CN115433725A - 甘油单-二酰酯脂肪酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种甘油单‑二酰酯脂肪酶突变体及其应用。该脂肪酶突变体为在SEQ ID NO:2限定的氨基酸序列进行定点组合突变得到，突变位点包括：E257P，I260L，V264G，Q265L，A268T，G269C，K270L，并使氨基酸的编码提前终止于第271位的氨基酸。与野生型序列相比，本发明的脂肪酶突变体不仅在相同目标基因拷贝数条件下蛋白产量明显提高，而且酶的热稳定性也得到显著提升。
Description
技术领域
本发明涉及甘油单-二酰酯脂肪酶突变体及其应用。
背景技术
脂肪酶是酯酶的一种，可以催化甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯、其它小分子酯、多元醇酯和多元酸酯酯键的水解，脂肪为脂肪酶的天然底物，水解的过程中会产生甘油二酯和甘油单酯，水解最终产物为甘油和脂肪酸。脂肪酶水解条件温和，副产物少，不需要辅酶。脂肪多为疏水物质，因此水解反应发生在油水界面或者有机相中。甘油单-二酰酯脂肪酶(MDGL)是脂肪酶的一种，MDGL具有底物特异性，仅作用于甘油单酰酯(MAG)和甘油二酰酯(DAG)，对甘油三酰酯(TAG)不起催化作用，可以利用酯化或转酯化反应来生产具有较高工业价值的甘油单酰酯。
Yamaguchi等首先利用卡门柏青霉获得了MDGL，MDGL有2种形态，分子量分别为37KDa和39KDa，MDGL有26个氨基酸组成的信号肽，成熟肽包含279个氨基酸。Yamaguchi等以月桂酸乙烯酯为底物测定卡门柏青霉来源的MDGL酶活单位，经培养基过滤、乙醇纯化、硫酸铵沉淀、DEAE琼脂糖凝胶过滤、纤维素膜纯化和离子交换等纯化步骤后，MDGL的比酶活为6680U/mg。MDGL由mdlA编码，mdlA已经在毕赤酵母中获得表达。
MAG是一种优良的乳化剂，在食品、医药和化妆品工业中有广泛的应用。MAG的传统合成工艺是在高温下，以无机碱为催化剂，在氮气条件下通过油脂/甘油三酯与甘油连续酯化进行生产，产物为MAG、DAG和TAG的混合物，通过蒸馏获得MAG，MAG的产率为40-50％。与传统合成工艺不同，酶法合成MAG是以脂肪酸和甘油为底物，在温和条件下催化合成MAG，酶法催化中脂肪酸的转化率超过97％，MAG在产物中的占比超过74％。目前限制酶法应用的主要问题是酶的活力较低和酶的成本较高。
2020年，深圳市永年营养科技有限公司推出使用MDGL生产的食品级甘油二酯食用烹调油，甘油二酯含量超过80％，售价为180元/500ml，公司核心专利之一为“一种偏甘油酯脂肪酶突变体及其应用，CN 108642026 A”，氨基酸突变位点包括：Y84R，M209A，I260E，I260R，突变体大幅提高了偏甘油酯脂肪酶的热稳定性和过氧化氢耐受性。华南理工大学王永华教授团队针对MDGL做了其它突变，其中D25R，Tm值比PCL-WT提高了3℃，最适温度提高了5℃，有盐桥形成，增加了蛋白的稳定性。研究发现，MDGL的F256是影响TAG结合的关键氨基酸，F256的侧链占据TAG的sn-1脂肪酸结合位置，使得MDGL无法与TAG结合。F256与W88形成的桥式结构将催化口袋分为两个区域，口袋只能结合DAG。S83，S145，H259和D199对酶的活力至关重要，如果将其中任意一个氨基酸突变为丙氨酸，均不会产生有活力的MDGL。
S Yamaguchi等将Penicillium camembertii U-150来源的MDGL在米曲霉中使用其自身的启动子进行表达，最高蛋白产量为1g/L，MDGL可以在巴斯德毕赤酵母和酿酒酵母中表达，但目前没有发酵罐测试结果。
本领域中需要改进的(例如酶活性更高、热稳定性更高)甘油单-二酰酯脂肪酶。
发明内容
本发明第一方面提供一种具有甘油单-二酰酯脂肪酶活性的多肽，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：
(a)如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，以及
(b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，所述取代优选为氨基酸保守性取代，并且所述序列仍然保持SEQ ID NO:4的功能。
本发明第二方面提供一种核酸分子，选自：(1)编码本发明所述多肽的多核苷酸序列或与(1)所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明第三方面提供一种核酸构建体，其包含本发明所述的多核苷酸序列。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建体是克隆载体或表达载体。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建体还包含调节所述多核苷酸表达的调控序列，其中所述多核苷酸与调控序列可操作地连接。
本发明第四方面提供一种宿主细胞，其包含本发明所述的核酸分子，或本发明所述的核酸构建体。
在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞是毕赤酵母细胞。
在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞包含至少一个拷贝的如本发明所述的多核苷酸序列，或包含至少一个拷贝的如本发明所述的核酸构建体。
本发明第五方面提供一种分离的多肽，由本发明所述的宿主细胞表达产生。
本发明第六方面提供一种组合物，所述组合物含有本发明任一实施方案所述的多肽。
在一个或多个实施方案中，所述组合物用于制备甘油单酰酯。
本发明第七方面提供本发明所述的多肽、核酸分子、核酸构建体、宿主细胞以及组合物在甘油单酯乳化剂的合成，或甘油单酯和甘油二酯的水解中的应用。
本发明以来源于Penicilliurn camembertii U-150的mdlA基因为基础，根据巴斯德毕赤酵母的密码子偏好性，对编码成熟蛋白的序列进行密码子优化，合成的基因以巴斯德毕赤酵母m2H为表达宿主，并通过定点突变获得一个高水解活力和热稳定性提高的突变子。
本发明使用的MDGL编码基因序列来源于Penicilliurn camembertii U-150(genebank号：BAA14345.1)，对MDGL的部分氨基酸进行定点组合突变，突变位点包括：将MDGL的E257P，I260L，V264G，Q265L，A268T，G269C，K270L，并使氨基酸的编码提前终止于第271位的氨基酸，突变子命名为MDGL-MC，密码子根据巴斯德毕赤酵母的密码子偏好性进行优化，优化后的基因由生工生物工程有限公司合成，合成好的基因连接到pUC57中。MDGL-MC表达菌株构建方法参考CN106884009和Invitrogen公司毕赤酵母表达手册。pUC57-MDGL-MC用AvrII和EcoRI酶切，连接到pPIC9K(AvrII和EcoRI酶切)载体上，连接好的载体转入大肠杆菌DH5α，挑选单克隆进行菌落PCR验证，阳性菌株测序验证，测序结果正确的菌株用于提取质粒，质粒经salI线性化后电击法转化毕赤酵母m316H，转化物在不含组氨酸的筛选培养基上筛选，只有转化有外源基因片段的重组毕赤酵母才能在筛选培养基上生长。将筛选培养基上的菌落转接到BMMY-橄榄油筛选培养基平板上，根据水解圈大小挑选克隆，进行摇瓶发酵，得到含不同拷贝数目的基因的重组毕赤酵母m316-MDGL-MC，测定含不同拷贝数目的基因菌株的蛋白产量，另外对等体积的发酵蛋白进行SDS-PAGE分析，比较突变体和野生MDGL的蛋白产量。另外，将MDGL和MDGL-MC分别进行保温处理，测定酶活残留量。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
本发明中提供的MDGL突变子在相同目标基因拷贝数条件下蛋白产量明显提高，同时酶的热稳定性明显提升。
附图说明
图1为MDGL和MDGL-MC三角瓶发酵蛋白产量和生产强度。
图2为MDGL-MC和MDGL热处理后酶活残留率。
图3为突变子和野生型MDGL SDS-PAGE分析。
具体实施方式
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
本文中，术语“脂肪酶”是指如酶命名法所定义的EC3.1.1类中的一种酶。它可以具有脂肪酶活性(三酰基甘油脂肪酶，EC3.1.1.3)、角质酶活性(EC3.1.1.74)、固醇酯酶活性(EC3.1.1.13)和/或蜡酯水解酶活性(EC3.1.1.50)。本发明个中所述的MDGL即甘油单-二酰酯脂肪酶，是脂肪酶的一种，MDGL具有底物特异性，仅作用于甘油单酰酯(MAG)和甘油二酰酯(DAG)，对甘油三酰酯(TAG)不起催化作用，可以利用酯化或转酯化反应来生产具有较高工业价值的甘油单酰酯。
本文所述的多肽或分离的多肽是指在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列基础上进行突变而获得的多肽。本文中，“分离的”意指在自然界中不存在的一种形式或物质。分离的物质的非限制性例子包括任何非天然存在的物质和至少部分地从与其在自然界中相关联的一种或多种或全部天然存在的组分中除去的任何物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子。
本文中，突变包括取代、缺失和添加。取代意指将占据某位置的氨基酸用不同的氨基酸替代；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而添加(或插入)意指在邻接并紧接着占据某位置的氨基酸之后添加氨基酸。
本文中，序列相同性用于描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。可使用本领域周知的方法来计算序列相同性。例如，可使用EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等，2000，遗传学趋势，16:276-277)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman和Wunsch，1970，分子生物学杂志，48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列相同性。或者，可使用NCBI上的BLASTP来计算两条氨基酸序列之间的序列相同性。
本文所述的取代优选是保守性取代。保守取代的例子是在下组的范围内：极性带正电氨基酸(碱性氨基酸)包括(精氨酸R、赖氨酸K及组氨酸H)、极性带负电氨基酸(酸性氨基酸)包括(谷氨酸E和天冬氨酸D)、极性不带电氨基酸(甘氨酸G、丝氨酸S、苏氨酸T、半胱氨酸C、酪氨酸Y、谷氨酰胺Q和天冬酰胺N)、非极性疏水性氨基酸(丙氨酸A、脯氨酸P、苯丙氨酸F、色氨酸W、甲硫氨酸M、亮氨酸L、异亮氨酸I及缬氨酸C)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸F、色氨酸W及酪氨酸Y)及小氨基酸(甘氨酸G、丙氨酸A、丝氨酸S、苏氨酸T及甲硫氨酸M)。
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变来鉴定多肽中的必需氨基酸。在丙氨酸扫描诱变中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的脂肪酶活性以鉴定对分子的活性关键的氨基酸残基。酶或其他生物学相互作用的活性部位还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同对推定的接触位点氨基酸进行突变。还可以从与相关多肽的比对推断鉴别必需氨基酸。
在某些实施方案中，本发明也包括本文所述的多肽的具有脂肪酶活性的片段。
本文包括成熟多肽。“成熟多肽”指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。成熟多肽在氨基酸序列上前文任一实施方案所述的多肽的氨基酸序列完全相同，但在翻译过程中，可能会引入N端和/或C端修饰，和/或糖基化和/或磷酸化修饰。本领域中已知的是，一个宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。
本发明也包括多核苷酸序列，该多核苷酸序列为本文所述多肽的编码序列或其互补序列。本文中，编码序列指一种多核苷酸。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始，并且以一个终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。本文中，示例性的编码序列如SEQ IDNO:3所示。本文也包括SEQ ID NO:3的互补序列。
因此，在某些实施方案中，本文所述的多肽是由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:4所述的多肽的编码序列或(ii)(i)的全长补体杂交。在某些实施方案中，本文所述的多肽是由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:3所示的编码序列具有至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但是小于100％序列相同性。
本文中，“低严格条件”指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA以及25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。“中严格条件”指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。“中-高严格条件”指对于至少100个核苷酸长的探针来说，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切且变性的蛙鱼精子DNA以及35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。“非常高严格条件”指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。
本文所述的多核苷酸序列，如SEQ ID NO:3，可以用于设计核酸探针，以根据本领域中熟知的方法从不同属或物种的品系中鉴别和克隆出编码一种母体的DNA。具体地，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的对应基因。此类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如可在300个核苷酸以内。DNA和RNA探针二者均可使用。将对探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。可以使用所述探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得感兴趣的序列。用于直接地从自然生活环境分离微生物和DNA的技术是本领域中熟知的。然后可通过在另一种微生物或混合DNA样品的基因组DNA或cDNA文库中类似地进行筛选来获得感兴趣的多核苷酸。一旦获得感兴趣的多核苷酸，则可利用本领域普通技术人员熟知的技术来分离或克隆该多核苷酸(参见，例如，Sambrook等，1989)。因此，本文涵盖此类探针。在某些实施方案中，本文涉及用作探针的本发明多核苷酸序列的片段，该片段长度可在15-300、优选25-300或25-100个核苷酸范围内。
本文还提供一种核酸构建体，其含有本文所述的多核苷酸序列。本文中，核酸构建体指单链或双链核酸分子，其分离自天然存在的基因，或其被修饰成以本来在自然界中不存在的方式含有核酸的区段，或其为合成的，其包括一个或多个控制序列。控制序列指为编码本文所述多肽的一种多核苷酸的表达所需的核酸序列。每个控制序列对于编码序列来说可以是原生的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列以及转录终止子等。至少，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。通常，本文所述的多核苷酸序列与这些控制序列可操作地连接。可操作地连接指控制序列相对于本文所述多核苷酸放置在适当位置，以使得控制序列能指导该编码序列的表达。
因此，本文所述的核酸构建体含有可操作地连接至一个或多个控制序列上的本文所述的多核苷酸序列，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导该多核苷酸序列在适合的宿主细胞中的表达。
可以按多种方式来操纵该多核苷酸序列以提供本文所述多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵该多核苷酸序列可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域熟知的。
控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的多核苷酸。启动子包含介导本文所述多肽的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本文所述核酸构建体的转录的合适启动子的例子可从以下任一基因获得：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金杆菌cryIIIA基因、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、原核β-内酰胺酶基因以及tac启动子。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子可以是从以下任一基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶、镶片镰孢Daria(Fusarium venenatum Daria)、镶片镰孢Quinn(Fusarium venenatum Quinn)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切右旋糖酐酶I、里氏木霉内切右旋糖酐酶II、里氏木霉内切右旋糖酐酶III、里氏木霉内切右旋糖酐酶IV、里氏木霉内切右旋糖酐酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子。
在酵母宿主中，有用的启动子可从以下任一基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。
控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子序列被可操作地连接至编码本文所述多肽的多核苷酸的3’末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。
例如，用于细菌宿主细胞的优选终止子可以是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得的终止子。丝状真菌宿主细胞的优选终止子可以是从以下各项的基因中获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。用于酵母宿主细胞的优选终止子可从以下任一基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定子区，它增加该基因的表达。适合的mRNA稳定子区可以从以下基因获得：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因和枯草芽孢杆菌SP82基因。
控制序列还可以是前导序列，该序列是对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。前导子序列可操作地连接至编码本文所述多肽的多核苷酸的5’端。在宿主细胞中起作用的任何前导子都可以使用。例如，用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子可从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因中获得。用于酵母宿主细胞的前导子可从以下任一基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
控制序列还可以是多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至该变体编码序列的3’末端并且当转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mRNA上的信号的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。例如，用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列可从以下任一基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。用于酵母宿主细胞的聚腺苷酸化序列在Mol.Cellular Biol.，1995，15:5983-5990中描述。
控制序列还可以是信号肽编码区，编码与本文所述多肽的N-端连接的信号肽，并且引导该多肽进入细胞的分泌通路。该多核苷酸的5’端可以固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码本文所述多肽的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列5’端可以包括对于该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地置换天然信号肽编码序列，以便增加变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列可从以下任一基因获得：芽孢杆菌属NCIB11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢杆菌prsA。用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列可从以下任一基因获得：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑毛霉天冬氨酸蛋白酶。用于酵母宿主细胞的信号肽可获自以任一基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。
控制序列还可以是编码位于本文所述多肽的N端处的前肽的前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶或多肽原。多肽原通常是无活性的并且可以通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可从以下任一基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α因子。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻本文所述多肽的N端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N端。
在某些实施方案中，本文所述的核酸构建体还包括相对于宿主细胞的生长来调节本文所述多肽的表达的调节系统。调节系统的例子包括响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的序列。原核系统中的调节系统包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。
本文还提供包括编码本文所述多肽的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码本文所述多肽的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性的或闭合的环状质粒。
该载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可以包含任何用以保证自我复制的要素。可替代地，该载体可以是整合载体，即，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
该载体优选包含允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是这样一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。
细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。
载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码本文所述多肽的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，该载体可以进一步包括使该载体能够在感兴趣的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。例如，细菌复制起点的例子包括允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。在酵母宿主细胞中使用的复制起点的例子包括2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合以及ARS4与CEN6的组合。用于丝状真菌细胞中的复制起点包括AMA1和ANS1。
可以将本文所述的多核苷酸的一个以上的拷贝插入到宿主细胞中，以增加感兴趣多肽的产生。
用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的，例如，可参见Sambrook等，1989。
本文还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括编码本文所述多肽的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导所述多肽的表达。在某些实施方案中，本文所述的重组宿主细胞表达本文所述的多肽。将包括本文所述的多核苷酸的核酸构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该核酸构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码该变体的基因及其来源。
宿主细胞可以是在重组产生变体中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金杆菌细胞。细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽瘟亚种细胞。细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不局限于产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。宿主细胞可以是真菌细胞，该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁弗酵母、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母细胞。真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属或木霉属细胞。
可采用本领域周知的方法将核酸构建体或载体引入宿主细胞，这些方法包括但不限于原生质体转化、感受态细胞转化、电穿孔、接合或转导等。可根据宿主细胞的不同而选择核实的引入方法。
本文还提供一种本文所述多肽的制备方法，该方法包括：在适合于所述多肽表达的条件下培养本文所述的宿主细胞，和回收所述多肽。
可使用本领域已知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养这些宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在一种适合的培养基中并在允许所述多肽表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果该变体被分泌到该营养培养基中，则该变体可直接从该培养基中回收。如果该变体没有分泌，则它可从细胞裂解液中回收。
使用本领域已知的对这些多肽特异的方法可以检测该多肽。这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。
可以使用本领域已知的方法回收本文所述的多肽。例如，可以通过多种常规程序从该营养培养基中回收本文所述的多肽，这些常规程序包括但不局限于收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化本文所述的多肽以获得基本上纯的所述多肽，这些程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取。
本发明还提供一种组合物，该组合物含有本文所述的多肽。该组合物可以是发酵液或表达本文所述多肽的细胞的裂解液，或所述发酵液或裂解液的浓缩液。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并不意图限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域周知和常规的方法和试剂。
实施例1 MDGL-MC序列的合成和克隆
以来源于Penicilliurn camembertii U-150(genebank号：BAA14345.1)的mdlA基因为基础，根据巴斯德毕赤酵母的密码子偏好性，对编码成熟蛋白的序列进行密码子优化，并经生工生物工程(上海)股份有限公司合成的MDGL成熟肽核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该MDGL的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
对MDGL进行定点组合突变，突变位点包括：E257P，I260L，V264G，Q265L，A268T，G269C，K270L，并使氨基酸的编码提前终止于第271位的氨基酸(如SEQ ID NO:4所示)，突变子命名为MDGL-MC。根据巴斯德毕赤酵母的密码子偏好性，对编码成熟蛋白的序列进行密码子优化，并经生工生物工程(上海)股份有限公司合成的MDGL-MC成熟肽核苷酸序列如SEQID NO:3所示。
将合成的MDGL-MC序列克隆在质粒pUC57(购自Invitrogen公司)中，保存于大肠杆菌DH5α中，使用NEB公司的AvrII和EcoRI酶切质粒，同时用AvrII和EcoRI酶切质粒酶切带有诱导型启动子PAOX1和酵母α-交配因子的质粒pPIC9K(购自Invitrogen公司)，然后使用Axygen公司的凝胶回收试剂盒纯化。使用Fermentas公司T4 DNA连接酶，按照产品说明，将MDGL-MC序列酶切片段和质粒酶切片段进行连接，连接物热激法转入大肠杆菌DH5α中，在含氨苄(浓度为100ug/ml)的LB平板上过夜培养。次日挑取单克隆在LB液体培养基中培养，使用Axygen公司质粒提取试剂盒提取质粒并送交上海生工生物有限公司测序。
实施例2突变子转化巴斯德毕赤酵母和平板筛选
将测序正确的MDGL-MC重组表达载体用SalI限制性内切酶酶切线性化后，电击转化巴斯德毕赤酵母m316H(保藏号为CGMCC No.19263)感受态细胞，涂布到选择培养基MGYS筛选平板(配方为：182g/L山梨醇，1％甘油，1.34％酵母无氨基酸氮源，1.7％琼脂糖)，于28℃培养三天，得到的菌株命名为m316-MDGL-MC。挑取转化子至橄榄油平板(1％YNB(酵母无氨基酸氮源)，2％橄榄油，2％琼脂糖，2％甲醇，2％蛋白胨，1％酵母提取物，0.01％罗丹明B)上，28℃培养1天，挑取不同大小沉淀圈的转化子用于摇瓶发酵测试。对照菌株为实施例1中序列优化的MDGL(如SEQ ID NO:1所示)，氨基酸序列(如SEQ ID NO:2所示)未突变，使用与突变子相同的方法获得阳性菌株。
实施例3含不同拷贝数目的基因的巴斯德毕赤酵母筛选
为了测试实施例2中突变子菌株m316-MDGL-MC和含未突变MDGL菌株中MDGL编码基因在基因组中的数量，使用荧光定量PCR的方法测定菌株中MDGL编码基因的拷贝数，以gap基因(甘油三磷酸脱氢酶编码基因，如SEQ ID NO:5所示)为内参基因，引物序列如下：
MDGL-copyF:TTGCTGATGCTACTTTCGTCCA(SEQ ID NO:6)
MDGL-copyR:AGATGGATAACCTTTACCACGCA(SEQ ID NO:7)
GAP-F:GGTATTAACGGTTTCGGACGTATTG(SEQ ID NO:8)
GAP-R:GATGTTGACAGGGTCTCTCTCTTGG(SEQ ID NO:9)
使用酚氯仿异戊醇法提取DNA，使用Bio-rad公司的通用型SYBR Green预混液(货号：172-5120)进行PCR，反应体系为：SYBR Green预混液10ul，DNA模板1ul，引物1(10uM)1ul，引物2(10uM)1ul，双蒸水7ul；反应条件为：95℃2min，95℃15s，60℃30s。通过2-ΔCt方法(郭晋霞等，2018)计算拷贝数，挑选拷贝数分别为1，3，8的菌株进行三角瓶发酵测试，发酵前和发酵结束分别测定拷贝数。
实施例4含不同拷贝数目的基因的产甘油单-二酰酯脂肪酶菌株的发酵验证
挑取实施例3中不同拷贝数目的基因的单克隆到50ml BMGY培养基中(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％酵母氮源碱(YNB)含硫酸铵不含氨基酸，2％甘油，4×10-5％D-生物素，100mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,pH 6.6)，28℃
200rpm，培养1天，测定OD600，培养液8000rpm离心2分钟，重悬到含50ml BMMY(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％酵母氮源碱(YNB)含硫酸铵不含氨基酸，2％甲醇，4×10-5％D-生物素，100mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,pH 6.6)的250ml三角瓶中，28℃200rpm培养，每12h补加甲醇500ul，培养3天。培养结束后收集所有菌液，8000rpm离心5分钟，取全部上清，使用Bradford试剂(生工生物工程(上海)股份有限公司)测定蛋白浓度。
结果如图1，其中A为含不同拷贝数目的基因菌株蛋白产量，B为含不同拷贝数目的基因菌株每72h每OD600为1的菌液生产蛋白的量。结果表明，在相同拷贝数(1，3，6，8)条件下，MDGL-MC的蛋白产量明显高于野生型MDGL，MDGL在拷贝数位8时蛋白产量最高，达到0.26mg/ml，MDGL-MC的拷贝数位3时蛋白产量最高，达到39mg/ml。1个拷贝的条件下，MDGL-MC的蛋白产量是MDGL的212％，3个拷贝的条件下，MDGL-MC的蛋白产量是MDGL的159％，6个拷贝的条件下，MDGL-MC的蛋白产量是MDGL的180％，8个拷贝的条件下，MDGL-MC的蛋白产量是MDGL的122％。不同拷贝数下，MDGL-MC的蛋白产量均明显高于野生MDGL。
实施例5 MDGL-MC和MDGL热稳定性测试
取拷贝数为3和6(此处的拷贝数并不作限制，只是选择蛋白产量较高的两个菌株)的MDGL-MC和MDGL的发酵液各20ul，分别于37℃、38.2℃、40.4℃、43.6℃、47.9℃、51.3℃、53.6℃和55℃下保温30分钟，保温结束后立即测定pNPP水解能力，以37℃条件下的活力为100％，计算酶活残留率。
结果如图2所示，其中MDGL-MC 3是含有3个拷贝MDGL-MC的菌株生产的酶液，MDGL-MC 6是含有6个拷贝MDGL-MC的菌株生产的酶液，MDGL 3是含有3个拷贝MDGL的菌株生产的酶液，MDGL 6是含有6个拷贝MDGL的菌株生产的酶液。结果表明，MDGL-MC在保温处理30min后活力残留比例明显高于MDGL，MDGL在43.6-51.3℃之间活力快速下降，51.3℃处理30min后MDGL基本失活，而MDGL-MC在51.3℃处理30min后活力残留为75％左右，表明MDGL-MC的热稳定性明显提高，且酶的热稳定性与生产菌株的拷贝数无关，3拷贝和6拷贝的结果基本一致。另外，我们对其他拷贝数的菌株也做了同样的测试，结果与拷贝数为3和6的菌株一致，说明拷贝数与蛋白性质无关。
实施例6 MDGL-MC和MDGL十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析和蛋白序列测定
发酵液中有大量非目标蛋白，为了排除杂蛋白的影响，对MDGL和MDGL-MC进行SDS-PAGE分析(图3)，所有样品为等体积的发酵酶液，分析发现MDGL-MC和MDGL电泳结果均具有一条明显的条带，但MDGL-MC的条带分子量明显大于MDGL，将MDGL-MC的条带割下，送往生工(上海)生物工程有限公司进行质谱测序，获得肽段LYAYASPR，FTHTNDPVPK，YITAQGNNFR，与MDGL完全匹配，说明分子量变大的条带为MDGL-MC。MDGL-MC的条带明显粗于MDGL，说明MDGL-MC的蛋白含量明显高于MDGL。MDGL-MC的条带大于MDGL，且出现弥散的现象，可能于突变后的糖基化有关。
序列表
<110> 丰益（上海）生物技术研发中心有限公司
<120> 甘油单-二酰酯脂肪酶突变体及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 840
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatgtctcca cttccgaact ggaccagttc gagttctggg ttcaatacgc agccgcctct 60
tactacgagg ctgattacac cgcacaggtt ggtgataagc tgtcctgctc taagggtaac 120
tgcccagaag ttgaagcaac cggtgcaact gtgtcttacg acttctccga ttccacgatc 180
actgacaccg caggttacat cgcagttgat cacaccaact ccgcagtggt actggcattc 240
cgtggttctt actccgtacg taactgggtt gctgatgcta ctttcgtcca taccaaccca 300
ggtctgtgtg atggttgtct ggctgagctg ggtttctggt cttcctggaa gctggttcgt 360
gatgatatta tcaaagaact gaaagaagtg gtggcacaga acccaaacta tgaactggtg 420
gtcgtgggcc actccctggg tgctgctgtg gctactctgg ctgctaccga cctgcgtggt 480
aaaggttatc catctgctaa actgtacgct tacgcttccc ctcgtgttgg caacgcagcc 540
ctggccaaat atatcaccgc ccagggcaac aacttccgtt tcacccacac caatgaccca 600
gtacctaaac tgccactgct gtctatgggc tatgtacatg tttctcctga atattggatc 660
acctctccta acaacgccac tgtttctacc tctgacatca aagtcattga cggcgacgta 720
tcttttgacg gcaataccgg cacgggcctg cctctgctga cggactttga agcccacatt 780
tggtactttg tacaggttga cgccggcaaa ggtcctggcc tgccattcaa acgtgtttaa 840
<210> 2
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Val Ser Thr Ser Glu Leu Asp Gln Phe Glu Phe Trp Val Gln Tyr
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ser Tyr Tyr Glu Ala Asp Tyr Thr Ala Gln Val Gly Asp
20 25 30
Lys Leu Ser Cys Ser Lys Gly Asn Cys Pro Glu Val Glu Ala Thr Gly
35 40 45
Ala Thr Val Ser Tyr Asp Phe Ser Asp Ser Thr Ile Thr Asp Thr Ala
50 55 60
Gly Tyr Ile Ala Val Asp His Thr Asn Ser Ala Val Val Leu Ala Phe
65 70 75 80
Arg Gly Ser Tyr Ser Val Arg Asn Trp Val Ala Asp Ala Thr Phe Val
85 90 95
His Thr Asn Pro Gly Leu Cys Asp Gly Cys Leu Ala Glu Leu Gly Phe
100 105 110
Trp Ser Ser Trp Lys Leu Val Arg Asp Asp Ile Ile Lys Glu Leu Lys
115 120 125
Glu Val Val Ala Gln Asn Pro Asn Tyr Glu Leu Val Val Val Gly His
130 135 140
Ser Leu Gly Ala Ala Val Ala Thr Leu Ala Ala Thr Asp Leu Arg Gly
145 150 155 160
Lys Gly Tyr Pro Ser Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Ala Ser Pro Arg Val
165 170 175
Gly Asn Ala Ala Leu Ala Lys Tyr Ile Thr Ala Gln Gly Asn Asn Phe
180 185 190
Arg Phe Thr His Thr Asn Asp Pro Val Pro Lys Leu Pro Leu Leu Ser
195 200 205
Met Gly Tyr Val His Val Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Pro Asn
210 215 220
Asn Ala Thr Val Ser Thr Ser Asp Ile Lys Val Ile Asp Gly Asp Val
225 230 235 240
Ser Phe Asp Gly Asn Thr Gly Thr Gly Leu Pro Leu Leu Thr Asp Phe
245 250 255
Glu Ala His Ile Trp Tyr Phe Val Gln Val Asp Ala Gly Lys Gly Pro
260 265 270
Gly Leu Pro Phe Lys Arg Val
275
<210> 3
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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tgtcctgaag ttgaggctac tggtgctact gtttcttacg atttctccga ttctactatc 180
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agaggttctc actctgttcg taactgggtt gctgacgcta cttttgttca cactaaccca 300
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gatgacatta ttaaggagtt gaaggaggtt gtcgctcaaa accctgacta cgagttggtt 420
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gttccaaagt tgccattgtt gtccatgggt tacgttcacg tttctccaga gtactggatt 660
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65 70 75 80
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100 105 110
Trp Ser Ser Trp Lys Leu Val Arg Asp Asp Ile Ile Lys Glu Leu Lys
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Glu Val Val Ala Gln Asn Pro Asn Tyr Glu Leu Val Val Val Gly His
130 135 140
Ser Leu Gly Ala Ala Val Ala Thr Leu Ala Ala Thr Asp Leu Arg Gly
145 150 155 160
Lys Gly Tyr Pro Ser Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Ala Ser Pro Arg Val
165 170 175
Gly Asn Ala Ala Leu Ala Lys Tyr Ile Thr Ala Gln Gly Asn Asn Phe
180 185 190
Arg Phe Thr His Thr Asn Asp Pro Val Pro Lys Leu Pro Leu Leu Ser
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Met Gly Tyr Val His Val Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Pro Asn
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Ser Phe Asp Gly Asn Thr Gly Thr Gly Leu Pro Leu Leu Thr Asp Phe
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Pro Ala His Leu
260
<210> 5
<211> 1872
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agatggataa cctttaccac gca 23
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggtattaacg gtttcggacg tattg 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gatgttgaca gggtctctct cttgg 25
Claims (10)
1.一种具有甘油单-二酰酯脂肪酶活性的多肽，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：
(a)如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，以及
(b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，所述取代优选为氨基酸保守性取代，并且所述序列仍然保持SEQ ID NO:4的功能。
2.一种核酸分子，选自：(1)编码权利要求1所述多肽的多核苷酸序列或与(1)所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的核酸分子，其多核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.一种核酸构建体，其包含权利要求2或3所述的多核苷酸序列；优选地，所述核酸构建体是克隆载体或表达载体。
5.如权利要求4所述的核酸构建体，其还包含调节所述多核苷酸表达的调控序列，其中所述多核苷酸与调控序列可操作地连接。
6.一种宿主细胞，其包含权利要求2或3所述的核酸分子，或权利要求4或5所述的核酸构建体。
7.如权利要求6所述的宿主细胞，其包含至少一个拷贝的如权利要求2或3所述的核酸分子，或包含至少一个拷贝的如权利要求4或5所述的核酸构建体。
8.一种分离的多肽，由权利要求7所述的宿主细胞表达产生。
9.一种组合物，所述组合物含有权利要求1或8所述的多肽；优选地，所述组合物用于制备甘油单酰酯。
10.权利要求1或8所述的多肽、权利要求2或3所述的核酸分子、权利要求4或5所述的核酸构建体、权利要求6或7所述的宿主细胞，以及权利要求9所述的组合物在甘油单酯乳化剂的合成，或甘油单酯和甘油二酯的水解中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110625938.2A CN115433725A (zh) | 2021-06-04 | 2021-06-04 | 甘油单-二酰酯脂肪酶突变体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202110625938.2A CN115433725A (zh) | 2021-06-04 | 2021-06-04 | 甘油单-二酰酯脂肪酶突变体及其应用 |
Publications (1)
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| CN115433725A true CN115433725A (zh) | 2022-12-06 |
Family
ID=84271955
Family Applications (1)
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Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115433725A (zh) |
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2021
- 2021-06-04 CN CN202110625938.2A patent/CN115433725A/zh active Pending
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