ctacgagcat tcactaatgt 20

<210> 3

<211> 1072

<212> DNA

<213> 黑曲霉（Aspergillus niger）

<400> 3

atgtttctcc gcagggaatt tggggctgtt gcagccctat ctgtgctggc ccatgctgct 60

cccgcacctg ctccgatgca gcgtagaggt aagacacact taccaatttg cagaacaccc 120

gctaacctac tcagacatct cctctaccgt cttggacaat atcgacctct tcgcccaata 180

cagtgcagca gcttactgct cctcgaacat cgagtccacc ggcacgactc tgacctgcga 240

cgtaggcaat tgccctctcg tcgaggcagc cggtgccacg accatcgatg agtttgacga 300

gtaagccaat ccaaccccaa catcttcccc cacttggcat ccagctcaca cccccatagc 360

accagcagct acggcgaccc gactgggttc atcgccgttg acccaacgaa cgagttaatt 420

gttctgtctt tccggggtag ttccgacctc tcgaactgga ttgccgacct agacttcggc 480

ctcacctccg taagcagcat ctgtgatggc tgtgagatgc acaagggctt ctacgaggcc 540

tgggaagtca tcgcggacac catcactagc aaggtggagg ctgctgtctc cagctatccg 600

gactacaccc tcgtgttcac tggacacagc tacggcgctg cattggcggc tgtcgcggcc 660

accgtgctcc gcaacgccgg atacactctt gacctggtaa gttcctactc ttttatcctt 720

gtaacgttcc cccatcattc ggatggtcta ctaacacaat caacagtaca acttcggcca 780

gccccgtatt ggcaacctcg ccttagccga ctatatcacc ggccaaaata tgggcagcaa 840

ctaccgcgtc acgcacaccg atgacatcgt gcctaagctg cctccggagc tgctgggcta 900

ccaccacttc agcccggagt actggatcac cagcggtaat gatgtgacgg tgactacgtc 960

ggacgtgacc gaggtcgtgg gggtggattc gacggctggg aatgacggca cgctgcttga 1020

cagtacgact gcccatcggt ggtacacgat ctacattagt gaatgctcgt ag 1072

<210> 4

<211> 1072

<212> DNA

<213> 黑曲霉（Aspergillus niger）

<400> 4

atgtttctcc gcagggaatt tggggctgtt gcagccctat ctgtgctggc ccatgctgct 60

cccgcacctg ctccgatgca gcgtagaggt aagacacact tacccatttg cagaaattcc 120

gctaatatac tcagacatct cctctaccgt cttggacaat atcgacctct tcgcccaata 180

cagtgcagca gcttactgct cctccaacat cgagtccacc ggcacgactc tgacctgcga 240

cgtaggcaat tgccctctcg tcgaggcagc cggtgccacg accatcgatg agtttgacga 300

gtaagccaat ccaaccccaa cgtctcctcc cacttggcat ccagctcaca cccccatagc 360

agcagcagct acggcgaccc gacggggttc atcgccgttg acccgacgaa cgagttaatc 420

gttctgtctt tccggggcag ttccgacctc tcgaactgga ttgccgacct agacttcggc 480

ctcacatccg taagcagcat ctgtgatggc tgtgagatgc acaagggctt ctacgaggcc 540

tgggaagtca ttgccgacac catcacatcc aaggtggagg ccgccgtctc cagctatccg 600

gactacaccc tcgtgttcac cggacacagc tacggcgctg cattggcggc tgtcgcggcc 660

accgtgctcc gcaacgccgg atacactctt gacctggtaa gttcctactc ttttatcctt 720

gtaatgttcc tccgtcattc ggatagtcta ctaaatcaat cgacagtaca acttcggcca 780

gccccgtatt ggcaacctcg ccttagccga ctacatcacc gaccaaaaca tgggcagcaa 840

ctaccgcgtc acgcacaccg atgacatcgt gcctaagctg cctccggagc tgctgggcta 900

ccaccacttc agtccggagt actggatcac cagcggcaat gatgtgacgg tgacaacgtc 960

ggacgtcacc gaggtcgtgg gggtggattc gacggctggg aatgacggca cgctgcttga 1020

cagtacgact gcccatcggt ggtacacgat ctacattagt gaatgctcgt ag 1072

<210> 5

<211> 298

<212> PRT

<213> 黑曲霉（Aspergillus niger）

<400> 5

Met Phe Leu Arg Arg Glu Phe Gly Ala Val Ala Ala Leu Ser Val Leu

1 5 10 15

Ala His Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Met Gln Arg Arg Asp Ile Ser

20 25 30

Ser Thr Val Leu Asp Asn Ile Asp Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala

35 40 45

Ala Tyr Cys Ser Ser Asn Ile Glu Ser Thr Gly Thr Thr Leu Thr Cys

50 55 60

Asp Val Gly Asn Cys Pro Leu Val Glu Ala Ala Gly Ala Thr Thr Ile

65 70 75 80

Asp Glu Phe Asp Asp Thr Ser Ser Tyr Gly Asp Pro Thr Gly Phe Ile

85 90 95

Ala Val Asp Pro Thr Asn Glu Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser

100 105 110

Ser Asp Leu Ser Asn Trp Ile Ala Asp Leu Asp Phe Gly Leu Thr Ser

115 120 125

Val Ser Ser Ile Cys Asp Gly Cys Glu Met His Lys Gly Phe Tyr Glu

130 135 140

Ala Trp Glu Val Ile Ala Asp Thr Ile Thr Ser Lys Val Glu Ala Ala

145 150 155 160

Val Ser Ser Tyr Pro Asp Tyr Thr Leu Val Phe Thr Gly His Ser Tyr

165 170 175

Gly Ala Ala Leu Ala Ala Val Ala Ala Thr Val Leu Arg Asn Ala Gly

180 185 190

Tyr Thr Leu Asp Leu Tyr Asn Phe Gly Gln Pro Arg Ile Gly Asn Leu

195 200 205

Ala Leu Ala Asp Tyr Ile Thr Gly Gln Asn Met Gly Ser Asn Tyr Arg

210 215 220

Val Thr His Thr Asp Asp Ile Val Pro Lys Leu Pro Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Tyr His His Phe Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Asn Asp

245 250 255

Val Thr Val Thr Thr Ser Asp Val Thr Glu Val Val Gly Val Asp Ser

260 265 270

Thr Ala Gly Asn Asp Gly Thr Leu Leu Asp Ser Thr Thr Ala His Arg

275 280 285

Trp Tyr Thr Ile Tyr Ile Ser Glu Cys Ser

290 295

<210> 6

<211> 298

<212> PRT

<213> 黑曲霉（Aspergillus niger）

<400> 6

Met Phe Leu Arg Arg Glu Phe Gly Ala Val Ala Ala Leu Ser Val Leu

1 5 10 15

Ala His Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Met Gln Arg Arg Asp Ile Ser

20 25 30

Ser Thr Val Leu Asp Asn Ile Asp Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala

35 40 45

Ala Tyr Cys Ser Ser Asn Ile Glu Ser Thr Gly Thr Thr Leu Thr Cys

50 55 60

Asp Val Gly Asn Cys Pro Leu Val Glu Ala Ala Gly Ala Thr Thr Ile

65 70 75 80

Asp Glu Phe Asp Asp Ser Ser Ser Tyr Gly Asp Pro Thr Gly Phe Ile

85 90 95

Ala Val Asp Pro Thr Asn Glu Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser

100 105 110

Ser Asp Leu Ser Asn Trp Ile Ala Asp Leu Asp Phe Gly Leu Thr Ser

115 120 125

Val Ser Ser Ile Cys Asp Gly Cys Glu Met His Lys Gly Phe Tyr Glu

130 135 140

Ala Trp Glu Val Ile Ala Asp Thr Ile Thr Ser Lys Val Glu Ala Ala

145 150 155 160

Val Ser Ser Tyr Pro Asp Tyr Thr Leu Val Phe Thr Gly His Ser Tyr

165 170 175

Gly Ala Ala Leu Ala Ala Val Ala Ala Thr Val Leu Arg Asn Ala Gly

180 185 190

Tyr Thr Leu Asp Leu Tyr Asn Phe Gly Gln Pro Arg Ile Gly Asn Leu

195 200 205

Ala Leu Ala Asp Tyr Ile Thr Asp Gln Asn Met Gly Ser Asn Tyr Arg

210 215 220

Val Thr His Thr Asp Asp Ile Val Pro Lys Leu Pro Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Tyr His His Phe Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Asn Asp

245 250 255

Val Thr Val Thr Thr Ser Asp Val Thr Glu Val Val Gly Val Asp Ser

260 265 270

Thr Ala Gly Asn Asp Gly Thr Leu Leu Asp Ser Thr Thr Ala His Arg

275 280 285

Trp Tyr Thr Ile Tyr Ile Ser Glu Cys Ser

290 295

<210> 7

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 7

cccaagcttt ttccaactca atttacctct atccacactt ctcttccttc ctcaatcctc 60

tatatacaca actggggatc cttcaccatg atggtcgcgt ggtggtct 108

<210> 8

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 8

atgatggtcg cgtggtggtc tctatttctg tacggccttc aggtcgcggc acctgctttg 60

gctgctcccg cacctgctcc gat 83

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 9

acatgcatgc ctaggagcac tcggag 26

<210> 10

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 10

tttccaactc aatttacctc tatccacact tctcttcctt cctcaatcct ctatatacac 60

aactggggat ccttcacc 78

<210> 11

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 11

atgatggtcg cgtggtggtc tctatttctg tacggccttc aggtcgcggc acctgctttg 60

gct 63

<210> 12

<211> 279

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 12

Ala Pro Ala Pro Ala Pro Met Gln Arg Arg Asp Ile Ser Ser Thr Val

1 5 10 15

Leu Asp Asn Ile Asp Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys

20 25 30

Ser Ser Asn Ile Glu Ser Thr Gly Thr Thr Leu Thr Cys Asp Val Gly

35 40 45

Asn Cys Pro Leu Val Glu Ala Ala Gly Ala Thr Thr Ile Asp Glu Phe

50 55 60

Asp Asp Thr Ser Ser Tyr Gly Asp Pro Thr Gly Phe Ile Ala Val Asp

65 70 75 80

Pro Thr Asn Glu Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Ser Asp Leu

85 90 95

Ser Asn Trp Ile Ala Asp Leu Asp Phe Gly Leu Thr Ser Val Ser Ser

100 105 110

Ile Cys Asp Gly Cys Glu Met His Lys Gly Phe Tyr Glu Ala Trp Glu

115 120 125

Val Ile Ala Asp Thr Ile Thr Ser Lys Val Glu Ala Ala Val Ser Ser

130 135 140

Tyr Pro Asp Tyr Thr Leu Val Phe Thr Gly His Ser Tyr Gly Ala Ala

145 150 155 160

Leu Ala Ala Val Ala Ala Thr Val Leu Arg Asn Ala Gly Tyr Thr Leu

165 170 175

Asp Leu Tyr Asn Phe Gly Gln Pro Arg Ile Gly Asn Leu Ala Leu Ala

180 185 190

Asp Tyr Ile Thr Gly Gln Asn Met Gly Ser Asn Tyr Arg Val Thr His

195 200 205

Thr Asp Asp Ile Val Pro Lys Leu Pro Pro Glu Leu Leu Gly Tyr His

210 215 220

His Phe Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Asn Asp Val Thr Val

225 230 235 240

Thr Thr Ser Asp Val Thr Glu Val Val Gly Val Asp Ser Thr Ala Gly

245 250 255

Asn Asp Gly Thr Leu Leu Asp Ser Thr Thr Ala His Arg Trp Tyr Thr

260 265 270

Ile Tyr Ile Ser Glu Cys Ser

275

<210> 13

<211> 279

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 13

Ala Pro Ala Pro Ala Pro Met Gln Arg Arg Asp Ile Ser Ser Thr Val

1 5 10 15

Leu Asp Asn Ile Asp Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys

20 25 30

Ser Ser Asn Ile Glu Ser Thr Gly Thr Thr Leu Thr Cys Asp Val Gly

35 40 45

Asn Cys Pro Leu Val Glu Ala Ala Gly Ala Thr Thr Ile Asp Glu Phe

50 55 60

Asp Asp Thr Ser Ser Tyr Gly Asp Pro Thr Gly Phe Ile Ala Val Asp

65 70 75 80

Pro Thr Asn Glu Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Ser Asp Ile

85 90 95

Ser Asn Trp Ile Ala Asp Leu Asp Phe Gly Leu Thr Ser Val Ser Ser

100 105 110

Ile Cys Asp Gly Cys Glu Met His Lys Gly Phe Tyr Glu Ala Trp Glu

115 120 125

Val Ile Ala Asp Thr Ile Thr Ser Lys Val Glu Ala Ala Val Ser Ser

130 135 140

Tyr Pro Asp Tyr Thr Leu Val Phe Thr Gly His Ser Tyr Gly Ala Ala

145 150 155 160

Leu Ala Ala Val Ala Ala Thr Val Leu Arg Asn Ala Gly Tyr Thr Leu

165 170 175

Asp Leu Tyr Asn Phe Gly Gln Pro Arg Ile Gly Asn Leu Ala Leu Ala

180 185 190

Asp Tyr Ile Thr Asp Gln Asn Met Gly Ser Asn Tyr Arg Val Thr His

195 200 205

Thr Asp Asp Ile Val Pro Lys Leu Pro Pro Lys Leu Leu Gly Tyr His

210 215 220

His Phe Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Asn Asp Val Thr Val

225 230 235 240

Thr Thr Ser Asp Val Thr Glu Val Val Gly Val Asp Ser Thr Asp Gly

245 250 255

Asn Asp Gly Thr Leu Leu Asp Ser Thr Thr Ala His Arg Trp Tyr Thr

260 265 270

Ile Tyr Ile Ser Glu Cys Ser

275

<210> 14

<211> 279

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 14

Ala Pro Ala Pro Ala Pro Met Gln Arg Arg Asp Ile Ser Ser Thr Val

1 5 10 15

Leu Asp Asn Ile Asp Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys

20 25 30

Ser Ser Asn Ile Glu Ser Thr Gly Thr Thr Leu Thr Cys Asp Val Gly

35 40 45

Asn Cys Pro Leu Val Glu Ala Ala Gly Ala Thr Thr Ile Asp Glu Phe

50 55 60

Asp Asp Thr Ser Ser Tyr Gly Asp Pro Thr Gly Phe Ile Ala Val Asp

65 70 75 80

Pro Thr Asn Glu Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Ser Asp Leu

85 90 95

Ser Asn Trp Ile Ala Asp Leu Asp Phe Gly Leu Thr Ser Val Ser Ser

100 105 110

Ile Cys Asp Gly Cys Glu Met His Lys Gly Phe Tyr Glu Ala Trp Glu

115 120 125

Val Ile Ala Asp Thr Ile Thr Ser Lys Val Glu Ala Ala Val Ser Ser

130 135 140

Tyr Pro Asp Tyr Thr Leu Val Phe Thr Gly His Ser Tyr Gly Ala Ala

145 150 155 160

Leu Ala Ala Val Ala Ala Thr Val Leu Arg Asn Ala Gly Tyr Thr Leu

165 170 175

Asp Leu Tyr Asn Phe Gly Gln Pro Arg Ile Gly Asn Leu Ala Leu Ala

180 185 190

Asp Tyr Ile Thr Asp Gln Asn Met Gly Ser Asn Tyr Arg Val Thr His

195 200 205

Thr Asp Asp Ile Val Pro Lys Leu Pro Pro Glu Leu Leu Gly Tyr His

210 215 220

His Phe Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Asn Asp Val Thr Val

225 230 235 240

Thr Thr Ser Asp Val Thr Glu Val Val Gly Val Asp Ser Thr Asp Gly

245 250 255

Asn Asp Gly Thr Leu Leu Asp Ser Thr Thr Ala His Arg Trp Tyr Thr

260 265 270

Ile Tyr Ile Ser Glu Cys Ser

275

<210> 15

<211> 279

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 15

Ala Pro Ala Pro Ala Pro Met Gln Arg Arg Asp Ile Ser Ser Thr Val

1 5 10 15

Leu Asp Asn Ile Asp Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys

20 25 30

Ser Ser Asn Ile Glu Ser Thr Gly Thr Thr Leu Thr Cys Asp Val Gly

35 40 45

Asn Cys Pro Leu Val Glu Ala Ala Gly Ala Thr Thr Ile Asp Glu Phe

50 55 60

Asp Asp Thr Ser Ser Tyr Gly Asp Pro Thr Gly Phe Ile Ala Val Asp

65 70 75 80

Pro Thr Asn Glu Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Ser Asp Ile

85 90 95

Ser Asn Trp Ile Ala Asp Leu Asp Phe Gly Leu Thr Ser Val Ser Ser

100 105 110

Ile Cys Asp Gly Cys Glu Met His Lys Gly Phe Tyr Glu Ala Trp Glu

115 120 125

Val Ile Ala Asp Thr Ile Thr Ser Lys Val Glu Ala Ala Val Ser Ser

130 135 140

Tyr Pro Asp Tyr Thr Leu Val Phe Thr Gly His Ser Tyr Gly Ala Ala

145 150 155 160

Leu Ala Ala Val Ala Ala Thr Val Leu Arg Asn Ala Gly Tyr Thr Leu

165 170 175

Asp Leu Tyr Asn Phe Gly Gln Pro Arg Ile Gly Asn Leu Ala Leu Ala

180 185 190

Asp Tyr Ile Thr Gly Gln Asn Met Gly Ser Asn Tyr Arg Val Thr His

195 200 205

Thr Asp Asp Ile Val Pro Lys Leu Pro Pro Lys Leu Leu Gly Tyr His

210 215 220

His Phe Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Asn Asp Val Thr Val

225 230 235 240

Thr Thr Ser Asp Val Thr Glu Val Val Gly Val Asp Ser Thr Ala Gly

245 250 255

Asn Asp Gly Thr Leu Leu Asp Ser Thr Thr Ala His Arg Trp Tyr Thr

260 265 270

Ile Tyr Ile Ser Glu Cys Ser

275

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 16

tccccgcggc gaaacgatga gatttccttc 30

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 17

ccggaattct taagaacact cagaaatg 28

<210> 18

<211> 1020

<212> DNA

<213> Rhizomucor miehei

<400> 18

gtgccaatca agagacaatc aaacagcacg gtggatagtc tgccacccct catcccctct 60

cgaacctcgg caccttcatc atcaccaagc acaaccgacc ctgaagctcc agccatgagt 120

cgcaatggac cgctgccctc ggatgtagag actaaatatg gcatggcttt gaatgctact 180

tcctatccgg attctgtggt ccaagcaatg agcattgatg gtggtatccg cgctgcgacc 240

tcgcaagaaa tcaatgaatt gacttattac actacactat ctgccaactc gtactgccgc 300

actgtcattc ctggagctac ctgggactgt atccactgtg atgcaacgga ggatctcaag 360

attatcaaga cttggagcac gctcatctat gatacaaatg caatggttgc acgtggtgac 420

agcgaaaaaa ctatctatat cgttttccga ggttcgagct ctatccgcaa ctggattgct 480

gatctcacct ttgtgccagt ttcatatcct ccggtcagtg gtacaaaagt acacaaggga 540

ttcctggaca gttacgggga agttcaaaac gagcttgttg ctactgttct tgatcaattc 600

aagcaatatc caagctacaa ggttgctgtt acaggtcact cactcggtgg tgctactgcg 660

ttgctttgcg ccctgggtct ctatcaacga gaagaaggac tctcatccag caacttgttc 720

ctttacactc aaggtcaacc acgggtaggc gaccctgcct ttgccaacta cgttgttagc 780

accggcattc cttacaggcg cacggtcaat gaacgagata tcgttcctca tcttccacct 840

gctgcttttg gttttctcca cgctggcgag gagtattgga ttactgacaa tagcccagag 900

actgttcagg tctgcacaag cgatctggaa acctctgatt gctctaacag cattgttccc 960

ttcacaagtg ttcttgacca tctctcgtac tttggtatca acacaggcct ctgtacttaa 1020

<210> 19

<211> 339

<212> PRT

<213> Rhizomucor miehei

<400> 19

Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser Leu Pro Pro

1 5 10 15

Leu Ile Pro Ser Arg Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro Ser Thr Thr

20 25 30

Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met Ser Arg Asn Gly Pro Leu Pro Ser Asp

35 40 45

Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala Leu Asn Ala Thr Ser Tyr Pro Asp

50 55 60

Ser Val Val Gln Ala Met Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala Ala Thr

65 70 75 80

Ser Gln Glu Ile Asn Glu Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn

85 90 95

Ser Tyr Cys Arg Thr Val Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His

100 105 110

Cys Asp Ala Thr Glu Asp Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu

115 120 125

Ile Tyr Asp Thr Asn Ala Met Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr

130 135 140

Ile Tyr Ile Val Phe Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg Asn Trp Ile Ala

145 150 155 160

Asp Leu Thr Phe Val Pro Val Ser Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys

165 170 175

Val His Lys Gly Phe Leu Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu

180 185 190

Val Ala Thr Val Leu Asp Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val

195 200 205

Ala Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala

210 215 220

Leu Asp Leu Tyr Gln Arg Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Asn Leu Phe

225 230 235 240

Leu Tyr Thr Gln Gly Gln Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn

245 250 255

Tyr Val Val Ser Thr Gly Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg

260 265 270

Asp Ile Val Pro His Leu Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala

275 280 285

Gly Glu Glu Tyr Trp Ile Thr Asp Asn Ser Pro Glu Thr Val Gln Val

290 295 300

Cys Thr Ser Asp Leu Glu Thr Ser Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro

305 310 315 320

Phe Thr Ser Val Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly

325 330 335

Leu Cys Thr

<210> 20

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 20

gtcgtgtcgg gcatttatcg ggggatggac caatcagcgt agg 43

<210> 21

<211> 840

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 21

gctccagctc ctgcaccaat gcaaagaaga gatatttctt ctaccgtttt ggataacatt 60

gatttgttcg ctcaatactc cgctgctgct tactgttctt ctaacattga gtctactggt 120

accactttga cttgtgacgt tggtaactgt ccattggttg aggctgctgg tgctaccact 180

attgatgagt tcgatgatac ttcctcttac ggtgatccta ctggtttcat tgctgttgac 240

cctactaacg agttgattgt tttgtctttt agaggttctt ctgacttgtc taactggatt 300

gctgatttgg atttcggttt gacttctgtt tcttctattt gtgacggttg tgaaatgcac 360

aagggtttct atgaagcctg ggaagttatt gctgatacta ttacttctaa ggttgaagct 420

gctgtttctt cttacccaga ttacactttg gttttcaccg gtcactctta cggtgctgcc 480

ttggctgctg ttgctgctac tgttttgaga aacgctggtt acactttgga tttgtacaac 540

tttggtcaac caagaattgg taacttggct ttggctgact acattactgg tcaaaacatg 600

ggttctaact acagagttac tcacactgat gatattgttc ctaagttgcc accagagttg 660

ttgggttacc accacttctc cccagagtac tggattactt ctggtaacga tgttactgtt 720

accacttctg atgttactga ggttgttggt gttgattcca ccgctggtaa cgatggtact 780

ttgttggact ctactactgc tcacagatgg tacaccattt acatttctga gtgttcttaa 840

<210> 22

<211> 840

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 22

gctccagctc ctgcaccaat gcaaagaaga gatatttctt ctaccgtttt ggataacatt 60

gatttgttcg ctcaatactc cgctgctgct tactgttctt ctaacattga gtctactggt 120

accactttga cttgtgacgt tggtaactgt ccattggttg aggctgctgg tgctaccact 180

attgatgagt tcgatgatac ttcctcttac ggtgatccta ctggtttcat tgctgttgac 240

cctactaacg agttgattgt tttgtctttt agaggttctt ctgacatctc taactggatt 300

gctgatttgg atttcggttt gacttctgtt tcttctattt gtgacggttg tgaaatgcac 360

aagggtttct atgaagcctg ggaagttatt gctgatacta ttacttctaa ggttgaagct 420

gctgtttctt cttacccaga ttacactttg gttttcaccg gtcactctta cggtgctgcc 480

ttggctgctg ttgctgctac tgttttgaga aacgctggtt acactttgga tttgtacaac 540

tttggtcaac caagaattgg taacttggct ttggctgact acattactga tcaaaacatg 600

ggttctaact acagagttac tcacactgat gatattgttc ctaagttgcc accaaagttg 660

ttgggttacc accacttctc cccagagtac tggattactt ctggtaacga tgttactgtt 720

accacttctg atgttactga ggttgttggt gttgattcca ccgatggtaa cgatggtact 780

ttgttggact ctactactgc tcacagatgg tacaccattt acatttctga gtgttcttaa 840

<210> 23

<211> 840

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 23

gctccagctc ctgcaccaat gcaaagaaga gatatttctt ctaccgtttt ggataacatt 60

gatttgttcg ctcaatactc cgctgctgct tactgttctt ctaacattga gtctactggt 120

accactttga cttgtgacgt tggtaactgt ccattggttg aggctgctgg tgctaccact 180

attgatgagt tcgatgatac ttcctcttac ggtgatccta ctggtttcat tgctgttgac 240

cctactaacg agttgattgt tttgtctttt agaggttctt ctgacctctc taactggatt 300

gctgatttgg atttcggttt gacttctgtt tcttctattt gtgacggttg tgaaatgcac 360

aagggtttct atgaagcctg ggaagttatt gctgatacta ttacttctaa ggttgaagct 420

gctgtttctt cttacccaga ttacactttg gttttcaccg gtcactctta cggtgctgcc 480

ttggctgctg ttgctgctac tgttttgaga aacgctggtt acactttgga tttgtacaac 540

tttggtcaac caagaattgg taacttggct ttggctgact acattactga tcaaaacatg 600

ggttctaact acagagttac tcacactgat gatattgttc ctaagttgcc accagagttg 660

ttgggttacc accacttctc cccagagtac tggattactt ctggtaacga tgttactgtt 720

accacttctg atgttactga ggttgttggt gttgattcca ccgatggtaa cgatggtact 780

ttgttggact ctactactgc tcacagatgg tacaccattt acatttctga gtgttcttaa 840

<210> 24

<211> 840

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 24

gctccagctc ctgcaccaat gcaaagaaga gatatttctt ctaccgtttt ggataacatt 60

gatttgttcg ctcaatactc cgctgctgct tactgttctt ctaacattga gtctactggt 120

accactttga cttgtgacgt tggtaactgt ccattggttg aggctgctgg tgctaccact 180

attgatgagt tcgatgatac ttcctcttac ggtgatccta ctggtttcat tgctgttgac 240

cctactaacg agttgattgt tttgtctttt agaggttctt ctgacatctc taactggatt 300

gctgatttgg atttcggttt gacttctgtt tcttctattt gtgacggttg tgaaatgcac 360

aagggtttct atgaagcctg ggaagttatt gctgatacta ttacttctaa ggttgaagct 420

gctgtttctt cttacccaga ttacactttg gttttcaccg gtcactctta cggtgctgcc 480

ttggctgctg ttgctgctac tgttttgaga aacgctggtt acactttgga tttgtacaac 540

tttggtcaac caagaattgg taacttggct ttggctgact acattactgg tcaaaacatg 600

ggttctaact acagagttac tcacactgat gatattgttc ctaagttgcc accaaagttg 660

ttgggttacc accacttctc cccagagtac tggattactt ctggtaacga tgttactgtt 720

accacttctg atgttactga ggttgttggt gttgattcca ccgctggtaa cgatggtact 780

ttgttggact ctactactgc tcacagatgg tacaccattt acatttctga gtgttcttaa 840

Claims

1.一种具有溶血磷脂酶和/或磷脂酶活力的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：12所示序列相比存在以下突变中的至少1个：L86I，G187D，E209K和A245D。

2.如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白具有SEQ ID NO：13所示序列。

3.一种多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列选自：(1)编码权利要求1或2所述的多肽的多核苷酸；(2)与(1)所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸；和(3)(1)或(2)所述的多核苷酸的长10-40个碱基的片段；优选地，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO：22所示。

4.一种多核苷酸构建物，其特征在于，所述多核苷酸构建物含有权利要求3所述的多核苷酸序列；优选地，所述多核苷酸构建物是表达载体或克隆载体。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞：(1)表达权利要求1或2所述的多肽；和/或(2)含有权利要求3所述的多核苷酸序列或权利要求4所述的多核苷酸构建物，所述宿主细胞优选选自原核或真核微生物，所述宿主细胞优选选自黑曲霉、毕赤酵母、大肠杆菌、芽孢杆菌属、里氏木霉和/或米曲霉。

6.一种包含权利要求1或2所述的蛋白的组合物，所述组合物优选为酶组合物，优选的，所述酶组合物还包括磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶B、磷脂酶C、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶和/或纤维素酶中的一种或多种。

7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述组合物为权利要求5所述的宿主细胞的发酵表达物，例如，发酵液、发酵浓缩液、发酵上清液、发酵液制备的酶制剂。

8.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有权利要求1或2所述的蛋白和任选的辅料，优选地，所述辅料为选自活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃的吸附材料。

9.制备权利要求1或2所述的蛋白的方法，包括发酵权利要求5的宿主细胞的步骤。

10.权利要求1或2所述的多肽、权利要求3所述的多核苷酸序列、权利要求4所述的核酸构建体、权利要求5所述的宿主细胞或权利要求6-8中任一项所述的组合物在植物油脱胶、面包面团改性、淀粉水解产物处理、溶血磷脂酶制备和/或L-α-甘油磷酸胆碱中的应用。