CN104220593A

CN104220593A - α-淀粉酶

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Publication number: CN104220593A
Application number: CN201380007360.8A
Authority: CN
Inventors: 鲁斯·帕拉尼克瓦
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2012-01-30
Filing date: 2013-01-29
Publication date: 2014-12-17
Anticipated expiration: 2033-01-29
Also published as: CN104220593B; EP2809781A1; BR112014018610A2; CL2014002030A1; DK2620496T3; US20140377407A1; US8426182B1; EA201400850A1; AU2013214397A1; EP2620496B1; WO2013113665A1; EP2620496A1; AR089840A1; ES2546630T3; CA2861148A1

Abstract

本发明涉及新α-淀粉酶、其制备方法和该淀粉酶的用途。本发明涉及来自Alicyclobacillus pohliae的包含编码新α-淀粉酶的基因的新鉴定的多核苷酸序列。本发明的特征在于新基因的全长编码序列以及该基因的全长功能性蛋白的氨基酸序列。本发明还涉及在工业过程例如食品工业如烘焙业中使用这些蛋白质的方法。本发明还包括适合生产这些蛋白质和细胞的用本发明的多核苷酸转化的细胞。

Description

α-淀粉酶

发明领域

本发明涉及新α-淀粉酶、其制备方法和该淀粉酶的用途。

本发明涉及包含编码新α-淀粉酶的基因的新鉴定的多核苷酸序列。本发明的特征在于新基因的全长编码序列以及该基因的全长功能性蛋白的氨基酸序列。本发明还涉及在工业过程例如食品工业如烘焙业中使用这些蛋白质的方法。本发明还包括适合生产这些蛋白质和细胞的用本发明的多核苷酸转化的细胞。本发明涉及制造本发明的多核苷酸的方法。本发明还涉及制造本发明的多肽的方法。

发明背景

关于面包陈化的研究指出，面包中的淀粉部分在贮存期间发生再结晶，从而导致内芯(crumb)紧实度的增加，其可以以面包片硬度的增加来测量。

本发明涉及α-淀粉酶。α-淀粉酶已被用于工业很长一段时间。

α-淀粉酶传统上通过添加麦芽小麦或大麦面粉来提供，并且给烘焙者带来一些优势。使用α-淀粉酶以在面团发酵期间得到满意的气体产生和气体保留以及满意的表皮颜色。这意味着，如果该酶没有以足量使用，面包块的体积、质地和外观都会被显著损害。α-淀粉酶在小麦作物本身中自然产生，由哈格伯格降落数值(Hagberg Falling Number)常规测定(ICC107法)，并通过在磨机中加入α-淀粉酶以及在烘焙厂使用专门的配料来采取措施以使这种变化最小化，因为此酶极度重要。

在更现代的时候，来自谷物的α-淀粉酶很大程度被来自微生物来源包括真菌来源和细菌来源的酶替换。通过在菌种选择、发酵和加工中使用生物技术，酶可以由所述微生物来源制备，而这相比麦芽面粉更具优势，因为酶具有更为受控的质量，相对纯，使用更经济。

但是，α-淀粉酶的性质及其技术效果确实显示了重要的区别。除了影响气体产生、气体保留和表皮颜色，α-淀粉酶可以与烘焙产品的货架期有关。

在小麦面粉中的淀粉含有两种主要的成分，直链淀粉和支链淀粉，这些淀粉的组织形式为淀粉颗粒。来自硬质小麦(hard-milling wheat)品种的这些颗粒的一部分“被破坏”，颗粒在碾压能量的结果下分裂开来。在烘焙过程中，淀粉颗粒糊化；该过程涉及颗粒的吸水膨胀和颗粒结晶性质的失去；特别是已知天然颗粒内的支链淀粉作为结晶存在并且这些分子在糊化过程中解离并失去结晶性。一旦面包被烘焙，支链淀粉经数天慢慢地重新结晶，该重新结晶或淀粉的回生(retrogradation)被视为面包陈化的主要原因。

这些不同形式的淀粉以及它们与α-淀粉酶的相互作用表明了酶在烘焙技术方面的作用。来自真菌来源的、最典型地来自Aspergillus种的α-淀粉酶主要在面团混合和整个发酵/发面期间作用于被破坏的淀粉。酶的低热稳定性意味着酶在烘焙期间以及关键地在淀粉糊化发生之前被灭活，使得很少或没有淀粉从未被破坏的部分分解。因此，真菌淀粉酶在为发酵和颜色提供糖类方面是有用的，但在延长货架期方面几乎没有价值。另一方面，细菌α-淀粉酶最典型地来自Bacillus amyloliquifaciens的α-淀粉酶的确带来了面包烘焙期间以及淀粉糊化期间的扩展的温度稳定性和活性。细菌淀粉酶然后导致淀粉以及由之引起的烘焙面包品质的更广泛改性；特别是烘焙面包的内芯可在整个货架期显见地更柔软并且可使得货架期增加。然而，尽管细菌α-淀粉酶可对于延长货架期有用，却很难实际使用，因为很小的过量就会导致内芯结构有不可接受的大和开放的孔洞，而质地可变得过于柔软并且“粘软”。

本发明人已经鉴定了来自特定细菌来源的α-淀粉酶，其具有界于典型的真菌α-淀粉酶和典型的细菌α-淀粉酶之间的热稳定性。这种酶的热稳定性比真菌α-淀粉酶更高，因此允许糊化期间和糊化之后支链淀粉有更大的活性，但它在烘焙过程中发挥作用的时间不像典型的细菌淀粉酶那么长，并且不过度消化(over digesting)淀粉。

US4,598,048描述了产麦芽糖淀粉酶的制备。US4,604,355描述了产麦芽糖淀粉酶、其制备及其用途。US RE38,507描述了抗陈化方法和制剂。US RE38,507所描述的产品以商品名在产业中使用。

致力于寻找一种能够生产改进的α-淀粉酶的有机体。结果，本发明人鉴定到了在南极发现的Alicyclobacillus pohliae NCIMB 14276菌株。这是新菌株，其以前没有被用作具有改进性能的α-淀粉酶的来源。

发明概要

本发明涉及多肽。本发明提供了可用于延缓烘焙产品如面包和蛋糕的陈化的新α-淀粉酶。本发明进一步提供了编码所述新α-淀粉酶的新多核苷酸。

因此，本发明涉及：

编码具有α-淀粉酶活性的多肽的多核苷酸，其包含：

(a)编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或具有SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列；或

(b)编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽与具有SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列的多肽有至少99.5％的同一性；或

(c)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3第100-2157位核苷酸所示的多核苷酸序列；或

(d)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的多核苷酸序列。

进一步，本发明涉及：

α-淀粉酶多肽，其包含：

(a)SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列；或

(b)与SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少99.5％的同一性的氨基酸序列；或

(c)由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3第100-2157位核苷酸所示的多核苷酸编码的氨基酸序列；或

(d)根据(c)的氨基酸序列，其中所述多核苷酸是由Alicyclobacillus pohliae NCIMB 14276生产的；或

(e)与SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少70％的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一个的氨基酸序列，所述位置参照SEQ ID NO：2来定义；或

(f)与SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少70％的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一个的氨基酸序列，所述位置参照SEQ ID NO：2来定义，并且所述氨基酸序列的特征在于，当被用于制备具有基于面粉的至少5wt％的糖的烘焙产品时，所述烘焙产品相比不使用所述氨基酸序列制备的烘焙产品具有减小的贮存后硬度。

另一个方面，本发明涉及包含本发明的多核苷酸序列的载体。本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的重组宿主细胞。本发明涉及制造本发明的多核苷酸的方法。本发明还涉及制造本发明的多肽的方法。本发明涉及所述多肽用于食品制造的用途。本发明还涉及酶组合物。本发明还涉及制备面团的方法以及涉及包含本发明多肽或本发明酶组合物的面团。

本发明还涉及制备烘焙产品的方法，其包括烘焙本发明的面团的步骤。

本发明还涉及烘焙的产品。

本发明还涉及生产多肽的方法，其包括使用Alicyclobacillus pohliaeNCIMB 14276。

附图简要描述

图1示出pGBB09的质粒图谱

图2示出pGBB09DSM-AM1的质粒图谱

图3示出SEQ ID NO：1.

图4示出SEQ ID NO：2.

图5示出SEQ ID NO：3.

序列表简要描述

SEQ ID NO：1示出编码野生型信号序列(1-99位核苷酸所示)、本发明的α-淀粉酶(第100-2157位核苷酸所示)以及3′-末端的终止密码子(2157-2160位核苷酸所示)的来自Alicyclobacillus pohliaeNCIMB14276的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：2示出Alicyclobacillus pohliae NCIMB 14276野生型信号序列(1-33位氨基酸所示)和本发明的α-淀粉酶(第34-719位氨基酸所示)的氨基酸序列。本文中也被称为DSM-AM蛋白。

SEQ ID NO：3示出编码野生型信号序列(第1-99位核苷酸所示)、本发明的α-淀粉酶(第100-2157位核苷酸所示)以及3′-末端的终止密码子(第2157-2160位核苷酸所示)的来自Alicyclobacillus pohliaeNCIMB14276的密码子优化的多核苷酸序列。

发明内容

在本说明书和所附的权利要求书全文中，词语“包含”和“包括”及其时态变化应当被解释为开放的和包含性的。也就是说，当上下文允许时，这些词语旨在表示可包含没有具体列举的其他要素或整体。

在本说明书和所附的权利要求书全文中，措辞“第100-2157位核苷酸”表示第100位直至并包括第2157位核苷酸。

在本说明书和所附的权利要求书全文中，措辞“第34-719位氨基酸”是指第34位直至并包括第719位氨基酸。

术语“具有SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列的多肽”、“SEQ ID NO：2所示的成熟多肽”以及“成熟的DSM-AM”在本文中可互换使用。

术语“与具有SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列的多肽有至少99.5％的同一性的多肽”、“本发明的成熟多肽”、“本发明的成熟酶”、“本发明的淀粉分解酶”、“本发明的α-淀粉酶(alpha-amylase enzyme)”、“本发明的α-淀粉酶(alpha-amylase)”以及“本发明的多肽”在本文中可互换使用。

术语“与具有SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列的多肽有至少70％的同一性的多肽”、“本发明的成熟多肽”、“本发明的成熟酶”、“本发明的淀粉分解酶”、“本发明的α-淀粉酶(alpha-amylase enzyme)”、”本发明的α-淀粉酶(alpha-amylase)”和“本发明的多肽”在本文中可互换使用。

术语“根据本发明”和“本发明的”在本文中可互换使用。

术语“DSM-AM基因”、“本发明的α-淀粉酶基因”、“AM基因”和“SEQ ID NO：1的多核苷酸”在本文可互换使用。

术语“本发明的多核苷酸”包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3。

在本发明的上下文中，“成熟多肽”在本文中定义为具有α-淀粉酶活性的多肽，其是在翻译和包括N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等任何翻译后修饰之后的其最终形式。成熟过程可取决于所使用的特定的表达载体、表达宿主和生产工艺。

为了确认来自Alicyclobacillus pohliae NCIMB 14276的DSM-AM基因的多核苷酸序列，对A.pohliaeNCIMB14276的整个基因组进行测序。其结果证实了编码DSM-AM蛋白的多核苷酸是如SEQ ID NO：1所公开的。由此，如SEQ ID NO：2所示的DSM-AM蛋白的719位氨基酸序列得到确认。从DSM-AM蛋白的N′-末端开始的前33个氨基酸属于信号序列。

多核苷酸

本发明涉及编码具有α-淀粉酶活性的多肽的多核苷酸，其包含：

(a)编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽具有SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列；或

(c)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：13第100-2157位核苷酸所示的多核苷酸序列；或

(d)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的多核苷酸序列。

在一个方面，本发明的多核苷酸是分离的多核苷酸，其包含：

(a)SEQ ID NO：1或3的多核苷酸序列的第100-2157位核苷酸(为免生疑义，包括第100位和第2157位核苷酸)所示的多核苷酸序列；或

(b)编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或具有SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列(为免生疑义，包括第34位和第719位氨基酸)；或

(c)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的多核苷酸序列。

在一个方面，所述分离的多核苷酸可以通过合成得到，例如通过固相合成或通过本领域技术人员已知的其他方法。

SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的序列包括编码本发明的成熟多肽和野生型信号序列的核苷酸。SEQ ID NO：2包括本发明的成熟多肽和野生型信号序列。

“分离的多核苷酸”或“分离的核酸”是这样的DNA或RNA，它们与在获得其的生物的天然基因组中与其紧密相邻的两条编码序列(5’末端一条，3’末端一条)并非紧密相邻。因此，在一个实施方案中，分离的多核苷酸包括与编码序列紧密相邻的5’非编码(例如，启动子)序列的一些或全部。该术语因此包括，例如，整合入载体的重组DNA，整合入自主复制的质粒或病毒的重组DNA，或者整合入原核生物或真核生物的基因组DNA的重组DNA，或者其作为单独分子独立于其他序列而存在(例如通过PCR或限制性内切酶处理产生的基因组DNA片段或cDNA)。该术语还包括作为编码额外多肽的杂合基因的一部分的重组DNA，其基本不含细胞材料、病毒材料或培养基(通过重组DNA技术生产时)或化学前体或其他化学品(化学合成时)。另外，“分离的多核苷酸片段”是不以片段的形式天然存在并且在天然状态下不会被发现的多核苷酸片段。

本发明的多核苷酸还包括这样的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：1或3的编码序列的某些变体序列并且可以编码功能性α-淀粉酶。所述变体序列因此编码具有α-淀粉酶活性的多肽。

本发明的多核苷酸序列一般包含编码如下多肽的序列，所述多肽与具有SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列的多肽有通过那些序列的全长计算的至少约99.5％的同一性。

SEQ ID NO：1或3的编码序列可以通过核苷酸替换被修饰。SEQ IDNO：1或3的多核苷酸可以可替代地或另外地通过一个或更多个插入和/或缺失和/或通过在任意一端或两端的延伸来被修饰。被修饰的多核苷酸编码具有α-淀粉酶活性的多肽。

在本发明的多核苷酸的一个实施方案中，所述多核苷酸是由Alicyclobacillus pohliae NCIMB 14276产生的。如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸分子”及类似用语旨在包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如，mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。多核苷酸分子可以是单链的或双链的，但优选地是双链DNA。多核苷酸可以是合成的，从而其包含合成的或被修饰的核苷酸。本领域已知对多核苷酸有多种不同类型的修饰。这些修饰包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯骨架、吖啶或聚赖氨酸链在分子的3′和/或5′端的添加。所述寡核苷酸可以被用来例如制备具有改变的碱基配对能力或提高的核酸酶抗性的多核苷酸。

为了本发明的目的，应当理解的是，本文所描述的多核苷酸可以通过本领域中可用的任何方法进行修饰。可以进行所述修饰例如来增加本发明的多核苷酸在合适的宿主细胞中可被表达的程度。

本发明的多核苷酸如DNA多核苷酸可以通过重组、合成或由本领域技术人员可用的任何手段来制备。它们也可以通过标准技术被克隆。本发明的多核苷酸通常以分离和/或纯化的形式被提供。

多核苷酸可以使用重组的手段来制备，例如使用PCR(聚合酶链反应)克隆技术。这将涉及制备针对希望扩增的多核苷酸区域的引物对(例如约15-30个核苷酸)，使引物与从合适的细胞得到的mRNA或cDNA接触，在如下条件下进行聚合酶链反应，所述条件实现了所期望区域的扩增，分离和回收扩增的DNA。引物可被设计成含有合适的限制性酶识别位点，以便扩增的DNA可以被方便地克隆到合适的克隆载体中。

所述技术可以用来获得本文所描述的SEQ ID NO：1或3的多核苷酸的全部或部分，或其变体。

与SEQ ID NO：1或3的序列不具有100％的序列同一性但仍然落入本发明的范围内的多核苷酸可以通过多种方式获得。例如，多核苷酸可以通过合适的诱变技术如SEQ ID NO：1或3的定点诱变获得。这可用于例如，当序列需要沉默密码子改变以针对表达多核苷酸序列的特定宿主细胞进行密码子偏好性优化时。为了引入限制性酶识别位点，或为了改变由多核苷酸编码的多肽的特性或功能，其他序列的改变也可以是期望的。

为了增加引入的酶在本发明的细胞中以活性形式表达的可能性，可以改变相应的编码核苷酸序列来针对所选择宿主细胞的密码子使用优化其密码子使用，例如SEQ ID NO：3。几种用于密码子优化的方法是本领域已知的。一种优选的针对所选择宿主细胞的密码子使用优化核苷酸序列的密码子使用的方法是，WO2006/077258和/或WO2008/000632所披露的密码子对优化技术。WO2008/000632涉及密码子对优化。密码子对优化是这样一种方法，其中编码多肽的核苷酸序列在其密码子使用方面被改造，特别是所使用的密码子对，以获得编码多肽的核苷酸序列的改进的表达和/或所编码多肽的改进的生产。密码子对被定义为编码序列中一组两个连续的三联体(密码子)。

作为基因表达和翻译效率的一个简单计量，本文中使用了如XuhuaXia，Evolutionary Bioinformatics 2007，3：53-58所描述的密码子适应指数(CAI)。该指数使用了来自物种的高表达基因的参照组，来评估每个密码子的相对优劣，并且由基因中所有密码子的使用频率为该基因计算分数。该指数评估了选择在塑造密码子使用模式中有效的程度。在这方面，其可用于预测基因的表达水平、评估病毒基因对其宿主的适应性以及比较不同生物体中的密码子使用。该指数还可以对异源基因表达成功的可能性给出大致的指示。在本发明的密码子对优化的基因中，CAI为0.6或更高、0.7或更高、0.8或更高、0.85或更高、0.87或更高、0.90或更高、0.95或更高或约1.0。

本发明进一步提供了包含本发明的多核苷酸及其互补链的双链多核苷酸。

本发明的多核苷酸、探针或引物可以携带显示标记。合适的标记包括放射性同位素如³²P或³⁵S、酶标记或其他蛋白质标记如生物素。所述标记可以被添加至本发明的多核苷酸、探针或引物，并且可以使用本身已知的技术检测。

多肽

本发明提供了具有淀粉降解活性的(分离的)多肽。本发明还涉及制备本发明多肽的方法。

术语“肽”和“寡肽”被认为是同义的(如通常认为的那样)并且每个术语可以按照上下文需要互换使用来指代通过肽键联接的至少两个氨基酸的链。词语“多肽”(或蛋白质)在本文中用于含有多于七个氨基酸残基的链。本文所有的寡肽和多肽的式或序列为从左至右并且以从氨基末端向羧基末端的方向书写。本文所使用的氨基酸的三字母代码是本领域常规已知的，并且可以在Sambrook，等(Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001)中找到。

本发明涉及α-淀粉酶多肽，其包含：

(a)SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列；或

(d)与SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少70％的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一个的氨基酸序列，所述位置参照SEQ ID NO：2来定义；或

(e)与SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少70％的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一个的氨基酸序列，所述位置参照SEQ ID NO：2来定义，并且所述氨基酸序列的特征在于，当被用于制备具有基于面粉的至少5 wt％的糖的烘焙产品时，所述烘焙产品相比不使用所述氨基酸序列制备的烘焙产品具有减小的贮存后硬度。

在一个实施方案中，本发明涉及分离的多肽，其包含：

(a)SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列；或

(b)由SEQ ID NO：1或3第100-2157位核苷酸所示的多核苷酸编码的氨基酸序列；或

(c)根据(b)的氨基酸序列，其中所述多核苷酸是由Alicyclobacillus pohliae NCIMB 14276产生的；或

(d)由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的多核苷酸序列编码的氨基酸序列。

本发明的多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与具有α-淀粉酶活性的具有SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列的多肽有至少99.5％的同一性、优选地至少99.6％的同一性、优选地至少99.7％的同一性、优选地至少99.8％的同一性、优选地至少99.9％的同一性。一般地，SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的天然氨基酸序列是优选的。

在一个方面，本发明的多肽包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少70％的同一性、在一方面至少80％的同一性、在一方面至少85％的同一性、在一方面至少90％的同一性、在一方面至少95％的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一个，所述位置参照SEQ ID NO：2来定义。

如本领域技术人员已知的，有可能SEQ ID NO：2或根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列的成熟多肽(第34-719位氨基酸所示)的N-和/或C-末端由于成熟期间的加工中的变化而可能是异质的。特别地，所述加工变化可在多肽过表达时发生。此外，外切蛋白酶活性可引起异质性。异质性发生的程度也取决于所使用的宿主和发酵方案。这样的C-末端加工的人为缺陷(artefacts)可导致SEQ ID NO：2或根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列的成熟多肽所示的更短的多肽或更长的多肽。由于这样的加工变化，N-末端也可能是异质的。N-末端的加工变体可以是由于信号肽酶对信号序列的可替换性切割。

在另一个方面，本发明提供了编码SEQ ID NO：2的多肽或者SEQ IDNO：2的氨基酸序列的成熟多肽的分离的多核苷酸，其包含额外的残基并从第-1或-2或-3等位点起始。或者，其可能缺乏某些残基，因而在第2或3或4等位点起始。额外的残基还可以存在于C-末端例如在第720位、第721位等。或者，C-末端可能缺乏某些残基，因而在第718位或第717位等终止。

本发明的多肽优选地与SEQ ID NO：2所示的序列具有99.5％的序列同一性。

SEQ ID NO：2的多肽的序列因此可以被修饰来提供本发明的多肽。可以进行氨基酸替换例如1个、2个、3个或4个替换。经修饰的多肽保留α淀粉酶的活性。

在一个方面，本发明的多肽与具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或具有SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列的多肽有至少70％的同一性、在一方面至少80％的同一性、在一方面至少85％的同一性、在一方面至少90％的同一性、在一方面至少95％的同一性、在一方面至少99.5％的同一性。

优选地，所述多肽具有这样的氨基酸序列，该氨基酸序列当与SEQID NO：2所示的氨基酸序列比对时，包含第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一个，所述位置参照SEQ ID NO：2来定义。优选地，所述α-淀粉酶至少包含第297位的Ala，所述位置参照SEQ ID NO：2来定义。

在一个方面，本发明的多肽可以包含第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少两个，所述位置参照SEQ ID NO：2来定义。优选地，所述多肽至少包含：第184位的Asp与第297位的Ala；至少第297位的Ala与第368位的Thr；或者至少第297位的Ala与第489位的Asn，所有的所述位置参照SEQ ID NO：2来定义。

在一个方面，本发明的多肽可以包含第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少三个，所述位置参照SEQ ID NO：2来定义。优选地，所述多肽至少包含：第297位的Ala、第368位的Thr与第489位的Asn；第184位的Asp、第297位的Ala与第368位的Thr；或第184位的Asp、第297位的Ala与第489位的Asn，所有的所述位置参照SEQ ID NO：2来定义。

在一个方面，本发明的多肽可以包含第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn，所有的所述位置参照SEQ ID NO：2来定义。

在一个方面，本发明的多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少80％的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一个，所述位置参照SEQ ID NO：2来定义。

在一个方面，本发明的多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少85％的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一个，所述位置参照SEQ ID NO：2来定义。

在一个方面，本发明的多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少90％的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一个，所述位置参照SEQ ID NO：2来定义。

在一个方面，本发明的多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少95％的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一个，所述位置参照SEQ ID NO：2来定义。

在一个方面，本发明的多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少80％的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn，所述位置参照SEQ ID NO：2来定义。

在一个方面，本发明的多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少85％的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn，所述位置参照SEQ ID NO：2来定义。

在一个方面，本发明的多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少90％的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn，所述位置参照SEQ ID NO：2来定义。

在一个方面，本发明的多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少95％的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn，所述位置参照SEQ ID NO：2来定义。

在一个方面，本发明的多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少99.5％的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn，所述位置参照SEQ ID NO：2来定义。

在一个方面，本发明的多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列有至少70％的同一性并且具有第184位的Asp、第297位的Ala、第368位的Thr和第489位的Asn中的至少一个，所述位置参照SEQ ID NO：2来定义，并且所述氨基酸序列的特征在于，当被用于制备具有基于面粉的至少5wt％的糖的烘焙产品时，所述烘焙产品相比不使用所述氨基酸序列制备的烘焙产品具有减少的贮存后硬度。

本发明多肽的一个或更多个氨基酸可以被取代来改进在宿主细胞中的表达。此外，本发明蛋白质的一个或更多个氨基酸可以被取代来改变酶的比活性或热稳定性。

保守的氨基酸替换是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，一组具有脂肪族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；一组具有含酰胺侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳香族侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。

优选的保守氨基酸替换基团包括：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。本文公开的氨基酸序列的替换变体是其中所公开的序列中的至少一个残基被去除并且该位置插入了不同的残基的那些。优选地，氨基酸改变是保守的。每个天然氨基酸的优选的保守替换包括：Ala至ser；Arg至lys；Asn至gln或his；Asp至glu；Cys至ser或ala；GIn至asn；GIu至asp；GIy至pro；His至asn或gln；He至leu或val；Leu至ile或val；Lys至arg；gln或glu；Met至leu或ile；Phe至met、leu或tyr；Ser至thr；Thr至ser；Trp至tyr；Tyr至trp或phe；以及Val至ile或leu。

本发明的多肽可以是基本上分离的形式。可以理解，所述多肽可以与不会干扰该多肽的预期目的的载体或稀释剂混合，但仍然被认为是基本上分离的。本发明的多肽还可以是基本上纯化的形式，在这种情况下，其通常包括制剂中的多肽，其中按重量计所述制剂中超过50％，例如超过80％、超过90％、超过95％或超过99％的多肽是本发明的多肽。

例如，如同已通过任何合适的技术例如Smith与Johnson，Gene 67：31-40(1988)披露的单步纯化法基本上纯化的天然的或重组的多肽，在宿主细胞中重组制备的多肽和蛋白质对于本发明目的被认为是分离的。

本发明的多肽可以是化学修饰的例如翻译后修饰的。例如它们可以被糖基化或包含被修饰的氨基酸残基。它们也可以通过添加组氨酸残基或T7标签被修饰来协助其纯化或通过添加信号序列来促进其从细胞分泌。这种被修饰的多肽和蛋白质落入本发明的术语“多肽”的范围之内。

为了将翻译的蛋白质分泌进入内质网腔、进入周质空间或进入细胞外环境，可以融合合适的分泌信号序列至本发明的多核苷酸。该信号对于多肽可以是内源的或者它们可以是异源信号。

本发明的多肽可以以被修饰的形式例如融合蛋白被生产，并且不仅可以包括分泌信号，还可以包括另外的异源功能区域。因此，举例来说，额外氨基酸的区域特别是带电的氨基酸可以被添加到多肽的N-末端来提高在宿主细胞中、在纯化期间或在随后的处理和贮存期间的稳定性和持久性。而且，肽部分可以被添加至多肽来促进纯化。

本发明的多肽包括天然纯化的产物、化学合成程序的产物以及通过重组技术由原核或真核宿主包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞生产的产物。根据重组生产程序中所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的或可以是非糖基化的。此外，本发明的多肽还可以包括初始修饰(initial modified)的甲硫氨酸残基，在某些情况下作为宿主介导过程的结果。

序列同一性

术语“同源性”、“百分比同一性”、“百分比同源性”和“同一性的百分比”在本文可互换使用。为了本发明的目的，本文中定义其为为了确定两个氨基酸序列或两个多核苷酸序列(本文也被称为核酸序列)的百分比同一性，序列被以最佳比较为目的而比对。为了最优化两条序列之间的比对，可以在所比较的两个序列中的任意个中引入缺口。所述比对可以在被比较的序列的全长上进行。或者，比对可以在更短的长度上进行，例如超过约20个、约50个、约100个或更多个核酸/碱基或氨基酸上进行。百分比同源性或百分比同一性是在报道的对比区域上两个序列之间相同匹配的百分比。

序列的比较以及两个序列之间的百分比同一性的确定可以使用数学算法来完成。本领域技术人员知道若干不同的计算机程序能够用于比对两个序列并确定两个序列之间的同源性这一事实(Kruskal，J.B.(1983)Anoverview of sequence comparison In D.Sankoff and J.B.Kruskal，(ed.)，Timewarps，string edits and macromolecules：the theory and practice of sequencecomparison，pp.1-44 Addison Wesley)。两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的百分比同一性可以使用用于比对两个序列的Needleman和Wunsch算法来确定。(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453)。氨基酸序列和多核苷酸序列两者都可以用算法比对。Needleman-Wunsch算法已经在计算机程序NEEDLE中实施。为了本发明的目的，使用来自EMBOSS软件包的NEEDLE程序(2.8.0或更高版本，EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite(2000)Rice，P.Longden，I.and Bleasby，A.Trends in Genetics 16，(6)pp276-277，http：//emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白质序列用EBLOSUM62作为替换矩阵。对于核苷酸序列，使用EDNAFULL。使用的可选参数是缺口开放罚分为10和缺口延伸罚分为0.5。本领域技术人员认识到所有这些不同的参数会产生稍微不同的结果，但是，使用不同算法时两条序列的整体百分比同一性不会显著改变。

通过如上所述的NEEDLE程序比对之后，查询序列和本发明的序列之间的同一性的百分比计算如下：在比对中两个序列显示为相同氨基酸或相同核苷酸的相应位点的数量除以扣除比对中缺口总数之后的比对总长度。本文中所定义的百分比同一性可以通过使用NOBRIEF选项由NEEDLE获得并且在程序的输出中被标记为“最长同一性”。

本发明的多核苷酸和蛋白质序列还可被用作“查询序列”来进行对公众数据库的搜索，例如，来鉴定其他家族成员或相关序列。可以使用Altschul，et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)来进行此类搜索。可以用NBLAST程序，以分数＝100，字长＝12来进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的多核苷酸同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序，以分数＝50，字长＝3来进行BLAST蛋白搜索，以获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。为获得用于比较目的的缺口比对，可以利用Altschul et al.，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中描述的Gapped BLAST。当利用BLAST和GappedBLAST程序时，可以使用各个程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。见国家生物技术信息中心的主页http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。

载体

本发明的多核苷酸可以被整合到载体，包括克隆和表达载体。载体可以是重组的可复制载体。载体可以被用来在相容的宿主细胞中复制本发明的多核苷酸。载体可方便地进行重组DNA程序。

本发明还涉及在合适的宿主细胞中培养、转化或转染所述载体的方法，例如在本发明的多肽的表达发生的条件下。本发明提供了通过将本发明的多核苷酸引入载体(在一个实施方案中为表达载体)、将载体引入相容的宿主细胞以及在使得所述载体复制的条件下培养所述宿主细胞来制备本发明的多肽的方法。所述载体可以从宿主细胞中回收。

本发明的载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外的实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒。或者，载体可以是当引入宿主细胞时整合到宿主细胞基因组并与其被整合进入的染色体一同复制的载体。

一种类型的载体是“质粒”，它指的是可以插入额外的DNA区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以被插入到病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌的复制起点的细菌载体以及附加体型哺乳动物载体)。其他载体(例如，没有合适的复制起点的细菌整合载体或非附加体型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后被整合到宿主细胞的基因组中，并因此与宿主基因组一同被复制。

此外，某些载体能够指导与其可操作性连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为“表达载体”。在本文中术语“表达载体”、“表达构建体”和“重组表达载体”可以互换使用，一般而言，在重组DNA技术中用到的表达载体通常是质粒的形式。在本文中术语“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用到的载体形式。然而，本发明也将包括其他形式的表达载体，例如提供等同的功能的粘粒、病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)和噬菌体载体。

本发明的载体可以在体外使用，例如用于生产RNA或用于转染或转化宿主细胞例如细菌细胞，以及用来生产由本发明的多核苷酸所编码的α-淀粉酶。

本发明的重组表达载体包含以适合多核苷酸在宿主细胞中表达的形式存在的本发明的多核苷酸，这意味着所述重组表达载体包含一个或更多个调控序列，调控序列是基于被用于表达的宿主细胞来选择的，其被可操作地连接到待表达的多核苷酸序列上。

在重组表达载体中，“可操作地连接”用于表示：目的核苷酸序列被以允许核苷酸序列的表达的方式连接到调控序列上(例如，在体外转录/翻译系统中或在载体被引入宿主细胞时的宿主细胞中)，即术语“可操作地连接”是指并列(juxtaposition)，其中所述组分的关系允许它们以其预期方式发挥功能。“可操作地连接”到编码序列的调控序列如启动子、增强子或其他表达调控信号被定位的方式使得编码序列在与控制序列相容的条件下得到表达，或者序列被布置以便它们以其预期目的一起发挥功能，例如转录在启动子处起始并且在编码多肽的DNA序列上进行。

术语“调控序列”旨在包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。例如，在Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中对此类调控序列进行了描述。

术语调控序列包括在很多种类型的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型表达的序列以及仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列的表达的序列(例如，组织特异性调控序列)。

给定宿主细胞的载体或表达构建体可以因此包含以下元件，所述元件以从5′-末端至3′-末端(相对于编码第一发明多肽的序列的编码链)的连续顺序可操作地彼此连接：(1)能够指导编码多肽的核苷酸序列在给定宿主细胞中转录的启动子序列；(2)促进转录的RNA的翻译的核糖体结合位点(3)任选地，能够指导多肽从给定宿主细胞分泌到培养基的信号序列；(4)本发明的多核苷酸序列；优选地还有(5)能够终止编码多肽的核苷酸序列下游的转录的转录终止区域(终止子)。

在本发明的核苷酸序列的下游，可以有含有一个或更多个转录终止位点(例如终止子，本文也被称为终止密码子)的3′非翻译区域。终止子的来源是不太重要的。终止子可以例如对编码多肽的DNA序列是天然的。然而优选地，细菌宿主细胞用细菌终止子以及丝状真菌宿主细胞用丝状真菌终止子。更优选地，终止子对于宿主细胞(其中编码多肽的核苷酸序列将被表达)是内源的。在被转录的区域中，可存在用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录本的编码部分将包括起始密码子，其通常是AUG(或ATG)，但也有替代的起始密码子，例如GUG(或GTG)和UUG(或TTG)，它们被用于原核生物。而且停止或翻译终止密码子被适当地定位在将被翻译的多肽的末端。

本发明多核苷酸的增强表达也可以通过同源和异源调控区域例如启动子、分泌前导物和/或终止子区域的选择来实现，其可用于增加表达以及如果期望的话，增加目的蛋白从表达宿主中的分泌水平，和/或提供本发明的多肽表达的诱导型控制。

本领域的技术人员将意识到，对表达载体的设计可依赖于以下因素：对将被转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白的表达水平。本发明的表达载体可以被引入宿主细胞，以由此生产本文所述的多核苷酸编码的蛋白质或肽(例如本发明的具有α-淀粉酶活性的多肽或如本文所述的其变体)。

本发明的重组表达载体(本文中也被称为“本发明的载体”)可被设计用于本发明的多肽在原核或真核细胞中的表达。例如，本发明的多肽可以在细菌细胞如E.coli和Bacilli、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、真菌细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞中生产。本文以及进一步地Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)对合适的宿主细胞进行了讨论。或者，重组表达载体可在体外进行转录及翻译，例如，使用T7启动子调控序列和T7聚合酶。

对于大部分细菌、丝状真菌和酵母，载体或表达构建体优选地被整合到宿主细胞的基因组中来获得稳定的转化体。在表达构建体被整合到宿主细胞基因组中的情况下，该构建体或被整合在基因组的随机位点或使用同源重组被整合在预定的目标位点，在这种情况下目标位点优选地包含高度表达的基因。

因此，可用于本发明的表达载体包括源自染色体、附加体和病毒的载体，例如作为质粒，噬菌体，酵母游离体，酵母附加体的载体，病毒例如杆状病毒、乳多泡病毒(papova virus)、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和逆转录病毒，以及上述物质的组合的载体，例如质粒和噬菌体遗传元件组成的载体，例如粘粒和噬菌粒(phagemid)。

本发明的多核苷酸应当被可操作地连接至合适的启动子。除了对编码本发明多肽的基因天然的启动子，其他的启动子亦可以用于指导本发明的多肽的表达。可以根据指导本发明的多肽在期望的表达宿主中表达的效率来选择启动子。合适的启动子可以是“诱导型启动子”，其为导致基因的mRNA合成在特定条件下暂时启动的启动子。或者，启动子可以是“组成型”启动子，即允许基因在几乎所有的环境条件下表达的启动子，即指导恒定的、非特异性基因表达的启动子。可以使用“强组成型启动子”，即相比天然宿主细胞导致mRNA以高频率启动的启动子。

在本发明中，细菌可以优选地被用作用于本发明多肽的表达的宿主细胞，特别是Bacilli。可用于所述宿主细胞的合适的诱导型启动子包括：(i)可以由辅助因子如阻遏子或激活子来主要调节的启动子。阻遏子是抑制启动子活性的序列特异性DNA结合蛋白。在防止阻遏子与启动子的操纵子结合的诱导物的存在下，转录可以从该启动子启动。来自革兰氏阳性微生物的此类启动子的例子包括但不限于，gnt(葡糖酸盐/酯操纵子的启动子)；来自Bacillus licheniformis的penP；glnA(谷氨酰胺合成酶)；xylAB(木糖操纵子)；araABD(L-阿拉伯糖操纵子)和P_spac启动子，可以由诱导物例如异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)控制的SPO1/lac杂合启动子(Yansura D.G.，Henner D.J.Proc Natl Acad Sci U S A.1984 81(2)：439-443)。激活子也是诱导启动子活性的序列特异性DNA结合蛋白。来自革兰氏阳性微生物的此类启动子的例子包括但不限于，双组分体系(PhoP-PhoR、DegU-DegS、Spo0A-Phosphorelay)、LevR、Mry和GltC。(ii)次级sigma因子的产生可以主要负责来自特定启动子的转录。来自革兰氏阳性微生物的例子包括但不限于，由芽孢形成特异性sigma因子σ^F、σ^E、σ^G和σ^K以及一般性应激sigma因子σ^B激活的启动子。σ^B介导的应答由能量限制和环境应激来诱导(Hecker M，U.Mol Microbiol.1998；29(5)：1129-1136)。(iii)衰减作用和抗终止作用也调控转录。来自革兰氏阳性微生物的例子包括但不限于，trp操纵子和sacB基因。(iv)表达载体中其他受调控的启动子基于带来蔗糖诱导性的sacR调控体系(Klier AF，Rapoport G.Annu Rev Microbiol.1988；42：65-95)。

强组成型启动子是公知的，并且可以根据宿主细胞中要控制的特定序列来选择合适的强组成型启动子。可用于细菌例如Bacilli的合适的诱导型启动子包括：来自革兰氏阳性微生物的启动子例如但不限于，SP01-26、SP01-15、veg、pyc(丙酮酸羧化酶启动子)和amyE。来自革兰氏阴性微生物的启动子的例子包括但不限于，tac、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、laclq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-P_R和λ-P_L。

可用于细菌细胞如Bacilli的启动子的另外的例子包括α-淀粉酶和SPo2启动子以及来自细胞外蛋白酶基因的启动子。

在一个实施方案中，启动子序列可以从细菌来源获得。在另一个实施方案中，启动子序列可以获得自革兰氏阳性细菌如Bacillus菌株，例如Bacillus alkalophilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus brevis、Bacilluscirculans、Bacillus clausii、Bacillus coagulans、Bacillus firmus、Bacilluslautus、Bacillus lentus、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus pumilus、Bacillus stearothermophilus、Bacillus subtilis或Bacillusthuringiensis；或Streptomyces菌株，如Streptomyces lividans或Streptomyces murinus；或来自革兰氏阴性细菌，如E.coli或假单胞菌属(Pseudomonas sp.)。

用于在本发明的方法中指导多核苷酸序列的转录的合适启动子的一个实例是从E.coli lac操纵子中得到的启动子。另一个例子是Streptomycescoelicolor琼脂糖酶基因(dagA)的启动子。另一个例子是Bacillus lentus碱性蛋白酶基因(aprH)的启动子。另一个例子是Bacillus licheniformis碱性蛋白酶基因(枯草杆菌蛋白酶Carlsberg基因)的启动子。另一个例子是Bacillus subtilis果聚糖蔗糖酶基因(sacB)的启动子。另一个例子是Bacillus subtilisα-淀粉酶基因(amyF)的启动子。另一个例子是Bacilluslicheniformisα-淀粉酶基因(amyL)的启动子。另一个例子是Bacillusstearothermophilus麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子。另一个例子是Bacillus amyloliquefaciensα-淀粉酶基因(amyQ)的启动子。另一个例子是“-35”区域具有序列TTGACA和“-10”区域具有序列TATAAT的“共有序列(consensus)”启动子。另一个例子是Bacillus licheniformis青霉素酶基因(penP)的启动子。另一个例子是Bacillus subtilisxylA和xylB基因的启动子。

可以使用能够指导本发明的重组宿主细胞中的转录的多种启动子。优选地，启动子序列来自高度表达的基因。从中可以选择启动子和/或被包含在用于整合表达构建体的优选预定目标位点中的优选的高度表达的基因的例子包括但不限于，编码糖酵解酶如丙糖-磷酸异构酶(TPI)、甘油醛-磷酸脱氢酶(GAPDH)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、丙酮酸激酶(PYK或PKI)、醇脱氢酶(ADH)的基因以及编码淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-半乳糖苷酶、醇(甲醇)氧化酶、延伸因子和核糖体蛋白的基因。合适的高度表达的基因的具体例子包括例如来自Kluyveromyces sp.的LAC4基因、分别来自Hansenula与Pichia的甲醇氧化酶基因(AOX和MOX)、来自A.niger和A.awamori的葡糖淀粉酶(glaA)基因、A.oryzaeTAKA-淀粉酶基因、A.nidulansgpdA基因以及T.reesei纤维二糖水解酶基因。

可以用于真菌表达宿主细胞的强组成型启动子和/或诱导型启动子的例子包括可获得自木聚糖酶(xlnA)、肌醇六磷酸酶、ATP合成酶、亚基9(oliC)、丙糖磷酸异构酶(tpi)、醇脱氢酶(AdhA)、α-淀粉酶(amy)、淀粉葡萄糖苷酶(AG-来自glaA基因)、乙酰胺酶(amdS)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)启动子的真菌基因的那些启动子。

所有上述启动子是本领域现有可用的。

载体可以含有反义方向的本发明的多核苷酸来提供反义RNA的产生。

载体DNA可以通过自然感受态、常规转化或转染技术被引入原核或真核细胞。如本文所用，术语“转化”和“转染”意在指多种用于将外源多核苷酸(例如DNA)引入宿主细胞的本领域公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀，DEAE-葡聚糖介导的转染、转导、感染，脂质转染(lipofection)，阳离子脂质介导的转染或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可以在Sambrook等(同上)和其他实验室手册中找到。

为了鉴定和选择载有载体的细胞，通常将编码可选择标记(如抗生素抗性)的基因连同本发明的多核苷酸一起引入宿主细胞。优选的可选择标记包括但不限于赋予药物抗性或在宿主细胞中回补缺陷的那些标记。

这样的标记包括ATP合成酶，亚基9(oliC)，乳清苷-5′-磷酸脱羧酶(pvrA)，细菌G418抗性基因(这也可在酵母中使用，但是不在真菌中使用)，氨苄青霉素抗性基因(E.coli)，新霉素、卡那霉素、四环素、壮观霉素、红霉素、氯霉素、腐草霉素(Bacillus)的抗性基因以及E.coliuidA基因，其编码β-葡糖醛酸酶(GUS)。载体可以在体外使用，例如用于生产RNA或用于转染或转化宿主细胞。

它们还包括例如可用于转化大多数丝状真菌和酵母的通用标记基因，例如乙酰胺酶基因或cDNA(来自A.nidulans、A.oryzae或A.niger的amdS、niaD、facA基因或cDNA)或提供针对抗生素如G418、潮霉素、博来霉素、卡那霉素、甲氨蝶呤的抗性、腐草霉素orbenomyl的抗性(benA)的基因。或者，可以使用特定的选择标记例如需要相应突变宿主菌株的营养缺陷型标记，例如：D-丙氨酸消旋酶(来自Bacillus)、URA3(来自S.cerevisiae或来自其他酵母的类似基因)、pyrG或pyrA(来自A.nidulans或A.niger)、argB(来自A.nidulans或A.niger)或trpC。在一个实施方案中，选择标记在引入表达构建体后从被转化的宿主细胞中剔除以便获得能够生产没有选择标记基因的多肽的被转化的宿主细胞。

蛋白质在原核生物中的表达通常在含有指导融合蛋白或非融合蛋白的表达的组成型或诱导型启动子的载体中进行。融合载体将一些氨基酸添加到其中编码的蛋白质上，例如添加到重组蛋白质的氨基末端。这些融合载体一般有三个目的：1)增加重组蛋白质的表达；2)增加重组蛋白质的溶解性；以及3)通过充当亲和纯化中的配体帮助重组蛋白质的纯化。通常，在融合表达载体中，蛋白水解切割位点在融合部分和重组蛋白的交界处引入，以使在纯化融合蛋白之后将重组蛋白从融合部分分离。

用于上述宿主细胞的适当的培养基和条件是本领域已知的。

优选地用于细菌的载体例如在WO-A1-2004/074468中被公开，其通过引用并入本文。其他合适的载体对于本领域技术人员是现成可见的。

如本文所述，本发明的载体可以被转化进入合适的宿主细胞来提供本发明多肽的表达。因此，在另一个方面，本发明提供了制备本发明多肽的方法，其包括培养用编码多肽的表达载体转化或转染的的宿主细胞，并回收所表达的多肽。

宿主细胞

本发明还提供了用用于本发明多核苷酸的复制和/或表达的载体转化或转染的“重组宿主细胞”，其在本文中也被称为“宿主细胞”。细胞将被选择为与所述载体相容。启动子和其他表达调控信号可以被选择为与设计表达的宿主细胞相容。

本发明的特征包括细胞，例如包含本发明的多核苷酸或包含本发明的载体的被转化的宿主细胞或重组宿主细胞。

“被转化的宿主细胞”或“重组的宿主细胞”是本发明的多核苷酸已经通过重组DNA技术被引入其中(或引入其祖先(ancestor))的细胞。原核细胞和真核细胞均包括在内，例如细菌、真菌、酵母、昆虫、哺乳动物等。

优选的是Bacillus菌株的细胞，例如Bacillus alkalophilus、Bacillusamyloliquefaciens、Bacillus brevis、Bacillus circulans、Bacillus clausii、Bacillus coagulans、Bacillus firmus、Bacillus lautus、Bacillus lentus、Bacillus licheniformis、Bacillus megaterium、Bacillus pumilus、Bacillusstearothermophilus、Bacillus subtilis或Bacillus thuringiensis；或Streptomyces菌株的细胞，如Streptomyces lividans或Streptomyces murinus；或来自革兰氏阴性细菌，如E.coli或Pseudomonas sp.。

根据另一个方面，宿主细胞是真核宿主细胞。优选地，真核细胞是哺乳动物、昆虫、植物、真菌或藻类的细胞。优选的哺乳动物的细胞包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、293细胞、细胞和杂交瘤。许多适合哺乳动物细胞的稳定转染的载体为公众可用，构建这类细胞系的方法也例如在Ausubel等人(同上)中为公知的。

在一个实施方案中，昆虫细胞包括例如Sf9和Sf2以及它们的衍生物。

在一个实施方案中，真核细胞是真菌细胞即酵母细胞，如Candida、Hansenula、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、Schizosaccharomyces或Yarrowia strain。优选地来自Kluyveromyces lactis、S.cerevisiae、Hansenula polymorpha、Yarrowia lipolytica和Pichia pastoris，或丝状真菌细胞。

丝状真菌包括Eumycota和Oomycota亚门(如Hawksworth等人，在Ainsworth and Bisby′s Dictionary of The Fungi，8th edition，1995，CABInternational，University Press，Cambridge，UK所定义)的所有丝状形式。丝状真菌的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、甲壳质、甘露聚糖和其他复合多糖构成的菌丝体壁。营养生长通过菌丝延伸并且碳代谢是绝对好氧的。丝状真菌菌株包括但不限于Acremonium、Agaricus、Aspergillus、Aureobasidium、Chrysosporium、Coprinus、Cryptococcus、Filibasidium、Fusarium、Humicola、Magnaporthe、Mucor、Myceliophthora、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Piromyces、Panerochaete、Pleurotus、Schizophyllum、Talaromyces、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium和Trichoderma的菌株。在一个实施方案中，丝状真菌细胞属于Aspergillus、Chrysosporium、Penicillium、Talaromyces、Fusarium或Trichoderma属的种，并且优选地是Aspergillus niger、Aspergillus awamori、Aspergillus foetidus、Aspergillus sojae、Aspergillusfumigatus、Talaromyces emersonii、Aspergillus oryzae、Chrysosporiumlucknowense、Myceliophthora thermophila、Fusarium oxysporum、Trichoderma reesei或Penicillium chrysogenum的种。在一个实施方案中，宿主细胞是Aspergillus niger。

如果本发明的宿主细胞是Aspergillus niger宿主细胞，所述宿主细胞优选地是CBS 513.88、CBS124.903或其衍生物。

宿主细胞可以被选择为调节被插入的序列的表达，或以特定的、期望的方式修饰和加工基因产物。蛋白质产物的所述修饰(如糖基化)和加工(如切割)可促进蛋白质发挥最佳功能。

多种宿主细胞具有用于翻译后加工和修饰蛋白质和基因产物的特色的和特定的机制。可以选择分子生物学和/或微生物学领域技术人员熟悉的合适的细胞系或宿主系统来确保所产生的外源蛋白质的期望的和正确的修饰和加工。为此目的，可以使用具有正确加工初级转录本、糖基化和磷酸化基因产物的细胞机制的真核宿主细胞。这样的宿主细胞是本领域公知的。

如果期望，如上文所述的宿主细胞可以在本发明多肽的制备中使用。这种方法典型地包括在条件下培养重组宿主细胞(例如，如上所述用表达载体转化或转染的)来提供编码多肽的编码序列的表达(通过载体)并且任选地从细胞或培养基中回收，更优选地回收并纯化生产的多肽。本发明的多核苷酸可以被整合入重组的可复制载体例如表达载体中。载体可用来在相容的宿主细胞中复制多核苷酸。因此，在另一实施方案中，本发明提供了制备本发明的多核苷酸的方法，其通过将本发明的多核苷酸引入可复制的载体、将载体引入相容的宿主细胞并且在使得载体复制的条件下培养所述宿主细胞。载体可以从宿主细胞中回收。

优选地，本发明的多肽是作为分泌蛋白生产的，在此情况下在表达构建体中编码成熟形式的多肽的核苷酸序列可操作地连接至编码信号序列的核苷酸序列。优选地信号序列对于编码多肽的核苷酸序列是天然的(同源的)，本文也被称为“野生型”。或者，信号序列对于编码多肽的核苷酸序列是外源的(异源的)，在这种情况下信号序列优选地对于本发明核苷酸序列在其中被表达的宿主细胞是内源的。用于Bacilli的合适的信号序列的例子是来自Bacillus subtilis的amyE、yurI fliL、vpr、glpQ、phy、lytC、ywsB、ybbD、ybxI、yolA、ylqB、ybbC、pel、yckD、ywaD、ywmD、yweA、yraJ、dacF、yfjS、yybN、yrpD、yvcE、wprA、yxaL、ykwD、yncM2、sacB、phrC、SacC、yoqM、ykoJ、lip、yfkN、yurI、ybfO、yfkD、yoaJ、xynA、penP、ydjM、yddT、yojL、yomL、yqxI、yrvJ、yvpA、yjcM、yjfA、ypjP、ggt、yoqH、ywtD、ylaE、yraJ、lytB、lytD、nprB、nucB、rplR、yfhK、yjdB、ykvV、ybbE、yuiC、ylbL、yacD、yvpB基因。合适的酵母信号序列是来自酵母α-因子基因的信号序列。类似地，用于丝状真菌宿主细胞的合适的信号序列例如是来自丝状真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因例如A.niger glaA基因的信号序列。这可与淀粉葡糖苷酶(也称为(葡糖)淀粉酶)启动子自身组合使用，以及与其他的启动子组合使用。杂合信号序列也可以用于本发明的上下文。

优选的异源分泌前导序列是源自真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA-例如来自Aspergillus的18个和24个氨基酸的两个版本)、α-因子基因(酵母例如Saccharomyces和Kluyveromyces)或α-淀粉酶(amyE、amyQ和amyL)和碱性蛋白酶aprE和天然蛋白酶基因(Bacillus)的那些。载体可以被转化或转染到如上所述的合适的宿主细胞中来提供本发明多肽的表达。该过程可以包括在条件下培养用如上所述的表达载体转化的宿主细胞来提供编码多肽的编码序列的载体的表达。

本发明因此提供了用本发明的多核苷酸或载体转化或转染的或包含本发明的多核苷酸或载体的宿主细胞。优选地，用于多核苷酸的复制和表达的载体中携带有多核苷酸。细胞将被选择为与所述载体相容，并且可以例如是原核生物(例如细菌)、真菌、酵母或植物的细胞。

也可以选择异源宿主细胞，其中本发明的多肽以基本上没有可干扰应用的酶活性的形式被生产，例如没有淀粉降解、纤维素降解或半纤维素降解酶。这可以通过选择在正常情况下不生产这些酶的宿主细胞来实现。

本发明包括通过编码多肽的DNA序列的重组表达生产本发明的多肽的方法。为此目的，本发明的DNA序列可用于基因扩增和/或表达信号如启动子、分泌信号序列的交换，以使得在合适的同源或异源宿主细胞中经济地生产多肽。同源宿主细胞是与获得DNA序列的物种属于相同种或是相同种内的变种的宿主细胞。

宿主细胞可过表达多肽，并且改造成过表达的技术是公知的。因此宿主可以具有编码多核苷酸的两个或更多个拷贝(因此载体也可相应地具有两个或更多个拷贝)。

因此，在本发明的一个实施方案中，本发明的重组宿主细胞能够表达或过表达本发明的多核苷酸或载体。

本发明的另一个方面是生产本发明多肽的方法，其包括(a)在条件下培养本发明的重组宿主细胞以便生产本发明的多肽；以及(b)任选地从细胞培养基中回收本发明的多肽。

根据本发明，本发明多肽的生产可以通过在常规的营养发酵培养基中培养本发明的宿主细胞来完成，所述宿主细胞已经用本发明的一个或更多个多核苷酸转化。本发明的方法包括在条件下培养本发明的宿主细胞以便生产本发明的多肽的步骤。

本发明的重组宿主细胞可以使用本领域已知的程序进行培养。对于启动子和宿主细胞的每个组合，有利于编码多肽的DNA序列的表达的培养条件是可获得的。在达到期望的细胞密度或多肽滴度后停止培养，用已知的程序回收多肽。

术语“培养”包括使本发明的活重组宿主细胞特别是本发明的重组宿主细胞维持和/或生长。在一个方面，本发明的重组宿主细胞在液体培养基中培养。在另一个方面，重组宿主细胞在固体培养基或半固体培养基中培养。

优选地，本发明的重组宿主细胞在含有对重组宿主细胞的维持和/或生长必需的或有利的营养物的液体培养基中培养。这样的营养物包括但不限于碳源或碳底物，如复合碳水化合物如豆类或谷物粉、淀粉、糖、糖醇、碳氢化合物、油、脂肪、脂肪酸、有机酸和醇；氮源，如从谷类、豆类和块茎中获得的植物蛋白、胨、肽和氨基酸，从动物来源如肉、乳和动物副产物如胨、肉提取物和酪蛋白水解物获得的蛋白质、肽和氨基酸；无机氮源，如尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和磷酸铵；磷源，如磷酸、其钠和钾盐；微量元素，例如镁、铁、锰、钙、铜、锌、硼、钼和/或钴盐；以及生长因子如氨基酸、维生素、生长促进剂，等等。

合适培养基的选择可以基于表达宿主的选择即重组宿主细胞的选择和/或基于表达构建体的调控需求。这样的培养基是本领域技术人员已知的。如果期望，培养基可以含有相比其他潜在的污染微生物更有利于被转化的表达宿主的额外的组分。

可以在液体培养基中连续或间歇地通过常规培养方法如静置培养、试管培养、振荡培养、通气搅拌培养或发酵来培养重组宿主细胞。优选地，在发酵器中培养重组宿主细胞。本发明的发酵方法包括发酵的分批法、补料分批法和连续法。多种这样的工艺已被开发出来，并且在本领域是众所周知的。

优选地在受控的pH下培养重组宿主细胞。在一个实施方案中，可以在4.5和8.5之间、优选地6.0和8.5之间、更优选地约7的pH下培养重组宿主细胞。期望的pH值可以通过本领域技术人员已知的任何方法来维持。

优选地，还在受控的通风和受控的温度下培养重组宿主细胞。在一个实施方案中，受控的温度包括15℃和70℃之间、优选地20℃和55℃之间、更优选地30℃和50℃之间的温度。

通常基于表达宿主和要生产的蛋白质的选择来选择适当的条件。

发酵后，如果必要，可以通过离心分离或过滤将细胞从发酵液中除去。发酵停止或除去细胞之后，然后可以回收本发明的多肽并且如果期望，通过常规手段进行纯化和分离，所述常规方法包括但不限于用常规树脂处理、用常规吸附剂处理、改变pH、溶剂萃取、透析、过滤、浓缩、结晶、重结晶、pH调节、冻干等。

例如，本发明的α-淀粉酶可通过本领域已知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化(Protein Purification Protocols，Methods in MolecularBiology series，Paul Cutler，Humana Press，2004)。

通常，当所得到的制剂基本上不含其他成分时，化合物是“分离的”。在一个实施方案中，制剂的纯度大于所期望化合物的约80％(干重)(例如小于约20％的所有培养基、组分或发酵副产物)，在另一个实施方案中大于所期望化合物的约90％，在另一个实施方案中大于所期望化合物的约95％，在另一个实施方案中大于所期望化合物的约98％至99％。

然而或者，所期望化合物不从重组宿主细胞或培养物中纯化。整个培养物或培养物上清液可作为产品的来源。在一个具体的实施方案中，使用培养物或培养物上清液而无需改造。在另一个实施方案中，培养物或培养物上清液被浓缩、干燥和/或冻干。

本发明的重组宿主细胞能够在合适的条件下生产本发明的多肽化合物。优选地，本发明多肽的生产意味着每升培养基生产至少约50mg、约100mg、约200mg、约500mg、约1g、约3g、约5g或约10g的本发明的多肽。

酶的制备

在合适的发酵培养基中在有氧条件下培养Bacillus菌株DSM-AMB 154-1(见实施例)。

一种合适的培养基介质除无机盐以外可以含有可吸收的碳源和氮源，以及任选的生长促进营养物如酵母提取物。发酵通常是在35-40℃以及在6.5-7.5的pH下进行并且优选地由自动装置保持大致恒定。酶被排入培养基中。在发酵结束时，如果需要，生产宿主可以通过本领域技术人员已知的手段杀死。随后的发酵液可以通过例如过滤或离心从中清除细菌细胞、残渣和其他固体物。含有酶的滤液或上清液可以通过例如过滤或离心进一步澄清，然后，通过例如超滤或在减压下的蒸发设备来按照需要被浓缩以得到浓缩物，如果期望所述浓缩物可以通过例如冻干或喷雾干燥进行干燥。通常情况下，得到的粗的酶产品具有每g约10,000-500,000 MU的范围的活性。

本发明的多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：

(d)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸编码α-淀粉酶。

在本发明的多核苷酸的一个实施方案中，所述多核苷酸为分离的多核苷酸，其包含：

(a)SEQ ID NO：1或3所示的多核苷酸序列；或

(b)SEQ ID NO：1或3的多核苷酸序列的第100-2157位核苷酸所示的多核苷酸序列(为免生疑义，包括第100位和第2157位核苷酸)；或

(c)编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或具有SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列(为免生疑义，包括第34位和第719位氨基酸)。

在本发明的多核苷酸的一个实施方案中，所述多核苷酸是由Alicyclobacillus pohliae NCIMB 14276产生的。

在本发明的多核苷酸的另一个方面，分离的多核苷酸是由Alicyclobacillus pohliae NCIMB 14276产生的。

本发明的载体包含本发明的多核苷酸序列。

在本发明的载体的一个实施方案中，所述载体是表达载体，其中本发明的多核苷酸序列可操作地与至少一种调控序列连接，所述调控序列允许多核苷酸序列在合适的宿主细胞中表达。

合适的宿主细胞包括细菌，包括Escherichia、Anabaena、Caulobactert、Gluconobacter、Rhodobacter、Pseudomonas、Paracoccus、Bacillus、Brevibacterium、Corynebacterium、Rhizobium(Sinorhizobium)、Flavobacterium、Klebsiella、Enterobacter、Lactobacillus、Lactococcus、Methylobacterium、Staphylococcus或Streptomyces。在本发明载体的一个方面，宿主细胞是细菌细胞，其选自B.subtilis、B.puntis、B.megaterium、B.halodurans、B.pumilus、G.oxydans、Caulobactert crescentus CB 15、Methylobacterium extorquens、Rhodobacter sphaeroides、Pseudomonaszeaxanthinifaciens、Paracoccus denitrificans、C.glutamicum、Staphylococcus carnosus、Streptomyces lividans、Sinorhizobium melioti和Rhizobium radiobacter组成的组。

在本发明载体的另一实施方案中，合适的宿主细胞是Aspergillus、Bacillus、Chrysosporium、Escherichia、Kluyveromyces、Penicillium、Pseudomonas、Saccharomyces、Streptomyces或Talaromyces的种，优选地宿主细胞是Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Bacilluslicheniformis、Escherichia coli、Aspergillus Niger或Aspergillus oryzae种。

本发明的重组宿主细胞可以包含本发明的多核苷酸或本发明的载体。

在本发明的重组宿主细胞的一个实施方案中，重组宿主细胞能够表达或过表达本发明的多核苷酸或本发明的载体。

用于制造本发明多核苷酸或本发明载体的本发明方法包括以下步骤，培养用所述多核苷酸或所述载体转化的宿主细胞并从所述宿主细胞中分离所述多核苷酸或所述载体。

本发明的多肽包含：

α-淀粉酶多肽，其包含：

(a)SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列；或

在本发明的多肽的一个实施方案中，所述多肽是分离的多肽，其包含：

(a)SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列；或

(c)根据(b)的氨基酸序列，其中所述多核苷酸是由Alicyclobacillus pohliae NCIMB 14276产生的。

在本发明的多肽的一个实施方案中，通过在适当的宿主细胞中表达本发明的多核苷酸或或本发明的载体可获得所述多肽。

制造本发明多肽的本发明方法包括，在允许本发明多核苷酸或本发明载体表达的条件下培养本发明的重组宿主细胞，并且任选地从细胞或培养基中回收所编码的多肽。

在制造本发明多肽的本发明方法的一个实施方案中，所述方法包括在允许载体表达的条件下培养包含所述载体的宿主细胞，并且任选地从细胞或培养基中回收所编码的多肽，所述载体包含多核苷酸，所述多核苷酸包含：

(a)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的多核苷酸序列；或

在制造本发明多肽的本发明方法的一个实施方案中，所述方法包括在允许多核苷酸表达的条件下培养包含所述多核苷酸的宿主细胞，并且任选地从细胞或培养基中回收所编码的多肽，所述多核苷酸包含：

(a)SEQ ID NO：1或3所示的多核苷酸序列；或

本发明的多肽可以用于食品制造。

在用于食品制造的一个实施方案中，用途是制造烘焙产品，其包括但不限于面包或蛋糕。

本发明的酶组合物包含本发明的多肽以及一个或更多个选自奶粉，麸质，粒状脂肪，额外的酶，氨基酸，盐，氧化剂(包括抗坏血酸、溴酸盐和偶氮二甲酰胺(ADA))，还原剂(包括L-半胱氨酸)，乳化剂(包括单/二甘油酯、单甘油酯如单硬脂酸甘油酯(GMS)、硬脂酰乳酸钠(SSL)、硬脂酰乳酸钙(CSL)、脂肪酸聚甘油酯(PGE)和二乙酰酒石酸单和双甘油酯(DATEM)，胶(包括瓜尔豆胶和黄原胶)，调味剂，酸(包括柠檬酸、丙酸)，淀粉，改性淀粉，麸质，湿润剂(包括甘油)以及防腐剂组成的组的组分。

在本发明酶组合物的一个实施方案中，额外的酶是脂解酶，优选地是磷脂酶、半乳糖脂酶或具有磷脂酶活性和半乳糖脂酶两种活性的酶。

在本发明的酶组合物的一个实施方案中，额外的酶是磷脂酶。

在本发明的酶组合物的一个实施方案中，额外的酶是半乳糖脂酶。

在本发明的酶组合物的一个实施方案中，额外的酶是具有磷脂酶与半乳糖脂酶两种活性的酶。

本发明的制备面团的方法包括将本发明多肽或本发明酶组合物与至少一种面团成分相组合的步骤。“组合”包括但不限于将本发明的多肽或酶组合物加入到至少一种面团成分中，将至少一种面团成分加入到本发明的多肽或酶组合物中，将本发明的多肽和至少一种面团成分混合。

面团成分包括选自以下的组分：面粉，蛋，水，盐，糖，调味剂，脂肪(包括黄油、人造黄油、油和起酥油(shortening))，发面酵母(baker’s yeast)，化学发酵系统(chemical leavening systems)，奶，氧化剂(包括抗坏血酸、溴酸盐和偶氮二甲酰胺(ADA))，还原剂(包括L-半胱氨酸)，乳化剂(包括单/二甘油酯、单甘油酯如单硬脂酸甘油酯(GMS)、硬脂酰乳酸钠(SSL)、硬脂酰乳酸钙(CSL)、脂肪酸聚甘油酯(PGE)和二乙酰酒石酸单和双甘油酯(DATEM)，胶(包括瓜尔豆胶和黄原胶)，酸(包括柠檬酸、丙酸)，淀粉，改性淀粉，麸质，湿润剂(包括甘油)和防腐剂。

在本发明的制备面团的方法的一个方面，所述方法包括将本发明的多肽与选自以下的至少一种组分相组合的步骤：面粉，蛋，水，盐，糖，调味剂，脂肪(包括黄油、人造黄油、油和起酥油)，发面酵母，化学发酵系统，奶，氧化剂(包括抗坏血酸、溴酸盐和偶氮二甲酰胺(ADA))，还原剂(包括L-半胱氨酸)，乳化剂(包括单/二甘油酯、单甘油酯如单硬脂酸甘油酯(GMS)、硬脂酰乳酸钠(SSL)、硬脂酰乳酸钙(CSL)、脂肪酸聚甘油酯(PGE)和二乙酰酒石酸单和双甘油酯(DATEM)，胶(包括瓜尔豆胶和黄原胶)，酸(包括柠檬酸、丙酸)，淀粉，改性淀粉，麸质，湿润剂(包括甘油)和防腐剂。

在本发明的制备面团的方法的一个方面，所述方法包括将本发明的酶组合物与选自以下的至少一种组分相组合的步骤：面粉，蛋，水，盐，糖，调味剂，脂肪(包括黄油、人造黄油、油和起酥油)，发面酵母，化学发酵系统，奶，氧化剂(包括抗坏血酸、溴酸盐和偶氮二甲酰胺(ADA))，还原剂(包括L-半胱氨酸)，乳化剂(包括单/二甘油酯、单甘油酯如单硬脂酸甘油酯(GMS)、硬脂酰乳酸钠(SSL)、硬脂酰乳酸钙(CSL)、脂肪酸聚甘油酯(PGE)和二乙酰酒石酸单和双甘油酯(DATEM)，胶(包括瓜尔豆胶和黄原胶)，酸(包括柠檬酸、丙酸)，淀粉，改性淀粉，麸质，湿润剂(包括甘油)和防腐剂。

以上两方面的“组合”包括但不限于，将本发明的多肽或酶组合物添加至上述的至少一种组分中，将上述的至少一种组分添加至本发明的多肽或酶组合物中，将本发明的多肽和上述的至少一种组分混合。

本发明的面团可以包含本发明的多肽或本发明的酶组合物。

本发明的制备烘焙产品的方法包括烘焙本发明的面团的步骤。

在制备烘焙产品的方法的一个实施方案中，所述方法包括烘焙包含本发明多肽的面团。

在制备烘焙产品的方法的一个实施方案中，所述方法包括烘焙包含本发明酶组合物的面团。

在制备烘焙产品的方法的一个实施方案中，所述烘焙产品是面包或蛋糕。

本发明的烘焙产品可通过本发明的制备烘焙产品的方法获得。

本发明的制备多肽的方法包括使用Alicyclobacillus pohliae NCIMB14276，所述多肽与以下物质有至少60％的同一性、在一个实施方案中有至少70％的同一性、在一个实施方案中有至少80％的同一性、在一个实施方案中有至少85％的同一性、在一个实施方案中有至少90％的同一性、在一个实施方案中具有至少95％的同一性，所述物质为

(a)具有SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列的多肽；或

(b)与具有SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列的多肽有至少99.5％的同一性的多肽；或

(c)由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3第100-2157位核苷酸所示的多核苷酸编码的氨基酸序列。

本发明的α-淀粉酶是淀粉降解酶。α-淀粉酶的活性可以合适地使用由美国谷物化学家协会(American Association of Cereal Chemists，AACC)推荐的程序确定。

脂解酶(本文中也称为脂肪酶)是水解甘油三酯和/或半乳糖脂和或磷脂的酶。

脂肪酶的活性可以用分光光度法通过使用显色底物棕榈酸对硝基苯基酯(pNPP，Sigma N-2752)来测定。在该测试中，pNPP溶解于2-丙醇(每10ml 2-丙醇(Merk 1.09634)40 mg pNPP)，并悬浮于pH＝5.0含1.0％的Triton X-100(Merkl.12298)的100mM乙酸盐缓冲液中(45ml缓冲液中5ml底物)。最终的底物浓度为1.1mM。脂肪酶用该底物溶液在37℃下孵育10分钟。通过相对于所述反应混合物以1∶1的比例加入终止缓冲液2％Tris(Merk 1.08387)+1％的Triton X-100将反应终止，然后形成的对硝基苯酚(pNP)在405nm下测定。该测定也可以在不同的pH值下进行，以确定脂肪酶的pH依赖性。应当理解的是，不同的pH值可需要不同的缓冲液，或为了乳化底物不同的清洁剂去污可能是必要的。一个脂肪酶单位被定义为在所述反应条件下每分钟释放1微摩尔的对硝基苯酚的酶的量。应当明白，下述内容不是常规分析中不常见的实践：使用标准校准酶溶液(其具有在不同的测定中测定的已知活性)校正给定的测定的活性(其具有在校准测定中将被测定的单位)。

或者，脂肪酶活性可以通过使用2，3-巯基-1-丙醇-丁酸(TBDMP)作为底物来测定。脂肪酶水解TBDMP的硫酯键从而解放丁酸以及2，3-巯基-1-丙醇-二丁酸酯、2，3-巯基-1-丙醇-单丁酸酯或2，3-巯基-1-丙醇。释放的硫醇基在随后的反应中用4，4，-二硫代二吡啶(DTDP)滴定形成4-硫代吡啶酮。后者与在334nm吸收的4-巯基吡啶处于互变异构平衡。反应在含有0.2％的Triton-X100、0.65mM的TBDMP和0.2mM的DTDP的pH5.00.1M醋酸盐缓冲液中在37℃下进行。一个脂肪酶单位被定义为在所述反应条件下每分钟释放1微摩尔的4-硫代吡啶酮的酶的量。

除了分光光度测量，脂肪酶活性还可以使用滴定测量来测定。例如脂解酶的酯酶活性可以根据Food Chemical Codex，Forth Edition，NationalAcademy Press，1996，p803在三丁酸甘油酯作为底物时测量。

磷脂酶是催化脂肪酰基从磷脂中释放的酶。其可以是磷脂酶A2(PLA2，EC 3.1.1.4)或磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)。其可以或可以不具有其他的活性，如三酰甘油脂肪酶(EC 3.1.1.3)和/或半乳糖脂酶(EC3.1.1.26)的活性。

磷脂酶可以是来自哺乳动物或微生物来源的天然酶。

哺乳动物磷脂酶的一个例子是胰腺PLA2，例如牛或猪PLA2，例如商业产品Lecitase 10L(猪PLA2，Novozymes A/S的产品)。

微生物的磷脂酶可以来自镰孢菌属(Fusarium)，如F.oxysporum磷脂酶A1(WO 1998/026057)、F.venenatum磷脂酶A1(作为磷脂酶A2被描述在WO 2004/097012中，称为FvPLA2)，来自块菌属(Tuber)，例如T.borchii磷脂酶A2(称为TbPLA2，WO 2004/097012)。

磷脂酶还可以是具有磷脂酶活性的脂解酶变体，例如如WO2000/032758或WO 2003/060112所描述的。

磷脂酶也可催化脂肪酰基从存在于面团的其他脂质特别是小麦脂质中释放。因此，磷脂酶可以具有三酰甘油脂肪酶活性(EC 3.1.1.3)和/或半乳糖脂酶活性(EC 3.1.1.26)。

磷脂酶可以是如WO2009/106575中所述的脂解酶，如商业产品，DSM的产品。

术语“烘焙产品”指的是由面团制备的烘焙食品。

可以有利地通过本发明生产的烘焙产品(不管是白、黑或粗面粉(whole-meal)类型)的例子包括，通常为面包块或面包卷形式的面包(特别是白面包、粗面粉面包或黑麦面包)、法棍型(French baguette-type)面包、油酥糕点(pastries)、牛角面包、黄油鸡蛋面包(brioche)、意大利节日蛋糕(panettone)、通心粉、面条(煮或(翻)炒)、皮塔饼和其他扁面包、玉米饼、玉米卷、蛋糕、煎饼、饼干尤其是酥饼干(biscuits)、甜甜圈、包括酵母发酵的甜甜圈、百吉饼、馅饼皮、馒头、脆面包、布朗尼、单层蛋糕(sheet cakes)、休闲食品(如椒盐卷饼(pretzel)、玉米片、合成点心、合成薯片)。术语烘焙产品包括，含有2-30 wt％糖的面包、含有水果的面包、早餐谷物、谷物棒、不含蛋的蛋糕、软面包卷和无麸质面包。此处及之后的无麸质面包是含有至多20ppm的麸质的面包。几种谷类和淀粉来源被认为是对于无麸质饮食可以接受的。常用的来源是土豆、大米和木薯淀粉(tapioca)(来自木薯(cassava))。烘焙产品包括但不限于模制面包、面包块、绞花面包、小圆面包如汉堡小圆面包或小圆馒头、印度薄饼(chapati)、面包干、干馒头片、面包屑、无酵饼(matzos)、佛卡夏面包(focaccia)、梅尔巴吐司(melba toast)、特制加蛋烤面包片(zwieback)、烤面包丁(croutons)、软脆饼干、软和硬面包、面包条、酵母发酵和化学发酵的面包、叠层面团产品如丹麦糕点、牛角面包或泡芙糕点产品、松饼(muffin)、丹麦包、百吉饼、糖果包衣、薄饼干(crackers)、威化饼、比萨饼皮、玉米饼、通心粉产品、油煎薄饼、华夫饼、半烘焙(parbaked)产品及冷藏的和冷冻的面团产品。

半烘焙产品的例子包括但不限于在销售或消费时通过短暂的第二烘焙过程完成的部分烘焙的面包。

面包可以是白的盘式面包(pan bread)或棕的盘式面包；这种面包可以例如使用所谓的美式中种发酵法(Sponge and Dough Method)或美式直接方法(Direct method)来制造。

本文中的术语玉米饼包括玉米玉米饼和小麦玉米饼。玉米玉米饼是薄的、扁的面包的类型，通常由细磨的玉米(maize)(在美国通常称为“玉米(corn)”)未经发酵制成。面粉玉米饼是薄的、扁的面包类型，通常由细磨小麦面粉未经发酵制成。术语玉米饼还包括来自南美的被称作阿瑞巴(Arepa)的类似面包，尽管阿瑞巴通常比玉米饼厚得多。术语玉米饼还包括烙饼(laobing)，一种来自中国的比萨形状的厚“煎饼”，以及基本上由小麦面粉制成的印度烤饼(Indian Roti)。玉米饼通常具有圆形或椭圆形的形状，并且可以有约6至超过30 cm的直径变化。

术语“面团”在本文定义为面粉和其他成分的混合物。一方面，面团足够紧实以揉捏或滚动。面团可以是新鲜的、冷冻的、制备好的或半烘焙的。冷冻面团的制备由Kulp与Lorenz在Forzen and Refrigerated Doughsand Batters中描述。

面团用面团成分制作，所述面团成分包括但不限于(谷物)面粉，卵磷脂来源包括蛋，水，盐，糖，调味剂，脂肪来源包括黄油、人造黄油、油和起酥油，发面酵母、化学发酵系统如酸(产生化合物)和碳酸氢盐的组合，蛋白质来源包括奶、大豆粉，氧化剂(包括抗坏血酸、溴酸盐和偶氮二甲酰胺(ADA))，还原剂(包括L-半胱氨酸)，乳化剂(包括单/二甘油酯、单甘油酯如单硬脂酸甘油酯(GMS)、硬脂酰乳酸钠(SSL)、硬脂酰乳酸钙(CSL)、脂肪酸聚甘油酯(PGE)和二乙酰酒石酸单和双甘油酯(DATEM)，胶(包括瓜尔豆胶和黄原胶)，调味剂，酸(包括柠檬酸、丙酸)，淀粉，改性淀粉，麸质，湿润剂(包括甘油)和防腐剂。

谷物包括玉米、水稻、小麦、大麦、高粱、小米、燕麦、黑麦、黑小麦、荞麦、藜麦、斯佩尔特小麦、单粒小麦、二粒小麦、硬粒小麦和卡姆小麦。

面团通常是由基本面团成分制作，所述基本面团成分包括(谷物)面粉如小麦花或米粉、水和任选地盐。对于被发酵的产品，主要使用发面酵母，接着是例如酸(产生化合物)和碳酸氢盐的组合的化学发酵系统。

本文的术语面团包括面糊。面糊是一种或更多种面粉与例如水、牛奶或蛋的液体相组合的半液体混合物，其足够稀薄，能够从勺中落下或倒出，其用于制备多种食品包括蛋糕。

面团可以使用混合料制作，所述混合料包括蛋糕混合料、酥饼干混合料、布朗尼混合料、面包混合料、煎饼混合料和油煎薄饼混合料。

术语面团包括冷冻的面团，也被称为冷藏的面团。有不同类型的冷冻的面团；在发面前冷冻的面团和在部分或完全发面阶段之后冷冻的面团。冷冻的面团通常用于制造烘焙产品，包括但不限于酥饼干、面包、面包条和牛角面包。

本发明还涉及本发明α-淀粉酶在一些工业方法中的使用。尽管对于这些方法获得了长期的经验，但是本发明的α-淀粉酶可具有优于目前使用的酶的优势。根据特定的应用，这些优势可包括以下方面，如更低的生产成本、对底物的更高的特异性、更少的抗原性(antigenic)，更少的不期望的副活性，在合适的微生物中的更高的产率、更合适的pH和温度范围、最终产品的更好的口味以及食品级和按犹太教可食(kosher)。

在一个实施方案中，本发明的α-淀粉酶可以用于食品工业，包括用于食品制造。

本发明α-淀粉酶在食品的工业应用的一个例子是其使用在烘焙应用中。本发明的α-淀粉酶可以例如在烘焙产品例如面包或蛋糕中使用。例如以改进面团和/或烘焙产品的质量。

因此，本发明的一个实施方案提供了本发明的α-淀粉酶在制备面团中的使用并且提供了包含本发明α-淀粉酶的面团。本发明还提供了面团的制备，其包括将本发明的α-淀粉酶添加到至少一种面团成分中的步骤。

酵母、酶和任选的添加剂一般被单独加入到面团。

酶可以以例如粒化的干燥形式、液体形式或糊状形式添加。添加剂在大多数情况下以粉末形式添加。合适的添加剂包括氧化剂(包括抗坏血酸、溴酸盐和偶氮二甲酰胺(ADA))，还原剂(包括L-半胱氨酸)，乳化剂(包括单/二甘油酯、单甘油酯如单硬脂酸甘油酯(GMS)、硬脂酰乳酸钠(SSL)、硬脂酰乳酸钙(CSL)、脂肪酸聚甘油酯(PGE)和二乙酰酒石酸单和双甘油酯(DATEM)，胶(包括瓜尔豆胶和黄原胶)，调味剂，酸(包括柠檬酸、丙酸)，淀粉，改性淀粉，麸质，湿润剂(包括甘油)和防腐剂。

由面团成分制备面团是本领域公知的，其包括混合所述成分以及任选的一个或更多个模制和发酵步骤。

由所述面团制备烘焙产品也是本领域公知的，并且可以包括模制和成形以及在要求的温度和烘焙时间下烘焙之后的进一步发酵。在一个实施方案中，本发明提供了制备烘焙产品的方法，其包括烘焙本发明的面团的步骤。烘焙面团来制备烘焙产品可以使用本领域公知的方法进行。本发明还提供了根据该方法可获得的烘焙产品。在一个实施方案中，本发明的烘焙产品是面包或蛋糕。在本发明的一个方面，本发明的α-淀粉酶可以用来制备具有改进的脆性的用于烘焙制品的叠层面团。

本发明还涉及制备面团或烘焙产品的方法，其包括将有效量的本发明α-淀粉酶掺入面团，相比其中没有掺入所述多肽的面团或烘焙产品，其改进了面团或由所述面团获得的烘焙产品的一个或更多个特性。

短语“掺入面团”在本文被定义为将本发明的α-淀粉酶添加到面团、将由其制得面团的任何成分和/或将由其制得面团的面团成分的任何混合物。换句话说，本发明的α-淀粉酶可以在面团制备的任何步骤中加入，并且可以在一个、两个或更多个步骤中加入。将本发明的α-淀粉酶加入到面团的成分中，用本领域公知的方法揉捏和烘焙所述面团。见，例如美国专利No.4567046、EP-A-426，211、JP-A-60-78529、JP-A-62-111629和JP-A-63-258528。

术语“有效量”在本文被定义为足够对面团和/或烘焙产品的至少一个目的特性提供可测量效果的本发明α-淀粉酶的量。合适的量是10-20000MU单位/kg面粉的范围，在一个实施方案中是100-2000 MU/kg面粉，在另一个实施方案中是200-1000 MU/kg面粉。合适的量包括活性范围约10.000至12.000的1ppm-2000ppm的酶。在一个实施方案中，有效量的范围是活性范围约10.000至12.000的10-200ppm的酶，在另一个实施方案中是活性范围约10.000至12.000的20-80ppm的酶。在一个实施方案中，有效量的范围是活性约10.000 MU/g的10-200ppm的酶。此处以及之后的MU表示如实施例中标题“麦芽三糖测试(MU测试)”下定义的麦芽三糖单位(Maltotriose Unit)。

术语“改进的特性”在本文被定义为面团和/或由面团获得的产品特别是烘焙产品的任何特性，相对于没有掺入本发明α-淀粉酶的面团或产品，所述特性在本发明α-淀粉酶的作用下被改进。改进的特性可以包括但不限于增加的面团强度、增加的面团弹性(elasticity)、增加的面团稳定性、减小的面团粘性、改进的面团延展性、改进的面团可加工性、增加的烘焙产品体积、改进的烘焙产品风味、改进的烘焙产品内芯结构、改进的烘焙产品的内芯柔软性，减少的烘焙产品起泡、改进的脆性、改进的初始回弹性(resilience)以及特别地贮存后回弹性两者、减小的贮存后硬度和/或改进的烘焙产品的抗陈化性。

改进的特性可以包括更快的面团的面团形成时间和/或减小的面团的面团粘性。

改进的特性可以包括改进的烘焙产品可折叠性，如玉米饼、煎饼、扁面包、比萨饼皮、烤饼和/或面包片的改进的可折叠性。

改进的特性可以包括改进的烘焙产品柔韧性，包括玉米饼、煎饼、扁面包、比萨饼皮、烤饼和/或面包片的改进的柔韧性。

改进的特性可以包括改进的扁烘焙产品的可堆叠性，所述扁烘焙产品包括玉米饼、煎饼、扁面包、比萨饼皮、烤饼。

改进的特性可以包括减小的面条粘性和/或增强的面条柔韧性。

改进的特性可以包括减小的经烹饪面条的结块性和/或改进的面条风味甚至贮存一段时间后的面条风味。

改进的特性可以包括减少的薄饼干(cracker)产品中的发丝裂缝的形成，以及产生发酵效果和改进的风味形成。

改进的特性可以包括改进的口感和/或改进的挤压时的柔软性。

改进的特性可以包括减少的运输过程中的损坏，包括减少的运输过程中的破裂。

改进的特性可以包括减小的无麸质面包贮存后的硬度。

改进的特性可以包括改进的无麸质面包的回弹性。改进的特性可以包括改进的无麸质面包的初始回弹性以及特别地贮存后回弹性两者。

改进的特性可以包括减小的黑麦面包贮存后硬度。

改进的特性可以包括减小的黑麦面包贮存期间的回弹性损失。

改进的特性可以包括减小的烘焙产品贮存期间的回弹性损失，所述烘焙产品基于面粉包含至少5wt％的糖，在一个方面包含至少8wt％的糖，在一个方面包含至少12wt％的糖，在一个方面包含至少15wt％的糖。基于面粉在一个方面包含至少18wt％的糖，在一个方面包含至少20wt％的糖，在一个方面包含至少25wt％的糖，在一个方面包含至少30wt％的糖。因此，例如5％意味着配方中使用的每1000g面粉有50g糖。

改进的特性可以包括减小的烘焙产品的贮存后硬度，所述烘焙产品基于面粉包含至少5wt％的糖，在一个方面包含至少8wt％的糖，在一个方面包含至少12wt％的糖，在一个方面包含至少15wt％的糖。基于面粉在一个方面包含至少18wt％的糖，在一个方面包含至少20wt％的糖，在一个方面包含至少25wt％的糖，在一个方面包含至少30wt％的糖。因此，例如5％意味着配方中使用的每1000g面粉有50g糖。

改进的口感包括初咬时或咀嚼之后柔软的感觉，优选地没有口中的发粘的感觉和/或没有烘焙产品粘在牙上。改进的口感包括烘焙产品在初咬时或咀嚼之后在口中感觉的干涩更少。改进的口感包括烘焙产品在其被放置于包装或容器外之后在初咬时或咀嚼之后在口中感觉的干涩更少。改进的特性可以包括在面包片从其包装或容器中取出并暴露于环境条件下5分钟、在一个方面10分钟、在一个方面20分钟后，其具有改进的口感。

改进的特性可以包括在饼干从其包装或容器中取出并暴露于环境条件下10分钟、在一个方面20分钟、在一个方面30分钟、在一个方面1小时之后，其具有改进的口感。

在一个方面，此处以及之后的环境条件包括20摄氏度的温度和40％湿度的潮湿水平。

减少的运输过程中的破裂包括烘焙产品(包括但不限于饼干、面包如无麸质面包)不因为运输而破裂成额外的部分。

改进的挤压时的柔软性包括这样的触觉体验，即如果小圆面包被拿在手的手指和拇指之间时，拇指和手指向对方移动时需要较少的力量。

改进的烘焙产品的可折叠性可以进行如下测定。

将烘焙产品放置在平表面上。通过提起产品的一边并把它放在产品的相对边来折叠烘焙产品。通过这种方式得到的折叠的烘焙产品，其在位于或靠近中心的区域具有弯曲的曲线。肉眼检查折叠的烘焙产品的弯曲的外侧表面。如果在弯曲处或其附近观察到较少的裂缝，则可折叠性被提高。如果烘焙产品是玉米饼和/或面包片，这可以是特别有用的特性。

改进的可堆叠性可以如下测定。

将10个烘焙产品堆叠在彼此的顶部并密封在聚合物包装如聚乙烯箔中。这样得到一包烘焙产品。将10包烘焙产品堆叠在彼此的顶部并且在环境条件下保持3天、在一个方面为5天、在一个方面为1周、在一个方面为2周。环境条件是如本文所定义的条件。在此期限之后烘焙产品的底部包被打开，将烘焙产品彼此分离并且肉眼检查产品的表面。如果观察到更少的表面损伤，则可堆叠性得到改进。表面损伤可例如由被堆叠在彼此的顶部上的两个烘焙产品在分离过程中的表面破裂引起。如果烘焙产品是玉米饼，则这可以是特别有用的特性。

更快的面团形成时间可以如下测定。

面团形成时间是在麸质链开始分解之前，面团达到最大稠度、最大粘度需要的时间。其可以用来自德国的通过测量峰值时间来确定。如果用faronigraph确定面团形成时间，则面团形成时间是加入水的时刻与曲线达到其最高点的时刻之间的时间。峰时间优选地以分钟表示。

减小的面团粘性可以如下测定。

面团粘性优选地以至少8个面团块的两个单独批次，用配备压缩模式下测量力的5kg测力盒并带有圆柱形探头(25mm直径)的质构仪TAXT2i(Stable Micro Systems Ltd.，Surrey，英国)测定。使用2.0mm/s的测定前及测定后速度，而测定速度为1.0mm/s。集中面团块并将其压缩50％，探头在最大压缩下保持10秒。负峰值表示面团粘性。更小的负峰值表示减少的面团粘性。

增强的柔韧性可如下测定。

将烘焙产品放置在平表面上。烘焙产品被卷制成类似于管的形状，通过这种方式获得卷制的烘焙产品。如果卷制的烘焙产品仍然保持卷起的形状并且不松开则柔韧性得到改进。如果烘焙产品是玉米饼或煎饼，这可以是特别有用的特性。

改进的特性可以通过比较根据以下实施例中所描述的本发明方法添加了和不添加本发明(分离的)多肽所制备的面团和/或烘焙产品来测定。感官品质可以使用烘焙工业中已良好确立的程序进行评估，并且可以包括例如使用受训的味道测试者的小组。

术语“增加的面团强度”在本文被定义为这样的面团特性，即具有一般地更弹性的特性和/或需要更多的输入功(work input)来模制和成型。

术语“增加的面团弹性”在本文被定义为面团在经受一定的物理应变之后具有更高的倾向来恢复其原始形状的特性。

术语“增加的面团稳定性”在本文被定义为面团比较不易因机械损害而形成断层(faults)，从而更好地保持其形状和体积的特性，并且其以正常和/或延长的发面之后面包块横截面的高度：宽度的比例来评估。

术语“减小的面团粘性”在本文中被定义为面团在例如面团生产机械中粘附到表面的倾向更小的特性，并且其或者由具备本领域技能的测试烘焙者根据经验评估或者使用本领域已知的质构仪(例如TAXT Plus)来测量。

术语“改进的面团延展性”在本文中被定义为面团可以经受增加的应变或拉伸而不破裂的面团的特性。

术语“改进的面团可加工性”在本文被定义为面团一般地粘性更小和/或更紧实和/或更有弹性的特性。因此，厂房设备污垢较少并且清洁需求减少。

术语“增加的烘焙产品体积”优选地通过自动面包体积分析仪(例如BVM-3，TexVol Instruments AB，Viken，瑞典)使用本领域已知的超声或激光检测法测量为面包的给定的面包块的体积。在体积增加的情况下，特性得到改进。或者，在同一尺寸的罐(tin)中烘焙后的烘焙产品的高度指征烘焙产品的体积。在烘焙产品的高度增加的情况下，烘焙产品的体积增加。

术语“减少的烘焙产品起泡”在本文被定义为烘焙面包外皮上的气泡在视觉上测定的减少。

术语“改进的烘焙产品内芯结构”在本文被定义为烘焙产品的内芯中具有更细小的气囊(cell)和/或更薄的气囊壁和/或在内芯中具有更均一/均匀的气囊分布的特性，并且其通常由烘焙者来视觉评价或通过本领域中已知的数字成像分析(例如C-cell，Calibre Control International Ltd，Appleton，Warrington，UK)来评价。

术语“改进的烘焙产品柔软性”与“硬度”相对，在本文被定义为烘焙产品更容易被压缩的特性，并且其或者由具备本领域技能的测试烘焙者凭借经验评估或者通过使用本领域已知的质构仪(例如TAXT Plus)来测量。

术语“改进的烘焙产品风味”由受训的测试小组评估。

术语“改进的烘焙产品的抗陈化性”在本文被定义为烘焙产品的质量参数(例如减小的贮存后硬度和/或减小的贮存后回弹性损失)衰退速率减小的特性，。

抗陈化特性可以通过烘焙产品减小的贮存后硬度来证明。本发明的α-淀粉酶可以导致减小的硬度，例如在更容易被压缩的烘焙产品中。烘焙产品的硬度可以或者由具备本领域技能的测试烘焙者凭借经验评估或者通过使用本领域已知的质构仪(例如TAXT Plus)来测量。烘焙后24小时内测量的硬度被称为初始硬度。烘焙后24小时或更长时间测量的硬度被称为贮存后硬度，并且也是确定货架期的度量。在初始硬度减小的情况下，抗陈化特性得到了改进。在贮存后硬度减小的情况下，抗陈化特性得到了改进。优选地如本文实施例9所述测量硬度。

烘焙产品的回弹性优选地通过使用本领域中已知的质构仪(例如TAXTPlus)测量。

烘焙后24小时内测量的回弹性被称为初始回弹性。烘焙后24小时或更长时间测量的回弹性被称为贮存后回弹性，并且也是确定货架期的度量。新鲜烘焙的产品的内芯一般有高的初始回弹性但回弹性会在货架期期间损失。改进的抗陈化特性可以通过贮存期间回弹性损失的减少来证明。优选地如本文实施例9所述测量回弹性。

术语“改进的脆性”在本文被定义为烘焙产品相比本领域已知的参考商品有更脆的感觉以及比参考商品保持更长时间的脆感的特性。该特性可以使用例如质构仪TA-XT Plus(Stable Micro Systems Ltd，Surrey，英国)在压缩实验中测量固定速度下的力对距离的曲线并从该压缩曲线中获得物理参数来量化，即(i)第一个峰的力，(ii)第一个峰的距离，(iii)初始斜率，(iv)最高峰的力，(v)曲线下面积和(vi)断裂事件(力降大于某一预定值)的数量。改进的脆性的指征是更高的第一个峰的力、更短的第一个峰的距离、更高的初始斜率、更高的最高峰的力、更大的曲线下面积和更多数目的断裂事件。较之参考商品，更脆的产品应在这些参数的至少两个中有统计学上显著更好的得分。在本领域中，“脆性”还指脆、松脆(crunchiness)或硬皮性(crustiness)，表示具有脆的、松脆的或硬皮性的断裂行为的物质。

本发明可以提供具有至少一种改进的特性的面团，所述特性选自增加的强度、增加的弹性、增加的稳定性、减小的粘性和/或改进的延展性组成的组中的。

本发明还可以提供具有增加的面包块体积的烘焙产品。本发明还可以提供具有至少一种改进的特性的烘焙产品，所述特性选自增加的体积、改进的风味、改进的内芯结构、改进的内芯柔软性、改进的脆性、减少的起泡和/或改进的抗陈化性组成的组。

本发明的α-淀粉酶可用于延缓烘焙产品如面包和蛋糕的陈化。陈化的延缓可以通过相比没有根据本发明用本发明α-淀粉酶制备的包括面包和蛋糕的烘焙产品而言减小的硬度、特别是减小的贮存后硬度来表示。

相比工业中使用的其他α-淀粉酶，本发明的α-淀粉酶具有中等的热稳定性。本发明的α-淀粉酶比真菌α-淀粉酶或者来自谷物面粉的α-淀粉酶具有更高的温度稳定性。在另一方面，相比工业中使用的其他淀粉酶如细菌α-淀粉酶，其在高温下具有较低的热稳定性，特别是烘焙期间α-淀粉酶的失活温度下具有较低的热稳定性。

如使用本文实施例8所述的方法测量的，在高温下、在一个实施方案中在高于70℃的温度下、优选地在高于75℃的温度下、优选地在高于78℃的温度下、优选地在温度高于80℃的温度下、优选地在高于82℃的温度下、优选地在高于85℃的温度下，本发明的α-淀粉酶相比已知α-淀粉酶具有较低的热稳定性。优选地，热稳定性如下评估：25 MU/ml纯化的酶溶液在含有pH 5.050mM乙酸钠、1mM的CaCl₂和1g/L的BSA的缓冲液中在Eppendorf管中在不同温度下(40℃至86℃)预孵育30分钟。残留的酶活性用本文实施例“酶活性的测定”和“2)麦芽三糖测试(MU测试)”中所述的MU测试来测定。

本发明的α-淀粉酶优选地在烘焙期间具有活性并且优选地在烘焙结束之前失活。

在高温下具有中等热稳定性和/或较低的热稳定性的本发明α-淀粉酶的益处可以包括但不限于以下的一种或多种。

在高温下具有较低的热稳定性的酶可导致酶在烘焙过程中的变性水平增加。这可导致酶活性的更完全失活，从而赋予对烘焙过程中酶功能的更大控制。

已经观察到小型和大型烘焙产品具有不同的热传输速率、不同的烘焙时间以及因此不同的热处理。本发明α-淀粉酶对于因为烘焙时间和/或温度减少而经历更少热处理的烘焙产品可以是有益的。

已经观察到，在更高海拔如超过2000m的地点(例如墨西哥城海拔2240米)烘焙的面包可面临以下困难，即难以获得足够灭活热稳定酶的内芯温度。不束缚于理论，认为这是因为水在较低的大气压力下在更低的温度沸腾，并且这决定了烘焙产品的中心达到的最高温度。更低的烘焙产品中心的最高温度可使得(完全)灭活酶更加困难。高温下热稳定性更低的α-淀粉酶可以在例如墨西哥城这样的地方带来优势。

出于成本效益和可持续性的原因，工业面包坊在减少烘焙时间和烤箱温度-通常在20分钟以下-方面面临着越来越大的压力。更不耐热的酶可更适合较短的烘焙时间，因为这种酶在烘焙过程结束时更有效地变性。相比全烘焙的等同物，半烘焙的面包的烘焙时间较短-例如通常烘焙过程少20％和/或烤箱温度低10℃，并且因此也可预料到获益于高温下具有更低的热稳定性的酶。

本发明的α-淀粉酶和/或本发明的方法中所使用的额外的酶可以是适合于所讨论用途的任何形式，例如干燥粉末、凝聚粉末或颗粒尤其是无粉尘颗粒、液体特别是稳定化的液体或WO01/11974和WO02/26044中描述的受保护的酶的形式。液体形式包括但不限于乳液、悬浮液和溶液。颗粒和凝聚粉末可通过常规方法制备，例如将本发明的α-淀粉酶喷洒到流化床制粒机的载体(carrier)上。该载体可以由具有合适粒径的颗粒核心组成。载体可以是可溶的或不溶的，合适的载体包括盐(如NaCl或硫酸钠)、糖醇(如山梨糖醇)、淀粉、米粉、小麦粉、玉米粗磨粉(corn grit)、麦芽糖糊精或大豆。

包含本发明多肽的这样的颗粒或凝聚粉末可以被称为烘焙添加剂。所述烘焙添加剂优选地具有超过95％(以重量计)的颗粒为25-500μm的窄粒径分布。

本发明的淀粉分解酶和/或额外的酶可以被包含在缓释制剂中。用于制备缓释制剂的方法是本领域公知的。根据已确定的方法，添加营养学上可接受的稳定剂如糖、糖醇或其他多元醇，和/或乳酸或其他有机酸可以例如稳定液体酶制剂。

优选地，本发明的酶以干燥形式提供以便容易处理产物。不论酶的制剂为何，该制剂可以包含一种或更多种添加剂。合适的添加剂的例子包括氧化剂(包括抗坏血酸、溴酸盐和偶氮二甲酰胺(ADA))，还原剂(包括L-半胱氨酸)，乳化剂(包括单/二甘油酯、单甘油酯如单硬脂酸甘油酯(GMS)、硬脂酰乳酸钠(SSL)、硬脂酰乳酸钙(CSL)、脂肪酸聚甘油酯(PGE)和二乙酰酒石酸单和双甘油酯(DATEM)，胶(包括瓜尔豆胶和黄原胶)，调味剂，酸(包括柠檬酸、丙酸)，淀粉，改性淀粉，麸质，湿润剂(包括甘油)和防腐剂。

本发明的α-淀粉酶也可掺入到包含酵母的组合物中，例如EP-A-0619947、EP-A-0659344和WO02/49441中公开的。

为了包含在面粉的预混合料中，本发明的(分离的)多肽是干燥产物例如无粉尘颗粒的形式是有利的，而为了与液体一起加入，液体形式是有利的。

一种或更多种额外的酶也可以掺入到面团中。因此，本发明提供了包含本发明α-淀粉酶以及一种或更多种额外的酶的酶组合物。所述酶组合物可以是烘焙酶组合物。这种酶组合物可用于面团产品以及由所述面团得到的烘焙产品。例如其可以用在进一步含有蛋的面团产品和用在烘焙产品如黄油鸡蛋面包和意大利节日蛋糕中，两个都是常规的并且具有减少的蛋量。额外的酶可以来自任何来源，包括哺乳动物和植物，以及优选地微生物(细菌、酵母或真菌)来源，并可通过本领域常规使用的技术获得。

在一个实施方案中，额外的酶可以是淀粉酶，包括额外的α-淀粉酶，如真菌α-淀粉酶(其对提供酵母可发酵的糖类以及延缓陈化可以是有用的)、β-淀粉酶、环糊精葡聚糖转移酶、蛋白酶、肽酶特别是外肽酶(其对于风味增强可以是有用的)、转谷氨酰胺酶、三酰基甘油脂肪酶(其可以用于修饰面团或面团成分中存在的脂质从而软化面团)、半乳糖脂酶、磷脂酶、纤维素酶、半纤维素酶尤其是戊聚糖酶如木聚糖酶(其对戊聚糖更特别地阿拉伯木聚糖的部分水解可以是有用，其增加了面团的延展性)、蛋白酶(其对麸质弱化尤其使用硬小麦面粉时可以是有用的)、蛋白质二硫键异构酶例如WO 95/00636公开的蛋白质二硫键异构酶、糖基转移酶、过氧化物酶(其对于改进面团稠度可以是有用的)、漆酶、或氧化酶、己糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、醛糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、脂氧合酶或L-氨基酸氧化酶(其对于改进面团稠度可以是有用的)或蛋白酶。

纤维素酶可以来自A.niger或来自Trichoderma reesei。

淀粉葡糖苷酶可以是来自Aspergillus例如来自A.oryzae或A.niger，优选地来自A.niger的淀粉葡萄糖苷酶。

在一个实施方案中，额外的酶是脂解酶，包括三酰基甘油脂肪酶、磷脂酶、半乳糖脂酶和具有半乳糖脂酶和磷脂酶两种活性的酶。

三酰基甘油脂肪酶可以是真菌脂肪酶，优选地来自Rhizopus、Aspergillus、Candida、Penicillum、Thermomyces或Rhizomucor。在一个实施方案中，三酰基甘油脂肪酶来自Rhyzopus，在另一个实施方案中，使用来自Rhyzopus oryzae的三酰基甘油脂肪酶。任选地，可以使用两种或更多种三酰基甘油脂肪酶的组合。

在另一个实施方案中，脂解酶是磷脂酶或具有半乳糖脂酶和磷脂酶两种活性的酶。已知这样的脂肪酶作用于小麦的内源性脂质和如通过加入起酥油脂肪提供的或来自卵磷脂的外来脂肪源。优先地，脂肪酶切割极性脂质并且具有磷脂酶活性、半乳糖脂酶活性或磷脂酶和半乳糖脂酶活性的组合来产生溶血磷脂如溶血磷脂酰胆碱和溶血半乳糖脂(lysogalactolipids)如双半乳糖单甘油酯。脂肪酶的特异性可以通过使用合适底物例如三酰基甘油脂、磷脂酰胆碱和双半乳糖甘油二酯的体外测试来显示，或优选地通过分析混合与发酵期间在面团中产生的反应产物来显示。

50和被商业化用于标准化脂解活性，对于来自DSM的使用DLU测量，对于来自Novozymes的使用LU测量。DLU被定义为在pH 8.5在37℃下从对硝基苯基棕榈酸酯生产1微摩尔/分钟的对硝基苯酚需要的酶的量，而LU被定义为在pH7在30℃下从三丁酸甘油酯生产1微摩尔/分钟丁酸需要的酶的量。脂肪酶最佳地与本发明的α-淀粉酶在2-850 DLU/kg面粉或50-23500 LU/kg面粉下使用。

在本发明的酶组合物的一个实施方案中，额外的酶是如WO2009/106575所述的

在本发明的酶组合物的一个实施方案中，额外的酶是如WO9826057所述的酶。

在本发明的酶组合物的一个方面，额外的酶是如US RE38,507所述的酶。

在本发明的酶组合物的一个方面，额外的酶是如WO 9943794尤其是EP1058724B1所述的酶。

如果根据本发明的方法添加一个或更多个额外的酶活性物，这些活性物可以单独添加或与本发明的多肽一同加入，例如作为本发明的酶组合物，其包括面包改良组合物和/或面团改良组合物。其他酶活性物可以是上述任何的酶，并可以根据确定的烘焙实践来确定剂量。

在一个实施方案中，本发明的酶组合物以干燥的形式被提供，使得其更容易被添加到面团、面团成分中，但是液体的形式也可以。液体形式包括但不限于乳液、悬浮液和溶液。不论酶组合物是何种制剂，可以使用本领域已知的对改进和/或维持酶活性、面团和/或烘焙产品的质量有用的任何一种或更多种添加剂。合适的添加剂的例子包括氧化剂(包括抗坏血酸、溴酸盐和偶氮二甲酰胺(ADA))，还原剂(包括L-半胱氨酸)，乳化剂(包括单/二甘油酯、单甘油酯如单硬脂酸甘油酯(GMS)、硬脂酰乳酸钠(SSL)、硬脂酰乳酸钙(CSL)、脂肪酸聚甘油酯(PGE)和二乙酰酒石酸单和双甘油酯(DATEM)，胶(包括瓜尔豆胶和黄原胶)，调味剂，酸(包括柠檬酸、丙酸)，淀粉，改性淀粉，麸质，湿润剂(包括甘油)和防腐剂。

本发明的α-淀粉酶可以掺入到用于面团和/或由面团制备的烘焙产品的预混合料中，例如以面粉组合物的形式，其中所述预混合料包含本发明的多肽。术语“预混合料”在本文被定义为以其常规含义来理解，即作为烘焙剂的混合料，一般包含面粉，其不仅可用于工业面包烘焙工厂/设施，而且也可以用于零售烘焙品店。预混合料可以通过将本发明的α-淀粉酶或本发明的酶组合物与合适的载体如面粉、淀粉或盐混合来制备。预混合料可以含有上述的添加剂。

在另一个方面，本发明的α-淀粉酶可以用于生产蛋糕以及生产可以制备蛋糕的面糊。

在另一个方面，本发明的α-淀粉酶可用来减少基于面粉含有至少10wt％的糖的烘焙产品的贮存后的硬度。因此，例如5％意味着在配方中每使用1000g的面粉有50g。

本发明的α-淀粉酶可以用于制备许多蛋糕，包括油脂蛋糕(shortenedcakes)，例如磅蛋糕(pound cake)和黄油蛋糕(butter cake)，以及包括乳沫蛋糕(foam cake)，诸如例如蛋白糖霜蛋糕(meringues)、海绵蛋糕、酥饼干蛋糕(biscuit cake)、蛋糕卷(roulade)、杰诺瓦士蛋糕(genoise)和戚风蛋糕(chiffon cake)。海绵蛋糕是一种基于小麦面粉、糖、焙粉(baking powder)和蛋(以及任选地焙粉)的软蛋糕。存在的仅有的脂肪来自蛋黄，其有时独立于蛋清添加。其经常被用作其他类型的蛋糕和甜点的基料(base)。磅蛋糕一般用各一磅的面粉、黄油、蛋和糖来制备，以及任选地补充有焙粉。戚风蛋糕中黄油/人造黄油已被油取代。相比磅蛋糕或海绵蛋糕，糖和蛋黄的含量已减少，蛋清含量已增加。

制备面糊的方法优选地包括以下步骤：

a.通过至少加入下述物质来制备蛋糕的面糊：

i.糖；

ii.面粉；

iii.本发明的α-淀粉酶；

iv.至少一个蛋；以及

v.任选的磷脂酶。

制备本发明的蛋糕的方法还包括以下步骤

b.烘焙面糊来产生蛋糕。

本领域技术人员知道如何由面团成分制备面糊或蛋糕。任选地，一种或更多种其他的成分可以存在于组合物中例如来使得蛋糕中的蛋和/或脂肪减少，例如水胶体、酵母提取物、钙。

本发明的α-淀粉酶的上述工业应用仅包括了几个例子，该列表并不意味着是限制性的。

本发明的α-淀粉酶的其他用途可以包括：

-生产葡萄糖、果糖和麦芽糖糖浆；

-生产淀粉水解物如麦芽糖糊精；

-生产改性淀粉；

-动物饲料中淀粉组分的改性；

-酿造中替换麦芽；

-在胶水包括墙纸涂浆(wall paper paste)中使用；

-在使用淀粉制作的塑料物品中使用，所述塑料物品包括由聚合淀粉膜制成的塑料袋；和/或

-在废弃面包(waist bread)的再加工中使用。

实施例

酶活性的测定

1)AACC方法22-02.01

使用法测量植物和微生物材料中的α-淀粉酶

α-淀粉酶活性通过用Megazyme CERALPHAα-淀粉酶测试试剂盒(Megazyme International Ireland Ltd.，Co.Wicklow，爱尔兰)根据制造商的说明测量活性来定量。

2)麦芽三糖测试(MU测试)

一个麦芽三糖单元(MU)被定义为在下列测试条件下使用麦芽三糖底物每分钟释放1微摩尔葡萄糖的酶的量。酶活性在37℃和pH 5.0下使用麦芽三糖作为底物来测定。酶法水解麦芽三糖导致定量释放葡萄糖，这是酶活性的度量。最终测试浓度：8 mg/ml的麦芽三糖，0.007至0.02 MU/ml的成熟DSM-AM，20mM柠檬酸缓冲液，0.2 mg/ml BSA，2 mM NaCl。反应在30分钟之后停止(以1∶10的比例添加0.33M的NaOH)，使用葡萄糖己糖激酶FS试剂盒(Diagn.SYST)，释放的葡萄糖在其间形成NADH的两个步骤中被转化为葡萄糖-6-P。得到的吸光度在340nm波长处的增加是30分钟的孵育过程中释放的葡萄糖的量的度量。活性使用葡萄糖标准曲线来计算。

实施例1

本发明的的α-淀粉酶的生产

克隆和酶的制备

如以下进一步详细描述，α-淀粉酶基因以下述方式在B.subtilis中克隆和表达

菌株和质粒

Bacillus subtilis菌株BS154(CBS 363.94)(ΔaprE、ΔnprE、amyE-、spo-)被描述在Quax与Broekhuizen 1994 Appl Microbiol Biotechnol.41：425-431中。

E.coli/B.subtilis穿梭载体pBHA12被描述在(WO2008/000632)中。

Alicyclobacillus pohliae NCIMB 14276被Imperio等人描述(Int.J.Syst.Evol.Microbiol 58：221-225，2008)。

Bacillus stearothermophilusC599(NCIMB 11873)被描述在WO91/04669中。

分子生物学技术

进行本领域技术人员已知的分子生物学技术(见：Sambrook&Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd Ed.，CSHL Press，Cold SpringHarbor，NY，2001)。聚合酶链反应(PCR)用热循环仪用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes OY，Aspoo，芬兰)根据制造商的说明进行。

淀粉酶活性

如上所述根据AACC方法22-02.01对B.subtilis培养物的培养液中的α-淀粉酶活性进行定量。

Alicyclobacillus pohliae基因组测序

通过BaseClear(Leiden，荷兰)来对Alicyclobacillus pohliae NCIMB14276的基因组进行测序。将DNA片段化(剪切)并将DNA适配体连接到DNA片段的两端。得到两套Illumina GAIIx序列读出。一套由双末端(paired-end)读出组成，横跨大约250(+-125)个核苷酸的距离。第二套由配对(mate pair)读出组成，横跨大约4200(+-2100)个核苷酸的距离。在全Illumina GAIIx序列读出上施用基于Phred质量分数的质量过滤。此外，低质量的和不明核苷酸从剩余的读出中修剪掉。过滤后的双末端读出和配对读出用于CLC Genomics Workbench 4.6.1或4.7版本(CLC bio，Aarhus，丹麦)的‘从头’拼装(‘De novo’assembly)。通过这种方式，获得一组预拼装的重叠群(contigs)(连续序列)。使用Boetzer等人描述的SSPACE(Bioinformatics 27：578-579，2011)来进一步布置重叠群。序列分析显示Alicyclobacillus pohliae NCIMB 14276基因组含有编码α-淀粉酶的基因(在本文被称为DSM-AM)，其具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，见图3。

由SEQ ID NO.1编码的相应的DSM-AM蛋白具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，见图4。

SEQ ID NO：3示出密码子优化的DSM-AM基因的核苷酸序列，见图5。

实施例2

A.pohliae DSM-AM基因在Bacillus subtilis中的表达

通过用SphI和HindIII消化pBHA12在载体pBHA12中引入amyQ终止子和PmeI限制性位点并且克隆下列DNA序列

5’-

GCATGCGTTTAAACAAAAACACCTCCAAGCTGAGTGCGGGTATCAGCTTGGAGGTGCGTTTATTTTTTCAGCCGTATGACAAGGTCGGCATCAGAAGCTT-3’(5′SphI和3′HindIII限制性位点有下划线)。

该片段被克隆到pBHA12中产生载体pGBB09(图1)。

DSM-AM基因由GeneAart(德国)合成，并且在5′末端添加PacI限制性位点并且在3′末端添加PmeI限制性位点。将DSM-AM基因克隆到PacI和PmeI消化的pGBB09载体中从而产生载体pGBB09DSM-AM1(图2)。该载体被转化至B.subtilis菌株BS154。质粒的序列通过DNA测序确认。含有pGBB09DSM-AM1的B.subtilis菌株BS 154被命名为DSM-AMB154-1。

实施例3

用B.subtilis在摇瓶中表达DSM-AM

在摇瓶中培养B.subtilis菌株DSM-AMB154-1和BS154。这些摇瓶中含有20ml 2×TY培养基，所述培养基含有1.6％(w/v)细菌用胰蛋白胨、1％(w/v)的酵母提取物和0.5％(w/v)的NaCl。将培养物在37℃和250rpm下剧烈振荡16小时并使用0.2ml培养基接种20ml SMM培养基。SMM预培养基含有1.25％(w/w)的酵母提取物、0.05％(w/w)的CaCl₂、0.075％(w/w)的MgCl2.6H2O、15μg/l的MnSO4.4H2O、10μg/l的CoCl2.6H2O、0.05％(w/w)的柠檬酸、0.025％(w/w)的消泡剂86/013(Basildon Chemicals，Abingdon，英国)。为了完成SMM培养基，将均为单独制备与灭菌的20ml的5％(w/v)的麦芽糖和20ml的200mM的磷酸钠缓冲贮备液(pH为6.8)加入到60ml的SMM预培养基中。将这些培养物在37℃和250rpm下孵育48小时。收集上清液并分析酶的产率。根据如上所述的AACC方法22-02.01测定在DSM-AMBl54-1菌株的α-淀粉酶活性。DSM-AMB 154-1的上清液含有α-淀粉酶活性而亲本菌株BS 154没有。

实施例4

酶的制备

在合适的发酵培养基中在有氧条件下培养Bacillus菌株DSM-AMB154-1。

酶被分泌到培养基中。随后的发酵液被过滤来除去细菌细胞、来自这些细胞碎片和其他固体。由此获得的含有酶的滤液然后通过超滤浓缩得到含有成熟的DSM-AM的浓缩物。

实施例5

酶的纯化

使用以下步骤进行纯化。实施例4中得到的含有成熟DSM-AM的浓缩发酵液与pH 7.5、含有400mg/ml(NH₄)₂SO₄(1∶1比例)的50mMHEPES缓冲液混合。将溶液在4℃下搅拌过夜，随后在3220 rcf、4℃下离心10分钟。沉淀物重新悬浮在pH7.5的25mM Tris缓冲液中，并通过0.45μm的过滤器过滤。溶液的电导率通过加入MilliQ水调整至2ms/cm，然后调节pH至pH＝7.5。将溶液通过Vivaspin 20ml浓缩器(SartoriusStedim)10.000MWCO在3220rcf、4℃下浓缩15分钟。将溶液施加到用pH7.5、25mM的HEPES缓冲液平衡的Q-Sepharose柱。在流通液(flow-through)中收集蛋白质。流通液被重新施加到用pH 9.5、25mM的HEPES缓冲液平衡的Q-Sepharose柱。蛋白质用0-1M NaCl梯度洗脱。纯化的成熟DSM-AM酶通过PD-10脱盐柱(GE Healthcare)使用pH7.5、25mM的Tris缓冲液脱盐。

蛋白质测定

实施例5中获得的纯化的成熟DSM-AM酶的蛋白质浓度通过BCA^TM蛋白质测试试剂盒(Pierce)根据制造商的说明在以下条件下测定：样品与WR试剂的比例为1∶12，并且混合物的吸光度在540nm波长处测定。

实施例6

酶的特性

实施例5中得到的成熟DSM-AM酶的活性对pH值的依赖性通过如上所述的MU测试用其中pH调整为不同值(pH4.0、4.3、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)的反应混合物来测定。用两个最终的酶浓度0.01和0.018MU/ml进行两次测量。结果用相对活性描述。发现成熟DSM-AM的最适pH是pH5.0。在其他指定的pH下测量的活性示于下表。所述值对应于不同的酶浓度下的两次测量的平均值。

表6.1

pH	4.0	4.3	5.0	5.5	6.0	6.5	7.0	7.5
									相对活性	68％	76％	100％	87％	71％	40％	21％	8％

成熟DSM-AM酶的活性对温度的依赖性使用上述的MU测试用设定为40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、90℃的反应温度测定。成熟DSM-AM在60-75℃活性最大，当温度高于90℃时酶大约失去90％的其活性。

实施例7

α-淀粉酶活性

实施例5中得到的成熟DSM-AM的α-淀粉酶活性通过使用MegazymeCERALPHAα-淀粉酶测试试剂盒(Megazyme International Ireland Ltd.，Co.Wicklow，爱尔兰)根据制造商的说明测量活性来量化。

表7.1

实施例8

成熟DSM-AM的热稳定性

为了评估如实施例5得到的成熟DSM-AM的热稳定性，25MU/mL的纯化的酶溶液在含有pH 5.050mM乙酸钠、1mM的CaCl₂和1g/L的BSA的缓冲液中在Eppendorf管中在不同温度下(40℃至86℃)预孵育30分钟。残余的酶活性使用上述MU测试确定。为了比较，10.000被包括在内。结果被表示为在4℃下预孵育30分钟的样品的活性的百分比。

在从40℃至75℃的温度范围内，观察到成熟DSM-AM和10.000的可比较的高水平的活性(90％以上)(数据未显示)。76至86℃的温度范围内的残余的酶活性列于下表8.1。这些数据清楚地表明成熟DSM-AM和10.000在最高约80℃的温度下热稳定性相当。然而，在约80℃及更高的温度下，成的DSM-AM的残余酶活性比10.000的残余酶活性更低。

表8.1

10.000从Novozymes，丹麦获得。

为了进一步评估实施例5得到的成熟DSM-AM的热稳定性，在玻璃管中在pH 4.350mM乙酸钠、1mM的CaCl₂的缓冲液中测试7.5MU/ml的成熟DSM-AM的残余活性。在80℃下孵育15分钟后，如上所述测定残余的活性。在同样的条件下，成熟DSM-AM显示出3％的残余活性，而10.000显示出13％的残余活性。结果列于表8.2

表8.2

10.000从Novozymes，丹麦获得。

实施例9烘焙实验

成熟DSM-AM的烘焙性能用荷兰模制面包(Dutch tin bread)测试。使用两个配料表(见表9.1)。配方A用于表9.2的结果，配方B用于表9.3的结果。表9.2和9.3的对照是指分别用配方A和B并且不包含成熟的DSM-AM制备的面包的面包块。

在烘焙实验中可以如实施例4所述来生产的成熟DSM-AM的浓缩物的使用剂量为550-605 MU/kg面粉。

在表9.1中所列的成分在DIOSNA SP-12混合器在转速400转/分下混合4分钟，其后以速度1560转/分钟混合10分钟，至最终的面团温度为27℃。面团被分为840克的8块，制成圆形并且在28℃和90％的相对湿度下发面45分钟。

随后对面团块进行模制，并放置在上了油脂的模具(DGP-01)中并在35℃在88％相对湿度下发面75分钟。

完全发面的面团块被放置在Wachtel Piccolo烘箱中并且在第一阶段在280℃下烘焙7分钟，其中添加初始蒸汽。之后在第二阶段将温度升高到265℃/270℃进行28分钟。

此后，卸载烘箱，面包出盘(depanned)并放在架子上，在通常是20℃和25℃之间的环境温度下冷却至少1小时。在1-2小时的冷却后，面包被包裹在聚乙烯塑料袋中。

此后，对面包进行评估。

在硬度测量之间，面包被保存在塑料袋中。

表9.1

*Kolibri、Edelweiss和Ibis面粉从Meneba，荷兰获得。Koningsgist从AB Mauri，荷兰获得。

**基本的面包改良剂包含作为混合材料的20ppm的抗坏血酸(来自DSM Nutritional Products，瑞士)、5 ppmP500(来自DSM，荷兰的真菌α-淀粉酶)、15 ppmHSP6000(来自DSM，荷兰的真菌半纤维素酶)以及Kolibri面粉。

***富面包改良剂包含大豆粉(来自Soja Austria，奥地利)32.9wt％、乳清粉(来自Vreugdenhill，荷兰)18wt％、棕榈油(100％棕榈油，来自Remia，荷兰)6wt％、油菜籽油(来自Aldoc B.V.，荷兰)3wt％、SSL(来自Cognis Deutschland GmbH&Co.KG，德国)10wt％、Kolibri面粉(来自Meneba，荷兰)30.1wt％。

硬度的测量

将面包用切片距离设定为2.1厘米的面包片机切片。

用来自Stable Micro Systems仪器的质构仪TA-XTPlus并且应用以下设置测量硬度。

设置

·测试模式＝压缩

·测试前速度＝3mm/s

·测试速度＝1mm/s

·测试后速度5mm/s

·距离＝5mm

·保持时间＝10秒

·触发力＝5克

列出的硬度是测量的力；最大峰值以克记录。回弹性是10秒保持时间之后的力(F)除以最大峰值力乘以100。

回弹性＝(F2/F1)X100

冷却至室温后，面包块的体积由自动面包体积分析仪(BVM-3，TexVol Instruments)来确定。对照面包的面包块体积被定义为100％。

面团的稠度、本身、形成、延展性、弹性、粘性由有经验的烘焙者进行评估并判定为良好。

面包的体积、内芯结构和内芯颜色由有经验的烘焙者判定为良好。

得到了表明面团良好且面包良好的令人满意的结果。

表9.2配方A的三个测试的平均值

第0天是面包烘焙的当天。第4天是面包烘焙后第4天。第7天是面包烘焙后的第7天。

表9.3用Edelweiss的更长货架期测试(配方B)

第0天是面包烘焙的当天。第1周是面包烘焙后第7天。第2周是面包烘焙后的第14天。第3周是面包烘焙后的第21天。

从这些结果可以看出，使用成熟DSM-AM制备的面包片与缺乏这种酶的对照面包片相比贮存后硬度减小了。

实施例10烘焙实验

成熟DSM-AM的烘焙性能用含有较高水平糖的敞口式(open top)模制面包测试。为了比较，10.000被包括在内。添加的糖在12-20％的范围内。烘焙实验中所用的成分列于表10.1。其结果示于表10.2。表10.2中的对照是指制备的不含有成熟DSM-AM或10.000的面包的面包块。

在烘焙实验中可以如实施例4中所述生产的成熟DSM-AM的浓缩物的使用剂量为550MU/kg面粉。为了比较，10.000以50mg/kg面粉加入。

表10.1中所列的成分在Diosna SP-12混合器中在25Hz的频率下以400转混合，其后在50Hz的频率下以1800转混合至最终的面团温度为27℃。面团被分成840g的8块，制成圆形并且在28℃和90％的相对湿度下发面45分钟。

完全发面的面团块被放置在Wachtel Piccolo烘箱中并且在第一阶段在200/230℃下烘焙15分钟，其中添加初始蒸汽。之后在第二阶段温度被降低至160℃/180℃进行20分钟。

此后，卸载烘箱，面包出盘并放在架子上，在通常是20℃和25℃之间的环境温度下冷却至少1小时。在1-2小时的冷却后，面包被包裹在聚乙烯塑料袋中。

此后，对面包进行评估。

在硬度测量之间，面包被保存在塑料袋中。

表10.1

*BG100面粉从Paniflour，比利时获得。Koningsgist从AB Mauri，荷兰获得。

**基本的面包改良剂包含作为混合材料的20ppm的抗坏血酸(来自DSM Nutritional Products，瑞士)、5ppmP500(来自DSM，荷兰的真菌α-淀粉酶)、15 ppmHSP6000(来自DSM，荷兰的真菌半纤维素酶)以及Kolibri面粉。

硬度的测量

将面包用切片距离设定为2.1 cm的面包片机切片，。

设置

·测试模式＝压缩

·测试前速度＝3mm/s

·测试速度＝1mm/s

·测试后速度5mm/s

·距离＝5mm

·保持时间＝10秒

·触发力＝5克

回弹性＝(F2/F1)X100

得到了表明面团良好且面包良好的令人满意的结果。

表10.2货架期测试

实施例11烘焙实验

成熟DSM-AM的烘焙性能用荷兰模制面包测试。使用两个配料表(见表11.1)。配方A用于表11.2的结果，配方B用于表11.3的结果。表11.2和11.3的对照是指分别用配方A和B并且不含有成熟DSM-AM制备的面包的面包块，。

在烘焙实验中可以如实施例4所述来生产的成熟DSM-AM的浓缩物的使用剂量为550-605MU/kg面粉。

表11.1中所列的成分在Diosna SP-12混合器中在25Hz的频率下以400转混合，其后在50Hz的频率下以1800转混合至最终的面团温度为27℃。面团被分成840克的8块，制成圆形并且在28℃和90％的相对湿度下发面45分钟。

完全发面的面团块被放置在Wachtel Piccolo烘箱中并且在第一阶段在280℃下烘焙7分钟，其中添加初始蒸汽。之后在第二阶段温度被升至265℃/270℃进行28分钟。

此后，对面包进行评估。

在硬度测量之间，面包被保存在塑料袋中。

表11.1

*Kolibri、Edelweiss和Ibis面粉从Meneba，荷兰获得的。Koningsgist从AB Mauri，荷兰获得。

**基本面包改良剂包含作为混合材料的20 ppm抗坏血酸(来自DSMNutritional Products，瑞士)、5ppmP500(来自DSM，荷兰的真菌α-淀粉酶)、15ppmHSP6000(来自DSM，荷兰的真菌半纤维素酶)以及Kolibri面粉。

***富面包改良剂包含大豆粉(来自Soja Austria，奥地利)32.9 wt％、乳清粉(来自Vreugdenhill，荷兰)18 wt％、棕榈油(100％棕榈油，来自Remia，荷兰)6 wt％、油菜籽油(来自Aldoc B.V.，荷兰)3wt％、SSL(来自Cognis Deutschland GmbH&Co.KG，德国)10wt％、Kolibri面粉(来自Meneba，荷兰)30.1wt％。

硬度的测量

将面包用切片距离设定为2.1 cm的面包片机切片。

设置

·测试模式＝压缩

·测试前速度＝3mm/s

·测试速度＝1mm/s

·测试后速度5mm/s

·距离＝5mm

·保持时间＝10秒

·触发力＝5克

回弹性＝(F2/F1)X100

得到了表明面团良好且面包良好的令人满意的结果。

表11.2配方A三个测试的平均值

表11.3用Edelweiss的较长货架期测试(配方B)

Claims

1.编码具有α-淀粉酶活性的多肽的多核苷酸，其包含：

(d)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的多核苷酸序列。

2.根据权利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸是由Alicyclobacillus pohliae NCIMB 14276产生的。

3.载体，其包含根据权利要求1或2的多核苷酸序列。

4.根据权利要求3的载体，其为表达载体，其中根据权利要求1或2的多核苷酸序列与允许所述多核苷酸序列在合适的宿主细胞中表达的至少一种调控序列可操作地连接。

5.根据权利要求4的载体，其中所述合适的宿主细胞是Aspergillus、Bacillus、Chrysosporium、Escherichia、Kluyveromyces、Penicillium、Pseudomonas、Saccharomyces、Streptomyces或Talaromyces的种、优选地是Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus licheniformis、Escherichia coli、Aspergillus Niger或Aspergillus oryzae种。

6.重组宿主细胞，其包含根据权利要求1或2的多核苷酸，或包含根据权利要求3至5中任意一项的载体。

7.根据权利要求6的重组宿主细胞，其能够表达或过表达所述多核苷酸或所述载体。

8.一种制造根据权利要求1或2的多核苷酸或根据权利要求3至5中任意一项的载体的方法，其包括以下步骤：培养用所述多核苷酸或所述载体转化的宿主细胞，并且将所述多核苷酸或所述载体从所述宿主细胞中分离。

9.α-淀粉酶多肽，其包含：

(a)SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列；或

10.通过在合适的宿主细胞中表达根据权利要求1或2的多核苷酸或根据权利要求3至5中任意一项的载体能够得到的根据权利要求9的多肽。

11.制造根据权利要求9或10的多肽的方法，其包括在允许根据权利要求1或2的多核苷酸或根据权利要求3至5的载体表达的条件下培养根据权利要求6或7的重组宿主细胞，以及任选地，从细胞或培养基中回收所编码的多肽。

12.根据权利要求9或10的多肽用于食品制造的用途。

13.根据权利要求12的用途，其用于制造烘焙产品，优选面包或蛋糕。

14.酶组合物，其包含根据权利要求9或10的多肽以及选自以下的一种或更多种组分：奶粉，麸质，粒状脂肪，额外的酶，氨基酸，盐，氧化剂如抗坏血酸、溴酸盐和偶氮二甲酰胺，还原剂如L-半胱氨酸，乳化剂如单甘油酯、二甘油酯、单硬脂酸甘油酯、硬脂酰乳酸钠、硬脂酰乳酸钙、脂肪酸聚甘油酯和二乙酰酒石酸单和双甘油酯，胶如瓜尔豆胶和黄原胶，调味剂，酸如柠檬酸和丙酸，淀粉，改性淀粉，麸质，湿润剂如甘油和防腐剂组成的组。

15.根据权利要求14的酶组合物，其中所述额外的酶是脂解酶，优选地为磷脂酶。

16.制备面团的方法，其包括将根据权利要求9或10的多肽或根据权利要求14或15的组合物与至少一种面团成分相组合的步骤。

17.面团，其包含根据权利要求9或10的多肽或根据权利要求14或15的组合物。

18.制备烘焙产品的方法，其包括烘焙根据权利要求17的面团的步骤。

19.根据权利要求18的方法能够得到的烘焙产品。

20.一种生产与下述氨基酸序列具有至少60％的同一性的多肽的方法，其包括使用Alicyclobacillus pohliae NCIMB 14276，所述氨基酸序列为

(a)SEQ ID NO：2第34-719位氨基酸所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：2的氨基酸序列的第34-719位氨基酸有至少99.5％的同一性的氨基酸序列；或

(b)由根据权利要求1或2的多核苷酸编码的氨基酸序列。

21.根据权利要求9或10的多肽用于减小烘焙产品的贮存后硬度的用途，所述烘焙产品含有基于面粉的至少5wt％的糖。