CN106479996A - 一种新型的淀粉酶 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型的淀粉酶，所述淀粉酶含有(1)SEQ ID NO:2第1－306位氨基酸序列；或(2)在(1)所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留SEQ ID NO:2第1－306位氨基酸序列所具备的磷脂酶活性的由(1)衍生的多肽。本发明还涉及所述淀粉酶的多核苷酸序列，含有所述多核苷酸序列的核酸构建体，所述多核苷酸序列或核酸构建体的宿主细胞，含有所述多肽的组合物，以及所述多肽的用途。

Description

一种新型的淀粉酶

技术领域

本发明属于淀粉酶领域，具体涉及一种新型淀粉酶。

背景技术

淀粉酶(amylase)是一种可以水解淀粉，糖原和多糖，并使它们转化为糖的一类酶的统称。广泛分布于植物，动物，微生物中，大量生产还是依赖于微生物的发酵，是一种研究最广，时间最久，应用最早的工业用酶，占整个酶制剂用量的50％以上。主要有以下几类：

α-淀粉酶：主要水解底物内部的糖苷键；

β-淀粉酶：主要从非还原性末端将麦芽糖单位水解下来；

葡萄糖淀粉酶：从底物的非还原性末端将葡萄糖单位水解下来；

脱支酶：只对支链淀粉，糖原等分支点的α-1，6糖苷键有专一性。可参见张树正，《酶制剂工业》，北京:科学出版社，1984。

淀粉酶被广泛应用在不同工业：

1、酿酒应用：将淀粉直接发酵生产乙醇，在酒精生产和酿酒工业中使用淀粉酶，能保证发酵物中的酶活性一致，能够提高糖化率，酒精出率和酵母的生长，除此以外，还能够提高啤酒的口感。

2、烘焙应用：面包烘烤工业中，使用淀粉酶可以使产品体积更大，颜色更好，颗粒更柔软，对面包的口感，品质也都有促进作用。

3、淀粉脱浆：现代纤维制造工艺容易产生大量的细菌，为防止纱线断裂，往往在表面加一层淀粉，淀粉脱浆可以用淀粉酶水解淀粉，因而容易被洗掉，反应过程绿色，环保，无污染〔吕晶、陈水林，“酶及其在纺织加工中的应用”，《纺织学报》，2002，2(23)：155-157〕。

4、除垢剂中的应用：在除垢剂中，淀粉酶也是其中重要成分之一，其主要功能是能够使除垢剂更加温和，降低残留对人体的伤害。目前已经被大量应用于洗涤行业，市场占有率最高的淀粉酶厂家是诺维信和杰能科，主要优点是通过利用基因改造得技术使得它们的酶具有良好的储存稳定性〔Van Ee J H、van Rijswijk W C、Bollier M.，Enzymatic automated dish-wash detergents，ChimOggi，1992，10:21-24〕。

目前国际上只有诺维信，丹尼斯特和帝斯曼等少数几家公司拥有真菌淀粉酶的先进生产技术与产品，发酵水平在2000U/g以上，我国在淀粉酶上的相关技术还存在不足，国内报道的发酵水平大多数在200-600U/g，国内市场供应的淀粉酶都还是来自国外，国内企业在竞争上还是处于劣势〔李松、王正祥，“真菌α-淀粉酶的研究进展”，《生物技术通报》，2011(3):67-7〕。

发明内容

本发明提供一种分离的多肽，该多肽含有：

(1)SEQ ID NO:2第1－306位氨基酸序列；或

(2)在(1)所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留SEQ ID NO:2第1－306位氨基酸序列所具备的磷脂酶活性的由(1)衍生的多肽。

在一个具体实施方式中，所述分离的多肽：

(a)如SEQ ID NO:2所示，或

(b)含有选自前导肽、末端延伸、GST、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的标签，或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点的氨基酸序列。

本发明提供一种分离的多核苷酸序列，选自：

(1)编码本发明所述分离的多肽的多核苷酸序列；和

(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。

在一个具体实施方式中，所述多核苷酸序列选自：

(1)SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列；和

(2)(1)所述的多核苷酸序列的互补序列。

本发明还提供一种核酸构建体，该核酸构建体包含本发明多核苷酸序列。

在一个具体实施方式中，所述核酸构建体是表达载体。

本发明还提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的多核苷酸序列或核酸构建体。

本发明还提供一种组合物，该组合物含有本发明多肽。

本发明还提供本发明多肽在酒精生产、酿酒、烘焙、淀粉脱浆和除垢剂制备领域中的应用。

本发明还提供一种调节(提高或抑制)本发明多肽的酶活的方法，所述方法包括：

(1)在所述多肽的使用环境中添加含Mn²⁺、Mg²⁺、NH₄ ⁺、或Ca²⁺的溶液；和/或

(2)将所述多肽的使用环境的温度控制在65～70℃之间，优选在67.5～70℃之间；和/或

(3)将所述多肽的使用环境的pH控制在6.5～7.5之间，优选约为7.5。

在一个具体实施例中，所述调节为提高酶活，所述方法包括在所述多肽的使用环境中添加含Mn²⁺离子的溶液。

在一个具体实施例中，所述调节为抑制酶活，所述方法包括在所述多肽的使用环境中添加含Mg²⁺、NH₄ ⁺和/或Ca²⁺的溶液。

附图说明

图1显示不同温度下本发明淀粉酶BM4的酶活。

图2显示本发明淀粉酶BM4的稳定性测试。

图3显示本发明淀粉酶BM4在不同pH条件下的酶活。

图4显示本发明淀粉酶BM4在不同pH条件下的稳定性。

图5显示金属离子对本发明淀粉酶BM4酶活的影响。

图6显示本发明淀粉酶BM4的凝胶电泳检测结果，箭头所指为本发明蛋白。

图7显示OD值与淀粉含量相关性标准曲线。

具体实施方式

本发明提供一种新型的淀粉酶，其编码序列，含编码序列的核酸构建体或表达载体，含编码序列或核酸构建体或表达载体的宿主细胞，以及所述淀粉酶的用途等。

具有淀粉酶活性的多肽

本发明提供氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽。本发明还包括在SEQID NO:2的基础上具有一个或多个(通常为1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸缺失、插入和/或取代，尤其是在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为8以内)氨基酸的多肽。优选是保守性变异形式。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。

此外，本领域技术人员公知，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的蛋白末端引入一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的蛋白的活性。又如为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的标签，或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点。应理解，这些氨基酸序列的存在不会影响到所得多肽的活性。因此，本发明也包括在本发明多肽的C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸(例如前述接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、GST、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的标签，或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点等)所得的多肽，这些多肽仍具有本文所述的磷脂酶活性。

根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。

本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

多核苷酸

本申请包括编码本发明多肽的核苷酸序列或其互补序列。SEQ ID NO:1显示了本发明多肽的编码序列之一。所述“编码序列”包括编码本发明所述多肽的核酸序列。编码本发明多肽的序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，但与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列有差别的核苷酸序列。

编码本发明多肽的序列包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的片段、类似物、衍生物和变异形式。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。

本发明也包括编码本发明多肽的核酸序列(如SEQ ID NO：1或其互补序列)的片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码本发明多肽的多核苷酸。因此，在某些实施例中，核酸片段的长度在15－30个碱基。可采用现有技术从本发明的核酸序列中挑选出适当的核酸片段，用作引物或探针。

本发明多肽的编码序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

核酸构建体

本发明也涉及包括与指导编码序列在合适宿主细胞中，在与该调控序列相适合的条件下表达的一个或多个调控序列可操作连接的本发明的分离多核苷酸的核酸构建体。编码本发明多肽的多核苷酸可以多种方式被操作以保证该多肽的表达。在其插入载体之前该多核苷酸序列的操作可能根据该表达载体是合乎需要或必需的。利用重组DNA方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。

调控序列可以是合适的启动子序列，由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列包含接到多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于指导本发明的核酸构建体，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从噬菌体T7启动子、大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因等。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞正转录的合适启动子的实例是从米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉糖化酶(glaA)、里氏木霉纤维二糖水解酶I、氏木霉纤维二糖水解酶II、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、里氏木霉葡聚糖内切酶等基因获得的启动子及其突变、截短和杂合(hybrid)启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子可获得自酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因、巴斯德毕赤酵母醇氧化酶基因。用于酵母宿主细胞的其它有用启动子由Romanos et al.，1992，Yeast 8:423-488描述。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。

用于细菌宿主的优选终止子可以是来自T7噬菌体的终止子。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子获得自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶的基因。

用于酵母宿主细胞的优选终止子获得自酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C、酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶、巴斯德毕赤酵母醇氧化酶基因等。

调控序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。签到序列与编码该多肽的核苷酸序列的5′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。

调控序列也可以是编码与多肽的氨基酸末端连接的氨基酸序列并且指导该编码的多肽进入细胞分泌途径的信号肽编码区。核苷酸序列编码序列的5′端可固有地包含天然连接具有编码分泌多肽的编码区节段的翻译阅读框的信号肽编码区。备选地，编码序列的5′端可包含与该编码区外源的信号肽编码区。当编码序列非天然地包含信号肽编码区时，可能需要外来的信号肽编码区。备选地，外来的信号肽编码区可简单地替换天然的信号肽编码区以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入选择的宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区，即分泌进入培养基，都可用于本发明。

表达载体

本发明也涉及包括本发明多核苷酸的重组表达载体。各种核酸和调控序列可被连接在一起，以产生可能包括一个或多个容许在这种位点插入或取代该编码多肽的核苷酸序列的方便限制性位点的重组表达载体。备选地，本发明的核苷酸序列可通过插入核苷酸序列或包括进入适当表达载体的序列的核酸构建体而被表达。在制造表达载体时，编码序列位于载体中以使得该编码序列可操作地连接用于表达适当调控序列。

重组表达载体可以使能够方便地经受重组DNA方法并且可导致感兴趣的核苷酸序列表达的任何载体(如质粒或病毒)。载体的选择一般取决于载体与其中被导入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性或闭合的环形质粒。

载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在，其复制不依赖于染色体复制的载体，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可包含用于保证自我复制的任何方式。备选地，载体可以是当被导入宿主细胞时，整合到基因组中并且与其已经被整合进入的染色体一起复制的载体。此外，可使用一起包含将被导入宿主细胞基因组的总DNA的单个载体或质粒或两个或多个载体或质粒，或转座子。

本发明的载体优选包含一个或多个容许容易选择转化、转染、转导等细胞的可选择标记。可选择的标记是基因，其产物提供对抗生素或病毒的抗性、对重金属的抗性、原养型至营养缺陷型等。

本发明的载体优选包含容许该载体整合进入宿主细胞基因组或该载体在细胞中独立于基因组自主复制的元件。

一个以上拷贝的本发明的多核苷酸可被插入宿主细胞以增加该基因产物的产量。多核苷酸拷贝数的增加可通过将至少一个附加拷贝的序列整合进入宿主细胞基因组或通过包括可扩增的选择标记基因和该多核苷酸来获得，其中包含扩增拷贝的选择标记基因并且由此包含附加拷贝多核苷酸的细胞可通过在存在适当的选择剂时培养该细胞来筛选。

本发明的载体优选包含人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点，能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。

本发明优选使用能在大肠杆菌中表达的载体，例如pET24a(+)。

宿主细胞

本发明也涉及包括被用于重组生产多肽的本发明多核苷酸的重组宿主细胞。包括本发明多核苷酸的载体被导入宿主细胞以使得该载体如早先说明的作为染色体的组成部分或作为染色体外的自我复制载体来维持。宿主细胞的选择很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是单细胞微生物或非单细胞微生物。单细胞微生物例如革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌细胞，例如，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌等；或链霉菌细胞，例如钱青紫链霉菌；或革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌和假单胞菌属。

在优选的方面，细菌宿主是枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和大肠杆菌细胞。

宿主细胞也可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物、酵母或真菌细胞。可列举的“真核”生物包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门等。

因此，在某些实施方式中，宿主细胞可以是是子囊菌门的细胞如酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)以及Komagataella属等。

在其它实施方式中，宿主细胞可以是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)等。在另外最优选方面，宿主细胞是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。

多肽的性能及用途

本发明的淀粉酶的最适作用温度在65～70℃之间，在67.5℃左右达到最高酶活；在70℃左右高温下的稳定性很好；pH为3～7.5时酶活成上升趋势，在6.5～7.5之间能维持80％以上的酶活，并在pH7.5左右达最高酶活；从pH6到pH7.5，酶活稳定性逐步升高，pH7.5时达到最高位100％；在Mn²⁺离子存在下，酶活提高4.5倍，Mg²⁺、NH₄ ⁺、Ca²⁺存在下，酶活被完全抑制。

本发明的淀粉酶可被用在不同领域中，包括但不限于酒精生产、酿酒、烘焙、淀粉脱浆和除垢剂领域等。具体而言，在酒精生产和酿酒工业中使用淀粉酶，能保证发酵物中的酶活性一致，能够提高糖化率，酒精出率和酵母的生长，除此以外，还能够提高啤酒的口感。在面包烘烤工业中，使用淀粉酶可以使产品体积更大，颜色更好，颗粒更柔软，对面包的口感，品质也都有促进作用。现代纤维制造工艺中，为防止纱线断裂，往往在表面加一层淀粉，淀粉脱浆可以用淀粉酶水解淀粉，因而容易被洗掉，反应过程绿色，环保，无污染。而在除垢剂中，加入淀粉酶能使除垢剂更加温和，降低残留对人体的伤害。

本发明的淀粉酶可以纯的制品的形式提供，也可以组合物的形式提供。当以组合物的形式提供时，可根据不同的应用领域，组合物中可含有适用于该领域的其它辅料，这类辅料包括但不限于吸附材料，尤其是选自活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等的吸附材料。

下文将以具体实施例的方式阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社2002，[美]J.萨姆布鲁克、D.W.拉塞尔著，黄培堂等译)所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。对于试剂的用法和用量，除非另有说明，否则按照常规的用法和用量使用。本发明中所用化学品若无特别说明，均商购自sigma公司，为分析纯级。

实施例1：淀粉酶的制备

由生工生物工程(上海)股份有限公司合成SEQ ID NO:1所示序列(其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)，并克隆在表达载体pET24a(+)上。

将带有该核苷酸序列的pET24a(+)转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达(参考《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社2002，[美]J.萨姆布鲁克、D.W.拉塞尔著，黄培堂等译)。具体过程如下：

挑取阳性转化子在LB培养基中，于37℃进行过夜种子培养，按1％的接种量，将种子培养液接种到表达培养基中，于37℃，220rpm培养至OD600＝0.6-0.8。

冷却至16℃后，加入IPTG至1mM进行诱导，16℃，190rpm过夜表达。诱导表达结束后，离心收集菌体。用裂解缓冲液重悬菌体(每克细胞加5毫升缓冲液)。

将重悬的菌体进行低温超声破碎细胞(50％电压输出，2秒超声破碎，9秒间隔，共超声20分钟)，操作时将样品冰浴冷却以保护蛋白。细胞破碎后，14000rpm离心20分钟并收集上清。凝胶电泳检测结果如图6所示，命名为BM4。

实施例2：OD值与淀粉含量相关性标准曲线制定

原碘液：称取11.0g碘和22.0g碘化钾，用少量水使碘完全溶解，并定容至500ml。

稀碘液：吸取原碘液2.0ml，加20g碘化钾，用水溶解并定容至500ml。

分别配制0.2，0.4，0.6，0.8，1，1.2，1.4mg/ml的淀粉溶液(用pH7.5的磷酸缓冲液溶解)，以1：5的体积比加入稀碘液，测量并记录混合液的OD660值，做出相关性直线，其线性关系如图7所示，得出对应公式：n＝1.6111OD-0.0939。

实施例3：利用碘液颜色的下降来指示淀粉酶降解淀粉的活力

采用碘-淀粉比色法测BM4的酶活。具体而言，利用淀粉遇碘变蓝色的原理进行测试，可参见郭晶、王永军，“国产染色淀粉片剂法检测工业α-淀粉酶的活力”，《日用化学品科学》，2000，23(6)：39—40。

配制1.5g/l淀粉溶液：称取1.5g淀粉溶解于1L磷酸缓冲液中。

吸取1ml的淀粉溶液，60℃恒温水浴预热8min，加入100μl酶液，准确反应5min。以1：5的比例加入稀碘液。测量并记录混合液的OD660值，与此同时用灭活的淀粉酶酶液作对照。

酶活定义：1ml液体酶于60℃，pH7.5的磷酸缓冲液条件下1h液化1mg淀粉即为一个酶活力单位以U/ml来表示。

淀粉酶酶活公式为：A＝〔(A1-A0)×1.6111-0.0939〕×V1/(V2×t)

V1为总反应体积，V2为酶液体积，A1为混合液OD660值，A0为对照组OD660值。

淀粉酶BM4酶学性质检测：

1、最适反应温度：

在不同(55-75℃)温度下按照上述方法测定淀粉酶酶活，以测定酶活最高时的酶活力为100％，计算其他温度下的相对酶活(％)。由图1可见，该淀粉酶的酶学活力随着温度的提高呈现先上升后下降的趋势，其中67.5℃酶活最高(24.374U/ml)，为其最适作用温度。

2、温度稳定性

取1微升酶液分别放置60℃，65℃，70℃作为温度梯度，0H，2H，4H，6H作为时间梯度，用淀粉酶酶活测定方法，在不同的温度，时间梯度下测量酶活，以OH酶活为100％，计算其他条件下的相对酶活(％)。由图2可知，在70℃保温6小时后，按照上述方法测定的酶活依然有70％的活力，酶活在70℃高温下的稳定性很好。

3、最适反应pH

将酶液分别在不同pH(3.0-10.0)的缓冲体系溶解的淀粉溶液中(50mMNaAc，TrisHCl，MES,Gly-NaOH等)，4℃保温24h，再于67.5℃、pH7.5下用上述方法测定淀粉酶的活力。以酶活测定最高的缓冲液中所测得的酶活力(20.35484U/ml)为100％，计算其他pH下的相对酶活力。由图3可见pH7.5时酶活最高，3-7.5成上升趋势，7.5-9.5酶活下降趋势，降低至零。

4、pH稳定性

将酶液分别在不同pH(3.0-10.0)的缓冲体系(50mM NaAc，TrisHCl，Gly-NaOH等)中以1：1的比例混合，4℃保温24h，再于67.5℃、pH7.5下按上述方法测定淀粉酶的活力。以酶活测定最高的缓冲液中所测得的酶活力为100％，计算其他pH下的相对酶活力。由图4可知，从pH6到pH7.5，酶活稳定性逐步升高，pH7.5时达到最高位100％，从pH7.5到pH9稳定性逐步下降至0。

5、金属离子对淀粉酶活力的影响

配制ZnSO₄、MnCl₂、CoCl₂、CaCl₂、MgSO₄、CuSO₄、KCl、(NH₄)₂SO₄、NaCl、NiSO₄、FeCl₃等无机盐贮存液。按照上述方法(底物更换为pNPD)，首先配制反应混合液，向每个反应管中分装200ul混合液，并添加终浓度为5mmol/L的无机盐贮存液，再按照标准方法测定活性。以超纯水作对照(24U/ml)为100％，计算其他各组的相对活力。由图5可知，在Mn²⁺离子存在下，酶活提高4.5倍，Mg²⁺，NH₄ ⁺，Ca²⁺存在下，酶活被完全抑制。

应理解，上述实施例仅仅是示例性的，本发明并不限于上述实施例。在不偏离本发明精神和范围的情况下对本发明作出的任何修改和变动，都在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种分离的多肽，该多肽含有：

(1)SEQ ID NO:2第1－306位氨基酸序列；或

(2)在(1)所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，同时保留SEQ ID NO:2第1－306位氨基酸序列所具备的磷脂酶活性的由(1)衍生的多肽。

2.如权利要求1所述的分离的多肽，其特征在于，所述多肽：

(a)如SEQ ID NO:2所示，或

(b)含有选自前导肽、末端延伸、GST、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的标签，或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点的氨基酸序列。

3.一种分离的多核苷酸序列，选自：

(1)编码权利要求1或2所述的分离的多肽的多核苷酸序列；

(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列；和

(3)(1)或(2)所述序列的长15－30个碱基的片段。

4.如权利要求3所述的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列选自：

(1)SEQ ID NO:1所示的多核苷酸序列；

(2)(1)所述的多核苷酸序列的互补序列；和

(3)(1)或(2)所述序列的长15－30个碱基的片段。

5.一种核酸构建体，其特征在于，该核酸构建体包含权利要求3或4所述的多核苷酸序列。

6.如权利要求5所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体是表达载体。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3或4所述的多核苷酸序列或权利要求5或6所述的核酸构建体。

8.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有权利要求1或2所述的多肽和任选的辅料，优选的，所述辅料为选自活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃的吸附材料。

9.权利要求1或2所述的多肽在酒精生产、酿酒、烘焙、淀粉脱浆或除垢剂制备领域中的应用。

10.一种调节权利要求1或2所述的多肽的酶活的方法，所述方法包括：

(1)在所述多肽的使用环境中添加含Mn²⁺、Mg²⁺、NH₄ ⁺、或Ca²⁺的溶液；和/或

(2)将所述多肽的使用环境的温度控制在65～70℃之间，优选在67.5～70℃之间；和/或

(3)将所述多肽的使用环境的pH控制在6.5～7.5之间，优选约为7.5。