CN108239627B

CN108239627B - 活性提高的脂肪酶及其应用

Info

Publication number: CN108239627B
Application number: CN201611225972.6A
Authority: CN
Inventors: 王明启; 曹海生; 徐正军; 牛其文
Original assignee: Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Current assignee: Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Priority date: 2016-12-27
Filing date: 2016-12-27
Publication date: 2023-06-06
Anticipated expiration: 2036-12-27
Also published as: CN108239627A

Abstract

本发明涉及活性提高的脂肪酶及其应用。具体而言，本发明提供一种融合蛋白，所述融合蛋白是脂肪酶与哈茨木霉(Trichoderma harzianum)来源的内切葡聚糖酶II的纤维素结合域形成的融合蛋白。本发明还提供相应的多核苷酸序列，核酸构建物，宿主细胞及方法和应用。本发明将某种特定CBD序列融合到脂肪酶末端，显著提高了该脂肪酶的比酶活、热稳定性和甲醇耐受性。

Description

活性提高的脂肪酶及其应用

技术领域

本发明涉及活性提高的脂肪酶及其应用。

背景技术

脂肪酶是一类特殊的酰基水解酶，能够在油-水界面上催化酯水解、酯合成、酯交换、及立体异构体拆分等化学反应，常被应用于食品、日化、生物能源等领域，特别是在乳制品工业、家具清洁产品、油脂化学和医疗领域(治疗肥胖和动脉粥样硬化等)。为了更好地使其适应工业化需求，研究者们对其热稳定性，产量和活性的改造投入了很多精力。

纤维素结合域(Cellulose binding domain，CBD)是存在于纤维类原料酶(如纤维素酶)中的相对分子质量在0.4×10⁴－2.0×10⁴不等的片段，可特异结合纤维素基质(纤维素酶的底物)。因此，CBD序列很容易被想到用来与纤维素酶融合，改善其对底物的结合能力以及本身的酶活〔Naohisa Sugimoto、Kiyohiko Igarashi、Masahiro Samejima，Celluloseaffinity purification of fusion proteins tagged with fungal family1cellulose-binding domain，Protein Expression and Purification，2012；82，290-296；M.A.Lemos、J.A.Teixeira、M.R.M.Domingues、M.Mota、F.M.Gama，The enhancement ofthe cellulolytic activity of cellobiohydrolase I and endoglucanase by theaddition of cellulose binding domains derived from Trichoderma reesei，Enzymeand Microbial Technology，2003，32:35-40；Markus Linder、Irma Salovuori、LauraRuohonen和Tuula T.Teeri，Characterization of a Double Cellulose-bindingDomain，The Journal of Biological Chemistry，1996，271，No.35，21268-21272；Jantaporn Thongekkaew、Hiroko Ikeda、Kazuo Masaki、Haruyuki Iefuji，Fusion ofcellulose binding domain from Trichoderma reesei CBHI to Cryptococcus sp.S-2cellulase enhances its binding affinity and its cellulolytic activity toinsoluble cellulosic substrates，Enzyme and Microbial Technology，2013，52:241-246〕。但CBD与酶融合表达后，CBD会改变酶的性质，导致对酶性质的改变效果具有不可预判性。

发明内容

本发明第一方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白是脂肪酶与哈茨木霉(Trichoderma harzianum)来源的内切葡聚糖酶(THEG)II的纤维素结合域形成的融合蛋白。

在一个或多个实施方案中，所述脂肪酶为Thermomyces dupontii来源的脂肪酶、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)来源的脂肪酶或米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)来源的脂肪酶。

在一个或多个实施方案中，所述Thermomyces dupontii来源的脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:6第71～339位示。

在一个或多个实施方案中，所述疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)来源的脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:10第1～358位所示。

在一个或多个实施方案中，所述米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)来源的脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。

在一个或多个实施方案中，所述纤维素结合域的氨基酸序列如SEQ ID NO:6第1－70位氨基酸残基所示。

在一个或多个实施方案中，所述纤维素结合域在所述脂肪酶的N端。

在一个或多个实施方案中，所述纤维素结合域在所述脂肪酶的C端。

在一个或多个实施方案中，所述脂肪酶是Thermomyces dupontii来源的脂肪酶或疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)来源的脂肪酶。

在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6、8或10所示。

在一个或多个实施方案中，采用pNPP法检测的所述融合蛋白的比酶活高于600U/μmol，优选高于700U/μmol，更优选高于800U/μmol。

在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白在55℃的温度下孵育10小时后剩余的酶活大于40％，优选大于50％，更优选大于60％。

在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白在35℃、50％的甲醇中孵育10小时后剩余的酶活大于40％，优选大于50％，更优选大于60％。

本发明第二方面提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：

(1)编码本发明所述融合蛋白的多核苷酸序列；和

(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。

在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列中编码Thermomyces dupontii来源的脂肪酶的序列如SEQ ID NO:5第211－1020位碱基所示。

在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列中编码米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)来源的脂肪酶的序列如SEQ ID NO:11所示。

在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列中编码疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)来源的脂肪酶的序列如SEQ ID NO:9第1－1074位碱基所示。

在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列中编码所述纤维素结合域的序列如SEQ ID NO:5第1－210位碱基所示。

在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO:5、7或9所示。

本发明第三方面提供一种核酸构建物，所述核酸构建物含有本文所述的多核苷酸序列。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是克隆载体或表达载体。

本发明第四方面提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞：

(1)表达本发明所述融合蛋白；和/或

(2)含有本发明所述的多核苷酸序列或构建物。

本发明第五方面提供一种提高脂肪酶比酶活、温度稳定性和/或甲醇耐受性的方法，所述方法包括将所述脂肪酶与哈茨木霉(Trichoderma harzianum)来源的内切葡聚糖酶(THEG)II的纤维素结合域融合表达的步骤。

本发明第六方面提供哈茨木霉(Trichoderma harzianum)来源的内切葡聚糖酶(THEG)II的纤维素结合域在提高脂肪酶比酶活、温度稳定性和/或甲醇耐受性中的用途。

在一个或多个实施方案中，所述Thermomyces dupontii来源的脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:6第71～339位所示。

本发明第七方面提供本发明融合蛋白、多核苷酸序列、核酸构建物或遗传工程化的宿主细胞在催化酯水解、酯合成、酯交换、及立体异构体拆分中的应用，在食品、日化、生物能源领域，特别是在乳制品工业、家具清洁产品和油脂化学中的应用，以及在制备药物如治疗肥胖和动脉粥样硬化的药物中的应用。

附图说明

图1：聚丙烯胺凝胶电泳检测CBD3-TDL和TDL-CBD3的表达。泳道1-2：TDL转化子发酵液；泳道3-4：融合酶CBD3-TDL转化子发酵液；泳道5-6：融合酶TDL-CBD3转化子发酵液。

图2：聚丙烯胺凝胶电泳检测TDL-CBD3、CBD1-TDL、TDL-CBD1、CBM3-TDL和TDL-CBM3的表达。

图3：聚丙烯胺凝胶电泳检测RML-CBD3与TLL-CBD3的表达。从左到右的泳道分别RML、RML-CBD3、RML-CBD3、Marker、TLL、TLL-CBD3、TLL-CBD3。

图4：CBD3-TDL和TDL-CBD3的比酶活检测。横坐标为每μmoL脂肪酶所含的活力单位(U)。CBD3-TDL(*P<0.05)和TDL-CBD3(**P<0.01)的比活力显著高于TDL。

图5：CBD3-TDL和TDL-CBD3的温度稳定性检测。横坐标为脂肪酶在55℃水浴锅中孵育的时间，纵坐标为剩余的酶活力(％)。

图6：TLL-CBD3的温度稳定性检测。横坐标为脂肪酶在55℃水浴锅中孵育的时间，纵坐标为剩余的酶活力(％)。

图7：CBD3-TDL和TDL-CBD3的甲醇耐受性检测。横坐标为脂肪酶与50％甲醇混合后在35℃水浴锅中孵育的时间，纵坐标为剩余的酶活力(％)。CBD3-TDL和TDL-CBD3的甲醇耐受性高于TDL。

图8：TLL-CBD3的甲醇耐受性检测。横坐标为脂肪酶与50％甲醇混合后在35℃水浴锅中孵育的时间，纵坐标为剩余的酶活力(％)。

图9：TDL-CBD3的酯化效率检测。纵坐标为PFAD剩余的酸价(％)。TDL-CBD3的酯化效率显著高于TDL(**P<0.01)。

具体实施方式

本发明发现，将某种特定CBD序列融合到脂肪酶末端(尤其是C端)，会显著提高该脂肪酶的比酶活、热稳定性和甲醇耐受性。以下将从不同方面详细阐述本发明。

融合蛋白

本发明提供CBD序列与脂肪酶的融合蛋白。该融合蛋白中，CBD序列可在脂肪酶的N端，也可在C端。在某些实施方案中，该CBD序列在脂肪酶的C端。

尤其是，本发明使用哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的内切葡聚糖酶(THEG)II的纤维素结合域。在某些实施方案中，本发明使用其氨基酸序列如SEQ ID NO:6第1～70位所示的纤维素结合域。应理解的是，本文所述的纤维素结合域(CBD)通常包括其天然接头序列。例如，在某些实施方案中，所述天然接头序列如SEQ ID NO:6第37～70位所示。

适用于本发明的脂肪酶可以是Thermomyces dupontii来源的脂肪酶(TDL)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)来源的脂肪酶(TLL)或米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)来源的脂肪酶(RML)。

例如，在某些实施方案中，适用于本发明的Thermomyces dupontii来源的脂肪酶(TDL)的氨基酸序列可如SEQ ID NO:6第71～339位示。在某些实施方案中，适用于本发明的疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的脂肪酶(TLL)的氨基酸序列可如SEQ IDNO:10第1～358位所示。在某些实施方案中，适用于本发明的米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)来源的脂肪酶(RML)的氨基酸序列可如SEQ ID NO:12所示。在某些实施方案中，本发明融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6、8或10所示。

应理解的是，本发明可使用脂肪酶的变异体。例如，在SEQ ID NO:6第71～339位所示氨基酸、SEQ ID NO:10第1～358位所示序列或SEQ ID NO:12所示氨基酸序列中具有一个或多个(通常为1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸缺失、插入和/或取代，尤其是在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为8以内，更佳在5个以内)氨基酸的变异体。

优选是保守性变异形式。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。

这些变异体具有与所述TDL、TLL和RML相似、相同，甚至更佳的酶活。本领域技术人员能理解，少数位置上的突变并不改变本发明利用特定CBD序列来进一步提高相同类别的酶(TDL或其变异体，TLL或其变异体，RML或其变异体)的酶活、热稳定性和甲醇耐受性。

此外，本领域技术人员公知，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的蛋白末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的蛋白的活性。又如为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的标签，或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点。应理解，这些氨基酸序列的存在不会影响到所得多肽的活性。因此，本发明也包括在本发明融合蛋白的C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸(例如前述接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、GST、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的标签，或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点等)所得的融合蛋白，这些融合蛋白仍具有本文所述的脂肪酶活性。

根据重组生产方案所用的宿主，本发明的融合蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。

多核苷酸

本申请包括编码本发明融合蛋白的核苷酸序列或其互补序列或简并变异体。SEQID NO：5、7和9显示了本发明多肽的编码序列例子。如本文所用，“简并变异体”在本发明中是指编码相同的氨基酸序列，但核苷酸序列有差别的核苷酸序列。

本发明也包括编码本发明多肽的核酸序列的片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码本发明多肽的多核苷酸。因此，在某些实施例中，核酸片段的长度在15－30个碱基。可采用现有技术从本发明的核酸序列中挑选出适当的核酸片段，用作引物或探针。

本发明的多肽的编码序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

核酸构建物

本发明也涉及包括与本发明所述多核苷酸序列可操作性连接的一个或多个调控序列的核酸构建物。

本文中，“可操作性连接”或类似描述指元件的排列，其中所述成分被排成一定的形状，以便执行它们所需的功能。因而，可操作性连接于编码序列的给定的启动子，在正确的转录因子等存在时，能使该编码序列有效表达。该启动子不需要与该编码序列邻接，只要它起到指导该序列表达的功能即可。因此，例如不参与翻译但转录的序列可存在于启动子序列和编码序列之间，与可转录的内含子一样；并且仍可认为该启动子序列“可操作性连接”于该编码序列。

编码本发明多肽的多核苷酸可以多种方式被操作以保证该多肽的表达。在其插入载体之前该多核苷酸序列的操作可能根据该表达载体而是合乎需要或必需的。利用重组DNA方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。

调控序列可以是合适的启动子序列，由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列包含接到多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于指导本发明的核酸构建物，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从噬菌体T7启动子、大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因等中获得的启动子序列。

用于指导本发明的核酸构建物在丝状真菌宿主细胞正转录的合适启动子的实例是从米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉糖化酶(glaA)、里氏木霉纤维二糖水解酶I、氏木霉纤维二糖水解酶II、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、里氏木霉葡聚糖内切酶等基因获得的启动子及其突变、截短和杂合(hybrid)启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子可获得自酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因、巴斯德毕赤酵母醇氧化酶基因。用于酵母宿主细胞的其它有用启动子由Romanos et al.，1992，Yeast8:423-488描述。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。

用于细菌宿主的优选终止子可以是来自T7噬菌体的终止子。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子获得自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶的基因。

用于酵母宿主细胞的优选终止子获得自酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C、酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶、巴斯德毕赤酵母醇氧化酶基因等。

调控序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。签到序列与编码该多肽的核苷酸序列的5′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何前导序列都可用于本发明。

调控序列也可以是编码与多肽的氨基酸末端连接的氨基酸序列并且指导该编码的多肽进入细胞分泌途径的信号肽编码区。核苷酸序列编码序列的5′端可固有地包含天然连接具有编码分泌多肽的编码区节段的翻译阅读框的信号肽编码区。备选地，编码序列的5′端可包含与该编码区外源的信号肽编码区。当编码序列非天然地包含信号肽编码区时，可能需要外来的信号肽编码区。备选地，外来的信号肽编码区可简单地替换天然的信号肽编码区以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入选择的宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区，即分泌进入培养基，都可用于本发明。

载体

本发明也涉及包括本发明多核苷酸序列的载体，包括但不限于表达载体和克隆载体。例如，在某些实施方案中，本发明所述的核酸构建物为表达载体或克隆载体。

表达载体中，各种核酸和调控序列可被连接在一起以产生可能包括一个或多个容许在这种位点插入或取代该编码多肽的核苷酸序列的方便限制性位点的重组表达载体。备选地，本发明的核苷酸序列可通过插入核苷酸序列或包括进入适当表达载体的序列的核酸构建物而被表达。在制造表达载体时，编码序列位于载体中以使得该编码序列可操作地连接用于表达适当调控序列。

重组表达载体可以使能够方便地经受重组DNA方法并且可导致感兴趣的核苷酸序列表达的任何载体(如质粒或病毒)。载体的选择一般取决于载体与其中被导入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性或闭合的环形质粒。

载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在，其复制不依赖于染色体复制的载体，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可包含用于保证自我复制的任何方式。备选地，载体可以是当被导入宿主细胞时，整合到基因组中并且与其已经被整合进入的染色体一起复制的载体。此外，可使用一起包含将被导入宿主细胞基因组的总DNA的单个载体或质粒或两个或多个载体或质粒，或转座子。

本发明的载体优选包含一个或多个容许容易选择转化、转染、转导等细胞的可选择标记。可选择的标记是基因，其产物提供对抗生素或病毒的抗性、对重金属的抗性、原养型至营养缺陷型等。

本发明的载体优选包含容许该载体整合进入宿主细胞基因组或该载体在细胞中独立于基因组自主个复制的元件。

一个以上拷贝的本发明的多核苷酸可被插入宿主细胞以增加该基因产物的产量。多核苷酸拷贝数的增加可通过将至少一个附加拷贝的序列整合进入宿主细胞基因组或通过包括可扩增的选择标记基因和该多核苷酸来获得，其中包含扩增拷贝的选择标记基因并且由此包含附加拷贝多核苷酸的细胞可通过在存在适当的选择剂时培养该细胞来筛选。

本发明的载体优选包含人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点，能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。

本发明的表达载体更为优选地选择可用于毕赤酵母中表达的载体。本发明的载体优选商品化的毕赤酵母中使用的载体如pPIC、pPICZ、pAO、pGAP或pGAPZ等一系列的载体。

构建表达本发明的融合蛋白的表达载体的技术是现有技术已知的，包括例如通过overlap-PCR的方法将脂肪酶编码序列和纤维素结合域的编码序列串联起来，然后用连接酶将脂肪酶-纤维素结合域重组编码序列或纤维素结合域-脂肪酶重组编码序列连接到合适的载体上，提取质粒，测序等步骤。

构建获得所需的表达载体后，可将该表达载体转化到合适的宿主中。可根据所需表达的目的蛋白选择相应的宿主微生物。例如，优选选用本领域已知的用于表达生产该目的蛋白的宿主微生物来实施本发明。例如，对于TDL而言，可选用毕赤酵母；对于RML而言，可选用黑曲霉。

含有本发明多核苷酸序列的克隆载体可用于复制足够多的目标质粒。因此，本发明的克隆载体带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等。通常，本发明的克隆载体不具有表达元件。

宿主细胞

本发明也涉及含有被用于重组生产融合蛋白的本发明多核苷酸的重组宿主细胞。包括本发明多核苷酸的载体被导入宿主细胞以使得该载体如早先说明的作为染色体的组成部分或作为染色体外的自我复制载体来维持。宿主细胞的选择很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是单细胞微生物或非单细胞微生物。单细胞微生物例如革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌细胞，例如，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌等；或链霉菌细胞，例如钱青紫链霉菌；或革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌和假单胞菌属。在优选的方面，细菌宿主是枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和大肠杆菌细胞。

宿主细胞也可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物、酵母或真菌细胞。在优选的方面，宿主细胞是真核细胞，如在此使用的“真核”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门等。

在更优选的方面，宿主细胞是子囊菌门的细胞如酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)以及Komagataella属等。

在最优选的方面，宿主细胞是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)等。在另外最优选方面，宿主细胞是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。

生产方法

在获得多肽的编码序列后，可采用如下方法生产本发明多肽，该方法包括：(a)在有助于生产融合蛋白的条件下培养含表达该多肽的表达载体的宿主细胞；以及(b)回收该融合蛋白。

本发明的生产方法中，细胞可以利用本领域已知的方法在适于生产融合蛋白的培养基中培养。例如，细胞可通过在实验室或工业发酵罐中进行的摇瓶培养和小规模或大规模的发酵(包括连续的、分批的、分批补料或固态发酵)，在合适的培养基和容许该融合蛋白表达和/或分离的条件下进行培养。培养发生在利用本领域已知的方法包括碳源和氮源和无机盐的合适培养基中。合适的培养基可获得自商业供应者或可根据公开的组合物来制备。如果该融合蛋白分泌进入培养基，该融合蛋白可从培养基直接回收。如果该融合蛋白不分泌进入培养基，它可从细胞裂解物回收。

或者，也可采用本领域已知的化学合成方法来合成本发明的融合蛋白。多肽化学合成方法包括固相合成法和液相合成法，其中以固相合成法常用。固相合成方法包括但不限于Fmoc和tBoc两种常用方法。通常，使用树脂作为不溶性的固相载体，通常从C端(羧基端)向N端(氨基端)逐个将氨基酸连接在肽链上，每个氨基酸连接循环由以下三步反应构成：1)脱保护：被保护的氨基酸必须用一种脱保护溶剂去除氨基的保护基团；2)活化：待连接的氨基酸的羧基被活化剂所活化；和3)偶联：活化的羧基与前一个氨基酸裸露的氨基反应，形成肽键。反复循环直到肽链延伸至所需长度时即可完成。最后用切割液切割肽链和固相载体之间的连接，就可获得所需的氨基酸序列。可以在程序控制的自动化多肽合成仪上进行上述化学合成，这类仪器包括但不限于Protein Technologies公司推出的Tribute双通道多肽合成仪、C S Bio公司的UV Online Monitor系统、Aapptec公司推出的Focus XC三通道合成仪等。

本发明所描述的融合蛋白可利用本领域已知的方法来回收。例如，融合蛋白可通过常规方法，包括但不限于离心、过滤、超滤、萃取、层析、喷雾干燥、冷冻干燥、蒸发或沉淀等从培养基回收。

本发明的融合蛋白可通过本领域已知的多种方法来纯化，包括但不限于色谱法(如离子交换、亲和性、疏水性、色谱聚焦、分子排阻)，电泳法(例如等电聚焦)、差异溶解度(如盐析沉淀)、SDS-PAGE或萃取法以获得基本上纯的融合蛋白。

多肽的性能及用途

本发明的多肽/脂肪酶能够在油-水界面上催化酯水解、酯合成、酯交换、及立体异构体拆分等化学反应，可被应用于食品、日化、生物能源等领域，特别是在乳制品工业、家具清洁产品、油脂化学和医疗领域(治疗肥胖和动脉粥样硬化等)。

下文将以具体实施例的方式阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等，《分子克隆：实验室指南》(美国纽约州：冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，1989)所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。对于试剂的用法和用量，除非另有说明，否则按照常规的用法和用量使用。

实施例1：含特异分子标签的脂肪酶的构建及表达

经过优化并经生工生物工程(上海)股份有限公司合成以下序列的编码序列：

(1)纤维素结合域的编码序列

CBD1：核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

CBM3：核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

CBD3：核苷酸序列如SEQ ID NO:5第1～210位所示；氨基酸序列如SEQ ID NO:6第1～70位所示；

(2)脂肪酶的编码序列

TDL：核苷酸序列如SEQ ID NO:5第211～1020位所示；氨基酸序列如SEQ ID NO:6第71～339位所示；

TLL：核苷酸序列如SEQ ID NO:9第1～1074位所示；氨基酸序列如SEQ ID NO:10第1～358位所示；

RML：核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。

用primerstar高保真聚合酶(Takara公司)对各脂肪酶和纤维素结合域序列分别进行PCR扩增，以各脂肪酶和纤维素结合域的PCR产物为模板，通过overlap-PCR将纤维素结合域序列分别串联在脂肪酶的N端或C端，获得以下重组序列：CBD3-TDL、TDL-CBD3、CBD1-TDL、TDL-CBD1、TDL-CBM3、CBM3-TDL、TLL-CBD3和RML-CBD3。

然后用T4连接酶(Fermentas)将所得重组序列连接到载体pPIC 9K中。提取质粒，测序。将测序正确的载体用SalI限制性内切酶酶切线性化后，按照毕赤酵母的标准转化方法，电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞，涂布到选择培养基MDS筛选平板，于28℃培养过夜。

PCR所用扩增引物分别如下所示(5’-3’，依次为SEQ ID NO:13－44)：

CBD3_1：AGCTACGTACAGCAAACCGTGTGG

CBD3_TDL_2：AAAGATCCTGGGACACTTCAGATGAAGTGGGAGGAGT

CBD3_TDL_3：ACTCCTCCCACTTCATCTGAAGTGTCCCAGGATCTTT

TDL_4：CCGGAATTCTTACAAACAAGTGCCAATT

TDL_1：CCGTACGTAGAAGTGTCCCAGGATCTTT

TDL_CBD3_2：GTCCCCACACGGTTTGCTGCAAACAAGTGCCAATTAAG

TDL_CBD3_3：CTTAATTGGCACTTGTTTGCAGCAAACCGTGTGGGGAC

CBD3_4：CCGGAATTCTTAAGATGAAGTGGGAGGA

TDL1：CCGTACGTAGAAGTGTCCCAGGATCTTT

TDL_CBD1_2：AGAAGGGTTTCCGGTGGACAAACAAGTGCCAATTAAG

TDL_CBD1_3：CTTAATTGGCACTTGTTTGTCCACCGGAAACCCTTCT

CBD1_4：CCGGAATTCTTAAAGACACTGTGAAT

TDL1：CCGTACGTAGAAGTGTCCCAGGATCTTT

TDL_CBD1_2：AGAAGGGTTTCCGGTGGACAAACAAGTGCCAATTAAG

TDL_CBD1_3：CTTAATTGGCACTTGTTTGTCCACCGGAAACCCTTCT

CBD1_4：CCGGAATTCTTAAAGACACTGTGAAT

TDL1：CCGTACGTAGAAGTGTCCCAGGATCTTT

TDL_CBM3_2：

CAACCTTCAAGTTACCAGAAACTGGCAAACAAGTGCCAATTAAGCCAA

TDL_CBM3_3：

TTGGCTTAATTGGCACTTGTTTGCCAGTTTCTGGTAACTTGAAGGTTG

CBM3_4：CCGGAATTCTTATGGTTCCTTACCCCAA

CBM3_1：CCGTACGTACCAGTTTCTGGTAACTTGA

CBM3_TDL_2：AAAGATCCTGGGACACTTCTGGTTCCTTACCCCAAACCA

CBM3_TDL_3：TGGTTTGGGGTAAGGAACCAGAAGTGTCCCAGGATCTTT

TDL_4：CCGGAATTCTTACAAACAAGTGCCAATT

RML_1：CCGAATTCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTG

RML_2：CCCACACGGTTTGCTGAGTACACAAACCGGTGTTA

RML_3：TAACACCGGTTTGTGTACTCAGCAAACCGTGTGGC

RML_4：ATAAGGCGGCCGCTTAAGATGAAGTGGGAGGAGT

TLL_1：CCGAATTCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTG

TLL_2：CCCACACGGTTTGCTGCAAGCAAGTACCAATCA

TLL_3：TGATTGGTACTTGCTTGCAGCAAACCGTGTGGG

TLL_4：ATAAGGCGGCCGCTTAAGATGAAGTGGGAGGAGT。

挑取酵母单菌落接种于5mL YPD培养基中，28℃，200rpm过夜培养。接种至50mL的BMGY培养基中，28℃，220rpm培养，收集菌体。用无菌水重悬洗涤菌体2次，然后用BMMY培养基重悬菌体。向BMMY培养基中添加2％的甲醇，28℃，220rpm诱导表达。每隔24h取样测定酶活，并向50mL培养基中补加0.5mL甲醇。诱导3d后，发酵液浓缩收集。

聚丙烯胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测所得蛋白的浓度。结果如图1、2和3所示。CBD3-TDL、TDL-CBD3和TLL-CDB3显示了较高的表达量，其分子量约为55kD。

实施例2：pNPP法检测CBD3-TDL和TDL-CBD3的比酶活

脂肪酶酶活单位的定义：在温度为40℃，pH值8.0的条件下，样品水解底物棕榈酸对硝基苯脂，每分钟释放出1μmol对硝基苯酚(pNP)所需的酶量为1个酶活力单位(U)。

测定试剂：

A液：0.2mol/L NaH₂PO₄溶液，称取2.4g NaH₂PO₄，用蒸馏水溶解并定容至100mL；

B液：0.2mol/L Na₂HPO₄溶液，称取2.84g Na₂HPO₄用蒸馏水溶解并定容至100mL；

底物缓冲液：取5.3mL A液和9.47mL B液，混合后加入约280mL水，加入0.92g脱氧胆酸钠、0.44g阿拉伯胶粉，搅拌溶解，用H₃PO₄或NaOH调节pH值至8.0，定容至400mL，4℃保存。

底物pNPP溶液(0.0795mol/L，3mg/mL)：称取棕榈酸对硝基苯脂(pNPP)0.030g，加入10mL异丙醇42℃搅拌溶解，4℃保存。

测定方法：取1mL pNPP溶液和9mL底物缓冲溶液混合。每2mL离心管加入600μL混合液，40℃预热5min。每离心管加入25μL样品，混匀，在40℃水浴锅内反应15min，立即加入无水乙醇500μL终止反应。12000rpm离心2min。分光光度测定(405nm)。

测得的数据用Origin 8.0处理，结果如图4所示。如图4所示，CBD3-TDL和TDL-CBD3的比酶活显著高于TDL。

实施例3：pNPP法检测CBD3-TDL、TDL-CBD3和TLL-CBD3的温度稳定性

将TDL、TLL、CBD3-TDL、TDL-CBD3和TLL-CBD3分别放入55℃水浴锅内孵育，分别在0h、0.5h、1h、2h、4h和24h取样。

pNPP检测方法同实施例2，检测剩余酶活。

测得的数据用Origin 8.0处理，结果如图5和6所示，CBD3-TDL和TDL-CBD3的温度稳定性高于TDL，TLL-CBD3的温度稳定性显著高于TLL。

实施例4：pNPP法检测CBD3-TDL、TDL-CBD3和TLL-CBD3的甲醇耐受性

将TDL、TLL、CBD3-TDL、TDL-CBD3和TLL-CBD3分别与50％甲醇混合后，放入35℃水浴锅内孵育，分别在0h、0.5h、1h、2h、4h和24h取样。

pNPP检测方法同实施例2，检测剩余酶活。

测得的数据用Origin 8.0处理，结果如图7或8所示，CBD3-TDL和TDL-CBD3的甲醇耐受性显著高于TDL，TLL-CBD3的甲醇耐受性显著高于TLL。

实施例5：PFAD酯化效率实验

将棕榈脂肪酸馏出液(PFAD)(主要成分为C16和C18)与脂肪酸甲酯(FAME)(主要成分为C16:0和C18:1)按3:1加热融化混合后，取400μL至1.5mL离心管中，35℃降温，加1μL8％氢氧化钠混合均匀。

按2％的添加量分别加入TDL、CBD3-TDL和TDL-CBD3酶液，加水20μL。

加甲醇50μL，每隔1h加一次甲醇，共反应24h。

12000rpm，离心2min，取200μL至三角瓶中称重，5mL乙醇溶解，加一两滴酚酞做指示剂。

用50mM KOH滴定测定酸价。

测得的数据用Origin 8.0处理，结果如图9所示，TDL-CBD3的PFAD酯化效率高于TDL。

序列表

<110> 丰益（上海）生物技术研发中心有限公司

<120> 活性提高的脂肪酶及其应用

<130> 166578

<160> 44

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 210

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CBD1核苷酸序列

<400> 1

tccaccggaa acccttctgg aggaaatcct ccaggtggaa atccaccagg tacaactact 60

accagacgtc ctgctactac aaccggttct agtccaggtc ctactcaatc acattacggt 120

cagtgcggag gcattggtta ctccggcccc actgtttgtg cctctgggac aacgtgtcaa 180

gtcttgaacc cctattattc acagtgtctt 210

<210> 2

<211> 70

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CBD1氨基酸序列

<400> 2

Ser Thr Gly Asn Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Asn Pro Pro

1 5 10 15

Gly Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro

20 25 30

Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser

35 40 45

Gly Pro Thr Val Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gln Val Leu Asn Pro

50 55 60

Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu

65 70

<210> 3

<211> 477

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CBM3核苷酸序列

<400> 3

ccagtttctg gtaacttgaa ggttgaattt tacaactcta acccatctga tactactaac 60

tctattaacc cacaatttaa ggttactaac actggttctt ctgctattga tttgtctaag 120

ttgactttga gatactacta cactgttgat ggtcaaaagg atcaaacttt ttggtgtgat 180

catgctgcta ttattggttc taacggttct tacaacggta ttacttctaa cgttaagggt 240

acttttgtta agatgtcttc ttctactaac aacgctgata cttacttgga aatttctttt 300

actggtggta ctttggaacc aggtgctcat gttcaaattc aaggtagatt tgctaagaac 360

gattggtcta actacactca atctaacgat tactctttta agtctgcttc tcaatttgtt 420

gaatgggatc aagttactgc ttacttgaac ggtgttttgg tttggggtaa ggaacca 477

<210> 4

<211> 159

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CBM3氨基酸序列

<400> 4

Pro Val Ser Gly Asn Leu Lys Val Glu Phe Tyr Asn Ser Asn Pro Ser

1 5 10 15

Asp Thr Thr Asn Ser Ile Asn Pro Gln Phe Lys Val Thr Asn Thr Gly

20 25 30

Ser Ser Ala Ile Asp Leu Ser Lys Leu Thr Leu Arg Tyr Tyr Tyr Thr

35 40 45

Val Asp Gly Gln Lys Asp Gln Thr Phe Trp Cys Asp His Ala Ala Ile

50 55 60

Ile Gly Ser Asn Gly Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Ser Asn Val Lys Gly

65 70 75 80

Thr Phe Val Lys Met Ser Ser Ser Thr Asn Asn Ala Asp Thr Tyr Leu

85 90 95

Glu Ile Ser Phe Thr Gly Gly Thr Leu Glu Pro Gly Ala His Val Gln

100 105 110

Ile Gln Gly Arg Phe Ala Lys Asn Asp Trp Ser Asn Tyr Thr Gln Ser

115 120 125

Asn Asp Tyr Ser Phe Lys Ser Ala Ser Gln Phe Val Glu Trp Asp Gln

130 135 140

Val Thr Ala Tyr Leu Asn Gly Val Leu Val Trp Gly Lys Glu Pro

145 150 155

<210> 5

<211> 1020

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CBD3-TDL核苷酸序列

<400> 5

cagcaaaccg tgtggggaca atgtggtggt caaggttgga gtggaccaac aagttgtgtt 60

gcaggctcag catgttctac cttgaaccct tactatgccc agtgcattcc aggggctact 120

acaatgagta ccacgacgaa gccaacttca gtctccgctt ccacaactag agcttccgct 180

acttcttctg ccactcctcc cacttcatct gaagtgtccc aggatctttt cgatcagttc 240

aacttattcg ctcaatactc cgcagctgca tactgtgcaa agaacaacga tgcacctgca 300

ggagctaacg ttacatgtag aggatctatc tgtccagaag tagagaaggc agatgctaca 360

ttcctatact ccttcgaaga ttccggtgtt ggtgacgtaa caggatttct agctctagat 420

aacacaaaca ggctgatcgt actgtccttc cgaggaagta gaagtctgga gaactggata 480

ggaaacatca acttggatct gaagggtatc gatgatattt gctcaggttg caaaggtcac 540

gacggtttta cgtcatcttg gaggtctgtg gctaatacgc ttactcaaca agtccagaat 600

gctgtgagag aacaccctga ttacagagtc gtttttaccg gacactcatt gggaggtgct 660

cttgctactg ttgctggtgc ttctttaaga ggaaatggtt acgacataga tgtcttttct 720

tacggggccc ctagagttgg gaatagagcc tttgccgaat ttttgactgc ccaaactggt 780

ggtactttat atagaataac ccataccaat gacattgtgc ctcgacttcc accacgtgaa 840

ttggggtatt ctcattcatc accagagtat tggattacca gtggcacttt ggtccccgtt 900

actaagaacg acattgttaa agttgagggt attgacagta ctgacggcaa taatcaacca 960

aatacccccg acattgccgc ccatttgtgg tattttggct taattggcac ttgtttgtaa 1020

<210> 6

<211> 339

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CBD3-TDL氨基酸序列

<400> 6

Gln Gln Thr Val Trp Gly Gln Cys Gly Gly Gln Gly Trp Ser Gly Pro

1 5 10 15

Thr Ser Cys Val Ala Gly Ser Ala Cys Ser Thr Leu Asn Pro Tyr Tyr

20 25 30

Ala Gln Cys Ile Pro Gly Ala Thr Thr Met Ser Thr Thr Thr Lys Pro

35 40 45

Thr Ser Val Ser Ala Ser Thr Thr Arg Ala Ser Ala Thr Ser Ser Ala

50 55 60

Thr Pro Pro Thr Ser Ser Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asp Gln Phe

65 70 75 80

Asn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ala Lys Asn Asn

85 90 95

Asp Ala Pro Ala Gly Ala Asn Val Thr Cys Arg Gly Ser Ile Cys Pro

100 105 110

Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser

115 120 125

Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Arg

130 135 140

Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Leu Glu Asn Trp Ile

145 150 155 160

Gly Asn Ile Asn Leu Asp Leu Lys Gly Ile Asp Asp Ile Cys Ser Gly

165 170 175

Cys Lys Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asn

180 185 190

Thr Leu Thr Gln Gln Val Gln Asn Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr

195 200 205

Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val

210 215 220

Ala Gly Ala Ser Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser

225 230 235 240

Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr

245 250 255

Ala Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile

260 265 270

Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Leu Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro

275 280 285

Glu Tyr Trp Ile Thr Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Lys Asn Asp

290 295 300

Ile Val Lys Val Glu Gly Ile Asp Ser Thr Asp Gly Asn Asn Gln Pro

305 310 315 320

Asn Thr Pro Asp Ile Ala Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly

325 330 335

Thr Cys Leu

<210> 7

<211> 1020

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TDL-CBD3核苷酸序列

<400> 7

gaagtgtccc aggatctttt cgatcagttc aacttattcg ctcaatactc cgcagctgca 60

tactgtgcaa agaacaacga tgcacctgca ggagctaacg ttacatgtag aggatctatc 120

tgtccagaag tagagaaggc agatgctaca ttcctatact ccttcgaaga ttccggtgtt 180

ggtgacgtaa caggatttct agctctagat aacacaaaca ggctgatcgt actgtccttc 240

cgaggaagta gaagtctgga gaactggata ggaaacatca acttggatct gaagggtatc 300

gatgatattt gctcaggttg caaaggtcac gacggtttta cgtcatcttg gaggtctgtg 360

gctaatacgc ttactcaaca agtccagaat gctgtgagag aacaccctga ttacagagtc 420

gtttttaccg gacactcatt gggaggtgct cttgctactg ttgctggtgc ttctttaaga 480

ggaaatggtt acgacataga tgtcttttct tacggggccc ctagagttgg gaatagagcc 540

tttgccgaat ttttgactgc ccaaactggt ggtactttat atagaataac ccataccaat 600

gacattgtgc ctcgacttcc accacgtgaa ttggggtatt ctcattcatc accagagtat 660

tggattacca gtggcacttt ggtccccgtt actaagaacg acattgttaa agttgagggt 720

attgacagta ctgacggcaa taatcaacca aatacccccg acattgccgc ccatttgtgg 780

tattttggct taattggcac ttgtttgcag caaaccgtgt ggggacaatg tggtggtcaa 840

ggttggagtg gaccaacaag ttgtgttgca ggctcagcat gttctacctt gaacccttac 900

tatgcccagt gcattccagg ggctactaca atgagtacca cgacgaagcc aacttcagtc 960

tccgcttcca caactagagc ttccgctact tcttctgcca ctcctcccac ttcatcttaa 1020

<210> 8

<211> 339

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TDL-CBD3氨基酸序列

<400> 8

Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asp Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr

1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ala Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Ala

20 25 30

Asn Val Thr Cys Arg Gly Ser Ile Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp

35 40 45

Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr

50 55 60

Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Arg Leu Ile Val Leu Ser Phe

65 70 75 80

Arg Gly Ser Arg Ser Leu Glu Asn Trp Ile Gly Asn Ile Asn Leu Asp

85 90 95

Leu Lys Gly Ile Asp Asp Ile Cys Ser Gly Cys Lys Gly His Asp Gly

100 105 110

Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asn Thr Leu Thr Gln Gln Val

115 120 125

Gln Asn Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly

130 135 140

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Ser Leu Arg

145 150 155 160

Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val

165 170 175

Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Ala Gln Thr Gly Gly Thr

180 185 190

Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro

195 200 205

Arg Glu Leu Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser

210 215 220

Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Lys Asn Asp Ile Val Lys Val Glu Gly

225 230 235 240

Ile Asp Ser Thr Asp Gly Asn Asn Gln Pro Asn Thr Pro Asp Ile Ala

245 250 255

Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu Gln Gln Thr

260 265 270

Val Trp Gly Gln Cys Gly Gly Gln Gly Trp Ser Gly Pro Thr Ser Cys

275 280 285

Val Ala Gly Ser Ala Cys Ser Thr Leu Asn Pro Tyr Tyr Ala Gln Cys

290 295 300

Ile Pro Gly Ala Thr Thr Met Ser Thr Thr Thr Lys Pro Thr Ser Val

305 310 315 320

Ser Ala Ser Thr Thr Arg Ala Ser Ala Thr Ser Ser Ala Thr Pro Pro

325 330 335

Thr Ser Ser

<210> 9

<211> 1287

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TLL-CBD3核苷酸序列

<400> 9

atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240

tctcttgaga aaagagaggc tgaagctgaa gtctctcaag acttgttcaa ccagttcaac 300

ttgttcgctc aatactctgc cgctgcctac tgtggtaaga acaatgatgc tccagctggt 360

actaacatta cctgtactgg taacgcttgt ccagaagttg agaaggctga tgctaccttc 420

ctgtactcct tcgaagactc tggagttgga gatgttactg gtttcctggc cttggataac 480

actaacaagt tgatcgttct gtccttcaga ggttccagat ccatcgagaa ctggattggt 540

aacttgaact ttgacttgaa ggagatcaac gacatctgtt ctggatgtcg tggtcacgat 600

ggatttacct cctcttggag atctgttgct gataccttga gacagaaggt cgaagatgct 660

gtcagagaac atccagacta tagagttgtc ttcactggtc actccttggg aggtgccttg 720

gctactgttg ctggtgctga cttgcgtggt aatggttatg acattgatgt cttctcctac 780

ggtgctccaa gagttggtaa tcgtgccttc gctgagtttc tgaccgtcca aactggaggt 840

actttgtaca gaattaccca tactaacgac attgttccaa gattgccacc acgtgagttc 900

ggatactctc attcctctcc agagtactgg atcaagtctg gaaccttggt tccagtcact 960

cgtaacgaca tcgtcaagat tgaaggtatt gatgccactg gaggtaacaa tcaaccaaac 1020

attccagaca ttccagctca cttgtggtac tttggtctga ttggtacttg cttgcagcaa 1080

accgtgtggg gacaatgtgg tggtcaaggt tggagtggac caacaagttg tgttgcaggc 1140

tcagcatgtt ctaccttgaa cccttactat gcccagtgca ttccaggggc tactacaatg 1200

agtaccacga cgaagccaac ttcagtctcc gcttccacaa ctagagcttc cgctacttct 1260

tctgccactc ctcccacttc atcttaa 1287

<210> 10

<211> 428

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TLL-CBD3氨基酸序列

<400> 10

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

20 25 30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50 55 60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65 70 75 80

Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe

85 90 95

Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly

100 105 110

Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn

115 120 125

Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe

130 135 140

Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn

145 150 155 160

Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu

165 170 175

Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile

180 185 190

Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser

195 200 205

Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His

210 215 220

Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu

225 230 235 240

Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp

245 250 255

Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu

260 265 270

Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr

275 280 285

Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His

290 295 300

Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr

305 310 315 320

Arg Asn Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn

325 330 335

Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly

340 345 350

Leu Ile Gly Thr Cys Leu Gln Gln Thr Val Trp Gly Gln Cys Gly Gly

355 360 365

Gln Gly Trp Ser Gly Pro Thr Ser Cys Val Ala Gly Ser Ala Cys Ser

370 375 380

Thr Leu Asn Pro Tyr Tyr Ala Gln Cys Ile Pro Gly Ala Thr Thr Met

385 390 395 400

Ser Thr Thr Thr Lys Pro Thr Ser Val Ser Ala Ser Thr Thr Arg Ala

405 410 415

Ser Ala Thr Ser Ser Ala Thr Pro Pro Thr Ser Ser

420 425

<210> 11

<211> 1095

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RML核苷酸序列

<400> 11

atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgtt 60

ccaatcaaga gacaatctaa ttccactgtc gattctttgc ctccattgat tccttctaga 120

actagtgcac cttcatcctc tccatctaca actgaccctg aggctccagc tatgtcaaga 180

aatggtccac ttccttctga tgttgagacc aagtacggaa tggccctgaa tgctacttct 240

tatccagatt ctgtcgttca agctatgaaa agagaggctg aagcttccat cgacggaggt 300

attagagccg ctacttctca ggaaatcaac gaacttactt actatacaac tttgtcagct 360

aattcttact gtagaactgt tattcctggt gctacttggg attgcataca ttgtgacgcc 420

actgaagatt taaagataat taaaacctgg tctactttga tttacgacac taacgctatg 480

gttgctagag gagattccga gaagactatt tatatcgtgt ttagaggttc ttcatctatt 540

cgtaattgga tcgctgattt gacattcgtt ccagtctctt accctccagt ttctggtact 600

aaggttcaca aaggatttct tgattcttat ggtgaagttc aaaacgagtt ggttgctact 660

gtcttggatc agtttaaaca atacccatct tataaggttg ctgtcactgg tcactctttg 720

ggaggtgcta ctgccttgct gtgtgcttta ggtttatacc agagagagga aggattgtct 780

tcaagtaacc tattcttgta cactcaaggt cagcctagag ttggagatcc agcatttgct 840

aattatgtgg tttctactgg tattccatat agacgtactg ttaacgaaag agacatagta 900

ccacacttgc ctccagctgc cttcggattt ctgcatgccg gtgaagagta ctggatcaca 960

gataattctc ctgaaaccgt tcaagtgtgt acatctgatt tagagacttc cgactgctct 1020

aacagtattg ttccatttac ttcagttctt gatcatttgt cttattttgg aattaacacc 1080

ggtttgtgta cttaa 1095

<210> 12

<211> 364

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RML氨基酸序列

<400> 12

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Val Pro Ile Lys Arg Gln Ser Asn Ser Thr Val Asp Ser

20 25 30

Leu Pro Pro Leu Ile Pro Ser Arg Thr Ser Ala Pro Ser Ser Ser Pro

35 40 45

Ser Thr Thr Asp Pro Glu Ala Pro Ala Met Ser Arg Asn Gly Pro Leu

50 55 60

Pro Ser Asp Val Glu Thr Lys Tyr Gly Met Ala Leu Asn Ala Thr Ser

65 70 75 80

Tyr Pro Asp Ser Val Val Gln Ala Met Lys Arg Glu Ala Glu Ala Ser

85 90 95

Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu Leu

100 105 110

Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ser Tyr Cys Arg Thr Val Ile

115 120 125

Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His Cys Asp Ala Thr Glu Asp Leu

130 135 140

Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala Met

145 150 155 160

Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg Gly

165 170 175

Ser Ser Ser Ile Arg Asn Trp Ile Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro Val

180 185 190

Ser Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys Val His Lys Gly Phe Leu Asp

195 200 205

Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu Val Ala Thr Val Leu Asp Gln

210 215 220

Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Ala Val Thr Gly His Ser Leu

225 230 235 240

Gly Gly Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala Leu Gly Leu Tyr Gln Arg Glu

245 250 255

Glu Gly Leu Ser Ser Ser Asn Leu Phe Leu Tyr Thr Gln Gly Gln Pro

260 265 270

Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn Tyr Val Val Ser Thr Gly Ile

275 280 285

Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu Pro

290 295 300

Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr Trp Ile Thr

305 310 315 320

Asp Asn Ser Pro Glu Thr Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu Thr

325 330 335

Ser Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp His

340 345 350

Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly Leu Cys Thr

355 360

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

agctacgtac agcaaaccgt gtgg 24

<210> 14

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

aaagatcctg ggacacttca gatgaagtgg gaggagt 37

<210> 15

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

actcctccca cttcatctga agtgtcccag gatcttt 37

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

ccggaattct tacaaacaag tgccaatt 28

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

ccgtacgtag aagtgtccca ggatcttt 28

<210> 18

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

gtccccacac ggtttgctgc aaacaagtgc caattaag 38

<210> 19

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

cttaattggc acttgtttgc agcaaaccgt gtggggac 38

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

ccggaattct taagatgaag tgggagga 28

<210> 21

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

ccgtacgtag aagtgtccca ggatcttt 28

<210> 22

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

agaagggttt ccggtggaca aacaagtgcc aattaag 37

<210> 23

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

cttaattggc acttgtttgt ccaccggaaa cccttct 37

<210> 24

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

ccggaattct taaagacact gtgaat 26

<210> 25

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

ccgtacgtag aagtgtccca ggatcttt 28

<210> 26

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

agaagggttt ccggtggaca aacaagtgcc aattaag 37

<210> 27

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

cttaattggc acttgtttgt ccaccggaaa cccttct 37

<210> 28

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

ccggaattct taaagacact gtgaat 26

<210> 29

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

ccgtacgtag aagtgtccca ggatcttt 28

<210> 30

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 30

caaccttcaa gttaccagaa actggcaaac aagtgccaat taagccaa 48

<210> 31

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

ttggcttaat tggcacttgt ttgccagttt ctggtaactt gaaggttg 48

<210> 32

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

ccggaattct tatggttcct taccccaa 28

<210> 33

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

ccgtacgtac cagtttctgg taacttga 28

<210> 34

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

aaagatcctg ggacacttct ggttccttac cccaaacca 39

<210> 35

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

tggtttgggg taaggaacca gaagtgtccc aggatcttt 39

<210> 36

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 36

ccggaattct tacaaacaag tgccaatt 28

<210> 37

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 37

ccgaattcat gagatttcct tcaattttta ctg 33

<210> 38

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 38

cccacacggt ttgctgagta cacaaaccgg tgtta 35

<210> 39

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 39

taacaccggt ttgtgtactc agcaaaccgt gtggc 35

<210> 40

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 40

ataaggcggc cgcttaagat gaagtgggag gagt 34

<210> 41

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 41

ccgaattcat gagatttcct tcaattttta ctg 33

<210> 42

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 42

cccacacggt ttgctgcaag caagtaccaa tca 33

<210> 43

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 43

tgattggtac ttgcttgcag caaaccgtgt ggg 33

<210> 44

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 44

ataaggcggc cgcttaagat gaagtgggag gagt 34

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6、8或10所示。

2.一种多核苷酸分子，其特征在于，所述多核苷酸分子的多核苷酸序列选自：

(1)编码权利要求1所述融合蛋白的多核苷酸序列；和

(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。

3.如权利要求2所述的多核苷酸分子，其特征在于，所述多核苷酸分子的多核苷酸序列如SEQ ID NO:5、7或9所示。

4.一种核酸构建物，所述核酸构建物含有权利要求2或3所述的多核苷酸分子的多核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物是克隆载体或表达载体。

6.一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞：

(1)表达权利要求1所述的融合蛋白；和/或

(2)含有权利要求2或3所述的多核苷酸序列或权利要求4或5所述的核酸构建物。

7.一种提高脂肪酶比酶活、温度稳定性和甲醇耐受性的方法，所述方法包括将所述脂肪酶与哈茨木霉(Trichoderma harzianum)来源的内切葡聚糖酶II的纤维素结合域融合表达的步骤；其中，所述纤维素结合域的氨基酸序列如SEQ ID NO:6第1-70位氨基酸残基所示；所述脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:6第71～339位所示或如SEQ ID NO:10第1～358位所示。

8.氨基酸序列如SEQ ID NO:6第1-70位氨基酸残基所示的哈茨木霉(Trichodermaharzianum)来源的内切葡聚糖酶II的纤维素结合域在提高脂肪酶比酶活、温度稳定性和甲醇耐受性中的用途；其中，所述脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:6第71～339位所示或如SEQ ID NO:10第1～358位所示。

9.权利要求1所述融合蛋白、权利要求2或3所述的多核苷酸分子、权利要求4或5所述的核酸构建物或权利要求6所述的遗传工程化的宿主细胞在催化酯水解、酯合成、酯交换或立体异构体拆分中的应用。

10.权利要求1所述融合蛋白、权利要求2或3所述的多核苷酸分子、权利要求4或5所述的核酸构建物或权利要求6所述的遗传工程化的宿主细胞在制备药物中的应用。