CN102428177B - 提高面包耐码垛性的方法及其产品 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及淀粉酶和脂肪分解酶的组合在提高面包耐码垛性中的用途，用于制备具有所述酶组合的面团和烘焙产品的方法，以及具有特定面包耐码垛性特征的面包。

Description

提高面包耐码垛性的方法及其产品
发明领域
本发明涉及淀粉酶和脂肪分解酶在用于提高面包耐码垛性(stackability)中的用途，用于制备包含所述酶的面团的方法，包含所述酶的烘焙产品，例如面包，以及具有特定面包耐码垛性特征的面包。 
背景技术
期望烘焙产品(例如面包)在烘焙后具有一定的初始硬度，其允许码垛所述烘焙产品而不会对所述烘焙产品的质量和/或外观产生不良影响。然而，此初始硬度需要与烘焙产品长期保持其新鲜度的需求(例如防止烘焙产品老化(staling)的需求)相制衡。 
因此，需要在初始硬度与其后硬度随时间提高的水平之间具有良好平衡的烘焙产品。本文将其称为“面包耐码垛性”。 
发明内容
本发明的内容体现于权利要求书和以下的说明中。 
本发明的一个方面涉及淀粉酶和脂肪分解酶在改进面包耐码垛性中的用途。 
本发明的第二方面公开了一种用于制备面团的方法，其包括： 
a)添加SEQ ID No.1所示的淀粉酶或与SEQ ID No.1具有至少75％同一性的非产麦芽糖的淀粉酶(non-maltogenic amylase)至在面团中10ppm的量；和 
b)添加脂肪分解酶至在面团中10ppm的量。 
第三方面，本发明涉及一种面团，其包含： 
a)SEQ ID No.1所示的淀粉酶或与SEQ ID No.1具有至少75％同一性的非产麦芽糖的淀粉酶；和 
b)脂肪分解酶， 
其中所述淀粉酶和脂肪分解酶的量分别达到在面团中10ppm。 
第四方面，本发明涉及一种通过烘焙面团制备的烘焙产品，其中所述面团包含： 
a)SEQ ID No.1所示的淀粉酶或与SEQ ID No.1具有至少75％同一性的非产麦芽糖的淀粉酶；和 
b)脂肪分解酶， 
其中所述淀粉酶和脂肪分解酶的量分别达到在面团中10ppm。 
第五方面，本发明涉及一种面包，其具有： 
a)至少7HPa/g的初始硬度； 
b)自烘焙后2小时起的硬度变化： 
i.在4天后小于或等于12HPa/g；和/或 
ii.在6天后小于或等于15HPa/g；和/或 
iii.在11天后小于或等于20HPa/g。 
第六方面，本发明涉及一种面包，其具有： 
a)至少7HPa/g的初始硬度； 
b)自烘焙后2小时起的硬度变化： 
i.在4天后小于或等于所述初始硬度的1.7倍；和/或 
ii.在6天后小于或等于所述初始硬度的2.1倍；和/或 
iii.在11天后小于或等于所述初始硬度的2.9倍。 
本发明还包括基本如实施例中所述的方法、用途、面团和烘焙产品(例如面包)。 
令人惊讶地，发现淀粉酶和脂肪分解酶的组合应用能够提供良好的面包耐码垛性。 
具体地，发现淀粉酶和脂肪分解酶的组合应用能够在烘焙后2小时的初始硬度与其后硬度的提高水平之间提供良好的平衡。 
具体实施方式
根据本发明的第一方面，本文提供了淀粉酶和脂肪分解酶在改进面包耐码垛性中的用途。 
所述“改进面包耐码垛性”是指与没有添加淀粉酶和/或脂肪分解酶的对照面包相比，烘焙后的初始硬度提高且其后硬度随时间减小。 
所述“初始硬度”是指烘焙后2小时的硬度。 
理想的初始硬度水平取决于烘焙产品的类型。例如，具有较高初始硬度的黑面包(rye bread)比白面包更为理想。 
适合地，烘焙产品的初始硬度可高于没有添加脂肪分解酶和淀粉酶的对照面包。例如，初始硬度可适合地比对照提高至少0.5HPa/g，优选至少1HPa/g，优选至少1.5HPa/g。 
适合地，烘焙产品的初始硬度可以是至少7HPa/g。 
所述“硬度随时间减小”是指从烘焙后2小时至烘焙后至少4天(例如至少6天或11天)期间硬度的相对增加小于没有添加脂肪分解酶和/或淀粉酶的对照面包。 
例如，从烘焙后2小时至烘焙后4天(或6天或11天)期间的硬度增加可以比对照的硬度增加低至少0.5HPa/g，或至少1HPa/g，或至少1.5HPa/g，或至少2.0HPa/g，或至少2.5HPa/g，或至少3.0HPa/g，或至少3.5HPa/g，或至少4.0HPa/g，或至少4.5HPa/g，或至少5.0HPa/g，或至少5.5HPa/g。 
适合地，自烘焙后2小时的硬度变化可以是： 
i.在4天后小于或等于12HPa/g；和/或 
ii.在6天后小于或等于15HPa/g；和/或 
iii.在11天后小于或等于20HPa/g。 
在一种实施方式中，本发明的烘焙产品可具有： 
a)至少7HPa/g的初始硬度；和 
b)自烘焙后2小时起的硬度变化： 
i.在4天后小于或等于所述初始硬度的1.7倍；和/或 
ii.在6天后小于或等于所述初始硬度的2.1倍；和/或 
iii.在11天后小于或等于所述初始硬度的2.9倍。 
适合地，所述淀粉酶可以是麦芽糖淀粉酶或非产麦芽糖的淀粉酶，优选所述淀粉酶是非产麦芽糖的淀粉酶，例如具有非产麦芽糖的外切淀粉酶活性的多肽，适合地是与具有SEQ ID 1所示序列的淀粉酶等效的非产麦芽糖的淀粉酶。 
麦芽糖淀粉酶和非产麦芽糖的淀粉酶的实例是本领域普通技术人员所熟 知的。 
此类酶的实例为具有葡聚糖1，4-α-麦芽四糖水解酶(maltotetrahydrolase，EC 3.2.1.60)活性的酶，例如GRINDAMYL POWERFreshTM酶和WO05/003339中公开的酶。适合的非产麦芽糖的淀粉酶是可商购的，如PowersoftTM(可得自于丹麦Danisco A/S)。也可使用麦芽糖淀粉酶，例如NovamylTM(丹麦Novozymes A/S)。 
适合地，所述淀粉酶可包括： 
a)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列(参见图8)；或 
b)与SEQ ID No.1具有至少75％同一性并且编码非产麦芽糖的淀粉酶的氨基酸序列。 
适合地，非产麦芽糖的淀粉酶可包含与SEQ ID No.1具有至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少97％同一性的氨基酸序列。 
用于本发明的脂肪分解酶可具有选自以下的一个或多个活性：磷脂酶活性(例如磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)，或磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)；糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)，三酰甘油水解活性(E.C.3.1.1.3)，脂质酰基转移酶活性(根据国际生物化学和分子生物学联盟命名委员会(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology)的酶命名推荐(Enzyme Nomenclature Recommendations(1992))，通常归类为E.C.2.3.1.x)及其任意组合。这些脂肪分解酶是本领域内公知的。 
适合地，所述脂肪分解酶可以是任何可商购的脂肪分解酶。例如，所述脂肪分解酶可以是以下任意一种或多种：Lecitase UltraTM，丹麦Novozymes；Lecitase 10TM；来自镰刀菌(Fusarium spp)的磷脂酶A1，例如Lipopan FTM、Lipopan ExtraTM、YieldMaxTM；来自黑曲霉(Aspergillus niger)的磷脂酶A2；来自紫红链霉菌(Streptomyces violaceruber)的磷脂酶A2，例如LysoMax PLA2TM；来自勃氏块菌(Tuber borchii)的磷脂酶A2；或来自黑曲霉的磷脂酶B、脂酶3(SEQ ID NO.3)、Grindamyl EXEL 16TM，和GRINDAMYL POWERBake 4000range PanamoreTM，GRINDAMYL POWERBake 4070(SEQ ID NO 9)或GRINDAMYL POWERBake 4100。 
适合地，用于本发明的脂肪分解酶具有以下氨基酸序列之一： 
a)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或优选SEQ ID No.9； 
b)SEQ ID No.3所示的氨基酸序列； 
c)SEQ ID No.4所示的氨基酸序列； 
d)SEQ ID No.5所示的氨基酸序列；或 
e)或编码与a)至d)中任一所述序列具有至少70％同一性的脂肪分解酶的氨基酸序列。 
还可存在其他的酶，例如木聚糖酶和/或抗老化淀粉酶。 
本发明的第二方面公开了一种用于制备面团的方法，其包括： 
a)添加SEQ ID No.1所示的淀粉酶或与SEQ ID No.1具有至少75％同一性的非产麦芽糖的淀粉酶至在面团中10ppm的量；和 
b)添加脂肪分解酶至在面团中10ppm的量。 
有利地，所述剂量的这两种酶能够使烘焙产品获得期望的面包耐码垛性。 
适合地，所使用的脂肪分解酶的量可以是在面团中0.1至9ppm，在面团中0.1至8ppm，在面团中0.1至7ppm，在面团中0.1至6ppm，在面团中0.1至5ppm，在面团中0.2至5ppm，在面团中0.2至4ppm，在面团中0.2至3ppm，优选在面团中0.2至2ppm，或在面团中0.3至1ppm，和/或所使用的淀粉酶的量可以是在面团中0.1至9ppm，在面团中0.1至8ppm，在面团中0.1至7ppm，在面团中0.1至6ppm，在面团中0.1至5ppm，在面团中0.2至5ppm，在面团中0.2至4ppm，在面团中0.2至3ppm，优选在面团中0.2至2ppm，或在面团中0.3至1ppm。 
适合地，可使用一个或多个以下试验鉴定用于本发明的脂肪分解酶。 
磷脂酶活性的测定(TIPU-K试验)： 
底物： 
将0.6％L-α磷脂酰胆碱95％Plant(Avanti#441601)，0.4％Triton-X 100(Sigma X-100)和5mM CaCl2溶解于0.05M HEPES缓冲剂(pH 7)。 
试验流程：使用KoneLab自动分析仪将34μl底物添加到试管中。在时间T＝0分钟时，添加4μ酶溶液。还分析了以水代替酶的空白对照。将样品混合并在30℃温育10分钟。使用来自WAKO GmbH的NEFA C试剂盒分析样品的游离脂肪酸含量。 
计算在试验条件下每分钟产生的脂肪酸微摩尔数作为酶活性TIPU pH 7。 
用于测定酰基转移酶活性％的方法 
可在酶促反应后，使用CHCl3∶CH3OH 2∶1提取已经添加了本发明脂质酰基转移酶的食用油，并按照下文详述的流程通过GLC和HPLC分离并分析包含脂质材料的有机相。通过GLC和HPLC分析，确定了游离脂肪酸和一种或多种甾醇酯/甾烷醇酯的量。通过相同的方式分析没有添加本发明酶的对照食用油。 
计算： 
根据GLC和HPLC分析的结果，可计算游离脂肪酸和甾醇酯/甾烷醇酯的增加： 
Δ％脂肪酸＝％脂肪酸(酶)-％脂肪酸(对照)；Mv脂肪酸＝脂肪酸的平均分子量； 
A＝Δ％甾醇酯/Mv甾醇酯(其中，Δ％甾醇酯＝％甾醇酯/甾烷醇酯(酶)-％甾醇酯/甾烷醇酯(对照)，Mv甾醇酯＝甾醇酯/甾烷醇酯的平均分子量)； 
转移酶活性计算为总酶活性的百分比： 
如果食用油中的游离脂肪酸增加，优选其没有大量增加，即没有增加到显著的程度。这是指游离脂肪酸的增加没有对食用油的质量产生不良影响。 
用于酰基转移酶活性试验的食用油优选是使用以下方法添加了植物甾醇(1％)和磷脂酰胆碱(2％)油的大豆油： 
通过在搅拌下加热至95℃，将植物甾醇和磷脂酰胆碱溶解在大豆油中。 
随后将油冷却至40℃，并添加酶。 
在磁力搅拌下，将样品保持在40℃，在4小时和20小时之后取出样品并通过TLC分析。 
对于所述试验，所用酶剂量优选为0.2TIPU-K/g油，更优选0.08TIPU-K/g油，优选0.01TIPU-K/g油。优选在4小时后，更优选在20小时后，测定磷脂在油中的存在水平和/或甾醇的转化％。 
当所使用的酶是脂质酰基转移酶时，优选温育时间能够确保至少5％的 转移酶活性，优选至少10％的转移酶活性，优选至少15％、20％、25％、26％、28％、30％、40％、50％、60％或75％的转移酶活性。 
可通过上文教导的方法测定转移酶活性％(即，作为总酶活性百分比的转移酶活性)。 
除(上述)评估油中的转移酶活性％之外或作为代替，为了确定最优选用于本发明方法的脂质酰基转移酶，还可以使用标题为“鉴定用于本发明的脂质酰基转移酶的方法”的以下试验。 
用于鉴定脂质酰基转移酶的方法 
本发明的脂质酰基转移酶是导致以下结果的一种酶： 
i)除去添加了植物甾醇(1％)和磷脂酰胆碱(2％)油的大豆油(使用以下方法：通过在搅拌下加热至95℃，将植物甾醇和磷脂酰胆碱溶解在大豆油中。随后将油冷却至40℃，并添加酶。在磁力搅拌下，将样品保持在40℃，在4小时和20小时之后取出样品并通过TLC分析)中存在的磷脂； 
和/或 
ii)所添加的甾醇至甾醇酯的转化(转化％)(使用上文i)中教导的方法)。可使用如实施例2中教导的用于测定甾醇和甾醇酯水平的GLC方法。 
对于所述试验，所用酶剂量可以是0.2TIPU-K/g油，优选0.08TIPU-K/g油，优选0.1TIPU-K/g油。优选在4小时后，更优选在20小时后，测定磷脂在油中的存在水平和/或甾醇的转化(转化％)。 
在用于鉴定脂质酰基转移酶的方法中，优选在酶促反应后添加5％的水并与油充分混合。随后，使用离心将油分成油相和水相(参见″Enzyme catalyzed degumming of vegetable oils″by Buchold，H.and Laurgi A.-G.，Fett Wissenschaft Technologie(1993)，95(8)，300-4，ISSN：：0931-5985)，此后使用以下方法(“磷含量的测试”)分析油相的磷含量。 
淀粉酶 
术语“淀粉酶”以其常用的意义使用，例如尤其能够催化淀粉降解的酶。特别地，它们是能够切割淀粉中α-D-(1，4)-糖苷键的水解酶。 
淀粉酶是降解淀粉的酶，分类为水解酶，其切割淀粉中的α-D-(1，4)- 糖苷键。通常，α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1，α-D-(1，4)-葡聚糖水解酶)定义为以随机的方式切割淀粉分子内的α-D-(1，4)-糖苷键的内切作用酶。相比之下，外切作用淀粉分解酶，例如β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2，α-D-(1，4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)和一些产物特异性淀粉酶，如麦芽糖α-淀粉酶(E.C.3.2.1.133)从底物的非还原末端切割淀粉分子。β-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶(E.C.3.2.1.20，α-D-葡萄糖苷酶)、葡萄糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3，α-D-(1，4)-葡聚糖葡糖水解酶)和产物特异性淀粉酶可从淀粉产生特定长度的麦芽低聚糖。 
适合地，在本发明中使用的淀粉酶是非产麦芽糖的淀粉酶，例如非产麦芽糖的外切淀粉酶。 
在一个实施方式中，本文中使用的术语“非产麦芽糖的外切淀粉酶”应当用来指根据本文中描述的产物测定方法所分析，在开始时不将淀粉降解成大量麦芽糖的酶。 
适合地，所述非产麦芽糖的外切淀粉酶可包括外切-麦芽四糖水解酶。外切-麦芽四糖水解酶(E.C.3.2.1.60)更正式地称为葡聚糖1，4-α-麦芽四糖水解酶。该酶水解淀粉多糖中的1，4-α-D-糖苷键，从而从非还原链末端连续除去麦芽四糖残基。 
非产麦芽糖的外切淀粉酶详细地描述于美国专利号6,667,065，该专利文献在此通过引用并入本文。 
在一种实施方式中，本发明中使用的淀粉酶可以是具有EP 09160655.8(其内容通过引用并入本文)中所述淀粉酶活性的多肽。为了便于参考，将在以下编号段落中描述其中部分淀粉酶。以下编号段落中所述的任意酶均可以以10ppm或更小的剂量用于面团中。 
1.具有淀粉酶活性的多肽，其包含以下氨基酸序列： 
a.与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少78％的序列同一性，并且其中所述多肽在以下位点包含一个或多个氨基酸取代：235、16、48、97、105、240、248、266、311、347、350、362、364、369、393、395、396、400、401、403、412或409，和/或 
b.与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少65％的序列同一性，并且其中所述多肽在以下位点包含一个或多个氨基酸取代：88或205，和/或 
c.与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少78％的序列同一性，并且其中所述多肽包含一个或多个以下氨基酸取代：42K/A/V/N/I/H/F、34Q、100Q/K/N/R、272D、392K/D/E/Y/N/Q/R/T/G或399C/H，和/或 
d.与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性，并且其中所述多肽在以下位点包含一个或多个氨基酸取代：44、96、204、354或377，和/或 
e.与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性，并且其中，参照SEQ ID NO：7所示序列的位点编号，所述多肽包含以下氨基酸取代：392S。 
2.如上段1所述的多肽，其中所述多肽包含位于以下位点的一个或多个氨基酸取代：235、88、205、240、248、266、311、377或409，和/或包含一个或多个以下氨基酸取代：42K/A/V/N/I/H/F、34Q、100Q/K/N/R、272D或392K/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G。 
3.如上段1或2任一段所述的多肽，其中所述多肽包含位于以下位点的一个或多个氨基酸取代：235、88、205、240、311或409，和/或包含一个或多个以下氨基酸取代：42K/N/I/H/F、272D或392K/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G。 
4.如上段1-3中任一段所述的多肽，其中所述多肽包含位于至少4个、5个或全部以下位点的氨基酸取代：88、205、235、240、311或409，和/或具有至少一个或两个以下氨基酸取代：42K/N/I/H/F、272D或392K/D/E/Y/N/Q/R/S/T/G。 
5.如上段1-4中任一段所述的多肽，其中所述多肽还包含一个或多个以下氨基酸：33Y、34N、70D、121F、134R、141P、146G、157L、161A、178F、179T、223E/S/K/A、229P、307K、309P和334P。 
6.如上段1-5中任一段所述的多肽，其与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。 
7.如上段1-6中任一段所述的多肽，其中所述多肽包含位于位点88的氨基酸取代。 
8.如上段7所述的多肽，其中所述多肽具有氨基酸88L。 
9.如上段1-8中任一段所述的多肽，其中所述多肽包含位于位点235的氨基酸取代。 
10.如上段9所述的多肽，其中所述多肽具有氨基酸235R。 
11.如上段1-10中任一段所述的多肽，其中所述多肽还包含一个或多个以下氨基酸：121F、134R、141P、229P或307K。 
12.如上段1-11中任一段所述的多肽，其具有在C-末端融合的接头。 
13.如上段1-12中任一段所述的多肽，其具有外切淀粉酶活性。 
14.如上段1-13中任一段所述的多肽，其具有非产麦芽糖的外切淀粉酶活性。 
非产麦芽糖的外切淀粉酶活性的测定 
下列系统用于表征适合用于本发明所述用途的具有非产麦芽糖的外切淀粉酶活性的多肽。 
初始背景信息，糯玉米支链淀粉(可作为WAXILYS 200从法国Roquette商购获得)是具有非常高支链淀粉含量(高于90％)的淀粉。 
将20mg/ml糯玉米淀粉在50mM MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)、2mM氯化钙的缓冲液(pH 6.0)中煮沸3分钟，然后在50℃下温育并在半小时内使用。 
1个单位的非产麦芽糖的外切淀粉酶定义为，当与4ml如上文所述配制的在50mM MES、2mM氯化钙(pH 6.0)中的10mg/ml糯玉米淀粉一起在试管中于50℃下温育时，每分钟释放相当于1μmol的还原性糖的水解产物的酶的量。 
使用麦芽糖作为标准品并使用本领域内已知的定量还原性糖的方法，特别是Bernfeld，Methods Enzymol.，(1954)，1，149-158的二硝基水杨酸方法来测量还原性糖。 
通过在50℃下将0.7个单位的非产麦芽糖的外切淀粉酶在试管中与4ml如上所述制备的在缓冲液中的10mg/ml糯玉米淀粉一起温育15或300分钟，来确定非产麦芽糖的外切淀粉酶的水解产物模式。 
通过将试管浸没在沸水浴中3分钟来终止反应。 
通过阴离子交换HPLC，使用Dionex PA 100柱，并以醋酸钠、氢氧化钠和水作为洗脱剂，使用脉冲安培检测(pulsed amperometric detection)和使用从葡萄糖至麦芽七糖的已知线性麦芽低聚糖作为标准品，来分析和定量水解产物。用于麦芽八糖至麦芽十糖的反应因子是发现用于麦芽七糖的反应因子。 
优选地，酶是非产麦芽糖的外切淀粉酶且在以下方法中使用时具有非产麦芽糖的外切淀粉酶活性。在50℃的温度和pH 6的条件下，将0.7单位的所述非产麦芽糖的外切淀粉酶在每ml包含50mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸和2mM氯化钙的缓冲溶液中具有10mg预煮沸糯玉米淀粉的4ml水溶液中温育15分钟。该酶产生由一种或多种具有2至10个D-吡喃葡萄糖基单位的线性麦芽低聚糖和任选葡萄糖组成的水解产物。至少60％(按重量)，优选至少70％(按重量)，更优选至少80％(按重量)和最优选至少85％(按重量)的所述水解产物可由具有3至10个D-吡喃葡萄糖基单位的线性麦芽低聚糖组成，优选由具有4至8个D-吡喃葡萄糖基单位的线性麦芽低聚糖组成。 
为了方便参考和为了本发明的目的，可将“在50℃的温度和pH 6.0条件下，将0.7单位的所述非产麦芽糖的外切淀粉酶在每ml包含50mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸和2mM氯化钙的缓冲溶液中具有10mg预煮沸糯玉米淀粉的4ml水溶液中温育15分钟”的特征称为“糯玉米淀粉温育试验”。 
因此，也可以表述为，本发明的优选非产麦芽糖的淀粉酶被表征为：在糯玉米淀粉温育试验中具有产生水解产物的能力，所述水解产物可由一种或多种具有2至10个D-吡喃葡萄糖基单位的线性麦芽低聚糖和任选葡萄糖组成；这样至少60％(按重量)，优选至少70％(按重量)，更优选至少80％(按重量)和最优选至少85％(按重量)的所述水解产物可由具有3至10个D-吡喃葡萄糖基单位的线性麦芽低聚糖组成，优选由具有4至8个D-吡喃葡萄糖基单位的线性麦芽低聚糖组成。 
糯玉米淀粉温育试验中的水解产物可包括一种或多种具有2至10个D-吡喃葡萄糖基单位的线性麦芽低聚糖和任选葡萄糖。糯玉米淀粉温育试验中的水解产物也可包括其他水解产物。此外，具有3至10个D-吡喃葡萄糖基单位的线性麦芽低聚糖的重量％是基于由一种或多种具有2至10个D-吡喃葡萄糖基单位的线性麦芽低聚糖和任选葡萄糖组成的水解产物的量。也就是说，具有3至10个D-吡喃葡萄糖基单位的线性麦芽低聚糖的重量％不是基于除一种或多种具有2至10个D-吡喃葡萄糖基单位的线性麦芽低聚糖和葡萄糖外的水解产物的量。 
可用任何合适的方法分析水解产物。例如，可通过阴离子交换HPLC，使用Dionex PA 100柱，使用脉冲安培检测和用例如已知的从葡萄糖至麦芽 七糖的线性麦芽低聚糖作为标准品来分析水解产物。 
为了方便参考和为了本发明的目的，可将“通过阴离子交换HPLC，使用Dionex PA 100柱，使用脉冲安培检测和以从葡萄糖至麦芽七糖的已知线性麦芽低聚糖作为标准来分析水解产物”的特征称为“通过阴离子交换进行的分析”。当然，正如所指出的，其他分析技术以及其他特定阴离子交换技术也可满足该目的。 
因此，也可以表述为，优选的淀粉酶是这样的淀粉酶：即，具有非产麦芽糖的外切淀粉酶活性从而使其在糯玉米淀粉温育试验中具有产生水解产物的能力，所述水解产物可由一种或多种具有2至10个D-吡喃葡萄糖基单位的线性麦芽低聚糖和任选葡萄糖组成；所述水解产物能够通过阴离子交换进行分析；这样至少60％(按重量)，优选至少70％(按重量)，更优选至少80％(按重量)和最优选至少85％(按重量)的所述水解产物可由具有3至10个D-吡喃葡萄糖基单位的线性麦芽低聚糖组成，优选由具有4至8个D-吡喃葡萄糖基单位的线性麦芽低聚糖组成。 
本文所用的术语“线性麦芽低聚糖”以正常的意义使用，是指通过α-(1-4)键连接的2至10个单位的α-D-吡喃葡萄糖。 
其他的酶 
除了淀粉酶和脂肪分解酶外，还可使用一种或多种其他的酶，例如将其加入食品、面团制备物或食物(foodstuff)。 
可加入至面团的其他酶包括氧化还原酶、水解酶(例如脂酶和酯酶)以及糖苷酶(如α淀粉酶、支链淀粉酶和木聚糖酶)。氧化还原酶，例如葡萄糖氧化酶和己糖氧化酶，可用于面团强化和控制烘焙产品的体积，并且可加入木聚糖酶和其他半纤维素酶以改良面团操作性质、面包心柔软度和面包体积。脂酶可用作面团强化剂和面包软化剂，α淀粉酶和其他淀粉酶可掺入面团以控制面包体积。 
可使用的其他酶可选自由纤维素酶、半纤维素酶、淀粉降解酶、蛋白酶、脂肪氧化酶组成的组。 
有用的氧化还原酶的实例包括氧化酶，例如葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4)、糖氧化酶、甘油氧化酶、吡喃糖氧化酶、半乳糖氧化酶(EC 1.1.3.10)、麦芽糖 氧化酶，例如己糖氧化酶(EC 1.1.3.5)。 
可向面团组合物中加入的其他有用的淀粉降解酶包括葡萄糖淀粉酶和支链淀粉酶。 
优选地，其他酶是至少木聚糖酶和/或至少抗老化淀粉酶。 
本文使用的术语“木聚糖酶”是指水解木糖苷键的木聚糖酶(EC 3.2.1.32)。 
本文使用的术语“淀粉酶”是指诸如α淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β淀粉酶(EC3.2.1.2)和γ淀粉酶(EC 3.2.1.3)之类的淀粉酶。 
可将其他酶与任何面团配料包括面粉、水或任选其他配料或添加剂、或改良面团的组合物一起添加。可在面粉、水以及任选其他配料和添加剂或改良面团的组合物之前加入其他酶。可在面粉、水以及任选其他配料和添加剂或改良面团的组合物之后加入其他酶。其他酶可方便地是液体制剂。然而，所述组合物可方便地是干燥组合物的形式。 
改良面团的组合物的一些酶能够在面团条件下相互作用达到这样的程度，即所述酶对改良面粉面团的流变学(rheological)和/或可加工性性质和/或由面团制成的产品的质量的效应不仅仅是累加性，而且该效应还是协同性的。 
对于由面团制成的产品(终产品)的改良，可发现在面包心结构方面所述组合导致显著的协同效应。同样，在烘焙产品的比容方面，可发现存在协同效应。 
宿主细胞 
所述宿主生物可以是原核或真核生物。 
在本发明的一种实施方式中，本发明的脂肪分解酶在宿主细胞中表达，例如在细菌细胞中，例如在芽孢杆菌(Bacillus spp)，例如在地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)宿主细胞中表达。 
可选择的宿主细胞有，例如真菌、酵母或植物。 
已经发现与其它生物如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)相比，使用地衣芽孢杆菌宿主细胞可使脂质酰基转移酶的表达增加。 
分离的 
一方面，在本发明中使用的酶可以是分离的形式。 
术语“分离的(或分离)”是指序列或蛋白至少基本不包含至少一种其它成分，这些成分原本与所述序列或蛋白天然结合，并且原本在一起发现。 
纯化的 
一方面，在本发明中使用的酶可以是纯化的形式。 
术语“纯化的”是指序列处于相对纯的状态，如至少约51％纯、或至少约75％纯、或至少约80％纯、或至少约90％纯、或至少约95％纯、或至少约98％纯。 
克隆编码本发明多肽的核苷酸序列 
编码具有如本文所定义的特定性质的多肽或适合修饰的多肽的核苷酸序列可以从产生所述多肽的任何细胞或生物中分离得到。用于分离核苷酸序列的各种方法都是本领域熟知的。 
例如，可以使用产生所述多肽的生物的染色体DNA或信使RNA来构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果所述多肽的氨基酸序列是已知的，可以合成经标记的寡核苷酸探针，并将其用于从由该生物制备的基因组文库中鉴定编码多肽的克隆。或者，也可以使用包含与另一已知多肽基因同源的序列的经标记的寡核苷酸探针来鉴定编码多肽的克隆。在后一种情况下，使用严谨性较低的杂交和清洗条件。 
或者，可以通过如下方式鉴定编码多肽的克隆：将基因组DNA的片段插入到表达载体(如质粒)中，使用所得的基因组DNA文库来转化酶为阴性的细菌，并随后将所转化的细菌涂布在包含被所述多肽抑制的酶的琼脂上，由此可以鉴定出表达所述多肽的克隆。 
再者，也可以通过成熟的标准方法通过合成来制备编码所述多肽的核苷酸序列，如Beucage S.L.等(1981)Tetrahedron Letters 22，1859-1869页描述的亚磷酰胺法，或Matthes等(1984)EMBO J.3，801-805页描述的方法。在亚磷酰胺法中，在如自动DNA合成仪上合成寡核苷酸，然后将其纯化、退火、连接并克隆到适当的载体中。 
所述核苷酸序列可以是源自混合的基因组和合成来源、混合的合成和 cDNA来源、或混合的基因组和cDNA来源，其根据标准技术通过连接源自合成的、基因组的或cDNA来源的片段(根据需要)而制得。每个连接的片段对应于整个核苷酸序列的不同部分。所述DNA序列也可以使用特定引物通过聚合酶链式反应(PCR)来制备，如US 4,683,202或Saiki R K等(Science(1988)239，487-491页)中所述。 
核苷酸序列 
本发明还涵盖编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列。本文所用的术语“核苷酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列和其变体、同源物、片段和衍生物(如其部分)。所述核苷酸序列可以是源自基因组或合成或重组来源，其可以是双链的或单链的(无论其代表正义链还是反义链)。 
本发明的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成的DNA和RNA。优选地，其指DNA，更优选为编码序列的cDNA。 
在一种优选的实施方式中，编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列本身不涵盖存在于其天然环境中的天然核苷酸序列，此时该序列与同处于其天然环境中的其天然结合序列相连接。为了便于参考，我们将此优选实施方式称为“非天然核苷酸序列”。由此，术语“天然核苷酸序列”是指处于其天然环境中并与其天然结合的完整启动子(同处于其天然环境中)可操作地连接的完整核苷酸序列。因此，可以利用核苷酸序列在其天然生物中表达本发明的多肽，但是其中所述核苷酸序列不受所述生物中与其天然结合的启动子的控制。 
优选地，所述多肽不是天然多肽。由此，术语“天然多肽”是指处于其天然环境中并已经由其天然核苷酸序列表达的完整多肽。 
通常，使用重组DNA技术(即重组的DNA)制备编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列。然而，在本发明的另一种可选实施方式中，可以使用本领域公知的化学方法来合成全部或部分核苷酸序列(参见Caruthers MH等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23和Horn T等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。 
分子进化 
分离出编码酶的核苷酸序列或鉴定出编码推定酶的核苷酸序列后，可能需要对所选择的核苷酸序列进行修饰，例如可能需要对所述序列进行突变以制备本发明的酶。 
可以使用合成的寡核苷酸来引入突变。这些寡核苷酸包含目标突变位点侧翼的核苷酸序列。 
Morinaga等(Biotechnology(1984)2，646-649页)中公开了一种适合的方法。Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，147-151页)中描述了向编码酶的核苷酸序列中引入突变的另一种方法。 
替代如上文所述的定点诱变，可以随机引入突变，如使用商品试剂盒，如来自Stratagene的GeneMorph PCR诱变试剂盒，或来自Clontech的Diversify PCR随机诱变试剂盒。EP 0 583 265提到基于PCR的诱变的优化方法，其也可以结合使用DNA诱变类似物，如EP 0 866 796中所述的那些。易错PCR技术也适用于制备具有优选性质的脂质酰基转移酶变体。WO0206457提到了脂酶的分子进化。 
获得新型序列的第三种方法是使用任何数量的限制性酶或如DNA酶I(Dnase I)的酶将不同的核苷酸序列片段化，并重新组装成编码功能性蛋白的全长核苷酸序列。或者，可以使用一个或多个不同的核苷酸序列，并在重新组装全长核苷酸序列过程中引入突变。DNA改组(shuffling)和家族改组技术适用于制备具有优选性质的脂质酰基转移酶变体。适合进行“改组”的方法可以参见EP0 752 008、EP1 138 763、EP1 103 606。改组也可以与如US 6,180,406和WO 01/34835中所述的其它形式的DNA诱变相结合。 
因此，可在体内或体外在核苷酸序列中产生大量定点突变或随机突变，并随后通过多种手段筛选功能性得到改进的编码多肽。可以使用例如计算机分析(in silico)和核酸外切酶介导(exo-mediated)的重组方法(参见WO 00/58517、US 6,344,328、US 6,361,974)进行分子进化，其中所产生的变体保留了与已知酶或蛋白很低的同源性。由此获得的所述变体可与已知的转移酶具有显著的结构类似性，但却具有很低的氨基酸序列同源性。 
此外，如在非限制性实例中，多核苷酸序列的突变体或天然变体也可以与野生型或其它突变体或天然变体重组以产生新的变体。也可以筛选所述新的变体以获得功能性得到改进的编码多肽。 
应用以上以及类似的分子进化方法能够在没有关于蛋白结构或功能的任何现有知识的情况下鉴定和选择具有优选特性的本发明的酶变体，并能够产生不可预测的但有益的突变体或变体。在本领域中应用分子进化来优化或改变酶活性的实例有很多，所述实例包括但不限于以下的一种或多种：优化在宿主细胞中或体外的表达和/或活性、增加酶活性、改变底物和/或产物特异性、增加或降低酶稳定性或结构稳定性、改变在优选环境条件(如温度、pH、底物)中酶的活性/特异性。 
使用分子进化工具可以改变酶以提高该酶的功能性，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。 
适合地，用于本发明的编码脂肪分解酶和/或淀粉酶的核苷酸序列可以编码变体，即当与亲本酶比较时，所述脂肪分解酶和/或淀粉酶可以包含至少一个氨基酸的取代、缺失或添加。变体酶与亲本酶保持至少70％、80％、90％、95％、97％、99％的同源性。 
与亲本酶相比，所述脂肪分解酶变体可以对甘油三酯和/或甘油单酯和/或甘油二酯具有降低的活性。 
适合地，所述酶变体可以对甘油三酯、和/或甘油单酯和/或甘油二酯没有活性。 
或者，所述酶变体可以具有提高的热稳定性。 
所述酶变体可以对以下的一种或多种具有提高的活性：极性脂质、磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱、糖脂、二半乳糖基甘油单酯、单半乳糖基甘油单酯。 
脂质酰基转移酶变体是已知的，且一种或多种所述变体可以适用于本发明的方法和用途，和/或本发明的酶组合物中。仅举例来说，根据本发明可以使用以下文献中阐述的脂质酰基转移酶变体：Hilton和Buckley J Biol.Chem.1991 Jan 15：266(2)：997-1000；Robertson等J.Biol.Chem.1994 Jan 21；269(3)：2146-50；Brumlik等J.Bacteriol 1996 Apr；178(7)：2060-4；Peelman等Protein Sci.1998 Mar；7(3)：587-99。 
氨基酸序列 
本发明还涵盖由编码用于本发明任一方法和/或用途中的酶的核苷酸序列所编码的氨基酸序列的用途。 
本文所使用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白”同义。在一些情况中，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。 
所述氨基酸序列可以从适合的来源制备/分离，或其可以通过合成制备、或其可以使用重组DNA技术制备。 
适合地，所述氨基酸序列可以通过标准技术从本文教导的分离多肽获得。 
一种适合测定分离多肽的氨基酸序列的方法如下： 
可以将纯化的多肽冻干，并将100μg的冻干原料溶解于8M尿素和0.4M碳酸氢铵的50μl混合物(pH 8.4)中。在覆盖氮气并加入5μl 45mM二硫苏糖醇后，可以将溶解的蛋白在50℃变性并还原15分钟。冷却至室温后，可以加入5μl 100mM碘乙酰胺，从而使半胱氨酸残基在室温、避光和氮气下衍生化15分钟。 
可以向以上反应混合物中加入135μl水和含5μg内切蛋白酶Lys-C的5μl水溶液，并在37℃氮气保护下消化24小时。 
可以使用溶剂A(0.1％TFA的水溶液)和溶剂B(0.1％TFA的乙腈溶液)在VYDAC C18柱(0.46×15cm；10μm；The Separation Group，California，USA)上通过反相HPLC分离所得到的肽。在N-末端测序前，可以使用相同的溶剂体系在Develosil C18柱上对所选择的肽进行重新层析。可以使用Applied Biosystems 476A测序仪，根据生产商的说明书(Applied Biosystems，California，USA)使用脉冲液体快速循环来完成测序。 
序列同一性或序列同源性 
本文中的术语“同源物”是指与目标氨基酸序列和目标核苷酸序列具有一定同源性的实体。本文中的术语“同源性”可以等同于“同一性”。 
所述同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应提供和/或编码保留所述酶的功能活性和/或增强所述酶的活性的多肽。 
在本文中，认为同源序列包括可以与目标序列有至少50％、55％、60％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、80％、85％、90％、95％或98％同一性，优选为至少95％或98％同一性的氨基酸序列。通常，同源物将包含与目标氨基酸序列相同的活性位点等。虽然同源性也可以被视为相似性(即氨基酸残基具有相似的化学性质/功能)，但是在本发明的内容中，优选地同源性表示序 列的同一性。 
在本文中，认为同源序列包括可以与编码本发明多肽的核苷酸序列(目标序列)有至少75％、85％或90％同一性的核苷酸序列，优选为至少95％或98％同一性的核苷酸序列。通常，同源物将包括编码与目标序列活性位点等相同的序列。虽然同源性也可以被视为相似性(即氨基酸残基具有相似的化学性质/功能)，但是在本发明的内容中，优选地同源性表示序列的同一性。 
可以通过目测进行同源性比较，或者更通常是借助易于获得的序列比较程序进行同源性比较。这些商业性计算机程序可以计算两个或多个序列间的同源性％。 
可以在连续的序列中计算同源性％，即一个序列与另一个序列比对，且将一个序列中的每个氨基酸与另一个序列中的相应氨基酸直接比较，每次比较一个残基。这被称为“无缺口”比对。通常所述无缺口比对仅在数量相对少的残基中进行。 
虽然这是非常简单且稳定的方法，但是其未能考虑到如下情况：例如，在其它方面相同的成对序列中，一个插入或缺失将引起随后的氨基酸残基无法比对，因此可能导致在进行整体比对时的同源性％大大降低。因此，大部分序列比对方法被设计成产生考虑了可能的插入和缺失而不过度地惩罚整体同源性得分的最佳比对。这可以通过在序列比对中插入“缺口”以试图使局部同源性最大化而实现。 
然而，这些更加复杂的方法给比对中出现的每个缺口赋予“缺口罚分”，使得对于相同数目的相同氨基酸，具有尽量少缺口的序列比对(反映了两个比较的序列间更高的相关性)将比具有许多缺口的序列比对获得更高的得分。通常使用“仿射缺口罚分”(Affine gap cost)，即对缺口的存在处以较高罚分，而对缺口中的每个后续残基处以较小罚分。这是最常用的缺口评分系统。高缺口罚分将无疑产生具有更少缺口的优化比对。大多数比对程序允许修正缺口罚分。然而，当使用所述软件进行序列比较时，优选使用默认值。 
因此，最大同源性％的计算首先需要在考虑缺口罚分下产生最佳的比对。适合用于进行所述比对的计算机程序为Vector NTI(Invitrogen Corp.)。可以进行序列比较的其它软件的实例包括但不限于BLAST软件包(参见Ausubel等1999 Short Protocols in Molecular Biology，第4版，第18章)和FASTA (Altschul等1990 J.Mol.Biol.403-410)。BLAST和FASTA均可进行离线和在线搜索(参见Ausubel等1999，7-58页至7-60页)。然而，对于一些应用，优选使用Vector NTI程序。也可以将称为BLAST 2 Sequences的新型工具用于比较蛋白和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett 1999174(2)：247-50；FEMS Microbiol Lett 1999177(1)：187-8和tatianancbi.nlm.nih.gov)。 
虽然可以根据同一性来测定最终的同源性％，但是比对方法本身通常不是基于全是或全非的成对比较。作为代替，通常使用尺度相似性评分矩阵(scaled similarity score matrix)，基于化学相似性或进化距离对各成对比较评分。通常所用的此矩阵的实例为BLOSUM62矩阵(BLAST程序套装的默认矩阵)。Vector NTI程序通常使用公开的默认值，或者也可能使用所提供的自定义符号比较表(详见用户手册)。对于一些应用，优选使用Vector NTI软件包的默认值。 
或者，也可以使用基于与CLUSTAL(Higgins DG和Sharp PM(1988)，Gene 73(1)，237-244)类似的算法的Vector NTI(Invitrogen Corp.)中的多重比对特征来计算同源性％。 
一旦软件生成了最佳比对，就可以计算同源性％，优选为序列同一性％。软件通常将其作为序列比较的一部分来执行，并生成数值结果。 
如果在测定序列同一性时使用缺口罚分，则优选使用以下参数进行成对比对： 
  BLAST  
  缺口开口   0
  缺口延伸   0
  CLUSTAL   DNA   蛋白  
  字长(WORD SIZE)   2   1   K三联体
  缺口罚分   15   10  
  缺口延伸   6.66   0.1  
在一种实施方式中，优选使用具有以上定义的缺口罚分和缺口延伸设定的CLUSTAL来测定核苷酸序列的序列同一性。 
适合地，在至少20个连续的核苷酸中、优选在至少30个连续的核苷酸 中、优选在至少40个连续的核苷酸中、优选在至少50个连续的核苷酸中、优选在至少60个连续的核苷酸中、优选在至少100连续的核苷酸中测定核苷酸序列的同一性程度。 
适合地，在全序列中测定核苷酸序列的同一性程度。 
在一种实施方式中，本发明氨基酸序列的同一性程度可以通过本领域已知的计算机程序的方法，如Vector NTI 10(Invitrogen Corp.)来适当地测定。对于成对比对，所用的矩阵优选为缺口开口罚分为10.0且缺口延伸罚分为0.1的BLOSUM62。 
适合地，在至少20个连续的氨基酸中、优选在至少30个连续的氨基酸中、优选在至少40个连续的氨基酸中、优选在至少50个连续的氨基酸中、优选在至少60个连续的氨基酸中测定氨基酸序列的同一性程度。 
适合地，在全序列中测定氨基酸序列的同一性程度。 
所述序列也可以具有产生沉默改变和产生功能等价物的氨基酸残基的缺失、插入或取代。可以根据残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质上的相似性来进行谨慎的氨基酸取代，只要该物质的二级结合活性被保持即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不带电荷的极性头基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。 
例如可以根据下表进行保守取代。在第二列中相同栏中的氨基酸，优选在第三列中相同行中的氨基酸可以相互取代： 
本发明还涵盖可以发生的同源取代(本文所用的取代和替换均指现存氨基酸残基与可选残基的互换)，即相似取代，如碱性氨基酸取代碱性氨基酸、 酸性氨基酸取代酸性氨基酸、极性氨基酸取代极性氨基酸等。也可以发生非同源取代，即从一类残基变成另一类残基，或涉及非天然氨基酸，如鸟氨酸(下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯甘氨酸。 
也可以使用非天然氨基酸进行替换。 
氨基酸变体序列可以包含可以在序列的任何两个氨基酸残基间插入的适合的间隔子基团，除氨基酸间隔子(如甘氨酸或β-丙氨酸残基)外，还包括烷基基团(如甲基、乙基或丙基基团)。本领域的技术人员可充分理解其它形式的变异，其涉及以类肽(peptoid)形式存在一个或多个氨基酸残基。为了避免争议，“类肽形式”用来指α-碳取代基基团在残基的氮原子上而非在α-碳上的氨基酸残基变体。制备类肽形式的肽的方法是本领域内已知的，如Simon RJ等，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和Horwell DC，Trends Biotechnol.(1995)13(4)，132-134。 
本发明所使用的或编码具有本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列可以在其内部包含合成的或修饰的核苷酸。本领域中已知对寡核苷酸的许多不同类型的修饰。这些修饰包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯骨架和/或在分子的3’末端和/或5’末端添加吖啶或多赖氨酸链。出于本发明的目的，应该理解可以用本领域中可用的任何方法来修饰本文所述的核苷酸序列。可以进行所述修饰以增强核苷酸序列的体内活性或寿命。 
本发明还涵盖与本文所讨论的序列或其任何衍生物、片段或衍生物互补的核苷酸序列的应用。如果序列与其片段互补，此序列可以被用作探针以鉴定其它生物等中相似的编码序列。 
可以以多种方式获得与本发明的序列并非100％同源但却落入本发明范围中的多核苷酸。可以通过例如探测由一系列个体(如来自不同种群的个体)制备的DNA文库来获得本文所述序列的其它变体。此外，可以获得其它病毒/细菌或细胞同源物，特别是存在于哺乳动物细胞(如大鼠、小鼠、牛和灵长类细胞)中的细胞同源物，且所述同源物或其片段将通常能够选择性地与本文序列表中所示的序列杂交。可以通过探测从其它动物物种制备的cDNA文库或基因组DNA文库，并在中度至高度严谨条件下使用包含所附序列表中任何一个序列的全部或部分序列的探针探测所述文库来获得所述序列。类似 的考虑用于获得本发明多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变体。 
也可以使用简并PCR来获得变体和株系/物种同源物，所述简并PCR将使用被设计为靶向变体和同源物中编码本发明序列中的保守氨基酸序列的序列的引物。例如可以通过比对来自多个变体/同源物的氨基酸序列来预测保守序列。可以使用本领域已知的计算机软件进行序列比对。例如广泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。 
简并PCR中所用的引物可包含一个或多个简并位点，且其使用条件的严谨性可低于使用针对已知序列的单一序列引物克隆序列所用的那些条件。 
或者，也可以通过已表征的序列的定点诱变来获得所述多核苷酸。例如当需要沉默密码序列的改变，从而为表达多核苷酸序列的特定宿主细胞优化密码子偏爱性时，这可能是有用的。可能需要其它序列改变，以引入限制性多肽识别位点，或改变由多核苷酸编码的多肽的性质或功能。 
可以使用本发明的多核苷酸(核苷酸序列)来制备引物(如PCR引物，用于可选扩增反应的引物)、探针(如使用放射性或非放射性标记物通过常规方法用显色标记物标记的探针)；或可以将多核苷酸克隆到载体中。所述引物、探针和其它片段的长度可以是至少15个、优选至少20个、如至少25个、30个或40个核苷酸，且其也涵盖在本文所用的术语“多核苷酸”之内。 
可以重组、合成或通过本领域技术人员可利用的任何方法来制备根据本发明的多核苷酸(如DNA多核苷酸)和探针。它们也可以通过标准技术进行克隆。 
通常，可通过合成方法来制备引物，该方法包括以每次一个核苷酸的方式逐步制备所需要的核酸序列。本领域中易于获得使用自动化技术来实现上述方法的技术。 
通常使用重组方法，如使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术来制备较长的多核苷酸。这包括制备位于所需要克隆的脂质靶向序列区域侧翼的一对引物(如约15至30个核苷酸)，使引物接触从动物或人细胞获得的mRNA或cDNA，在可以使所需区域扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的片段(如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)，并回收扩增的DNA。可以将引物设计成使其包含适合的限制性酶识别位点，以便可以将扩增的DNA克隆到适合的克隆载体中。 
杂交 
本发明还涵盖与本发明的序列互补的序列或能够与本发明的序列杂交或与其互补序列杂交的序列的应用。 
本文所用的术语“杂交”包括“一条核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程”，以及在聚合酶链式反应(PCR)技术中进行扩增的过程。 
本发明还涵盖这样的核苷酸序列的应用：即，所述核苷酸序列能够和与本文所讨论的目标序列、或其任何衍生物、片段或衍生物互补的序列杂交。 
本发明还涵盖能够与本文所讨论的核苷酸序列杂交的序列的互补序列。 
杂交条件基于核苷酸结合复合物的解链温度(Tm)，如Berger和Kimmel (1987，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology，第152卷，Academic Press，San Diego CA)中所教导，且给出了如下文所解释的定义的“严谨性”。 
最高严谨性通常在约(Tm-5)℃(比探针的Tm低5℃)；高严谨性比Tm低约5℃至10℃；中等严谨性比Tm低约10℃至20℃；且低严谨性比Tm低约20℃至25℃。本领域技术人员应理解，最高严谨性杂交可以用于鉴定或检测相同的核苷酸序列，而中等(或低)严谨性杂交可以用于鉴定或检测相似或相关的多核苷酸序列。 
优选地，本发明涵盖能够在高严谨性条件或中等严谨性条件下与编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列杂交的序列的互补序列的应用。 
更优选地，本发明涵盖能够在高严谨性条件(如65℃和0.1×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠，pH 7.0})下与编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列发生杂交的序列的互补序列的应用。 
本发明还涉及能够与本文讨论的核苷酸序列(包括本文讨论的那些序列的互补序列)杂交的核苷酸序列的应用。 
本发明还涉及能够与本文讨论的核苷酸序列(包括本文讨论的那些序列的互补序列)杂交的序列的互补核苷酸序列的应用。 
本发明的范围还包括能够在中等至最高严谨性条件下与本文所讨论的核苷酸序列杂交的多核苷酸序列的应用。 
在优选的方面，本发明涵盖能够在严谨性条件(如50℃和0.2×SSC)下与本文所讨论的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的应用。 
在更优选的方面，本发明涵盖能够在高严谨性条件(如65℃和0.1×SSC)下与本文所讨论的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列的应用。 
多肽的表达 
可以将用于本发明的核苷酸序列或用于编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列引入重组的复制型载体中。所述载体可以用于在相容的宿主细胞中和/或从相容的宿主细胞复制并以多肽形式表达所述核苷酸序列。可以使用调控序列来调控表达，所述调控序列包括含启动子/增强子和其它表达调控信号。可以使用原核生物的启动子和在真核细胞中有功能的启动子。可以使用组织特异性或刺激特异性启动子。也可以使用包含来自上述两个或更多不同启动子的序列元件的嵌合启动子。 
根据所用的序列和/或载体，通过由宿主重组细胞表达核苷酸序列而产生的多肽可以被分泌，或被包含在细胞内。编码序列经设计可以具有信号序列，该信号序列指导编码序列物质通过特定的原核生物或真核细胞膜分泌。 
构建体 
术语“构建体”，与术语如“轭合物(或连接物)”、“盒(cassette)”和“杂合体(hybrid)”同义，其包含依照本发明使用的编码具有本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列，且其直接或间接地与启动子连接。间接连接的实例是在启动子和本发明的核苷酸序列之间提供适合的间隔子基团，如内含子序列，如Sh1内含子或ADH内含子。本发明中的相关术语“融合”也是如此，其包括直接或间接连接。在一些情况中，这些术语不涵盖编码所述蛋白的核苷酸序列与其通常连接的野生型基因启动子的天然组合(此时这两者均处于其天然环境中)。 
所述构建体甚至可以包含或表达允许选择基因构建体的标记物。 
对于一些应用，优选构建体至少包含本发明的核苷酸序列，或编码具有如本文定义的特定性质的多肽且可操作地与启动子连接的核苷酸序列。 
生物 
与本发明有关的术语“生物”包括可包含本发明的核苷酸序列或编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物的任何生物。 
与本发明有关的术语“转基因生物”包括任何包含编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物的生物，和/或其中启动子能够允许编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列在所述生物内表达。优选地，所述核苷酸序列被引入到生物的基因组中。 
术语“转基因生物”不涵盖在处于自身天然环境中并同时受到其同处于自身天然环境中的天然启动子控制的天然核苷酸编码序列。 
因此，本发明的转基因生物包括包含以下任何一种或组合的生物：编码具有如本文定义的特定性质的多肽的核苷酸序列、本文定义的构建体、本文定义的载体、本文定义的质粒、本文定义的细胞或它们的产物。例如，所述转基因生物还可以包含编码具有如本文定义的特定性质的多肽且受到启动子控制的核苷酸序列，其中所述启动子原本并不与脂质酰基转移酶编码序列相连。 
宿主细胞/生物的转化 
所述宿主生物可以是原核或真核生物。 
合适的原核宿主的实例包括细菌，例如大肠杆菌(E.coli)和地衣芽孢杆菌，优选地衣芽孢杆菌。 
原核宿主的转化的教导在本领域中有详细的记载，例如参见Sambrook等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press)。如果使用原核宿主，则在转化前需要适当地修饰核苷酸序列，例如去除内含子。 
在另一种实施方式中，所述转基因生物可以为酵母。 
可以利用本领域已知的多种方法转化丝状真菌细胞，例如包括原生质体形成和原生质体转化，然后以已知的方式重建细胞壁的方法。在EP 0 238 023中公开了曲霉(Aspergillus)作为宿主微生物的应用。 
另一种宿主生物可以为植物。用于转化植物的常用技术的概述可见于 Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42：205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)的文章。关于植物转化的其它教导可见于EP-A-0449375。 
以下部分为关于真菌、酵母和植物转化的一般教导。 
转化的真菌 
宿主生物可以为真菌，例如丝状真菌。此类宿主的合适实例包括属于嗜热菌属(Thermomyces)、枝项孢属(Acremonium)、曲霉属、青霉属(Penicillium)、毛霉菌属(Mucor)、脉孢菌属(Neurospora)和木霉属(Trichoderma)等的任何成员。 
关于转化丝状真菌教导的概述见于US-A-5741665，其中声称用于丝状真菌转化以及真菌培养的标准技术是本领域所熟知的。应用于链孢霉(N.crassa)的技术的研究进展见于，例如Davis和de Serres，Methods Enzymol(1971)17A：79-143。 
关于转化丝状真菌的进一步教导的概述见于US-A-5674707。 
一方面，所述宿主生物可以为曲霉属，例如黑曲霉。 
本发明的转基因曲霉属还可以通过以下制备，例如Turner G.1994(Vectors for genetic manipulation.In：Martinelli S.D.，Kinghorn J.R.(Editors)Aspergillus：50 years on.Progress in industrial microbiology，第29卷.Elsevier Amsterdam 1994.641-666页)的教导。 
丝状真菌的基因表达的综述见于Punt等(2002)Trends Biotechnol 2002 May；20(5)：200-6，Archer和Peberdy Crit Rev Biotechnol(1997)17(4)：273-306。 
转化的酵母 
在另一种实施方式中，所述转基因生物可以为酵母。 
酵母中异源基因表达的原则的综述见于，例如Methods Mol Biol(1995)，49：341-54，和Curr Opin Biotechnol(1997)Oct；8(5)：554-60。 
在这一点上，酵母，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisi)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(参见FEMS Microbiol Rev(2000 24(1)：45-66)可用作异源基因表达的载体。 
在酿酒酵母中的异源基因表达和基因产物的分泌的原则的综述见于E Hinchcliffe E Kenny(1993，″Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes″，Yeasts，第5卷，Anthony H Rose和J Stuart Harrison编辑，第2版，Academic Press Ltd.)。 
对于酵母的转化，已经开发出了多个转化方法。例如，本发明的转基因酵母可以根据以下教导制备：Hinnen等(1978，Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75，1929)；Beggs，J D(1978，Nature，London，275，104)；和Ito，H等(1983，J Bacteriology 153，163-168)。 
可以利用各种筛选标记物筛选转化的酵母细胞，例如营养缺陷型标记物、显性抗生素抗性标记物。 
合适的酵母宿主生物可以选自在生物技术上相关的酵母种，例如但不限于选自毕赤酵母(Pichia spp.)、汉逊酵母(Hansenula spp.)、克鲁维酵母(Kluyveromyces spp.)、耶氏酵母(Yarrowinia spp.)、酵母菌(包括酿酒酵母)或裂殖酵母菌(包括粟酒裂殖酵母)的酵母种。 
甲醇营养型酵母种的菌株巴斯德毕赤酵母可以用作宿主生物。 
在一种实施方式中，所述宿主生物可以为汉逊酵母种，例如多形汉逊酵母(H.polymorpha)(如WO01/39544中的阐述)。 
转化的植物/植物细胞 
适合用于本发明的宿主生物可以为植物。常用技术的综述可见于以下文献：Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42：205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)，或者WO 01/16308。转基因植物可以产生例如水平提高的植物固醇酯和植物甾烷醇酯。 
因此，本发明还涉及一种产生具有增强水平的植物固醇酯和植物甾烷醇酯的转基因植物的方法，其包括以下步骤：利用本文定义的脂质酰基转移酶(尤其是利用包含本文定义的脂质酰基转移酶的表达载体或构建体)转化植物细胞，和由所转化的植物细胞培养出植物。 
分泌 
通常，期望表达宿主将多肽分泌到培养基中，由此可以更容易地回收酶。 根据本发明，可以基于所需的表达宿主来选择分泌前导序列。本发明中也可以使用杂合信号序列。 
原本不与编码脂质酰基转移酶的核苷酸序列连接的分泌前导序列的典型实例为那些源于真菌淀粉葡萄糖苷酶(AG)基因(glaA-18个氨基酸和24个氨基酸两种形式，如来自曲霉菌属)、a-因子基因(酵母，如酵母属、克鲁维酵母和汉逊酵母)或α-淀粉酶基因(芽孢杆菌)的序列。 
检测 
本领域已知多种用于检测和测定氨基酸序列表达的操作方法。其实例包括酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)和荧光活化的细胞分选(FACS)。 
本领域技术人员已知多种标记物和轭合技术，并可以将其用于各种核酸和氨基酸分析。 
许多公司如Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)、Promega(Madison，WI)和US Biochemical Corp(Cleveland，OH)为这些方法提供商业试剂盒和操作说明。 
适合的报告分子或标记物包括那些放射性核素、酶、荧光剂、化学发光剂或显色剂，以及底物、辅助因子、抑制剂和磁性粒子等。教导这些标记物应用的专利包括US-A-3,817,837、US-A-3,850,752、US-A-3,939,350、US-A-3,996,345、US-A-4,277,437、US-A-4,275,149和US-A-4,366,241。 
此外，可以如US-A-4,816,567中所示制备重组免疫球蛋白。 
融合蛋白 
用于本发明的酶可以作为融合蛋白制备，例如以便有助于其提取和纯化。融合蛋白配偶体(partner)的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6×His、GAL4(DNA结合和/或转录激活结构域)和β-半乳糖苷酶。也可以方便地在融合蛋白配偶体和目的蛋白序列之间包含蛋白水解切割位点以去除融合蛋白序列。优选地，融合蛋白将不会妨碍蛋白序列的活性。 
Curr.Opin.Biotechnol.(1995)6(5)：501-6已经对大肠杆菌中的基因融合表达系统进行了综述。 
具有如本文定义的特定性质的多肽的氨基酸序列可以与非天然序列连接以编码融合蛋白。例如，对于为获得能够影响物质活性的试剂而进行的肽库筛选，其可用于编码表达可被商购抗体所识别的非天然表位的嵌合物。 
其他目标蛋白(POI) 
用于本发明的序列还可以与一种或多种其他POI或目标核苷酸序列(NOI)结合使用。 
POI的非限制性实例包括：参与淀粉代谢的蛋白或酶，参与糖原代谢的蛋白或酶、乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶(arabinase)、阿拉伯糖呋喃糖苷酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、表异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲基酯酶、果胶分解酶(pectinolytic enzyme)、过氧化物酶、酚氧化酶、肌醇六磷酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李半乳糖醛酸酶(rhamno-galacturonase)、核糖核酸酶、甜蛋白(thaumatin)、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶(D-己糖：O2-氧化还原酶，EC 1.1.3.5)或它们的组合。而NOI可以是这些序列中任一序列的反义序列。 
POI也可以是融合蛋白以例如有助于提取和纯化。 
POI还可以与分泌序列融合。 
其他序列也可以促进分泌或提高分泌POI的产量。此类序列可编码伴侣蛋白，例如英国专利申请9821198.0中所述黑曲霉cyp B基因的产物。 
可出于多种原因而将NOI工程化以改变其活性，包括但不限于改进其表达产物的加工和/或表达的改变。其他实例例如，还可修饰NOI以优化在具体宿主细胞中的表达。还需要其他序列变化以引入限制性酶的识别位点。 
NOI还可在其中包含合成或修饰的核苷酸，例如膦酸甲酯和硫代磷酸酯骨架。 
可修饰NOI以提高细胞内稳定性和半衰期。可能的修饰包括，但不限于添加分子5′和/或3′末端的侧翼序列，或在分子骨架内使用硫代磷酸酯或2′O-甲基而非磷酸二酯酶键。
食品 
本发明的组合物可用作食品，或用于制备食品。本文使用的术语“食品”具有宽泛意义--并涵盖人的食品以及动物的食品(即饲料)。在优选的方面中，所述食品供人食用。 
所述食品可为溶液或固体形式，这取决于用途和/或应用的方式和/或施用的方式。 
当本发明的组合物用作食品或用于制备食品时，例如用作功能性食品或用于制备功能性食品时，其可以与下述中的一种或多种组合使用：在营养上可接受的载体、在营养上可接受的稀释剂、在营养上可接受的赋形剂、在营养上可接受的佐剂、有营养活性的成分。 
食品成分 
本发明的组合物可用作食品成分。 
本文使用的术语“食品成分”包括作为功能性食品或食物的制剂，或者可作为营养补充剂和/或纤维补充剂而添加到功能性食品或食物中的制剂。本文使用的术语“食品成分”还指能够低水平地用于需要凝胶化、质构化、稳定化、悬浮、成膜和结构化、保持汁液性并改进口感而不提高粘度的各种产品中的制剂。 
所述食品成分可为溶液或固体形式，这依赖于用途和/或应用的方式和/或施用的方式。 
下文将仅以例示的方式参考以下附图和实施例描述本发明。 
图1：显示烘焙2小时后的初始硬度，其中1：Lipopan F；2：GRINDAMYL POWERBAKE 4070；3：脂酶3(SEQ ID No.3)；4：Exel 16和5：YieldMax。所使用的麦芽糖淀粉酶是NovamylTM，非产麦芽糖的淀粉酶是G4(SEQ ID No.1)； 
图2：使用以下来烘焙面包2小时后的硬度变化，其中1：无酶；2：非产麦芽糖的淀粉酶G4(SEQ ID No.1)；3：非产麦芽糖的淀粉酶G4(SEQ ID No.1)和脂肪分解酶(SEQ ID No.9)和4：脂肪分解酶(SEQ ID No.9)； 
图3：使用以下来烘焙面包2小时后的硬度变化，其中1：无酶；5：非产麦芽糖的淀粉酶G4(SEQ ID No.1)和脂肪分解酶(SEQ ID No.9)和脂肪分解酶(Grindamyl EXEL 16)，和6：脂肪分解酶(Grindamyl EXEL 16)； 
图4：使用以下来烘焙面包2小时后的硬度变化，其中1：无酶；和2：Lipopan F； 
图5：使用以下来烘焙面包2小时后的硬度变化，其中1：无酶；和3：脂酶3(SEQ ID No.3)； 
图6：使用以下来烘焙面包2小时后的硬度变化，其中1：无酶；和4：Grindamyl EXEL 16； 
图7：使用以下来烘焙面包2小时后的硬度变化，其中1：无酶；和5：Yieldmax； 
图8：显示用于本发明的非产麦芽糖的淀粉酶的氨基酸序列-SEQ ID No.1； 
图9a：显示用于本发明的脂肪分解酶的氨基酸序列-SEQ ID No.2； 
图9b：显示用于本发明的脂肪分解酶的氨基酸序列，GRINDAMYL POWERbake 4070-SEQ ID No.9； 
图10：显示用于本发明的脂肪分解酶的氨基酸序列，脂酶3-SEQ ID No.3； 
图11：显示SEQ ID NO.4，Lipopan F(也描述于WO 98/26057的SEQ ID 2中)；WO 98/26057通过引用并入本文。 
图12：显示SEQ ID NO.5，Lipopan H(也描述于US5869438的SEQ ID2中)；US5869438通过引用并入本文。 
图13：显示SEQ ID NO.6，来自杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的脂质酰基转移酶变体的氨基酸序列(也描述于WO09/024736的SEQ ID 90中)。WO09/024736通过引用并入本文。 
图14：显示了pMS382的成熟蛋白序列SEQ ID 7，(也描述于申请EP 09160655.8的SEQ ID NO 1中)。EP 09160655.8通过引用并入本文。 
图15：显示了pMS382的核苷酸序列SEQ ID 8，(也描述于申请EP  09160655.8的SEQ ID NO 52中)。 
实施例1-烘焙试验 
成分 
称作“改良面粉(Reform flour)”的丹麦DK2007-00113标准改良小麦面粉 
干酵母1.5％ 
盐1.5％ 
砂糖250-400 1.5％ 
起酥油1.0％ 
水59％ 
丙酸钙0.3％ 
抗坏血酸10ppm。 
标准吐司面包 
软化方法 
配方： 
  成分   ％   g
  小麦面粉   100   2000
  干酵母   1.5   30
  盐   1.5   30
  糖   1.5   30
  VEGAO 73-02NT(AU)(起酥油)   1   20
  水   59％  
  *丙酸钙   0.3   6
使用α淀粉酶混合物和抗坏血酸优化。 
*如果需要多于7天后的软化测量，则使用丙酸钙。 
酶
GRINDAMYLTM A1000-在所有试验中使用80ppm的配制产品，对应于在面团中约4.1mg/kg的酶浓度(面团中4.1ppm的酶)。 
GRINDAMYLTM H 121-在所有试验中使用150ppm的配制木聚糖酶产 品，对应于0.15g配制H121/kg。这是0.20mg木聚糖酶蛋白/kg面粉的剂量(面团中0.2ppm的酶)。 
Novamyl 1500TM-在试验中使用300ppm的配制产品，对应于在面团中约1.5mg/kg的酶浓度(面团中1.5ppm的酶)。 
GR1NDAMYLTM MAX-LIFE U4-在一些试验中作为其他酶以50ppm的剂量使用。这是抗老化酶的实例。 
GR1NDAMYLTM EXEL 16-在一些试验中使用250ppm的配制产品。剂量为1.03mg/kg面粉(面团中1ppm的酶)。 
YieldMaxTM(No.3461)-在一些试验中使用860ppm的配制产品。剂量为面团中2-5ppm的酶蛋白。 
Lipopan F(SEQ ID No.4)-在一些试验中以100ppm配制产品的剂量使用。 
脂酶3(SEQ ID No.3)-在一些试验中以100ppm配制产品的剂量使用。 
在一些试验中，以163ppm配制产品和面团中约1ppm酶蛋白的剂量使用EDS 218。 
在一些试验中以600ppm配制产品的剂量使用GRINDAMYL Captive POWERfresh。 
来自杀鲑气单胞菌的脂质酰基转移酶变体如SEQ ID NO.6所示。 
以上每种酶均可以以约10ppm在面团中使用。 
方法 
1)使用DIOSNA搅拌器SP 12-4/FU将所有成分和适合的酶缓慢混合1分钟，并添加水； 
2)低速混合2分钟，高速混合5.5分钟(“DK吐司”程序)； 
3)面团温度必须为约24-25℃； 
4)将面团在30℃的烤炉中静置10分钟； 
5)称量4块750g的面团； 
6)将面团块在室温下静置5分钟； 
7)在Glimek烘焙系统滚筒BM1上成形；1∶4-2∶4-3∶14-4∶12-宽度∶10外侧(width∶10outside)； 
8)将面团块放置在DK吐司罐中-3份用盖密封，1份保持开放以测量体积； 
9)面团的醒发：在使用丙酸钙时，在33℃，85％相对湿度下进行60分钟，或者不使用丙酸钙，在33℃，85％相对湿度下进行50分钟； 
10)在220℃下烘焙30分钟并蒸12秒，在20分钟后打开节气闸(Miwe程序2)； 
11)烘焙后将面包从罐中取出； 
12)在称重和测量体积前，将面包在室温下冷却70分钟； 
可在烘焙后2小时、1天、6天和11天，使用下文所述的面包质地剖面分析法(Texture Profile Analysis of Bread)测量硬度。 
面包质地剖面分析法 
可使用来自英国Stable Micro Systems的质地分析仪，通过质地剖面分析法分析面包片来测定面包的硬度、粘结性和弹力。所使用的探头为铝制，直径为50mm。 
将面包切成厚12.5mm的薄片。从所述薄片切割出直径45mm的圆片，并分别进行测量。还可任选地测量每一片的重量以测定面包心的硬度/克。 
使用以下设置： 
测试前速度：2mm/s 
测试速度：2mm/s 
测试后速度：10mm/s 
断裂测试距离：1％ 
距离：40％ 
力量：0.098N 
时间：5.00秒 
计数：5 
测力仪：5kg 
激发类型：自动-0.01N 
将面包片压缩40％所需的压力(百帕，HPa)的计算为：力(牛顿，N)除以探头的直径(毫米，mm)。 
通过由将面包片压缩40％所需的压力除以面包的克数确定面包的硬度(百帕/克，HPa/g)。 
结果 
图1显示了烘焙2小时后的结果。可见，脂肪分解酶与淀粉酶(特别是非产麦芽糖的淀粉酶)的组合使用提高了面包的初始硬度。 
图2和图3显示自初始硬度起的硬度增加(即，烘焙后2小时后的硬度增加)。 
可见，与其中没有添加淀粉酶(SEQ ID No.1所示的非产麦芽糖的淀粉酶)和/或脂肪分解酶的对照酶相比，此淀粉酶与脂肪分解酶的组合减少了硬度随时间的增加。 
图4-7显示初始硬度的增加和其后的硬度降低(即，面包耐码垛性的改进)二者均与淀粉酶(SEQ ID No.1所示的非产麦芽糖的淀粉酶)与脂肪分解酶(分别为Lipopan F、脂酶3(SEQ ID No.3)、Grindamyl EXEL 16和Yieldmax)的组合应用相关。 
以上说明书中提到的所有公开文献均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明所述各方法和系统的各种改变和变体对本领域技术人员而言都是显而易见的。尽管已联系具体优选实施方式描述本发明，但应理解，本发明的保护范围绝不应仅限于这些具体实施方式。实际上，对生物化学和生物技术或相关领域技术人员而言显而易见的实施本发明所述方式的各种改进都落入以下权利要求书的范围之内。 

Claims (13)

1.淀粉酶和脂肪分解酶的组合在改进面包耐码垛性中的用途，其中，所述改进面包耐码垛性是指与没有添加淀粉酶和/或脂肪分解酶的对照面包相比，烘焙后的初始硬度提高且其后硬度随时间减小；其中，所述初始硬度是指烘焙后2小时的硬度；且其中，所述硬度随时间减小是指从烘焙后2小时至烘焙后至少4天期间硬度的相对增加小于没有添加脂肪分解酶和/或淀粉酶的对照面包。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述淀粉酶是非产麦芽糖的淀粉酶。
3.如权利要求1或权利要求2所述的用途，其中所述淀粉酶由SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列组成。
4.如权利要求1或权利要求2所述的用途，其中所述脂肪分解酶具有选自以下的一种或多种活性：磷脂酶活性、糖脂酶活性、三酰甘油水解活性、脂质酰基转移酶活性及它们的任意组合。
5.如权利要求1或权利要求2所述的用途，其中所述脂肪分解酶由一个或多个以下氨基酸序列组成：
a)SEQ ID No.2或SEQ ID No.9所示的氨基酸序列；
b)SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；
c)SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；或
d)SEQ ID No.5所示的氨基酸序列。
6.如权利要求1或权利要求2所述的用途，其中存在其他的酶，其中，所述其他的酶是木聚糖酶。
7.如权利要求1或权利要求2所述的用途，其中存在抗老化淀粉酶。
8.一种通过制备面团改进面包耐码垛性的方法，其由下述步骤组成：
a)添加SEQ ID No.1所示的淀粉酶至在面团中10ppm的量；和
b)添加脂肪分解酶至在面团中10ppm的量。
9.如权利要求8所述的方法，其中所使用的脂肪分解酶的量是在面团中0.2至2ppm。
10.一种面团，其由下述物质组成：
a)SEQ ID No.1所示的淀粉酶；和
b)脂肪分解酶，其中所述淀粉酶和脂肪分解酶的量分别达到在面团中10ppm，
其中用所述面团制备的面包具有改进的耐码垛性。
11.一种烘焙产品，其通过烘焙权利要求10所述的面团而制备。
12.通过烘焙权利要求8-10中任一项所述的面团而制备的面包，其具有：
a)至少7HPa/g的初始硬度；
b)自烘焙后2小时起的硬度变化：
i.在4天后小于或等于12HPa/g；和/或
ii.在6天后小于或等于15HPa/g；和/或
iii.在11天后小于或等于20HPa/g。
13.通过烘焙权利要求8-10中任一项所述的面团而制备的面包，其具有：
a)至少7HPa/g的初始硬度；
b)自烘焙后2小时起的硬度变化：
i.在4天后小于或等于所述初始硬度的1.7倍；和/或
ii.在6天后小于或等于所述初始硬度的2.1倍；和/或
iii.在11天后小于或等于所述初始硬度的2.9倍。
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