JP2008544751A - Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａ由来の修飾アミラーゼ - Google Patents

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アンジャ ヘミンゲン ケレット−スミス，
カルステン マティアス クラ，
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アンドリュー ショー，
ボー スパング ソーレンセン，
シャーロット レフダル ソーダル，
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    • C12N9/2428—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase

Abstract

本発明者らは、配列番号１として示されるシュードモナス・サッカロフィリア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａ）エキソアミラーゼ配列の位置ナンバリングに準拠して、特許請求の範囲において記載されるようなアミノ酸突然変異を含むポリペプチドからなる群から選択される、アミラーゼ活性を有する親ポリペプチドから誘導されるＰＳ４改変体ポリペプチド、食品添加物または試料添加物としてのかかるポリペプチドの使用、およびこれをエンコードする核酸を記載する。

Description

米国仮特許出願第６０／４８５，４１３号、同第６０／４８５，５３９号、および同第６０／４８５，６１６号（２００３年７月７日出願）に対して参照される。また、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２１７２３、およびＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２１７３９（２００４年７月７日出願、指定国米国、出願人：Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）に対しても参照される。また、米国特許出願第１０／８８６，９０５号および同第１０／８６６，９０３号（全て２００４年７月７日出願）に対しても参照される。
また、米国仮特許出願第６０／６０８，９１９号（米国特許出願第１０／８８７，０５６号として２００４年７月７日出願に出願されたが、２００４年９月１５日に仮特許出願に変更された）に対しても参照される。また、米国仮特許出願第６０／６１２，４０７号（２００４年９月２２日出願）に対しても参照される。
さらに、米国仮特許出願第６０／４８５，５３９号（２００３年７月７日出願）に対して参照される。また、国際出願ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００２４８７（２００４年７月７日出願、指定国米国、出願人：Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓ）に対しても参照される。また、米国特許出願第１０／８８６，０２３号（２００４年７月７日出願）に対しても参照される。
また、米国特許出願第１０／８８６，５０５号、同第１０／８８６，５２７号、および同第１０／８８６，５０４号（全て２００４年７月７日出願）に対しても参照される。また、米国特許出願第１０／９４７，６１２号（２００４年９月２２日出願）に対しても参照される。
また、国際出願ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００２６７５（２００５年７月７日出願、指定国米国、出願人：Ｄａｎｉｓｃｏ Ａ／ＳおよびＧｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ、Ｄ Ｙｏｕｎｇ＆Ｃｏ代理人参照番号：Ｐ０２０１６１ＷＯ）に対しても参照される。また、米国仮特許出願第６０／６９７，３０２号（２００５年７月７日出願）に対しても参照される。
上記の特許出願、ならびに上記特許および特許出願（審査中の特許出願を含む）のそれぞれにおいて引用されるかまたは参照される文書のそれぞれ（出願引用文書）、ならびに上記出願および文書のそれぞれにおいて、および出願引用文書のいずれかにおいて引用されるかまたは記載される、あらゆる製品についてのあらゆる製造業者らの説明書またはカタログは、本明細書中で参考として援用される。さらに、本文において引用される全ての文書、および本文において引用される文書において引用または参照される全ての文書、ならびに本文において引用または記載される任意の製品についてのあらゆる製造業者の説明書またはカタログは、本明細書中で参考として援用される。本明細書中で参考として援用される文書またはその中の任意の教示は、本発明の実施において使用され得る。本明細書中で参考として援用される文書は、先行技術として認められるものではない。
（分野）
本発明は、ポリペプチド、特に、アミラーゼポリペプチドおよびこれらをエンコードする核酸、ならびに食品製造における非糖産生エキソアミラーゼとしてのその使用に関する。本発明のアミラーゼはより有益な品質を有するために加工されてきた。特に、本発明のアミラーゼは変更されたエキソ特異性および／または変更された耐熱性を示す。特に、当該ポリペプチドは、非糖産生エキソアミラーゼ活性、特に、グルカン１，４−アルファ−マルトテトラヒドロラーゼ（ＥＣ ３．２．１．６０）活性を有するポリペプチド由来である。
（背景）
改良されたアミラーゼは、ベーキングなどのあるプロセスに固有の問題を改良することができる。アミロペクチンの結晶化は、ベーキング後数日のデンプン顆粒において起こり、このため、パンが硬さが増し、パンの老化（ｓｔａｌｉｎｇ）が起こる。パンが老化すると、クラムの柔らかさおよびクラム（ｃｒｕｍｂ）の水分が失われる。その結果、クラムは弾性が低くなり、堅くなる。
アミロペクチン側鎖の（例えば、アミラーゼによる）酵素加水分解は、結晶化を減少させることができ、抗老化を増大させることができる。結晶化は、アミロペクチン側鎖の長さに依存し：側鎖が長いほど、結晶化が大きくなる。ほとんどのデンプン顆粒は、２つのポリマー：すなわち、アミロペクチンおよびアミロースの混合物であって、その約７５％がアミロペクチンである混合物からなる。アミロペクチンは非常に大きく、分岐した分子であって、（１−４）結合により結合したα−Ｄ−グルコピラノシル単位の鎖からなるものであり、ここで、鎖はα−Ｄ−（ｌ−６）結合により結合して分枝を形成する。アミロースは、２、３のα−Ｄ−（ｌ−６）分枝を有する、（１−４）結合α−Ｄ−グルコピラノシル単位の直鎖である。
デンプン質のパン製品、例えば、精白パン、篩ったライ麦粉および粉から作られたパンおよびロールパンのベーキングは、１８０から２５０℃の範囲のオーブン温度で、約１５から６０分間、パン生地を焼くことにより行われる。ベーキングプロセスの間、急な温度勾配（２００→１２０℃）は、生地外層全体にわたり、この外層で焼かれた製品の堅い外皮が発達する。しかしながら、蒸気のために、クラム中の温度はベーキングの最後でたったの約１００℃である。約８５℃を超える温度で、酵素不活性化が起こり、酵素は老化防止特性を有さない。したがって、耐熱性アミラーゼのみが、ベーキングの間にデンプンを効率的に修飾できる。
エンドアミラーゼ活性は、分枝デキストリンの蓄積のために粘着性またはゴム状クラムを生成させることにより、最終パン製品の品質に悪影響を及ぼし得る。エキソアミラーゼ活性は、老化の遅延をもたらし、エンドアミラーゼ活性に関連するマイナスの効果がより少ない、デンプンの望ましい修飾を達成するので好ましい。エンドアミラーゼ活性の減少は、より大きなエキソ特異性につながり、これにより、分枝デキストリンを減少させ、より高い品質のパンを製造することができる。
（要旨）
本発明者らは、本発明に従って、特許請求の範囲において記載されるＰＳ４改変体ポリペプチドを提供する。本発明者らは、特許請求の範囲に記載される、食品添加物、食品、ベーカリー製品、改良剤組成物、飼料製品、例えば、動物飼料などにおいて、または前記のものとしての使用を包含する、かかるＰＳ４改変体ポリペプチドの使用を提供する。本発明者らは、特許請求の範囲において記載されるＰＳ４改変体ポリペプチドをエンコードし、関連する核酸を提供する。かかるＰＳ４改変体ポリペプチドを製造する方法、ならびに本発明の他の態様も特許請求の範囲に記載されている。
（配列表）
配列番号１は、シュードモナス・サッカロフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ）マルトテトラヒドロラーゼアミノ酸配列由来のＰＳ４参照配列を示す。配列番号２は、ｐＳａｃ−Ｄ３４配列；１１の置換およびデンプン結合ドメインの欠失を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａマルトテトラヒドロラーゼアミノ酸配列を示す。配列番号３は、ｐＳａｃ−Ｄ２０配列；１３の置換およびデンプン結合ドメインの欠失を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａマルトテトラヒドロラーゼアミノ酸配列を示す。配列番号４は、ｐＳａｃ−Ｄ１４配列；１４の置換およびデンプン結合ドメインの欠失を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａマルトテトラヒドロラーゼアミノ酸配列を示す。配列番号５はシュードモナス・サッカロフィラ・グルカン１，４−アルファ−マルトテトラヒドロラーゼ前駆体（ＥＣ ３．２．１．６０）（Ｇ４−アミラーゼ）（マルトテトラオース形成アミラーゼ）（エキソ−マルトテトラヒドロラーゼ）（マルトテトラオース形成エキソアミラーゼ）を示す。ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受入番号Ｐ２２９６３。配列番号６は、マルトテトラヒドロラーゼ（ＥＣ番号＝３．２．１．６０）をエンコードするＰ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ ｍｔａ遺伝子を示す。ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ１６７３２。配列番号７は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラヒドロラーゼアミノ酸配列由来のＰＳ４参照配列を示す。配列番号８は、ＰＳｔｕ−Ｄ３４配列；９の置換を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラヒドロラーゼアミノ酸配列を示す。配列番号９は、ＰＳｔｕ−Ｄ２０配列；１１の置換を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラヒドロラーゼアミノ酸配列を示す。配列番号１０は、ＰＳｔｕ−Ｄ１４配列；１２の置換を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラヒドロラーゼアミノ酸配列を示す。配列番号１１は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｅｒｆｅｃｔｏｍａｒｉｎａ）を示す。グルカン１，４−アルファ−マルトテトラヒドロラーゼ前駆体（ＥＣ ３．２．１．６０）（Ｇ４−アミラーゼ）（マルトテトラオース形成アミラーゼ）（エキソ−マルトテトラヒドロラーゼ）（マルトテトラオース形成エキソアミラーゼ）を示す。ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受入番号Ｐ１３５０７。配列番号１２は、Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラオース形成アミラーゼ（ａｍｙＰ）遺伝子、完全ｃｄｓを示す．ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｍ２４５１６。
配列番号１３は、３３Ｙ、３４Ｎ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、２７２Ｑ、３０３Ｅ、３０７Ｌ、３０９Ｐおよび３３４Ｐで突然変異を有するｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９アミノ酸配列を示す。配列番号１４は、ｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９核酸配列を示す。配列番号１５は、３３Ｙ、３４Ｎ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４５Ｄ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、２７２Ｑ、３０３Ｅ、３０７Ｌおよび３３４Ｐで突然変異を有するｐＳａｃ−ｐＭＤ２４８アミノ酸配列を示す。配列番号１６は、ｐＳａｃ−ｐＭＤ２４８核酸配列を示す。配列番号１７は、３３Ｙ、３４Ｎ、１２１Ｄ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、２７２Ｑ、３０３Ｅ、３０７Ｌ、３０９Ｐおよび３３４Ｐで突然変異を有するｐＳａｃ−ｐＭＤ２５３アミノ酸配列を示す。
配列番号１８は、ｐＳａｃ−ｐＭＤ２５３核酸配列を示す。配列番号１９は、３Ｓ、３３Ｙ、３４Ｎ、７０Ｄ、１２１Ｄ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、２７２Ｑ、３０３Ｅ、３０７Ｌ、３０９Ｐおよび３３４Ｐで突然変異を有するｐＳａｃ−ｐＭＤ２７１アミノ酸配列を示す。配列番号２０は、ｐＳａｃ−ｐＭＤ２７１核酸配列を示す。
（詳細な説明）
以下の記載および実施例において、別段の記載がない限り、ＰＳ４改変体ポリペプチドの用量は粉のｐｐｍ（マイクログラム／グラム）で提供される。例えば、「１Ｄ３４」とは、重量／重量基準で、１ｐｐｍのｐＳａｃ−Ｄ３４を意味する。好ましくは、酵素量は、標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用い、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６、Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｒａｍ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７２：２４８−２５４）において記載されている分析法を用いて測定される純粋な酵素タンパク質の当量として、活性分析に基づいて決定される。
産生されたか、または本明細書に含まれることが想定される、異なるＰＳ４改変体ポリペプチドの記載において、容易に参照できるように、次の用語が採用される：
（ｉ）置換が数および文字を含む場合、例えば、１４１Ｐであるならば、これは、［ナンバリングシステムによる位置／置換アミノ酸］を意味する。従って、例えば、１４１位におけるアミノ酸のプロリンへの置換は、１４１Ｐと表示される；
（ｉｉ）置換が数および文字を含む場合、例えば、Ａ１４１Ｐであるならば、これは、［もとのアミノ酸／ナンバリングシステムにしたがった位置／置換されたアミノ酸］を意味する。従って、例えば、１４１位におけるアラニンのプロリンでの置換は、Ａ１４１Ｐと表示される。
２以上の置換が特定の位置で可能であるならば、これは、連続した文字により（これらの文字は、場合により例えば、斜線「／」により区切られている場合がある）、例えば、Ｇ３０３ＥＤまたはＧ３０３Ｅ／Ｄと表される。ある位置での関連するアミノ酸は任意のアミノ酸により置換することができ、これは［ナンバリングシステムに従った位置／Ｘ］、たとえば、１２１Ｘと表される。
複数の突然変異は、斜線「／」（例えば、Ａ１４１Ｐ／Ｇ２２３Ａ）またはコンマ「，」（例えば、Ａ１４１Ｐ，Ｇ２２３Ａ）で区切ることにより表示することができ、１４１位および２２３位における突然変異はそれぞれアラニンをプロリンで、グリシンをアラニンで置換する。
特に記載しない限り、本明細書において用いられる技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の通常の技術を有する者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、２Ｄ ＥＤ．、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）、およびＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ、ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ、ＮＹ（１９９１）は、本発明において用いられる用語の多くの一般的辞書を当業者に提供する。本明細書において記載されているものと類似または等しい任意の方法および物質を本発明の実施または試験において用いることができるが、好ましい方法および物質が記載されている。数値範囲は、範囲を規定する数値を包含する。特に記載しない限り、核酸は５’から３’の方向において左から右へと記載され；アミノ酸配列はそれぞれアミノからカルボキシへの方向において左から右へと記載される。
本発明の実施は、特に記載しない限り、化学、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡおよび免疫学の通常の技術であって、当業者の技量の範囲内である技術を用いる。このような技術は、文献において例示されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｂｏｏｋｓ １−３、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら（１９９５および定期的補遺；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｃｈ．９、１３、および１６、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．Ｒｏｅ、Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ、およびＡ．Ｋａｈｎ、１９９６、ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｍ． ＰｏｌａｋおよびＪａｍｅｓ Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ、１９９０、Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（Ｅｄｉｔｏｒ）、１９８４、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉｒｌ Ｐｒｅｓｓ；Ｄ．Ｍ．Ｊ．ＬｉｌｌｅｙおよびＪ．Ｅ． Ｄａｈｌｂｅｒｇ、１９９２、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ＮＯ．Ｉ ｂｙ Ｅｄｗａｒｄ Ｈａｒｌｏｗ、Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ（１９９９、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ ０−８７９６９−５４４−７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｂｙ Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ（Ｅｄｉｔｏｒ）、Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（Ｅｄｉｔｏｒ）（１９８８、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３１４−２）、１８５５、Ｌａｒｓ−Ｉｎｇｅ Ｌａｒｓｓｏｎ “Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ”、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ｉｎｃ．、Ｂａｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ、１９８８、ＩＳＢＮ ０−８４９３−６０７８−１、Ｊｏｈｎ Ｄ． Ｐｏｕｎｄ（ｅｄ）；“Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ｖｏｌ ８０”、ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ：“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９８、ＩＳＢＮ ０−８９６０３−４９３−３、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ Ｓｅｅｔｈａｌａ、Ｐｒａｂｈａｖａｔｈｉ Ｂ． Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ（２００１、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、ＩＳＢＮ ０−８２４７−０５６２−９）；およびＬａｂ Ｒｅｆ：Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｒｅｃｉｐｅｓ、Ｒｅａｇｅｎｔｓ、ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ａｔ ｔｈｅ Ｂｅｎｃｈ、Ｅｄｉｔｅｄ Ｊａｎｅ Ｒｏｓｋａｍｓ ａｎｄ Ｌｉｎｄａ Ｒｏｄｇｅｒｓ、２００２、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＩＳＢＮ ０−８７９６９−６３０−３参照。これらのテキストのそれぞれは本発明の一部として参照される。
このような特許および刊行物内で開示された全ての配列を包含する全ての特許および刊行物は明白に本発明の一部として参照される。
（ＰＳ４改変体ポリペプチド）
本発明者らは、親酵素と比べて変更された性質、好ましくは変更されたエキソ特異性または変更された耐熱性、もしくは両方に影響を及ぼす、１以上の位置での置換を有するポリペプチドを提供する。このような改変体ポリペプチドは、本明細書において、簡便のために、「ＰＳ４改変体ポリペプチド」と記載される。
ＰＳ４改変体ポリペプチドは、好ましくは、酵素活性を示す。さらに好ましくは、ＰＳ４改変体ポリペプチドはアミラーゼ活性、好ましくは、エキソアミラーゼ活性を含む。非常に好ましい実施形態において、ＰＳ４改変体ポリペプチドは非糖産生エキソアミラーゼ活性を示す。
本発明者らはさらに、食品添加物、食品、ベーカリー製品、改良剤組成物、動物飼料を含む飼料製品などを包含する組成物であって、このような変更されたＰＳ４改変体ポリペプチド、好ましくは、非糖産生エキソアミラーゼ活性を含むもの、ならびにかかるポリペプチドおよび組成物の製造法および使用法を提供する。
前述のように、ＰＳ４改変体ポリペプチドは、１以上の改良された取り扱い特性、好ましくは、改良されたベーキング特性を含む。したがって、ＰＳ４改変体ポリペプチドがこのようであるので、かくして処理された食品は、より低い硬さ、より高い弾力性またはより高い凝集性の１以上（好ましくはすべて）を有する。ＰＳ４改変体ポリペプチドにより示されるこのような改良された取り扱いまたはベーキング特性を以下でさらに詳細に説明する。
本発明者らは、食品、特に生地およびベーカリー製品のかかるポリペプチドでの処理法を提供し、従って、食品は前記のような望ましい品質を示す。
本発明者らは、かかる組成物の他の用途、例えば、洗剤の調製における使用、甘味料、シロップなどとしての使用を提供する。組成物は、ポリペプチドを少なくとも１つの他の成分とともに含む。特に、本発明者らは、当該ポリペプチドを含む食品添加物または試料添加物を提供する。
このようなポリペプチドおよび核酸はその親配列と、多くの突然変異を含むことによって異なる。言い換えれば、ＰＳ４改変体ポリペプチドまたは核酸の配列は、その親と多くの位置または残基で異なる。好ましい実施形態において、突然変異はアミノ酸置換、すなわち、あるアミノ酸残基から他のアミノ酸残基への変化を含む。したがって、ＰＳ４改変体ポリペプチドは、親配列の１以上の位置で、アミノ酸残基の性質における多くの変化を含む。
本明細書において用いられる場合、「改変体」なる用語は、親分子由来の分子を意味すると理解されるべきである。改変体は、ポリペプチドならびに核酸を包含する。改変体は、とりわけ、１以上の場所での、アミノ酸レベルでの欠失、挿入および置換、ならびに核酸レベルでの塩基転換、転移および反転を含む。改変体は切断も含む。改変体は、親分子の同族のまたは機能的な派生物を含む。改変体は、本明細書において記載されるヌクレオチド配列とハイブリッド形成できる配列と相補性である配列を含む。
（ＰＳ４改変体ポリペプチドにおける突然変異の位置）
本発明者らは、アミラーゼ配列、好ましくは、エキソアミラーゼ活性、さらに好ましくは非糖産生エキソアミラーゼ配列においてアミノ酸置換を含む配列変更を有するＰＳ４改変体ポリペプチドを提供する。
特に、本発明者らは、配列番号１として示されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａエキソアミラーゼ配列のナンバリングに準拠して、３３、３４、１２１、１３４、１４１、１４６、１５７、１６１、１７８、１７９、２２３、２２９、２７２、３０３、３０７、３０９および３３４位のそれぞれにアミノ酸突然変異を含む非糖産生エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチド由来のＰＳ４改変体ポリペプチドを提供する。
本発明者らはさらに、配列番号１として示されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａエキソアミラーゼ配列のナンバリングに準拠して、３３、３４、１２１、１３４、１４１、１４５、１４６、１５７、１７８、１７９、２２３、２２９、２７２、３０３、３０７および３３４位のそれぞれでアミノ酸突然変異を含む、非糖産生エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチド由来のＰＳ４改変体ポリペプチドを提供する。
本発明者らはまた、配列番号１として示されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａエキソアミラーゼ配列のナンバリングに準拠して、３、３３、３４、１２１、１３４、１４１、１４６、１５７、１７８、１７９、２２３、２２９、２７２、３０３、３０７、３０９および３３４位のそれぞれでアミノ酸突然変異を含む、非糖産生エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチド由来のＰＳ４改変体ポリペプチドも提供する。
最後に、本発明者らは、配列番号１として示されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａエキソアミラーゼ配列のナンバリングに準拠して、３３、３４、７０、１２１、１３４、１４１、１４６、１５７、１７８、１７９、２２３、２２９、２７２、３０３、３０７、３０９および３３４位のそれぞれでアミノ酸突然変異を含む、非糖産生エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチド由来のＰＳ４改変体ポリペプチドも提供する。
好ましい実施形態において、これらのポリペプチドにおけるアミノ酸突然変異のそれぞれは：３Ｓ、３３Ｙ、３４Ｎ、７ＯＤ、１２１Ｄ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４５Ｄ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１６１Ａ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、２７２Ｑ、３０３Ｅ、３０７Ｌ、３０９Ｐおよび３３４Ｐからなる群から独立して選択される。
このような好ましい実施形態において、これらのポリペプチドにおけるアミノ酸突然変異のそれぞれは、好ましくは：Ａ３Ｓ、Ｎ３３Ｙ、Ｄ３４Ｎ、Ｇ７０Ｄ、Ｇ１２１Ｄ、Ｇ１２１Ｆ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｎ１４５Ｄ、Ｙ１４６Ｇ、Ｉ１５７Ｌ、Ｓ１６１Ａ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔ、Ｇ２２３Ｅ、Ｓ２２９Ｐ、Ｈ２７２Ｑ、Ｇ３０３Ｅ、Ｈ３０７Ｌ、Ａ３０９ＰおよびＳ３３４Ｐからなる置換群から好ましくは独立して選択される。
非常に好ましい実施形態において、ＰＳ４改変体ポリペプチドは、配列ｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９（配列番号１３）、ｐＳａｃ−ｐＭＤ２４８（配列番号１５）、ｐＳａｃ−ｐＭＤ２５３（配列番号１７）またはｐＳａｃ−ｐＭＤ２７１（配列番号１９）を含む。
ＰＳ４改変体ポリペプチドは、以下でさらに詳細に記載するように、他の部位で突然変異を含み得る。
このような改変体ポリペプチド、および本明細書において記載される他のものは、本明細書において、「ＰＳ４改変体ポリペプチド」と称する。かかる改変体ポリペプチドをエンコードする核酸も開示され、簡便のために、「ＰＳ４改変体核酸」と称する。ＰＳ４改変体ポリペプチドおよび核酸は以下でさらに詳細に記載される。
「親」配列、すなわち、ＰＳ４改変体ポリペプチドおよび核酸の基礎となる配列は、好ましくは、非糖産生エキソアミラーゼ活性を有するポリペプチドである。「親酵素」および「親ポリペプチド」なる用語は、それに応じて解釈されるべきであり、ＰＳ４改変体ポリペプチドの基礎となる酵素およびポリペプチドを意味すると解釈される。これらは以下でさらに詳細に記載される。
突然変異およびアミノ酸変化は、以下にさらに詳細に記載されるように、任意の適切なポリペプチド主鎖またはバックグラウンド、野生型または突然変異に関して加えられる。
特に好ましい実施形態において、親配列は非糖産生エキソアミラーゼ酵素、好ましくは細菌非糖産生エキソアミラーゼ酵素である。非常に好ましい実施形態において、親配列はグルカン１，４−アルファ−マルトテトラヒドロラーゼ（ＥＣ ３．２．１．６０）を含む。好ましくは、親配列は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、たとえば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ由来である。
いくつかの実施形態において、親ポリペプチドは、野生型非糖産生エキソアミラーゼ配列、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種由来のものを含むか、またはこれと相同性である。
したがって、親ポリペプチドは、配列番号１として示される配列を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａ非糖産生エキソアミラーゼを含み得る。他の好ましい実施形態において、親ポリペプチドは、配列番号１１として示される配列を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ、またはＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受入番号Ｐｌ３５０７を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ非糖産生エキソアミラーゼからの非糖産生エキソアミラーゼを含む。
一方、親ポリペプチドは、野生型配列の任意のものの改変体である、すなわち、親ポリペプチドそれ自体を処理することができるか、またはＰＳ４改変体ポリペプチドを含み得る。
好ましい実施形態において、突然変異および変化は、すでに突然変異したＰＳ４配列、好ましくはｐＳａｃ−Ｄ３４（例えば、配列番号２）に関して加えられる。
しかしながら、ＰＳ４改変体ポリペプチドはすでに突然変異した配列の突然変異により誘導され得るが、野生型配列（または実際には任意の好適な配列）から出発し、出発配列と望ましい改変体間の差を確認し、必要な突然変異を出発配列に導入して、望ましい改変体を得ることにより、かかる改変体ポリペプチドを構築できることは、当業者には明らかであろう。
配列番号１として示される配列を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａ非糖産生エキソアミラーゼ配列または配列番号１１として示されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ非糖産生エキソアミラーゼと配列または機能的相同性に関連するか、好ましく相同性を有するタンパク質および核酸は、本明細書においては、「ＰＳ４ファミリー」の構成要素と称する。ＰＳ４改変体ポリペプチドおよび核酸の生成における使用に適した「ＰＳ４ファミリー」非糖産生エキソアミラーゼ酵素の例は、以下でさらに詳細に開示される。
本明細書において記載されるＰＳ４改変体ポリペプチドは、好ましくは、親ポリペプチドの性質を保持し、さらに好ましくは、さらなる有用な特性、例えば、向上した活性または耐熱性、もしくはｐＨ耐性、あるいはその組み合わせ（好ましくは全て）を有する。これは、以下でさらに詳細に記載される。
本明細書において記載されるＰＳ４置換突然変異体は、任意の好適な目的のために使用することができる。これらは、好ましくは、親酵素が適している目的について用いることができる。特に、これらはエキソマルトテトラヒドロラーゼが用いられる任意の用途において用いることができる。非常に好ましい実施形態において、これらは、さらに高い耐熱性、またはさらに高いエキソアミラーゼ活性またはさらに高いｐＨ安定性、または任意の組み合わせの追加の利点を有する。ＰＳ４改変体ポリペプチドおよび核酸の好適な使用例としては、食品製造、特にベーキング、ならびに食材の製造が挙げられ；さらなる例は、以下で詳細に記載される。
ＰＳ４改変体ポリペプチドは、前記の位置に加えて、１以上のさらなる突然変異を含み得る。すでに記載したものに加えて、１、２、３、４、５、６、７またはそれ以上の突然変異、好ましくは置換が存在し得る。他の突然変異、例えば、アミノ酸レベルでの欠失、挿入および置換および核酸レベルでの塩基転換、ならびに塩基転換、転移および反転も、１以上の他の位置で、以下に記載するように含まれ得る。加えて、ＰＳ４改変体は、記載された位置で全ての置換を有する必要はない。実際、これらは１、２、３、４、または５の置換喪失を有し得る。すなわち、野生型アミノ酸残基がかかる位置で存在する。
（好ましい置換）
３位での置換は、存在する場合は、３Ｓ、好ましくはＡ３Ｓを含み得る。
３３位での置換は、存在する場合は、３３Ｙ、好ましくはＮ３３Ｙを含み得る。
３４位での置換は、３４Ｎ、３４Ｇ、３４Ａ、３４Ｓまたは３４Ｔ、好ましくは、３４Ｎ、Ｄ３４Ｇ、Ｄ３４Ａ、Ｄ３４ＳまたはＤ３４Ｔのいずれかを含み得る。非常に好ましい実施形態において、３４位での置換は３４Ｎ、好ましくはＤ３４Ｎを含む。
７０位での置換は、存在するならば、７ＯＤ、好ましくは、Ｇ７０Ｄを含み得る。
１２１位での置換は、１２１Ｆ、１２１Ｙ、１２１Ｗ、１２１Ｈ、１２１Ａ、１２１Ｍ、１２１Ｇ、１２１Ｓ、１２１Ｔ、１２１Ｄ、１２１Ｅ、１２１Ｌ、１２１Ｋ、１２１Ｖ、好ましくは、Ｇ１２１Ｆ、Ｇ１２１Ｙ、Ｇ１２１Ｗ、Ｇ１２１Ｈ、Ｇ１２１Ａ、Ｇ１２１Ｍ、Ｇ１２１Ｇ、Ｇ１２１Ｓ、Ｇ１２１Ｔ、Ｇ１２１Ｄ、Ｇ１２１Ｅ、Ｇ１２１Ｌ、Ｇ１２１Ｋ、Ｇ１２１Ｖのいずれかを含み得る。非常に好ましい実施形態において、１２１位での置換は、１２１Ｄまたは１２１Ｆ、好ましくは、Ｇ１２１ＤまたはＧ１２１Ｆを含む。
１３４位での置換は、１３４Ｒ、好ましくは、Ｇ１３４Ｒを含み得る。
１４１位での置換は、１４１Ｐ、好ましくは、Ａ１４１Ｐを含み得る。
１４５位での置換は、１４５Ｄ、好ましくは、Ｎ１４５Ｄを含み得る。
１４６位での置換は、１４６Ｍ、１４６Ｇ、好ましくは、Ｙ１４６Ｍ、Ｙ１４６Ｇのいずれかを含み得る。非常に好ましい実施形態において、１４６位での置換は、１４６Ｇ、好ましくは、Ｙ１４６Ｇを含む。
１５７位での置換は、１５７Ｌ、５７Ｍ、１５７Ｖ、１５７Ｎ、１５７Ｌ、好ましくは、Ｉ１５７Ｌ、Ｉ１５７Ｍ、Ｉ１５７Ｖ、Ｉ１５７Ｎ、Ｉ１５７Ｌのいずれかを含み得る。非常に好ましい実施形態において、１５７位での置換は、１５７Ｌ、好ましくは、Ｉ１５７Ｌを含む。
１６１位での置換は、存在するならば、１６１Ａ、好ましくはＳ１６１Ａを含み得る。
１７８位での置換は、１７８Ｆ、好ましくは、Ｌ１７８Ｆを含み得る。
１７９位での置換は、１７９Ｔ、１７９Ｖ、好ましくは、Ａ１７９Ｔ、Ａ１７９Ｖのいずれかを含み得る。非常に好ましい実施形態において、１７９位での置換は、１７９Ｔ、好ましくは、Ａ１７９Ｔを含む。
２２３位での置換は、２２３Ａ、２２３Ｅ、２２３Ｋ、Ｇ２２３Ｌ、２２３１、２２３Ｓ、２２３Ｔ、２２３Ｖ、２２３Ｒ、２２３Ｐ、２２３Ｄ、好ましくは、Ｇ２２３Ａ、Ｇ２２３Ｅ、Ｇ２２３Ｋ、Ｇ２２３Ｌ、Ｇ２２３Ｉ、Ｇ２２３Ｓ、Ｇ２２３Ｔ、Ｇ２２３Ｖ、Ｇ２２３Ｒ、Ｇ２２３Ｐ、Ｇ２２３Ｄのいずれかを含み得る。非常に好ましい実施形態において、２２３位での置換は、２２３Ｅ、好ましくは、Ｇ２２３Ｅを含む。
２２９位での置換は、２２９Ｐ、好ましくは、Ｓ２２９Ｐを含み得る。
２７２位での置換は、２７２Ｑ、好ましくは、Ｈ２７２Ｑを含み得る。
３０３位での置換は、３０３Ｅ、３０３Ｄ Ｇ３０３Ｅ、Ｇ３０３Ｄのいずれかを含み得る。非常に好ましい実施形態において、３０３位での置換は、３０３Ｅ、好ましくは、Ｇ３０３Ｅを含み得る。
３０７位での置換は、３０７Ｌ、好ましくは、Ｈ３０７Ｌを含み得る。
３０９位での置換は、３０９Ｐ、好ましくは、Ａ３０９Ｐを含み得る。
３３４位での置換は、３３４Ｐ、好ましくは、Ｓ３３４Ｐを含み得る。
（さらなる置換）
１６０での突然変異、好ましくは、１６０Ｄ、さらに好ましくは、Ｅ１６０Ｄも存在する。以下の表に記載される１以上の他の突然変異もさらに存在する可能性がある。
Figure 2008544751
 （他のＰＳ４改変体ポリペプチド配列）
本発明者らは、非糖産生エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチド由来のＰＳ４改変体ポリペプチドを特に提供し、ここで、ＰＳ４改変体ポリペプチドは次の位置３３、３４、１２１、１３４、１４１、１４６、１５７、１７８、１７９、２２３、２２９、２７２、３０３、３０７および３３４（配列番号１として示されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａエキソアミラーゼ配列の位置ナンバリングに準拠）のそれぞれで突然変異を含む。
３３位突然変異は、３３Ｙ、好ましくは、Ｎ３３Ｙを含み得る。３４位突然変異位は、３４Ｎ、好ましくは、Ｄ３４Ｎを含み得る。１２１位突然変異は、１２１Ｆ、好ましくは、Ｇ１２１Ｆを含み得る。１３４位突然変異は、１３４Ｒ、好ましくは、Ｇ１３４Ｒを含み得る。１４１位突然変異は、１４１Ｐ、好ましくは、Ａ１４１Ｐを含み得る。１４６位突然変異は、１４６Ｇ、好ましくは、Ｙ１４６Ｇを含み得る。１５７位突然変異は、１５７Ｌ、好ましくは、Ｉ１５７Ｌを含み得る。１７８位突然変異は、１７８Ｆ、好ましくは、Ｌ１７８Ｆを含み得る。１７９位突然変異は、１７９Ｔ、好ましくは、Ａ１７９Ｔを含み得る。２２３位突然変異は、２２３Ｅ、好ましくは、Ｇ２２３Ｅを含み得る。２２９位突然変異は、２２９Ｐ、好ましくは、Ｓ２２９Ｐを含み得る。２７２位突然変異は、２７２Ｑ、好ましくは、Ｈ２７２Ｑを含み得る。３０３位突然変異は、３０３Ｅ、好ましくは、Ｇ３０３Ｅを含み得る。３０７位突然変異は、３０７Ｌ、好ましくは、Ｈ３０７Ｌを含み得る。３３４位突然変異は、３３４Ｐ、好ましくは、Ｓ３３４Ｐを含み得る。
好ましくは、ＰＳ４改変体ポリペプチドは、次の置換３３Ｙ、３４Ｎ、１２１Ｆ、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１４６Ｇ、１５７Ｌ、１７８Ｆ、１７９Ｔ、２２３Ｅ、２２９Ｐ、２７２Ｑ、３０３Ｅ、３０７Ｌおよび３３４Ｐ、好ましくは、Ｎ３３Ｙ、Ｄ３４Ｎ、Ｇ１２１Ｆ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｙ１４６Ｇ、Ｉ１５７Ｌ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔ、Ｇ２２３Ｅ、Ｓ２２９Ｐ、Ｈ２７２Ｑ、Ｇ３０３Ｅ、Ｈ３０７ＬおよびＳ３３４Ｐのそれぞれを含む。
好ましい実施形態において、ＰＳ４改変体ポリペプチドは、１６１および３０９位にさらなる突然変異を含む。１６１位突然変異は、１６１Ａ、好ましくは、Ｓ１６１Ａを含み得る。さらに、３０９位突然変異は、３０９Ｐ、好ましくは、Ａ３０９Ｐを含み得る。好ましくは、ＰＳ４改変体ポリペプチドは配列ｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９（配列番号１３）を含む。
もうひとつ別の好ましい実施形態において、ＰＳ４改変体ポリペプチドは、１４５位にさらなる突然変異を含む。１４５位突然変異は、１４５Ｄ、好ましくは、Ｎ１４５Ｄを含み得る。好ましくは、ＰＳ４改変体ポリペプチドは配列ｐＳａｃ−ｐＭＤ２４８（配列番号１５）を含む。
さらなる好ましい実施形態において、ＰＳ４改変体ポリペプチドは３０９位にさらなる突然変異を含む。３０９位突然変異は、３０９Ｐ、好ましくは、Ａ３０９Ｐを含み得る。好ましくは、ＰＳ４改変体ポリペプチドは配列ｐＳａｃ−ｐＭＤ２５３（配列番号１７）を含む。
さらなる好ましい実施形態において、ＰＳ４改変体ポリペプチドは、３、７０および３０９位でさらなる突然変異を含む。３位突然変異は、３Ｓ、好ましくは、Ａ３Ｓを含む。７０位突然変異は、７０Ｄ、好ましくは、Ｇ７０Ｄを含み得る。３０９位突然変異は、３０９Ｐ、好ましくは、Ａ３０９Ｐを含み得る。好ましくは、ＰＳ４改変体ポリペプチドは、配列ｐＳａｃ−ｐＭＤ２７１（配列番号１９）を含む。
（ＰＳ４改変体核酸）
本発明者らは、本明細書において記載する目的のためにかかるポリペプチドを製造するのに用いられる、ＰＳ４改変体ポリペプチド配列における変更に対応するか、または変更をエンコードする配列を有するＰＳ４核酸も記載する。従って、本発明者らは、本明細書において記載される任意のポリペプチド配列をエンコードできる核酸を提供する。
当業者は、核酸配列とポリペプチド配列間の関係、特に、遺伝子コードとこのコードの縮重を認識し、かかるＰＳ４核酸を難なく構築できるであろう。例えば、当業者は、ＰＳ４改変体ポリペプチド配列におけるそれぞれのアミノ酸置換について、置換アミノ酸をエンコードする１以上のコドンがあることを認識するであろう。従って、特定のアミノ酸残基に関する遺伝子コードの縮重に応じて、１以上のＰＳ４核酸配列がＰＳ４改変体ポリペプチド配列に対応して生成し得ることは明らかであろう。さらに、ＰＳ４改変体ポリペプチドが１より多い置換、例えば、Ａ１４１Ｐ／Ｇ２２３Ａを含む場合、対応するＰＳ４核酸は、それぞれ２つのアミノ酸変化をエンコードするコドン対を含み得る。
ＰＳ４改変体核酸配列は前記の親ポリペプチドのいずれかをエンコードする親核酸から誘導できる。特に、親核酸は、野生型配列、例えば、配列番号６または配列番号１２を含む。ＰＳ４改変体核酸はしたがって、野生型非糖産生エキソアミラーゼをエンコードするが、関連する位置で、野生型アミノ酸残基のかわりに別のアミノ酸をエンコードする核酸を含み得る。ＰＳ４改変体核酸配列は、１以上の突然変異を有する野生型配列、例えば、「組み合わせ」の項で前述された親ポリペプチドをエンコードするものも含み得る。
特定のＰＳ４改変体核酸配列と同一でないが、これらと関連する核酸配列は、本明細書において記載された方法および組成物、例えば、ＰＳ４改変体核酸配列の改変体、相同体、誘導体またはフラグメント、もしくはこれとハイブリッド形成できる補体またはフラグメントについても有用であることは理解されるであろう。特に別段の記載がない限り、「ＰＳ４改変体核酸」なる用語は、前記のこれらの物質のそれぞれを包含すると理解されるべきである。
アミノ酸配列および核酸配列における突然変異は、当該分野において公知の多くの技術のいずれかによりもたらすことができる。改変体配列は、公知突然変異誘発技術、例えば、部位指向性突然変異誘発、適切なオリゴヌクレオチドプライマーでのＰＣＲを用いた部位特異的突然変異誘発法、５’アドオン突然変異誘発、ミスマッチプライマー突然変異誘発などのいずれかを用いて容易に調製することができる。別法として、または付加的に、ＰＳ４改変体核酸配列を新たに調製することができる。
特に好ましい実施形態において、突然変異は親配列に、実施例において記載されるような適切なプライマーを使用したＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により導入される。従って、任意の望ましいアミノ酸置換を親ポリペプチド、好ましくは非糖産生エキソアミラーゼ活性を有するものに導入すること、例えば、前述のように、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａまたはａＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉエキソアミラーゼ配列にアミノ酸または核酸レベルで導入することにより、ポリペプチドの配列を変更することが可能である。本発明者らは、非糖産生エキソアミラーゼをエンコードする核酸の配列を変更することにより、非糖産生エキソアミラーゼの配列が変更される方法を記載する。
しかしながら、もちろん、ＰＳ４改変体ポリペプチドは実際に野生型ポリペプチドまたは核酸配列から、例えば段階的突然変異により誘導される必要はないことは理解されるであろう。むしろ、ＰＳ４改変体ポリペプチドの配列が一旦確立されると、当業者は、全ての突然変異を有する野性型から、当該分野において公知の手段により、例えば適切なオリゴヌクレオチドプライマーおよびＰＣＲを用いて容易に調製できる。実際、ＰＳ４改変体ポリペプチドは、すべてのその突然変異を有するものを、例えば、ペプチド合成法により新たに調製することができる。
しかしながら、一般に、ＰＳ４改変体ポリペプチドおよび／または核酸は、「前駆体」配列由来であるか、または「前駆体」配列から誘導できる。本明細書において用いられる「前駆体」なる用語は、本明細書において記載される方法および組成物により修飾される酵素に先行する酵素を意味する。前駆体は、従って、修飾酵素を産生するために用いられる酵素を包含する。従って、前駆体は、本明細書の他の場所で記載されるように、突然変異誘発により修飾される酵素であり得る。同様に、前駆体は、野生型酵素、改変体野生型酵素またはすでに突然変異した酵素であってよい。
ＰＳ４改変体ポリペプチドおよび核酸は、当該分野において公知の任意の手段により産生することができる。特に、これらは、本来、インビトロまたはインビボである発現系から発現することができる。特に、本発明者らは、好ましくは、ＰＳ４改変体ポリペプチドを発現できるＰＳ４核酸配列を含むプラスミドおよび発現ベクターを記載する。かかるＰＳ４核酸、プラスミドおよびベクターで形質転換された細胞および宿主細胞も開示され、これらも本明細書に含まれることを明らかにすべきである。
好ましい実施形態において、ＰＳ４改変体ポリペプチド配列が単離された形態において食品添加物として使用される。「単離された」なる用語は、配列が自然界に関連するか、または本来、自然界で見出される、少なくとも１つの他の成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。一つの態様において、好ましくは、配列は精製された形態である。「精製された」なる用語は、配列が比較的純粋な状態、例えば少なくとも約９０％純粋、または少なくとも約９５％純粋、または少なくとも約９８％純粋であることを意味する。
ＰＳ４改変体ポリペプチドは、例えば、実施例において記載されるような適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲを用いた部位特異的突然変異誘発法、５’アドオン突然変異誘発、ミスマッチプライマー突然変異誘発などを用いて調製することができる。関連する突然変異を有するＰＳ４改変体ポリペプチドを産生するために、例えば、ｐＳａｃ−Ｄ３４配列に対応する核酸配列（配列番号２）などを調製し、関連する変化を導入することができる。しかしながら、当該分野における技術を有する読者は、好適な出発配列を用いることができ、実際、野生型エキソアミラーゼ配列から出発して、一段階で、または他の中間配列を経るかのいずれかで、望ましい改変体ポリペプチドを得ることができることを認識するであろう。
非常に好ましい実施形態において、核酸配列は、配列ｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９（配列番号１４）、ｐＳａｃ−ｐＭＤ２４８（配列番号１６）、ｐＳａｃ−ｐＭＤ２５３（配列番号１８）またはｐＳａｃ−ｐＭＤ２７１（配列番号２０）を含む。
（位置ナンバリング）
本明細書において番号により言及される全ての位置は、以下に示されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａエキソアミラーゼ参照配列（配列番号１）のナンバリングに準拠する：
Figure 2008544751
 参照配列は、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受入番号Ｐ２２９６３を有するが、シグナル配列
ＭＳＨＩＬＲＡＡＶＬＡＡＶＬＬＰＦＰＡＬＡを有さないＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａ配列由来である。
Ｃ末端デンプン結合ドメインＥＧＧＬＶＮＶＮＦＲ ＣＤＮＧＶＴＱＭＧＤ ＳＶＹＡＶＧＮＶＳＱ ＬＧＮＷＳＰＡＳＡＶ ＲＬＴＤＴＳＳＹＰＴ ＷＫＧＳＩＡＬＰＤＧ ＱＮＶＥＷＫＣＬＩＲ ＮＥＡＤＡＴＬＶＲＱ ＷＱＳＧＧＮＮＱＶＱ ＡＡＡＧＡＳＴＳＧＳ Ｆは場合により欠失または無視することができる。別法として、ＰＳ４改変体ポリペプチド配列中に含めることができる。
本明細書の記載に関連して、ＰＳ４エキソアミラーゼ酵素におけるアミノ酸残基の位置に関する特定のナンバリングが採用される。この点において、様々な公知エキソアミラーゼのアミノ酸配列を整列させることにより、そのアミノ酸配列が既知である任意のエキソアミラーゼ酵素における任意のアミノ酸残基の位置に対して、エキソアミラーゼアミノ酸位置番号を明確に割り当てることが可能である。例えば、多くの他の公知エキソアミラーゼのアミノ酸配列と整列された、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａから得られるエキソアミラーゼのアミノ酸配列起源のこのナンバリングシステムを用いて、エキソアミラーゼにおけるアミノ酸残基の位置を明確に示すことが可能である。
したがって、ナンバリングシステムは、基準点として特定の配列を使用するが、全ての関連する相同配列にも適用可能である。例えば、位置ナンバリングは、他のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種からの相同配列、または他の細菌からの相同配列に適用することができる。好ましくは、このような相同性は、前記参照配列（配列番号１）またはＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受入番号Ｐ２２９６３またはＰ１３５０７を有する配列、好ましくは、これらの全ての配列と、６０％以上の相同性、例えば、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の相同性を有する。タンパク質間の配列相同性は、本明細書において記載される周知の整列プログラムおよびハイブリダイゼーション技術を用いて解明することができる。このような相同配列、ならびに以下に記載される機能等価物は、本明細書において、「ＰＳ４ファミリー」と称する。
さらに、また前述のように、本明細書において用いられるナンバリングシステムは、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受入番号Ｐ２２９６３を有するが、シグナル配列ＭＳＨＩＬＲＡＡＶＬＡＡＶＬＬＰＦＰＡＬＡを有さない、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａ配列由来である参照配列（配列番号１）に準拠する。このシグナル配列 は参照配列のＮ末端に位置し、２１のアミノ酸残基からなる。従って、シグナル配列を含む対応する配列、または実際、任意の他のＮ末端またはＣ末端伸長または欠失を含む対応する配列において、特定の残基が突然変異しているか、または置換されているかを確認することはささいなことである。Ｎ末端付加または欠失に関連して、必要なのは、挿入または欠失した残基の数により位置ナンバリングを相殺することである。例えば、配列番号１における１位は、シグナル配列を有する配列における２２位に対応する。
（親酵素／ポリペプチド）
ＰＳ４改変体ポリペプチドは、「親酵素」、「親ポリペプチド」または「親配列」として公知の別の配列から誘導されるか、またはその改変体である。
本明細書において用いられる「親酵素」なる用語は、結果として得られる改変体、すなわち、ＰＳ４改変体ポリペプチドまたは核酸と化学構造が近接した、好ましくは最も近接した酵素を意味する。親酵素は前駆体酵素（すなわち、実際に突然変異した酵素）であるか、または新たに調製することができる。親酵素は野生型酵素であってもよいし、もしくは１以上の突然変異を含む野生型酵素であってもよい。
本明細書において用いられる「前駆体」なる用語は、酵素を産生するために修飾された酵素に先行する酵素を意味する。従って、前駆体は、突然変異誘発により修飾される酵素であり得る。同様に、前駆体は、野生型酵素、改変体野生型酵素またはすでに突然変異した酵素であってよい。
「野生型」なる用語は、当業者により理解される専門用語であり、天然に存在し、突然変異体の表現型と対照的な種のメンバーのほとんどに特徴的である表現型を意味する。従って、本発明に関連して、野生型酵素は、関連する種のほとんどのメンバーにおいて自然界で見られる酵素の一つの形態である。一般に、本明細書において記載される改変体ポリペプチドと関連する野生型酵素は、配列相同性の点で、最も密接に関連する対応する野生型酵素である。しかしながら、特定の野生型配列が、本明細書において記載される改変体ＰＳ４ポリペプチド産生の基礎として用いられた場合、これは、アミノ酸配列相同性の点でより密接に関連した別の野生型配列の存在に関係なく、対応する野生型配列である。
親酵素またはポリペプチドは任意の適した出発ポリペプチドであり得る。これは、好ましくはある酵素活性を有し得る。好ましくは、この酵素活性はアミラーゼ活性である。さらに好ましくは、親ポリペプチドはエキソアミラーゼ活性を含む。
親酵素は好ましくは、ポリペプチドであって、好ましくは非糖産生エキソアミラーゼ活性を示すものである。好ましくは、親酵素はそれ自体、非糖産生エキソアミラーゼである。例えば、親酵素はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ非糖産生エキソアミラーゼ、例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受入番号Ｐ２２９６３を有するポリペプチド、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ非糖産生エキソアミラーゼ、例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受入番号Ｐ１３５０７を有するポリペプチドである。
ＰＳ４ファミリーの他のメンバーは、親酵素として用いることができ；このような「ＰＳ４ファミリーメンバー」は、一般に、これらの２つの酵素のいずれかと類似しているか、相同性であるか、または機能的に等価であり、標準的方法、例えば、プローブを用いた適切なライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニング、またはゲノム配列分析により同定することができる。
特に、これらの２つの酵素のいずれかの機能的等価物、ならびに「ＰＳ４ファミリー」の他のメンバーは、本明細書において記載されるＰＳ４改変体ポリペプチドの生成のための出発点または親ポリペプチドとして使用することもできる。
タンパク質の「機能的等価物」とは、タンパク質の機能の１以上、好ましくは全てを共有するものを意味する。好ましくは、このような機能は、生物学的機能、好ましくは、酵素機能、例えばアミラーゼ活性、好ましくは、非糖産生エキソアミラーゼ活性である。このような機能は、エキソ特異性、耐熱性、および改良された取り扱い特性、例えば、硬度、弾力性および凝集性（以下で記載）を包含するタンパク質の任意の性質を含み得る。
親酵素に関連して、「機能的等価物」なる用語は、好ましくは、親分子と類似しているか、または同じ機能を有する分子を意味する。親分子は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ非糖産生エキソアミラーゼまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ非糖産生エキソアミラーゼ、または他の供給源から得られるポリペプチドであり得る。
「機能的等価物」なる用語は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ非糖産生エキソアミラーゼ、例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受入番号Ｐ２２９６３を有するポリペプチド、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ非糖産生エキソアミラーゼ、例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ受入番号Ｐ１３５０７を有するポリペプチドである親酵素に関連して、機能的等価物を他の供給源から得ることができることを意味する。機能的に等価な酵素は、異なるアミノ酸配列を有するが、非糖産生エキソアミラーゼ活性を有し得る。機能性を決定するための分析の例は、本明細書において記載され、当業者に公知である。
非常に好ましい実施形態において、機能的等価物は、前述のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ非糖産生エキソアミラーゼのいずれか、好ましくは両方と配列相同性を有する。機能的等価物はまた、配列番号１から１４、好ましくは、配列番号１または配列番号７または両方として記載される配列のいずれかと配列相同性を有する。かかる配列間の配列相同性は、好ましくは、少なくとも６０％、好ましくは、６５％以上、好ましくは、７５％以上、好ましくは、８０％以上、好ましくは、８５％以上、好ましくは、９０％以上、好ましくは、９５％以上である。かかる配列相同性は、当該分野において公知の多くのコンピュータプログラムのいずれか、例えば、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどにより得ることができる。かかる整列を行うために適したコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｕ．Ｓ．Ａ；Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、核酸 Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７）である。配列比較を行うことができる以外のソフトウェアの例は、これに限定されないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９ ｉｂｉｄ−Ｃｈａｐｔｅｒ １８）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、４０３−４１０）およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツールパッケージソフトを包含する。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡはどちらもオフラインおよびオンライン検索から入手可能である（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９ 前出、７−５８から７−６０ページ参照）。しかしながら、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。
他の実施形態において、機能的等価物は前記の配列のいずれかと特異的にハイブリッド形成できるであろう。１つの配列が別の配列とハイブリッド形成できるかどうかを決定する方法は、当該分野において公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）およびＡｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら（上記）に記載されている。非常に好ましい実施形態において、機能的等価物はストリンジェントな条件下、例えば ６５℃および０．１ｘＳＳＣ｛１ｘＳＳＣ＝０．１５ Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５ Ｍ Ｎａ３クエン酸塩 ｐＨ ７．０｝でハイブリッド形成できるであろう。
例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ非糖産生エキソアミラーゼと配列相同性を有する機能的等価物は、親酵素としての使用に適している。このような配列は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ配列と任意の１以上の位置で異なっている。さらに、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種の他の菌株、例えばＡＴＣＣ１７６８６からの非糖産生エキソアミラーゼも、親ポリペプチドとして用いることができる。ＰＳ４改変体ポリペプチド残基をこれらの親配列のいずれかに挿入して、改変体ＰＳ４ポリペプチド配列を生成させることができる。
ＰＳ４改変体ポリペプチドが１以上の突然変異をさらに含むのが望ましい場合、前述のようにＰＳ４改変体ペプチドの生成のための出発点または親ポリペプチドとして用いることができようにする目的で、前述のように、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種非糖産生エキソアミラーゼの機能的等価物の核酸配列、ならびに「ＰＳ４ファミリー」の他のメンバーにおいて対応する突然変異を引き起こすことができる。
特に、「ＰＳ４改変体ポリペプチド」なる用語に含まれるのは：
ＵＳ ６０／４８５，４１３、６０／４８５，５３９および６０／４８５，６１６；ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２１７２３およびＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２１７３９；ＵＳ １０／８８６，９０５および１０／８６６，９０３；ＵＳ ６０／６０８，９１９；ＵＳ ６０／６１２，４０７；６７０ ＵＳ ６０／４８５，５３９；ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００２４８７；ＵＳ １０／８８６，０２３；ＵＳ １０／８８６，５０５、ＵＳ １０／８８６，５２７およびＵＳ １０／８８６，５０４；ＵＳ １０／９４７，６１２において開示されているポリペプチドである。しかしながら、これらの文書は 先行技術として認められない。
かかるポリペプチドは、本明細書において記載される用途、特に、食品添加物として、前記のようなデンプンを処理するため、食品を調製するため、ベーカリー製品を製造するため、改良剤組成物の処方のために、組み合わせの処方のためなどで使用するのに適している。
（親配列の修飾）
親酵素は、アミノ酸レベルでまたは核酸レベルで修飾して、本明細書において記載されるＰＳ４改変体配列を生成させることができる。従って、本発明者らは１以上の対応するコドン変化を、非糖産生エキソアミラーゼポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列中に導入することにより、ＰＳ４改変体ポリペプチドを生成させる。
核酸ナンバリングは、好ましくは、配列番号６として示されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａエキソアミラーゼヌクレオチド配列の位置ナンバリングに準拠すべきである。別法として、または付加的に、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ１６７３２を有する配列が参照される。好ましい実施形態において、核酸ナンバリングは、配列番号６として示されるヌクレオチド配列を参照すべきである。しかしながら、アミノ酸残基ナンバリングに関して、この配列の残基ナンバリングは、参照目的にのみ用いられるべきである。特に、前記コドン変化は、任意のＰＳ４ファミリー核酸配列において引き起こすことができると理解される。例えば、配列変化は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ非糖産生エキソアミラーゼ核酸配列（例えば、Ｘ１６７３２、配列番号６またはＭ２４５１６、配列番号１２）において引き起こすことができる。
親酵素は、「完全」酵素を、すなわち、自然界において存在するままの（または突然変異した）その全長において含み得るか、またはその切断形態を含み得る。このようなもの由来のＰＳ４改変体は、従って、このように切断されていてもよいし、または「全長」であってもよい。切断は、Ｎ末端であっても、またはＣ末端であってもよく、好ましくは、Ｃ末端である。親酵素またはＰＳ４改変体は、活性であるかどうかなどに関わらず、１以上の部分、例えば、サブ配列、シグナル配列、ドメインまたは部分がない。例えば、親酵素またはＰＳ４改変体ポリペプチドは、前述のようにシグナル配列がない。別法として、または付加的に、親酵素またはＰＳ４改変体は１以上の触媒ドメインまたは結合ドメインがない。
非常に好ましい実施形態において、親酵素またはＰＳ４改変体は、非糖産生エキソアミラーゼにおいて存在するドメインの１以上、例えば、デンプン結合ドメインがない。例えば、ＰＳ４ポリペプチドは、配列番号１として示されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａ非糖産生エキソアミラーゼのナンバリングに関連して、４２９まで唯一の配列を有し得る。これはＰＳ４改変体ｐＳａｃ−ｄ３４、ｐＳａｃ−Ｄ２０およびｐＳａｃ−Ｄ１４についての場合であることに注意すべきである。
他の実施形態において、親酵素またはＰＳ４改変体は、「完全」酵素を、すなわち、自然界に存在する（または突然変異した）その全長において、Ｎ末端またはＣ末端で１以上の追加のアミノ酸配列とともに含む。例えば、親酵素またはＰＳ４改変体ポリペプチドは、Ｃ末端またはＮ末端で１つの追加のアミノ酸残基、例えば、Ｍ、Ａ、Ｇなどを含む。好ましくは、追加のアミノ酸残基はＮ末端で存在する。１以上の追加の残基が含まれる場合、位置ナンバリングは追加の長さにより相殺される。
（アミラーゼ）
ＰＳ４改変体ポリペプチドは一般にアミラーゼ活性を含む。
「アミラーゼ」なる用語は、例えば、特に、デンプンの分解を触媒できる酵素という、その通常の意味で用いられる。特に、これらは、デンプン中のα−Ｄ−（ｌ→４）Ｏ−グリコシド結合の開裂を触媒できる加水分解酵素である。
アミラーゼは、加水分解酵素として分類されるデンプン分解酵素であり、デンプン中のα−Ｄ−（ｌ→４）Ｏ−グリコシド結合を開裂させる。一般に、α−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１、α−Ｄ−（１→４）−グルカングルカノヒドロラーゼ）は、デンプン分子内のα−Ｄ−（ｌ→４）Ｏ−グリコシド結合をランダムに開裂させる、内部作用性酵素として定義される。対照的に、外部作用性デンプン分解酵素、例えば、β−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２、α−Ｄ−（ｌ→４）−グルカンマルトヒドロラーゼ）、および糖産生アルファ−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１３３）などのいくつかの生成物特異的アミラーゼは、基質の非還元末端からデンプン分子を開裂させる。β−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２０、α−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ）、グルコアミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．３、α−Ｄ−（ｌ→４）−グルカングルコヒドロラーゼ）、および生成物特異的アミラーゼは、デンプンから特定の長さのマルトオリゴ糖を産生させることができる。
（非糖産生エキソアミラーゼ）
本明細書において記載されるＰＳ４改変体ポリペプチドは、好ましくは非糖産生エキソアミラーゼ活性を示すポリペプチド由来（またはその改変体）である。好ましくは、これらの親酵素はそれ自体、非糖産生エキソアミラーゼである。ＰＳ４改変体ポリペプチドはそれ自体、非常に好ましい実施形態においても非糖産生エキソアミラーゼ活性を示す。
非常に好ましい実施形態において、「非糖産生エキソアミラーゼ酵素」なる用語は、本明細書において用いられる場合、当初はデンプンを、本明細書において記載されるような生成物測定法に従って分析される実質的な量のマルトースに分解しない酵素を意味する。
非常に好ましい実施形態において、非糖産生エキソアミラーゼは、エキソ−マルトテトラヒドロラーゼを含む。エキソ−マルトテトラヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．６０）はより正式には、グルカン１，４−アルファ−マルトテトラヒドロラーゼと呼ばれる。この酵素は、デンプン性多糖類における１，４−アルファ−Ｄ−グルコシド結合を加水分解して、非還元鎖末端から連続したマルトテトラオース残基を除去する。
非糖産生エキソアミラーゼは、米国特許第６，６６７，０６５号（本発明の一部として参照される）において詳細に記載されている。
（非糖産生エキソアミラーゼ活性の分析）
本明細書において記載される方法および組成物に従った使用に適した、非糖産生エキソアミラーゼ活性を有するポリペプチドを特徴づけるために、下記のシステムが用いられる。このシステムは、例えば、本明細書において記載されるＰＳ４親ポリペプチドまたは改変体ポリペプチドを特徴づけるために用いることができる。
最初の基礎知識として、ロウ様トウモロコシアミロペクチン（フランスのＲｏｑｕｅｔｔｅからＷＡＸＩＬＹＳ２００として入手可能）は非常にアミロペクチン含量が高い（９０％超）デンプンである。２０ｍｇ／ｍｌのロウ様トウモロコシデンプンを３分間、５０ ｍＭのＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、２ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ６．０の緩衝液中で３分間沸騰させ、続いて５０℃でインキュベートし、半時間以内に使用する。
１単位の非糖産生エキソアミラーゼは、前記のように調製された、５０ｍＭのＭＥＳ、２ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ ６．０中１０ ｍｇ／ｍｌのロウ様トウモロコシデンプン４ｍｌとともに試験管中、５０℃でインキュベートされた場合、１分あたり還元糖１マイクロモルに等しい加水分解生成物を放出する酵素の量として定義される。マルトースを標準として使用し、Ｂｅｒｎｆｅｌｄ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、（１９５４）、１、１４９−１５８のジニトロサリチル酸法または還元糖の定量化について当該分野において公知の別の方法を用いて、還元糖を測定する。
非糖産生エキソアミラーゼの加水分解生成物パターンは、０．７単位の非糖産生エキソアミラーゼを１５または３００分間、５０℃で、前述のようにして調製された緩衝液中１０ｍｇ／ｍｌのロウ様トウモロコシデンプン４ｍｌとともに試験管中でインキュベートすることにより決定される。試験管を３分間、沸騰水浴中に浸漬することにより、反応を停止させる。
溶離剤として酢酸ナトリウム、水酸化ナトリウムおよび水を用い、パルスアンペロメトリック検出を用い、標準としてグルコースからマルトヘプトースまでの公知直鎖マルトオリゴ糖を用いたＤｉｏｎｅｘ ＰＡ １００カラムを用いたアニオン交換ＨＰＬＣにより、加水分解生成物を分析し、定量化する。マルトオクトースについて使用される応答ファクターは、マルトヘプトースについて見られる応答ファクターである。
好ましくは、ＰＳ４改変体ポリペプチドは非糖産生エキソアミラーゼ活性を有するので、 ０．７単位の量の前記非糖産生エキソアミラーゼが、５０ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸および２ｍＭ塩化カルシウムを含有する１ｍｌの緩衝溶液につき１０ｍｇの前もって沸騰させたロウ様トウモロコシデンプンの水溶液４ｍｌ中、５０℃の温度、ｐＨ６で１５分間インキュベートされるならば、酵素は、２から１０までのＤ−グルコピラノシル単位を有する１以上の直鎖マルトオリゴ糖および場合によりグルコースからなる加水分解生成物を産生し；少なくとも６０重量％、好ましくは少なくとも７０重量％、さらに好ましくは、少なくとも８０重量％、最も好ましくは少なくとも８５重量％の前記加水分解生成物は、３から１０までのＤ−グルコピラノシル単位の直鎖マルトオリゴ糖、好ましくは４から８までのＤ−グルコピラノシル単位からなる直鎖マルトオリゴ糖からなる。
参照しやすいように、そして本発明の目的に関して、０．７単位の量の非糖産生エキソアミラーゼを１５分間、５０℃の温度、ｐＨ６．０で、５０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸および２ｍＭの塩化カルシウムを含有する緩衝溶液１ｍｌあたり、あらかじめ沸騰させたロウ様トウモロコシデンプン１０ｍｇの水溶液４ｍｌ中でインキュベートする機構は、「ロウ様トウモロコシデンプンインキュベーション試験」と呼ばれる。
従って、選択的に発現された、好ましいＰＳ４改変体ポリペプチドであって、非糖産生エキソアミラーゼであるものは、ロウ様トウモロコシデンプンインキュベーション試験において、２から１０までのＤ−グルコピラノシル単位を有する１以上の直鎖マルトオリゴ糖および場合によりグルコースからなる加水分解生成物を産生する能力を有するとして特徴づけられ；前記加水分解生成物の少なくとも６０％、好ましくは、少なくとも７０重量％、さらに好ましくは、少なくとも８０重量％、最も好ましくは少なくとも８５重量％は、３から１０までのＤ−グルコピラノシル単位を有する直鎖マルトオリゴ糖、好ましくは４から８までのＤ−グルコピラノシル単位からなる直鎖マルトオリゴ糖からなる。
ロウ様トウモロコシデンプンインキュベーション試験における加水分解生成物は、２から１０までのＤ−グルコピラノシル単位の１以上の直鎖マルトオリゴ糖および場合によりグルコースを含み得る。ロウ様トウモロコシデンプンインキュベーション試験における加水分解生成物は、他の加水分解生成物も含み得る。それでも、３から１０までのＤ−グルコピラノシル単位の直鎖マルトオリゴ糖の量（重量％）は、２から１０までのＤ−グルコピラノシル単位の１以上の直鎖マルトオリゴ糖および場合によりグルコースからなる加水分解生成物の量に基づく。言い換えると、３から１０までのＤ−グルコピラノシル単位の直鎖マルトオリゴ糖の量（重量％）は、２から１０までのＤ−グルコピラノシル単位の１以上の直鎖マルトオリゴ糖およびグルコース以外の加水分解生成物の量に基づかない。
加水分解生成物を任意の好適な手段により分析できる。例えば、加水分解生成物は、パルスアンペロメトリック検出を用い、例えば、標準としてグルコースからマルトヘプトースまでの公知の直鎖マルトオリゴ糖を用いたＤｉｏｎｅｘ ＰＡ １００ カラムを用いたアニオン交換ＨＰＬＣにより分析できる。
参照しやすいように、そして本発明の目的に関して、パルスアンペロメトリック検出を用い、グルコースからマルトヘプトースまでの公知直鎖マルトオリゴ糖を標準として用いたＤｉｏｎｅｘ ＰＡ １００を用いたアニオン交換ＨＰＬＣを用いて、加水分解生成物を分析する機構は、「アニオン交換による分析」と称する。もちろん、表示したように、他の分析技術、ならびに他の特異的アニオン交換技術も十分間に合うであろう。
従って、別の表現をすると、好ましいＰＳ４改変体ポリペプチドは、非糖産生エキソアミラーゼ活性を有するので、ロウ様トウモロコシデンプンインキュベーション試験において、２から１０までのＤ−グルコピラノシル単位の１以上の直鎖マルトオリゴ糖および場合によりグルコースからなる加水分解生成物を産生する能力を有し、前記加水分解生成物は、アニオン交換により分析でき；したがって、前記加水分解生成物の少なくとも６０重量％、好ましくは少なくとも７０重量％、さらに好ましくは少なくとも８０重量％、最も好ましくは少なくとも８５重量％は、３から１０までのＤ−グルコピラノシル単位のマルトオリゴ糖、好ましくは、４から８までのＤ−グルコピラノシル単位からなる直鎖マルトオリゴ糖からなる。
本明細書において用いられる場合、「直鎖マルトオリゴ糖」なる用語は、アルファ−（１→４）結合により結合した２−１０単位のα−Ｄ−グルコピラノースを意味する、通常の意味で用いられる。
非常に好ましい実施形態において、本明細書において記載されるＰＳ４ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較した場合、好ましくは同じ条件下で試験された場合、改良されたエキソアミラーゼ活性、好ましくは非糖産生エキソアミラーゼ活性を有する。特に、非常に好ましい実施形態において、ＰＳ４改変体ポリペプチドは、好ましくは、ロウ様トウモロコシデンプン試験において測定した場合、その親と比較して、１０％以上、好ましくは、２０％以上、好ましくは、５０％以上のエキソアミラーゼ活性を有する。
加水分解生成物は、任意の奥的な手段により分析できる。例えば、加水分解生成物は、 パルスアンペロメトリック検出を使用し、例えば、グルコースからマルトヘプトースまでの公知直鎖マルトオリゴ糖を標準として使用したＤｉｏｎｅｘ ＰＡ １００カラムを用いたアニオン交換ＨＰＬＣにより分析できる。
本明細書において用いられる場合、「直鎖マルトオリゴ糖」なる用語は、α−（ｌ→４）結合により結合した２−２０単位のα−Ｄ−グルコピラノースを意味する通常の意味で用いられる。
（改良された取り扱い特性）
本明細書において記載されるＰＳ４改変体は、好ましくは、親酵素と比較した場合に改良された特性、例えば、改良された耐熱性、改良されたｐＨ安定性、または改良されたエキソ特異性の任意の１以上を有する。本明細書において記載されるＰＳ４改変体は、好ましくは、改良された特性も有し、ＰＳ４改変体ポリペプチドで処理された食品は、親ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドで処理された食品と比較した場合に、より低い硬度、より高い弾力性またはより高い凝集性のいずれか１つまたは全部を有する。
特定の理論により拘束されることを望まないが、本発明者らは、特定の位置での突然変異は、かかる突然変異を含むポリペプチドの特性に対して、個別および累積的効果を有すると考える。
（耐熱性およびＰＨ安定性）
好ましくは、ＰＳ４改変体ポリペプチドは耐熱性であり；好ましくは、その親酵素よりも高い耐熱性を有する。
小麦および他の穀物において、アミロペクチンにおける外側鎖は、ＤＰ １２−１９の範囲である。従って、アミロペクチン側鎖の酵素加水分解、例えば、前記のような非糖産生エキソアミラーゼ活性を有するＰＳ４改変体ポリペプチドによるものは、その結晶化傾向を著しく減少させ得る。
ベーキングの目的で使用される小麦および他の穀物におけるデンプンは、一般に、アミラーゼによる酵素の攻撃に対して耐性であるデンプン顆粒の形態において存在する。従って、デンプン変性は、主に、損傷デンプンに限定され、デンプンのゼラチン化が約６０℃で開始するまで、生地処理および初期ベーキングの間、非常にゆっくりと進行する。これに関する結果として、非常に高度の耐熱性を有するアミラーゼのみが、ベーキングの間にデンプンを有効に変性させることができる。一般に、アミラーゼの効率は、耐熱性が増大するとともに増大する。これは、耐熱性が高いほど、酵素はベーキングの間、より長時間活性であり、従って、より高い老化防止効果が得られるためである。
従って、本明細書において前述されたＰＳ４改変体ポリペプチドの使用は、処理して食品にする任意の段階で、例えば、パンにするためのベーキング前、ベーキング中またはベーキング後にデンプンに添加される場合、老化（ｒｅｔｒｏｇｒａｄａｔｉｏｎ）を遅らせるか、または妨害するか、または抑制することができる。このような使用を以下でさらに詳細に記載する。
本明細書において用いられる場合、「耐熱性」なる用語は、酵素が高温にさらされた後で活性を保持する能力に関する。好ましくは、ＰＳ４改変体ポリペプチドは、約５５℃〜約８０℃以上の温度でデンプンを分解できる。好適には、酵素は約９５℃までの温度にさらされた後にその活性を保持する。
酵素、例えば、非糖産生エキソアミラーゼの耐熱性は、その半減期により測定される。従って、本明細書において記載されるＰＳ４改変体ポリペプチドは、好ましくは、５５℃〜約９５℃以上、好ましくは、約８０℃の高温で、親酵素に対して、好ましくは、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％以上延長された半減期を有する。
本明細書において用いられる場合、半減期（ｔ１／２）は、その間に酵素活性の半分が所定の熱条件下で不活性化される時間（分）である。好ましい実施形態において、半減期は８０℃で分析される。好ましくは、サンプルは１から１０分間、８０℃以上で加熱される。次に、本明細書において記載される方法のいずれかにより、残存するアミラーゼ活性を測定することにより、半減期の値を計算する。好ましくは、半減期分析は、実施例においてさらに詳細に記載されるようにして行われる。
好ましくは、本明細書において記載されるＰＳ４改変体は、ベーキングの間活性であり、約５５℃の温度で開始する、デンプン顆粒のゼラチン化中またはゼラチン化後にデンプンを加水分解する。耐熱性が高いほど、非糖産生エキソアミラーゼはより長い時間、活性であり得、従って、より大きな老化防止効果を提供する。しかしながら、約８５℃より高い温度でのベーキングの間、酵素不活性化が起こり得る。これが起こるならば、非糖産生エキソアミラーゼは徐々に不活性化して、最終的なパンにおいてベーキング後に実質的な活性は存在しない。従って、優先的に、前記のような使用に適した非糖産生エキソアミラーゼは５０℃より高く９８℃より低い最適温度を有する。
本明細書において記載されるＰＳ４改変体の耐熱性は、耐熱性がより高くなり、従って、本明細書において記載される用途により適するようにプロテインエンジニアリングを使用することにより改良することができ；本発明者らは従って、プロテインエンジニアリングにより、さらに耐熱性になるように修飾されたＰＳ４改変体の使用を包含する。
好ましくは、ＰＳ４改変体ポリペプチドはｐＨ安定性であり；さらに好ましくは、同族親ポリペプチドよりも高いｐＨ安定性を有する。本明細書において用いられる場合、「ｐＨ 安定性」なる用語は、酵素が広いｐＨ範囲にわたって活性を保持する能力に関する。好ましくは、ＰＳ４改変体ポリペプチドは約５から約１０．５のｐＨでデンプンを分解できる。一つの実施形態において、ｐＨ安定性の程度は、特定のｐＨ条件において酵素の半減期を測定することにより分析できる。もう一つ別の実施形態において、ｐＨ安定性の程度は、特定のｐＨ条件において酵素の活性または特異的活性を測定することにより分析できる。 特定のｐＨ条件は、ｐＨ５〜ｐＨ１０．５の任意のｐＨである。
したがって、ＰＳ４改変体ポリペプチドは、同じ条件下での親ポリペプチドと比較した場合、より長い半減期、またはより高い活性（分析に依存する）を有する。ＰＳ４改変体ポリペプチドは、同じｐＨ条件下でのその親ポリペプチドと比較した場合、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％以上長い半減期を有し得る。選択的に、あるいは付加的に、これらは、同じｐＨ条件下での親ポリペプチドと比較した場合に、このようなより高い活性を有し得る。
（エキソ特異性）
いくつかの非糖産生エキソアミラーゼは、ある程度のエンドアミラーゼ活性を有し得ることが知られている。いくつかの場合において、この種類の活性は、エンドアミラーゼ活性は、分枝デキストリンの蓄積のために粘着性またはゴム状のクラムをもたらすことにより、おそらくは最終パン製品の品質にマイナスの影響を及ぼし得るので、減少させるかまたは排除する必要がある。
エキソ特異性は、全アミラーゼ活性の全エンドアミラーゼ活性に対する比を決定することにより有用に測定できる。この比は、本明細書において、「エキソ特異性指数」と称する。好ましい実施形態において、酵素は２０以上のエキソ特異性指数を有するならば、エキソアミラーゼと見なされる。すなわち、その合計アミラーゼ活性（エキソアミラーゼ活性を包含する）はそのエンドアミラーゼ活性よりも２０倍以上高い。非常に好ましい実施形態において、エキソアミラーゼのエキソ特異性指数は、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、または１００以上である。非常に好ましい実施形態において、エキソ特異性指数は、１５０以上、２００以上、３００以上、４００以上、５００以上、または６００以上である。
合計アミラーゼ活性およびエンドアミラーゼ活性は、当該分野において公知の任意の手段により測定することができる。例えば、合計アミラーゼ活性は、デンプン基質から放出された還元末端の合計数を分析することにより測定できる。別法として、Ｂｅｔａｍｙｌ分析の使用が、実施例においてさらに詳細に記載されており、便宜上、実施例において分析されるアミラーゼ活性は表において「Ｂｅｔａｍｙｌ単位」で記載される。
Ｐｈａｄｅｂａｓ Ｋｉｔ（ＰｈａｒｍａｃｉａおよびＵｐｊｏｈｎ）の使用により、エンドアミラーゼ活性を分析できる。これは、青色標識された架橋デンプン（アゾ色素で標識）を使用し；デンプン分子における内部切断部のみが標識を放出し、この間、外部切断部は放出しない。色素の放出は、分光測光法により測定できる。従って、Ｐｈａｄｅｂａｓ Ｋｉｔはエンドアミラーゼ活性を測定し、便宜上、このような分析（実施例において記載）の結果は、本明細書において「Ｐｈａｄｅｂａｓ単位」と呼ばれる。
従って、非常に好ましい実施形態において、エキソ特異性指数はＢｅｔａｍｙｌ単位／Ｐｈａｄｅｂａｓ単位（「Ｂ／Ｐｈａｄ」とも記載）で表される。
エキソ特異性はまた、先行技術、例えば、本発明者らの国際特許公開番号ＷＯ９９／５０３９９において記載された方法に従って分析できる。これは、エンドアミラーゼ活性とエキソアミラーゼ活性間の比によりエキソ特異性を測定する。従って、好ましい態様において、本明細書において記載されるＰＳ４改変体は、エキソアミラーゼ活性１単位あたり０．５未満のエンドアミラーゼ単位（ＥＡＵ）を有する。好ましくは、本発明の使用に適した非糖産生エキソアミラーゼは、エキソアミラーゼ活性１単位あたり０．０５未満のＥＡＵ、さらに好ましくは、エキソアミラーゼ活性１単位あたり０．０１未満のＲＥＡＵを有する。
本明細書において記載されるＰＳ４改変体は好ましくは、例えば、前記のような、これらがエキソアミラーゼであることと一致するエキソ特異性指数により測定されるエキソ特異性を有する。さらに、これらは好ましくは、これらが誘導される親酵素またはポリペプチドと比較した場合に、より高いか、または増大したエキソ特異性を有する。従って、例えば、ＰＳ４改変体ポリペプチドは、好ましくは同じ条件下で、その親ポリペプチドと比較した場合、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％以上のエキソ特異性指数を有する。これらは、好ましくは同じ条件下での、その親ポリペプチドと比較した場合に、１．５倍以上、２倍以上、５倍以上、１０倍以上、５０倍以上、１００倍以上である。
（改良された取り扱い特性）
本明細書において記載されるＰＳ４改変体は、好ましくは、親ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドと比較して、改良された取り扱い特性を有する。改良された取り扱い特性は、好ましい実施形態において、改良されたベーキング特性を含む。
このように、ＰＳ４改変体は、ＰＳ４改変体ポリペプチドで処理された食品が、親ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドで処理された食品と比較して、改良された取り扱い特性または好ましくはベーキング特性を有するようなものである。取り扱い特性またはベーキング特性は：硬度、弾力性および凝集性からなる群から選択できる。
これらの取り扱い特性は、当該分野において公知の任意の手段により試験することができる。例えば、硬度、弾力性および凝集性は、例えば、実施例において記載されるような テクスチャー分析器を用いたテクスチャー特性分析によりパンのスライスを分析することにより決定できる。
（硬度）
本明細書において記載されるＰＳ４改変体は、好ましくは、親ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドで処理された食品と比べて硬度を低下させるようなものである。
硬度は、好ましい実施形態において、食品の柔らかさと逆相関し；従って、高度の柔らかさは、より低い硬度を反映し、逆の場合も同じである。
硬度は、好ましくは、実施例１２において記載される「硬度評価プロトコル」により測定される。
したがって、本明細書において記載されるＰＳ４改変体は、好ましくは、ＰＳ４改変体ポリペプチドで処理された食品が、親ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドで処理された食品と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％以上低い硬度を有するようなものである。ＰＳ４改変体ポリペプチドで処理された食品は、親ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドで処理された食品と比較して、１．１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍以上低い硬度を有し得る。
（弾力性）
本明細書において記載されるＰＳ４改変体は、好ましくは、親ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドで処理された食品と比べて高い弾力性を有するようなものである。
弾力性は、好ましくは、実施例１３において記載される「弾力性評価プロトコル」により測定される。
したがって、本明細書において記載されるＰＳ４改変体は、好ましくは、ＰＳ４改変体ポリペプチドで処理された食品が、親ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドで処理された食品と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％以上高い弾力性を有するようなものである。ＰＳ４改変体ポリペプチドで処理された食品は、親ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドで処理された食品と比較して、１．１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍以上高い弾力性を有し得る。
（凝集性）
本明細書において記載されるＰＳ４改変体は、好ましくは、ＰＳ４改変体ポリペプチドで処理された食品が、親ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドで処理された食品と比較して、より高い凝集性を有するようなものである。
凝集性は、好ましくは、実施例１４において記載される「凝集性評価プロトコル」により測定される。
従って、本明細書において記載されるＰＳ４改変体は、好ましくは、親ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドで処理された食品と比較して、ＰＳ４改変体ポリペプチドで処理された食品が１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％以上高い凝集性を有するようなものである。ＰＳ４改変体ポリペプチドで処理された食品は、親ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドで処理された食品と比較して、１．１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍以上高い凝集性を有するようなものである。
（ＰＳ４改変体ポリペプチドおよび核酸の使用）
ＰＳ４改変体ポリペプチド、核酸、宿主細胞、発現ベクター等は、アミラーゼを使用できる任意の用途において用いることができる。特に、これらは任意の非糖産生エキソアミラーゼの置換するために使用できる。これらは、単独または他の公知アミラーゼまたは非糖産生エキソアミラーゼとの組み合わせにおいて、アミラーゼまたは非糖産生エキソアミラーゼ活性を補完するために使用できる。
本明細書において記載されるＰＳ４改変体配列は、食品産業における様々な用途−例えば、ベーカリーおよび飲料製品において用いることができ、これらは他の用途、例えば、医薬組成物、またはさらには化学産業においても用いることができる。特に、ＰＳ４改変体ポリペプチドおよび核酸は、ベーキング（ＷＯ ９９／５０３９９において開示）および粉標準化（体積増大または改良）をはじめとする様々な工業用途について有用である。これらは、マルトテトラオースをデンプンまたは他の基質から製造するために使用できる。
本発明者らは従って、食品を調製する方法であって：（ａ）非糖産生エキソアミラーゼを得；（ｂ）本明細書において記載される非糖産生エキソアミラーゼの１以上の任意の場所で突然変異を導入し；（ｃ）得られたポリペプチドを食品成分と混合することを含む方法を記載する。
ベーカリー製品、例えばパンの体積を増大させるために、ＰＳ４改変体ポリペプチドを用いることができる。特定の理論により拘束されることを望まないが、本発明者らは、これは、エキソアミラーゼショートニングアミロース分子の結果としての、加熱（例えばベーキング）中の粘度の減少の結果であると考える。このことは、発酵により生じた二酸化炭素があまり障害なくパンのサイズを増大させることを可能にする。
従って、ＰＳ４改変体ポリペプチドを含むか、またはＰＳ４改変体ポリペプチドで処理された食品は、このような処理をされていないか、または親ポリペプチドで処理された製品と比較した場合、体積が膨張する。言い換えると、食品は、食品の体積あたり、より大きな体積の空気を有する。選択的に、または付加的に、ＰＳ４改変体ポリペプチドで処理された食品は、より低い密度、すなわち、体積あたりの重量（または質量）比を有する。特に好ましい実施形態において、パンの体積を増大させるためにＰＳ４改変体ポリペプチドが使用される。体積増大または膨張は、食品のガム質またはデンプン質を減少させるので有益である。軽い食べ物が消費者に好まれ、消費者満足体験が増大する。好ましい実施形態において、ＰＳ４改変体ポリペプチドの使用は、体積を１０％、２０％、３０％ ４０％、５０％以上増大させる。
食品の体積を増加させるためのＰＳ４改変体ポリペプチドの使用は、実施例において詳細に記載されている。
（食品用途）
本明細書において記載されるＰＳ４改変体ポリペプチドおよび核酸は、食物として、または食物の調製において使用できる。特に、これらは食物に、すなわち、食品添加物として添加できる。「食物」なる用語は、調理された食物、ならびに、粉としてなど食物の成分の両方を包含することを意図される。好ましい態様において、食物は、人間が消費するためのものである。食物は、用途および／または適用様式および／または投与様式に応じて、溶液の形態、または固体であってよい。
ＰＳ４改変体ポリペプチドおよび核酸は食品成分として用いることができる。本明細書において用いられる場合、「食品成分」なる用語は、機能性食品または食材に添加されるか、または添加できる処方を包含し、低レベルで、例えば、酸性化または乳化を必要とする様々な製品において使用できる処方を包含する。食品成分は、用途および／適用様式および／または投与様式に応じて、溶液の形態、または固体であってよい。
本明細書において開示されるＰＳ４改変体ポリペプチドおよび核酸は、食品サプリメントであってもよいし、あるいは食品サプリメントに添加してもよい。本明細書において開示されるＰＳ４改変体ポリペプチドおよび核酸は、機能性食品であってもよいし、機能性食品に添加してもよい。本明細書において用いられる場合、「機能性食品」なる用語は、栄養効果および／または味覚満足度を提供できるだけでなく、さらなる有益な効果を消費者に提供できる食物を意味する。機能性食品の法律上の定義はないが、この分野において関心のあるほとんどの団体は、これらが特定の健康上の効果を有するとして市販されることに同意している。
ＰＳ４改変体ポリペプチドは、食品または食材の製造においても使用できる。典型的な食材としては、乳製品、肉製品、家禽生産食品類、魚加工品および生地製品が挙げられる。 生地製品は、揚げた（ｆｒｉｅｄ、ｄｅｅｐ ｆｒｉｅｄ）生地、ローストされた生地、ベークされた生地、蒸された生地、およびゆでた生地、例えば、蒸しパンおよび餅を包含する任意の加工生地製品であってよい。非常に好ましい実施形態において、食品はベーカリー製品である。
好ましくは、食材はベーカリー製品である。典型的なベーカリー（ベークされた）製品は、パン、例えば、食パン、ロールパン、バンズ、ピザ生地など、ペストリー、プレッツェル、トルティーヤ、ケーキ、クッキー、ビスケット、クラッカーなどを包含する。
食品は好ましくは、本明細書において記載されるＰＳ４改変体ポリペプチドの改良された取り扱い特性またはベーキング特性の１以上から利益を得る。改良された取り扱い特性またはベーキング特性は：改良された硬度、改良された弾力性および改良された凝集性からなる群から選択することができる。
本発明者らは、従って、非糖産生エキソアミラーゼを含む食品添加物を修飾する方法であって、突然変異を本明細書において記載される非糖産生エキソアミラーゼの１以上の位置のいずれかで導入することを含む方法を記載する。食品成分、食品サプリメント、食品、または食材を修飾するために、同じ方法を用いることができる。
（老化（ＲＥＴＲＯＧＲＡＤＡＴＩＯＮ／ＳＴＡＬＩＮＧ））
本発明者らは、デンプン媒体、例えば、デンプンゲルの老化を遅らせることができるＰＳ４改変体タンパク質の使用を記載する。ＰＳ４改変体ポリペプチドは、デンプンの有害な老化を特に遅らせることができる。
ほとんどのデンプン顆粒は、２つのポリマー：本質的に直鎖のアミロースおよび高度に分岐したアミロペクチンの混合物からなる。アミロペクチンは、（１−４）結合により結合したα−Ｄ−グルコピラノシル単位の鎖からなる非常に大きく、分岐した分子であり、前記鎖はα−Ｄ−（ｌ−６）結合により結合して、分枝を形成する。アミロペクチンは、全ての天然のデンプンにおいて存在し、ほとんどの一般的なデンプンの約７５％を構成する。アミロースは、ほとんどα−Ｄ−（ｌ−６）分枝を有さない、（１−４）結合α−Ｄ−グルコピラノシル単位を有する本質的に直線状の鎖である。ほとんどのデンプンは約２５％のアミロースを含有する。
水の存在下で加熱されたデンプン顆粒は、ゼラチン化と呼ばれる秩序無秩序相転移を受け、ここで、液体は膨張する顆粒により吸収される。ゼラチン化温度は、異なるデンプンに関して変化する。新たにベークされたパンを冷却すると、アミロースフラクションが数時間以内に老化して、網目構造が発達する。このプロセスは、低い硬度および改良されたスライス特性を有する望ましいパン構造を造る点で有益である。アミロペクチンのさらにゆっくりとした結晶化が、ベーキング後数日の間のゼラチン化したデンプン顆粒内で起こる。このプロセスにおいて、アミロペクチンは、その中にデンプン顆粒が埋め込まれるアミロース網目構造を強化すると考えられる。この強化はパンのクラムの硬度の増加に至る。強化は、パン老化の主な原因の一つである。
ベークされた製品の品質は、貯蔵の間に徐々に劣化することが知られている。デンプン再結晶（老化（ｒｅｔｒｏｇｒａｄａｔｉｏｎ）とも呼ばれる）の結果として、クラムの保水容量が、変化し、官能性および食物特性に関して重大な関係がある。クラムは柔らかさおよび弾力性を失い、堅く、もろくなる。クラムの硬度の増大は、しばしば、パンの老化プロセスの尺度として用いられる。
アミロペクチンの有害な老化の速度は、アミロペクチンの側鎖の長さに依存する。従って、アミロペクチン側鎖の酵素加水分解、例えば、非糖産生エキソアミラーゼ活性を有するＰＳ４改変体ポリペプチドによるものは、その結晶化傾向を著しく減少させることができる。
従って、本明細書において記載されるＰＳ４改変体ポリペプチドの使用は、その食品への加工の任意の段階、例えば、ベーキングしてパンにする前、その間またはその後に添加される場合、老化を遅らせるか、または妨害するか、または抑制することができる。このような使用は、以下でさらに詳細に記載される。
本発明者らは、従って、生地製品の非糖産生エキソアミラーゼの老化（ｓｔａｌｉｎｇ）、好ましくは有害な老化（ｒｅｔｒｏｇｒａｄａｔｉｏｎ）を防止する能力を改良する方法であって、突然変異を本明細書において記載される非糖産生エキソアミラーゼの１以上の位置のいずれかで導入することを含む方法を記載する。
（老化（ｒｅｔｒｏｇｒａｄａｔｉｏｎ（ｓｔａｌｉｎｇを包含する））を測定するための分析法）
本明細書において記載される非糖産生エキソアミラーゼ活性を有するＰＳ４改変体ポリペプチドの老化防止効果を評価するために、クラムの硬度を、Ｉｎｓｔｒｏｎ ４３０１ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｆｏｏｄ Ｔｅｘｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｚｅｒまたは当該分野において公知の類似の装置により、ベーキングの１、３および７日後に測定することができる。
当該分野において伝統的に用いられる別の方法であって、非糖産生エキソアミラーゼ活性を有するＰＳ４改変体ポリペプチドのデンプン老化に対する影響を評価するために用いられる方法は、ＤＳＣ（示差走査熱力測定法）に基づく。ここで、クラムまたは酵素とともに、または酵素無しで（対照）ベークされたモデル生地システムからのクラムにおける老化アミロペクチンの融解エンタルピーを測定する。記載された実施例において適用されるＤＳＣ装置は、１０℃／分で２０から９５℃までの温度勾配で動作する、Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ ＤＳＣ ８２０である。サンプルを調製するために、１０−２０ｍｇのクラムを秤量し、Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏアルミ鍋に移し、これを次に密封する。
記載される実施例において使用されるモデルシステム生地は、標準的粉および最適量の水または緩衝液（非糖産生ＰＳ４改変体エキソアミラーゼを含むか、または含まない）を含有する。これらは１０または５０ｇのＢｒａｂｅｎｄｅｒ Ｆａｒｉｎｏｇｒａｐｈ中でそれぞれ６または７分間混合される。生地のサンプルを蓋付のガラス製試験管（１５＊０．８ｃｍ）中に入れる。これらの試験管を水浴中、３０分で出発する水浴中でのベーキングプロセス、３３℃でのインキュベーションに付し、続いて１．１℃／分の勾配で３３から９５℃まで加熱し、最終的に９５℃で５分間インキュベーションする。続いて、ＤＳＣ分析前に、２０℃でサーモスタット中で試験管を保存する。
好ましい実施形態において、本明細書において記載されるＰＳ４改変体は、対照と比較して、減少した融解エンタルピーを有し、非常に好ましい実施形態において、ＰＳ４改変体は１０％以上減少した融解エンタルピーを有する。好ましくは、これらは、対照と比較した場合に、２０％以上、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上減少した融解エンタルピーを有する。
Figure 2008544751
 （表２）
前記表２は、７日貯蔵後の異なる量のｐＳａｃ−Ｄ３４を用いて調製されたモデル生地システムのＤＳＣ値を示す。０．５、１および２ｐｐｍ（またはマイクログラム・パー・グラム）の粉を試験する。
（デンプン製品の調製）
本発明者らは、食品、特にデンプン製品の調製におけるＰＳ４改変体ポリペプチドの使用を提供する。方法は、非糖産生エキソアミラーゼ酵素、例えば、ＰＳ４改変体ポリペプチドをデンプン媒体に添加することにより、デンプン製品を形成することを含む。デンプン 媒体が生地であるならば、生地は、粉、水、非糖産生エキソアミラーゼであって、ＰＳ４改変体ポリペプチドであるものおよび場合により他の可能な成分および添加剤を混合することにより調製される。
「デンプン」なる用語は、デンプンそれ自体またはその成分、特にアミロペクチンを意味する。「デンプン媒体」なる用語は、デンプンを含む好適な媒体を意味する。 「デンプン製品」なる用語は、デンプンを含有するか、またはデンプンベースであるか、またはデンプン由来の任意の製品を意味する。好ましくは、デンプン製品は、粉から得られるデンプンを含有するか、またはこれに基づくか、またはこれから誘導される。「粉」なる用語は、本明細書において用いられる場合、小麦または他の穀物の細引き粉と同義である。しかしながら、好ましくは、この用語は、小麦自体から得られ、別の穀類からではない粉を意味する。従って、また別段の記載がない限り、「小麦粉」についての言及は、本明細書において用いられる場合、好ましくは、小麦粉自体、ならびに媒体、例えば生地中存在する場合の小麦粉を意味する。
好ましい粉は、小麦粉またはライ麦粉または小麦粉とライ麦粉の混合物である。しかしながら、他の種類の穀類、例えば、米、トウモロコシ、大麦、およびアズキモロコシ由来の粉を含む生地も想定される。好ましくは、デンプン製品はベーカリー製品である。さらに好ましくは、デンプン製品はパン製品である。なおいっそう好ましくは、デンプン製品はベークされたデンプン質のパン製品である。「ベークされたデンプン質のパン製品」なる用語は、粉、水、および膨張剤を生地形成条件下で混合することにより得ることができる生地に基づく任意のベークされた製品を意味する。さらなる成分をもちろん生地混合物に添加することができる。
したがって、デンプン製品がベークされたデンプン質のパン製品であるならば、プロセスは、粉、水、および膨張剤を、生地形成条件下で、任意の適切な順序で混合し、ＰＳ４改変体ポリペプチドを、場合によりプレミックスの形態で添加することを含む。膨張剤 は化学膨張剤、例えば、重炭酸ナトリウムまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（パン酵母）の任意の株であってよい。
ＰＳ４改変体非糖産生エキソアミラーゼを水または生地成分混合物を含む任意の生地成分と、または任意の添加剤または添加剤混合物と一緒に添加することができる。生地はベーキング産業または粉生地ベースの製品を製造する任意の他の産業において一般的な通常の生地調製法により調製できる。
デンプン質のパン製品、例えば、精白パン、篩ったライ麦粉および小麦粉から製造されたパン、ロールパンなどのべーキングは、典型的には、パン生地を１８０〜２５０℃の範囲のオーブン温度で、約１５から６０分間ベーキングすることにより行われる。ベーキングプロセスの間、急な温度勾配（２００→１２０℃）が外側生地層において広まっており、外側生地層では、焼き製品の特徴的な堅い外皮が発達する。しかしながら、蒸気発生のための熱消費により、クラムの温度は、ベーキングプロセスの最後でやっと１００℃に近くなる。
本発明者らは、従って：（ａ）デンプン媒体を提供し；（ｂ）デンプン媒体に本明細書において記載されるＰＳ４改変体ポリペプチドを添加し；（ｃ）段階（ｂ）の間または（ｂ）の後に、デンプン媒体に熱を加えて、パン製品を製造することを含むパン製品の製造法を記載する。本発明者らはさらに、デンプン媒体に前記のＰＳ４改変体ポリペプチドを添加することを含む、パン製品の製造法も記載する。
非糖産生エキソアミラーゼＰＳ４改変体ポリペプチドを、単独の活性成分として、または１以上の追加の生地成分または生地添加物との混合物においてのいずれかで酵素を含む液体調製物として、または乾燥粉末組成物として添加することができる。
（改良された組成物）
本発明者らは、パン改良剤組成物および生地改良剤組成物を包含する改良剤組成物を記載する。これらは、ＰＳ４改変体ポリペプチドを、場合によりさらなる成分、またはさらなる酵素、または両方とともに含む。
本発明者らはさらに、パンおよび生地改良剤組成物のベーキングにおける使用を提供する。さらに別の態様において、本発明者らは、パン改良剤組成物または生地改良剤組成物から得られる焼き製品または生地も提供する。もう一つ別の態様において、本発明者らは、パン改良剤組成物または生地改良剤組成物の使用から得られる焼き製品または生地を記載する。
（生地調製物）
生地は、粉、水、ＰＳ４改変体ポリペプチド（前述のとおり）を含む生地改良剤組成物および場合により他の成分および添加剤を混合することにより調製できる。
生地改良剤組成物を粉、水または任意の他の成分または添加剤を含む任意の生地成分とともに添加することができる。生地改良剤組成物は、粉または水または任意の他の成分または添加剤の前に添加することができる。生地改良剤組成物は、粉または水、または任意の他の成分または添加剤の後に添加することができる。生地は、ベーキング産業または粉生地ベースの製品を製造する他の産業において一般的な通常の生地調製法により調製することができる。
生地改良剤組成物は、液体調製物として、または組成物を単独活性成分として、または１以上の他の生地成分または添加剤との混合物においてのいずれかで含む、乾燥粉末組成物の形態において添加することができる。
添加されるＰＳ４改変体ポリペプチド非糖産生エキソアミラーゼの量は、通常、最終生地において、粉１ｋｇあたり５０から１００，０００単位、好ましくは、粉１ｋｇあたり１００から５０，０００単位が存在するようになる量である。好ましくは、この量は、粉１ｋｇあたり２００から２０，０００単位の範囲である。別法として、ＰＳ４改変体ポリペプチド非糖産生エキソアミラーゼは、粉基準で０．０２−５０ｐｐｍの酵素（粉１ｋｇあたり０．０２−５０ｍｇの酵素）、好ましくは、０．２−１０ｐｐｍが最終生地において存在するようになる量で添加される。
この文脈において、１単位の非糖産生エキソアミラーゼは、５０℃で試験管中、以下に記載されるような５０ｍＭのＭＥＳ、２ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ ６．０中、１０ｍｇ／ｍｌのロウ様トウモロコシデンプン４ｍｌとともにインキュベートされた場合、１分あたり、還元糖１マイクロモルに等しい加水分解生成物を放出する酵素の量として定義される。
本明細書において記載される生地は、一般に、小麦全粒粉または小麦粉および／または他の種類の穀粉、粉またはデンプン、例えば、コーン粉、コーンスターチ、トウモロコシ粉、米粉、ライ麦全粒粉、ライ麦粉、オーツ麦粉、オートミール、大豆粉、ソルガムミール、ソルガム粉、ポテトミール、ジャガイモ粉またはジャガイモデンプンを含む。生地は、生、凍結、または部分的にベークされてもよい。
生地は、発酵生地であっても、または発酵に付される生地であってもよい。生地は、例えば、膨張剤、例えば、重炭酸ナトリウムの添加によるか、またはパン種（発酵生地）の添加によるなど、様々な方法により、発酵させることができるが、好適なイースト培養物、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（パン酵母）、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの商業的に入手可能な菌株の培養物を添加することにより、生地を発酵させることが好ましい。
生地は脂肪、例えば、粒状脂肪またはショートニングを含むことができる。生地はさらに、乳化剤、例えば、モノグリセリドまたはジグリセリド、脂肪酸の糖エステル、脂肪酸のポリグリセロールエステル、モノグリセリドの乳酸エステル、モノグリセリドの酢酸エステル、ポリオキシエチレンステアレート、またはリゾレシチンを含むことができる。
本発明者らはさらに、粉を本明細書において前述された組み合わせとともに含むプレミックスも記載する。プレミックスは、他の生地改良添加剤および／またはパン改良添加剤、例えば本明細書において記載された酵素を包含する添加剤のいずれかを含有することができる。
（さらに別の添加剤または成分）
焼き製品の性質をさらに改良し、焼き製品に特徴的性質を付与するために、さらに別の生地成分および／または生地添加剤を生地中に組み入れることができる。典型的には、このようなさらに添加される成分は、生地成分、例えば、塩、穀物、油脂、糖または甘味料、食物繊維、タンパク源、例えば、粉ミルク、グルテン、大豆または卵および生地添加剤、例えば、乳化剤、他の酵素、親水コロイド、矯味矯臭剤、酸化剤、ミネラルおよびビタミンを含み得る。
乳化剤は生地強化剤およびクラム軟化剤として有用である。生地強化剤として、乳化剤は、休止時間に関する寛容性およびプルーフィングの間の衝撃に対する寛容性を提供することができる。さらに、生地強化剤は、所定の生地の発酵時間の変動に対する寛容性を改良するであろう。ほとんどの生地強化剤はさらに、オーブンスプリングに対して改良する。オーブンスプリングとは、プルーフからベークされた物品の体積の増大を意味する。最後に、生地強化剤は、調理混合物中に存在する脂肪を乳化させる。
好適な乳化剤としては、レシチン、ポリオキシエチレンステアレート、食用脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリド、食用脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドの酢酸エステル、食用脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドの乳酸エステル、食用脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドのクエン酸エステル、食用脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル、食用脂肪酸のシュークロースエステル、ステアロイル−２−ラクチル酸ナトリウム、およびステアロイル−２−ラクチル酸カルシウムが挙げられる。
さらに別の添加剤または成分を、粉、水または任意の他の成分または添加剤を包含する任意の生地成分、また生地改良剤組成物とともに添加することができる。さらに別の生地添加剤または成分を、粉、水、任意の他の成分または添加剤または生地改良剤組成物の前に添加することができる。さらに別の生地添加剤または成分は、粉、水、任意の他の成分または添加剤または生地改良剤組成物の後に添加することができる。
さらに別の生地添加剤または成分は、好都合には、液体調製物であってよい。しかしながら、さらに別の生地添加剤または成分は、好都合には、乾燥組成物の形態であってよい。
好ましくは、生地添加剤または成分は、生地の粉成分の重量の少なくとも１％である。さらに好ましくは、さらなる生地添加剤または成分は、少なくとも２％、好ましくは、少なくとも３％、好ましくは、少なくとも４％、好ましくは、少なくとも５％、好ましくは、少なくとも６％である。添加剤が脂肪である、典型的には、脂肪は１から５％まで、典型的には１から３％まで、さらに典型的には約２％の量で存在し得る。
（さらに別の酵素）
ＰＳ４改変体ポリペプチドに加えて、１以上のさらなる酵素を使用することができ、例えば、食物、生地調製物、食材またはデンプン組成物に添加することができる。
生地に添加できるさらなる酵素としては、オキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ、例えば、リパーゼおよびエステラーゼならびにグリコシダーゼ様α−アミラーゼ、プルラナーゼ、およびキシラナーゼが挙げられる。オキシドレダクターゼ、例えば、グルコースオキシダーゼおよびヘキソースオキシダーゼを生地強化および焼き製品の体積の調整のために用いることができ、生地取り扱い特性、クラム硬度およびパン体積を改良するために、キシラナーゼおよび他のヘミセルラーゼを添加することができる。リパーゼは生地強化剤およびクラム軟化剤として有用であり、パンの体積を調節し、クラム硬度をさらに減少させるためにα−アミラーゼおよび他のデンプン分解酵素を生地中に組み入れることができる。
使用できるさらなる酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、デンプン分解酵素、プロテアーゼ、リポキシゲナーゼからなる群から選択することができる。
有用なオキシドレダクターゼの例としては、オキシダーゼ、例えば、 マルトース酸化酵素、グルコースオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．４）、炭水化物オキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．１０）およびヘキソースオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．５）が挙げられる。
デンプン分解酵素のうちで、アミラーゼが生地改良添加剤として特に有用である。α−アミラーゼはデンプンをデキストリンに分解し、デキストリンは、β−アミラーゼによりマルトースにさらに分解される。他の有用なデンプン分解酵素であって、生地組成物に添加できるものとしては、グルコアミラーゼおよびプルラナーゼが挙げられる。
好ましくは、さらなる酵素は少なくともキシラナーゼおよび／または少なくともアミラーゼである。「キシラナーゼ」なる用語は本明細書において用いられる場合、キシロシド結合を加水分解するキシラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．３２）を意味する。リパーゼも添加することができる。
「アミラーゼ」なる用語は本明細書において用いられる場合、アミラーゼ、例えば、α−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１）、β−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．２）およびγ−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．３）を意味する。
さらなる酵素は、粉、水または任意の他の成分または添加剤、または生地改良剤組成物を包含する任意の生地成分とともに添加することができる。さらなる酵素は、粉、水、および場合により他の成分および添加剤または生地改良剤組成物の前に添加することができる。さらなる酵素は、粉、水、および場合により他の成分および添加剤または生地改良剤組成物の後に添加することができる。さらなる酵素は、好都合には、液体調製物であってよい。しかしながら、組成物は好都合には、乾燥組成物の形態であってよい。
生地改良剤組成物のいくつかの酵素は、生地条件下で、粉生地のレオロジーおよび／または可削性特性および／または生地から造られた製品の品質の改良に対する酵素による影響が、付加的であるだけでなく、効果が相乗的である程度まで、互いに相互作用できる。
生地から作られた製品（完成品）の改良に関連して、組み合わせの結果、クラム構造に関して実質的な相乗効果が得られることが判明している。さらに、焼き製品の比体積に関して、相乗効果が見られる。
さらなる酵素は、カルボン酸エステル結合を加水分解して、カルボキシレートを放出できるリパーゼ（ＥＣ ３．１．１）であってよい。リパーゼの例としては、これに限定されないが、トリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ ３．１．１．３）、ガラクトリパーゼ（ＥＣ３．１．１．２６）、ホスホリパーゼ Ａ１（ＥＣ ３．１．１．３２、ホスホリパーゼＡ２（ＥＣ３．１．１．４）およびリポタンパク質 リパーゼ Ａ２（ＥＣ ３．１．１．３４）が挙げられる。
（他の用途）
ＰＳ４改変体は、マルトースおよび高マルトースシロップの製造に適している。このような製品は、マルトースの低吸湿性、低粘度、良好な熱安定性および中程度の甘すぎない味のために、ある菓子類の製造においてかなり興味深い。マルトースシロップを製造するための工業的プロセスは、デンプンを液化し、次いでマルトース産生酵素、および場合によりアミロペクチンにおける１．６−分岐点で開裂する酵素、例えば、アルファ−１．６−アミログルコシダーゼで糖化することを含む。
本明細書において記載されるＰＳ４改変体を、洗剤組成物の成分に添加することができ、かくして、製剤組成物の成分になる。洗剤組成物は、例えば、汚れた布の前処理に適した洗濯用添加剤組成物およびすすぎで添加される織物柔軟剤組成物をはじめとする手洗いまたは洗濯機用洗剤組成物として処方することができるか、または一般に家庭での硬質表面洗浄操作において使用される洗剤組成物として処方することができるか、もしくは手洗いまたは機械による食器洗浄操作において使用される洗剤組成物として処方することができる。具体的な態様において、本発明者らは、ＰＳ４改変体を含む洗剤添加剤を記載する。洗剤添加剤ならびに洗剤組成物は、１以上の他の酵素、例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えば、ラッカーゼ、および／またはペルオキシダーゼを含むことができる。一般に、選択された酵素の特性は、選択された洗剤と適合性でなければならず（すなわち、他の酵素および非酵素成分とのｐＨ最適適合性など）、酵素は有効な量で存在すべきである。
ＰＳ４改変体はさらに、リグノセルロース物質、例えば、パルプ、紙および厚紙のデンプン強化古紙および厚紙からの製造において、特に、再パルプ化が７より高いｐＨで起こる場合およびアミラーゼが強化デンプンの分解により廃材の分解を促進できる場合に、用いることができる。ＰＳ４改変体は、デンプンでコーティングされた印刷紙から製紙用パルプを製造するプロセスにおいて特に有用である。プロセスは、ＷＯ ９５／１４８０７において記載されたようにして行うことができ、次の段階を含む：ａ）紙を分解してパルプを製造する段階、ｂ）段階ａ）の前、最中、または後にデンプン分解酵素で処理する工程、およびｃ）段階ａ）およびｂ）の後でパルプからインク粒子を分離する工程。ＰＳ４改変体はさらに、デンプンの修飾において非常に有用であり、ここで、酵素により修飾されたデンプンを製紙において、アルカリ性フィラー、例えば、炭酸カルシウム、カオリンおよびクレイとともに用いることができる。本明細書において記載されるＰＳ４改変体に関して、これはフィラーの存在下でデンプンを修飾できるようになり、かくして、より簡単な統合プロセスが可能になる。ＰＳ４改変体はさらに、織物のサイズ剤除去において非常に有用である。織物加工産業において、サイズ剤除去プロセスにおける補助剤として、製織中の横糸上の保護コーティングとしての働きをするデンプン含有サイズ剤の除去を促進するためにアミラーゼが伝統的に使用される。製織後のサイズ剤コーティングの完全な除去は、織物が精練、漂白および染色される、その後のプロセスにおける最適結果を保証するために重要である。酵素によるデンプン分解は、繊維材料に対する有害な影響を含まないので好ましい。ＰＳ４改変体を単独または、セルロース含有繊維または織物のサイズ剤除去の場合はセルラーゼとの組み合わせにおいて用いることができる。
ＰＳ４改変体はさらに、デンプンから甘味料を製造するための最適のアミラーゼである。デンプンをフルクトースシロップに変換するための「伝統的な」プロセスは、３つの連続した酵素プロセス、すなわち、液化プロセスと、それに続く糖化プロセスおよび異性化プロセスからなる。液化プロセスの間、デンプンはアミラーゼにより５．５から６．２の間のｐＨ値、９５〜１６０℃の温度で約２時間分解されてデキストリンになる。これらの条件下で最適酵素安定性を保証するために、１ｍＭのカルシウムが添加される（４０ｐｐｍの遊離カルシウムイオン）。液化プロセス後、グルコアミラーゼおよび脱分枝酵素、例えば、イソアミラーゼまたはプルラナーゼの添加により、デキストリンはデキストロースに変換される。この段階の前に、高温（９５℃超）を維持しつつ、ｐＨを４．５より低い値に下げ、液化アミラーゼ活性が変性される。温度を６０℃に下げ、グルコアミラーゼおよび脱分枝酵素を添加する。糖化プロセスは２４〜７２時間進行する。
（バイオエタノール産生）
本発明のＰＳ４改変体ポリペプチドは、一般に、デンプンを糖に変換するために用いられ、糖は次にエタノールまたは他の付加価値品、例えば、高フルクトースコーンシロップに加工することができる。従って、本発明者らは、バイオエタノールの製造におけるＰＳ４改変体ポリペプチドの使用を開示し、バイオエタノールは、本明細書において、バイオマス発酵により製造されるエタノールと見なすべきである。
このようにして製造されたエタノールは、燃料または飲料として用いることができるか、もしくは有機化合物、例えば、クエン酸、アスコルビン酸、リシン、グルタミン酸を製造するための発酵プロセスにおいて用いることができる。
エタノール（またはエチルアルコール）は、蒸留酒、ビールおよびワインなどのアルコール飲料のベースとして最もよく知られている。加えて、エタノールは、工業用化学物質、医薬品の製造において、および輸送燃料としての多くの用途を有する。
エタノールは、糖または炭水化物を含有するほとんどの原材料から製造することができる。したがって、エタノールは広範囲に及ぶ生物学的物質から製造することができる。エタノールを製造するために使用される３つの主な種類のバイオマス原材料は糖料作物、例えば、サトウキビ；小麦およびトウモロコシを包含するデンプン作物、およびセルロース材料、例えば、作物残渣（わら等）、および林業廃棄物を包含する。容易に入手可能なセルロース源からのエタノール製造は、安定で、再生可能な燃料源を提供する。
最も頻繁に使用される処理技術は、乾燥穀物粉砕である。このプロセスにおいて、穀物はまず穀粉濃度に粉砕される。穀粉を次に水およびアミラーゼと混合し、調理器具を通し、ここで穀物中のデンプンは液化される。グルコアミラーゼの添加のもとで、液化デンプンは発酵性糖に変換される。酵母を次にマッシュに添加して、糖をエタノールに発酵させる。発酵後、マッシュを蒸留および脱水プロセスに移し、ここでアルコールが固体および水から除去される。実際、穀物１トンにつき約２／３を燃料エタノールに変換する。残りの副生成物（希薄な流出物および湿潤蒸留かす）は、高タンパク質家畜飼料であって、ウシまたはヒツジなどの動物に特に適している。
エタノールはさらに、セルロース含有源、例えば、木材パルプから製造することができる。セルロースベースの原料は、農業廃棄物、草および木材および他の低価値のバイオマス、例えば、都市廃棄物（例えば、再生紙、ヤードクリッピングなど）からなる。エタノールは、これらのセルロース原料のいずれかの発酵から製造することができる。しかしながら、セルロースはまず、好適な酵素、例えば、セルラーゼでの処理により、エタノールへ変換できる前に、糖に変換しなければならない。
一旦、エタノールが処理工場を離れると、これは理論的には、それ自体、自動車燃料として用いることができるか、またはガソリンと８５対１５の比で混合されて、いわゆる「ニートエタノール燃料」が形成される。しかしながら、最も一般的には、エタノールはガソリンと７から１０容量％の濃度でブレンドされる。エタノールはオクタンエンハンサーとして使用できる。燃料源としてのエタノールは、石油由来の製品よりも環境に優しい。エタノールの使用は、空気の質を改良し、おそらくは局所的オゾン量およびスモッグを減少させるであろう。さらに、ガソリンの代わりにエタノールを使用することは、再生不能なエネルギーおよび石油化学供給における突然の変化の影響を和らげるのに戦略的に重要であり得る。
（飼料用途）
一つの実施形態において、ＰＳ４改変体ポリペプチドは難消化性デンプンを分解できる。
本明細書において用いられる場合、「分解」なる用語は、グルコースおよび／またはオリゴ糖、例えば、マルトースおよび／またはデキストリンの部分的または完全な加水分解または分解に関する。
ＰＳ４改変体ポリペプチドは、動物のアミラーゼにより完全に分解されない、残存する難消化性デンプンを分解する。一例として、難消化性デンプンの分解の改良において、動物のアミラーゼ（例えば、膵アミラーゼ）を助けるために、ＰＳ４改変体ポリペプチドを使用することができる。膵α−アミラーゼは動物により消化系において分泌される。膵α−アミラーゼは食物中のデンプンを分解する。しかしながら、デンプンの一部、難消化性デンプンは、膵α−アミラーゼにより完全に分解されず、従って小腸において吸収されない（難消化性デンプンの定義参照）。いくつかの実施形態におけるＰＳ４改変体ポリペプチドは、消化系におけるデンプンの分解において膵α−アミラーゼを助け、これにより、動物によるデンプンの利用を増大させることができる。
酵素が難消化性デンプンを分解する能力は、例えば、Ｍｅｇａｚｙｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｒｅｌａｎｄ Ｌｔｄ．により、難消化性デンプン、可溶化デンプンおよびサンプルの合計デンプン含量の測定のために開発され、開示された方法により分析することができる（難消化性デンプン分析法、ＡＯＡＣ Ｍｅｔｈｏｄ ２００２．０２、ＡＡＣＣ Ｍｅｔｈｏｄ ３２−４０）。
従って、ＰＳ４改変体ポリペプチドは、有益な目的のために動物により摂取され得るので、動物飼料中に組み入れることができる。
本発明者らは従って、ＰＳ４改変体ポリペプチドの、デンプンを含む飼料における使用、または飼料改良剤組成物における使用のための成分としての使用を開示し、ここで、ＰＳ４改変体ポリペプチドは、難消化性デンプンを分解することができる。本発明者らはさらに、 デンプンおよびＰＳ４改変体ポリペプチドを含む飼料も開示している。本発明者らはさらに、前記難消化性デンプンをＰＳ４改変体ポリペプチドと接触させることを含む、飼料における難消化性デンプンの分解法を開示する。
本発明者らはさらに、デンプンを含む飼料の調製における、難消化性デンプンを分解するためのＰＳ４改変体ポリペプチドの使用を記載する。さらに、本発明者らは、飼料の調製において、ＰＳ４改変体ポリペプチドを使用して、前記飼料のカロリー値を改良することを開示する。本発明者らは、飼料の調製において酵素を使用して、動物の性能を改良することを開示する。さらなる実施形態において、本発明者らは、デンプンおよびＰＳ４改変体ポリペプチド酵素を混合することを含む、飼料の調製法を記載する。
一例として、ＰＳ４改変体ポリペプチドを含み、難消化性デンプンを分解できる成分の使用は、デンプンおよび／または動物におけるデンプン分解産物の分解において顕著な増加があるので有利である。さらに、このような使用は、デンプンおよび／または動物によるデンプン分解産物の消化率において顕著な増加があるので有利である。さらに、このような使用は、動物による飼料からの抽出エネルギーを向上させる手段を提供するので有利である。さらに、このような使用は、難消化性デンプンのバイオアベイラビリティーを向上させる手段を提供するので有利である。
（動物飼料）
ＰＳ４改変体ポリペプチが使用に適している動物飼料は、特定の動物群の特定の要求に見合うように、そして必要な炭水化物、脂肪、タンパク質および動物により代謝できる形態の栄養素を提供するために処方することができる。
好ましくは、動物飼料は、ブタまたは家禽用飼料である。
本明細書において用いられる場合、「ブタ（ｓｗｉｎｅ）」なる用語は、非反芻雑食動物、たとえば、ブタ（ｐｉｇ）、ブタ（ｈｏｇ）またはイノシシ（ｂｏａｒ）に関する。典型的には、ブタの飼料は、約５０パーセントの炭水化物、約２０パーセントのタンパク質および約５％の脂肪を含む。高エネルギーブタの飼料の一例は、トウモロコシベースであり、これはしばしば飼料サプリメント、例えば、タンパク質、ミネラル、ビタミンおよびアミノ酸、例えば、シリンおよびトリプトファンと組み合わせられる。ブタの飼料の例は、動物性タンパク質製品、水産物、乳製品、穀物製品および植物性タンパク質製品を包含し、これらは全て、天然の矯味矯臭剤、人工の矯味矯臭剤、ミクロおよびマクロミネラル、動物性脂肪、植物性脂肪、ビタミン、保存料または薬品、例えば抗生物質をさらに含むことができる。
添付の特許請求の範囲を含む本明細書において「ブタの飼料」と言及される場合、このような言及は、「移行」または「スターター」飼料（子豚を離乳させるために使用）および「仕上げ」または「育成」飼料（ブタの市場に適した年齢および／またはサイズへ成長させる移行段階後に使用）を包含することを意味する。
本明細書において用いられる場合、「家禽」なる用語は、鳥類、例えば、ニワトリ、ブロイラー、メンドリ、オンドリ、去勢鶏、シチメンチョウ、アヒル、闘鶏、若鶏またはヒヨコに関する。家禽飼料は、全てのタンパク質、エネルギー、ビタミン、ミネラル、および鳥の適切な成長、産卵、および健康に必要な他の栄養素を含有するので、「完全」飼料と称する。しかしながら、家禽飼料は、ビタミン、ミネラルまたは薬品、例えば、抗コクシジウム剤（例えば、モネンシン（Ｍｏｎｅｎｓｉｎ）ナトリウム、ラサロシド（Ｌａｓａｌｏｃｉｄ）、アンプロリウム（Ａｍｐｒｏｌｉｕｍ）、サリノマイシン（Ｓａｌｉｎｏｍｙｃｉｎ）、およびスルファキノキサリン（Ｓｕｌｆａｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｅ））および／または抗生物質（例えば、ペニシリン、バシトラシン、クロルテトラサイクリン、およびオキシテトラサイクリン）をさらに含むことができる。
食肉生産用に飼われている幼鶏またはブロイラー、シチメンチョウ、アヒルは、産卵用に確保されたメンドリと異なった飼料を与えられる。ブロイラー、アヒルおよびシチメンチョウは、産卵種のニワトリよりも身体が大きく、より急速に体重が増加する。従って、これらの鳥は、より高いタンパク質およびエネルギーレベルの食餌を与えられる。
添付の特許請求の範囲を包含する本明細書において「家禽飼料」について言及される場合、このような言及は、「スターター」飼料（孵化後）、「仕上げ」、「育成」または「改良」飼料（６〜８週令から食肉処理サイズに達するまで）および「産卵用」飼料（産卵中に給餌）を包含することを意味する。
動物飼料は、例えば、食肉生産、ミルク生産、産卵、繁殖およびストレスへの反応に関して、動物の栄養必要量に見合うように処方することができる。加えて、動物飼料は、肥料品質を改良するために処方される。
好ましい態様において、動物飼料は、原料、例えば、豆科植物、例えば、エンドウ豆または大豆または穀草、例えば、小麦、コーン（トウモロコシ）、ライ麦または大麦を含有する。好適には、原料はジャガイモである。
（食料）
ＰＳ４改変体ポリペプチドは、ＰＳ４改変体ポリペプチドを飼料に単独または他の成分、例えば食品成分との組み合わせにおいて、直接的または間接的に適用することにより、動物が消費するための飼料において用いることができる。
典型的な食品成分は、添加剤、例えば、動物性または植物性脂肪、天然または合成調味料、酸化防止剤、粘度改良剤、精油、および／またはフレーバー、色素および／または着色剤、ビタミン、天然および／または非天然アミノ酸、栄養素、追加の酵素（遺伝子操作された酵素を含む）、結合剤、例えば、グアーガムまたはキサンタンガム、緩衝液、乳化剤、潤滑剤、アジュバント、懸濁化剤、保存料、コーティング剤または可溶化剤などの任意の１以上を含むことができる。
適用法の例は、これに限定されないが、ＰＳ４改変体ポリペプチドを含む物質中の飼料のコーティング、ＰＳ４改変体ポリペプチドを飼料と混合することによる直接適用、ＰＳ４改変体ポリペプチドの飼料表面上への噴霧またはＰＳ４改変体ポリペプチドの調製物中への飼料の浸漬を包含する。
ＰＳ４改変体ポリペプチドは、動物が消費するために、好ましくは、飼料と混合することによるか、または飼料粒子上に噴霧することにより適用される。別法として、ＰＳ４改変体ポリペプチドは、飼料のエマルジョン中に、もしくは注入または回転により固体製品の内部に含めることができる。
ＰＳ４改変体ポリペプチドは、飼料を散布、コートおよび／または浸漬するために適用できる。他の成分との混合物も用いることができ、別々に、同時に、または連続して適用することができる。キレート化剤、結合剤、乳化剤および他の添加剤、例えば、ミクロおよびマクロミネラル、アミノ酸、ビタミン、動物性脂肪、植物性脂肪、保存料、香味料、着色剤を同様に、飼料に同時に（混合物において、または別々のいずれか）または連続して適用することができる。
（ＰＳ４改変体ポリペプチドの量）
使用されるＰＳ４改変体ポリペプチドの最適量は、処置される飼料および／または飼料をＰＳ４改変体ポリペプチドと接触させる方法および／またはその意図される用途に依存するであろう。ＰＳ４改変体ポリペプチドの量は、飼料の摂取後、および消化中に難消化性デンプンを実質的に分解するために有効であるために十分な量であるべきである。
有利には、ＰＳ４改変体ポリペプチドは、動物が消費するための飼料の摂取後およびより完全な飼料の消化が得られるまでの飼料の消化の間、有効なままである。すなわち、飼料の増大した発熱量が放出される。
（アミラーゼの組み合わせ）
本発明者らは、特に、ＰＳ４改変体ポリペプチドのアミラーゼ、特に、糖産生アミラーゼとの組み合わせを開示する。糖産生アルファ−アミラーゼ（グルカン１，４−ａ−マルトヒドロラーゼ、Ｅ．Ｃ．３．２．１．１３３）は、アミロースおよびアミロペクチンをアルファ−構造のマルトースに加水分解することができる。
Ｂａｃｉｌｌｕｓから得られる糖酸性α−アミラーゼ（ＥＰ １２０ ６９３）は、Ｎｏｖａｍｙｌ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）の商品名で商業的に入手可能であり、ベーキング産業において、デンプンの老化を低下させるその能力のために老化防止剤として広く用いられている。Ｎｏｖａｍｙｌは、国際特許公開ＷＯ ９１／０４６６９において詳細に記載されている。糖産生アルファ−アミラーゼＮｏｖａｍｙｌは、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅｓ）と、配列相同性（Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ Ｂ、Ｂａｉｒｏｃｈ Ａ；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、３１６、６９５−６９６（１９９６））およびトランスグリコシル化生成物の形成（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｅｎ、Ｃら、１９９７、Ｓｔａｒｃｈ、ｖｏｌ．５０、Ｎｏ．１、３９−４５）を包含するいくつかの特徴を共有する。
非常に好ましい実施形態において、本発明者らは、ＰＳ４改変体ポリペプチドをＮｏｖａｍｙｌまたはその改変体のいずれかとともに含む組み合わせを開示する。このような組み合わせは、食品製造、例えば、ベーキングに有用である。Ｎｏｖａｍｙｌは特にＮｏｖａｍｙｌ １５００ ＭＧを含む。
Ｎｏｖａｍｙｌおよびその使用を記載する他の文献としては、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｅｎ、Ｃ．、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、Ｓ．、ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、Ｔ．、（１９９３） Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｌｔｏｓｅ ａｎ ａ ｌｉｍｉｔ ｄｅｘｔｒｉｎ、ｔｈｅ ｌｉｍｉｔ ｄｅｘｔｒｉｎ、ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｍｉｔ ｄｅｘｔｒｉｎ． Ｄｅｎｍａｒｋ、およびＷＯ ９５／１０６２７が挙げられる。これは、米国特許第４，５９８，０４８号および米国特許第４，６０４，３５５号においてさらに記載される。これらの文献のそれぞれは、本発明の一部として参照され、該特許において記載されるＮｏｖａｍｙｌポリペプチドは、本明細書において記載されるＰＳ４改変体ポリペプチドのいずれかとの組み合わせにおいて用いることができる。
Ｎｏｖａｍｙｌの改変体、相同体、および突然変異体がアルファアミラーゼ活性を保持すると仮定すると、これらを組み合わせに用いることができる。例えば、米国特許第６，１６２，６２８号（その全開示は、本発明の一部として参照される）において開示されるＮｏｖａｍｙｌ改変体のいずれかを、本明細書において開示されるＰＳ４改変体ポリペプチドとの組み合わせにおいて用いることができる。特に、この文献において記載されるポリペプチドのいずれか、特に、
Figure 2008544751
 に対応する１以上の位置のいずれかでの米国特許第６，１６２，６２８号の配列番号１の改変体を用いることができる。
（アミノ酸配列）
本発明は、ＰＳ４改変体核酸を利用し、かかるＰＳ４改変体核酸のアミノ酸配列は本明細書において記載される方法および組成物に含まれる。
本明細書において用いられる場合、「アミノ酸配列」なる用語は、「ポリペプチド」なる用語および／または「タンパク質」なる用語と同義である。いくつかの例において、「アミノ酸配列」なる用語は、「ペプチド」なる用語と同義である。いくつかの例において、「アミノ酸配列」なる用語は、「酵素」なる用語と同義である。
アミノ酸配列は、好適な供給源から調製／単離することができるか、または合成により調製できるか、または組み換えＤＮＡ技術の使用により調製することができる。
本明細書において記載されるＰＳ４改変体酵素は、他の酵素と組み合わせて用いることができる。従って、本発明者らは、酵素の組み合わせを開示し、ここで、この組み合わせは、本明細書において記載されるＰＳ４改変体ポリペプチド酵素および別の酵素であって、それ自体別のＰＳ４改変体ポリペプチド酵素であるものを含む。
（ＰＳ４改変体ヌクレオチド配列）
前述のように、本発明者らは、記載される特定の性質を有するＰＳ４改変体酵素をエンコードするヌクレオチド配列を開示する。
「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」なる用語は本明細書において用いられる場合、オリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列、およびその改変体、相同体、フラグメントおよび誘導体（例えば、その部分）を意味する。ヌクレオチド配列は、ゲノムまたは合成または組み換え起源のものであり、センスまたはアンチセンスストランドを表すかに関係なく、二本鎖であっても、または一本鎖であってもよい。
「ヌクレオチド配列」なる用語は本明細書において用いられる場合、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、およびＲＮＡを包含する。好ましくは、これは、ＤＮＡ、さらに好ましくは、ＰＳ４改変体ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列を意味する。
典型的には、ＰＳ４改変体ヌクレオチド配列は、組み換えＤＮＡ技術（すなわち、組み換えＤＮＡ）を用いて調製される。しかしながら、別の実施形態において、ヌクレオチド配列は全体として、または一部として、当該分野において公知の化学的方法（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ＭＨら、（１９８０） Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ ２１５−２３およびＨｏｒｎ Ｔら、（１９８０） Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ ２２５−２３２参照）を用いて合成することができる。
（核酸配列の調製）
本明細書において定義されるような特異的性質を有する酵素（例えば、ＰＳ４改変体ポリペプチド）または修飾に適した酵素、例えば、親酵素のいずれかをエンコードするヌクレオチド配列は、前記酵素を産生する任意の細胞または生物から同定および／または単離および／または精製することができる。当該分野において、ヌクレオチド配列の同定および／または単離および／または精製について様々な方法がよく知られている。一例として、好適な配列が同定および／または単離および／または精製されると、より多くの配列を調製するためにＰＣＲ増幅技術を用いることができる。
さらなる例として、酵素を産生する生物から得られる染色体ＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡを用いて、ゲノムＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡライブラリーを構築することができる。酵素のアミノ酸配列または酵素のアミノ酸配列の一部が既知であるならば、標識されたオリゴヌクレオチドプローブを合成し、使用して、酵素エンコード化クローンを生物から調製されたゲノムライブラリーから同定することができる。別法として、別の公知酵素遺伝子と相同性である配列を含有する標識されたオリゴヌクレオチドプローブ を用いて、酵素エンコード化クローンを同定することができる。後者の場合、低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が使用される。
別法として、ゲノムＤＮＡのフラグメントを発現ベクター、例えば、プラスミド中に挿入し、酵素−陰性菌を得られるゲノムＤＮＡライブラリーで形質転換し、次いで形質転換された細菌を、酵素の基質（すなわち、マルトース）を含有するプレート上にプレートし、これによりクローンに同定される酵素を発現させることにより、酵素エンコード化クローンを同定することができる。
さらなる代替例において、標準法、例えば、Ｂｅｕｃａｇｅ Ｓ．Ｌ．ら、（１９８１） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２、ｐ１８５９−１８６９により記載される亜リン酸アミダイト法、またはＭａｔｔｈｅｓら、（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３、ｐ８０１−８０５により記載される方法を確立することにより、酵素をエンコードするヌクレオチド配列を合成的に調製することができる。亜リン酸アミダイト法において、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成器において合成され、精製され、アニールされ、結紮され、適当なベクター中にクローンされる。
ヌクレオチド配列は、混合ゲノムおよび合成起源、混合合成およびｃＤＮＡ起源、または混合ゲノムおよびｃＤＮＡ起源を有するものであり、合成、ゲノムまたはｃＤＮＡ起源（適宜）を標準的技術に従って結紮することにより調製される。それぞれの結紮されたフラグメントは、全体的なヌクレオチド配列の様々な部分に対応する。ＤＮＡ配列はさらに、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号またはＳａｉｋｉ Ｒ Ｋら、（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９、ｐｐ４８７−４９１）に記載されるようにして、特定のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、調製することもできる。
（改変体／相同体／誘導体）
本発明者らは、酵素またはこのような酵素をエンコードするヌクレオチド配列、例えば、ＰＳ４改変体ポリペプチドまたはＰＳ４改変体核酸の任意のアミノ酸配列の改変体、相同体および誘導体の使用をさらに記載する。別段の記載がない限り、「ＰＳ４改変体核酸」なる用語は、以下に記載される核酸のそれぞれを包含すると解釈されるべきであり、「ＰＳ４改変体ポリペプチド」なる用語は、同様に、以下に記載されるポリペプチドまたはアミノ酸のそれぞれを包含すると理解されるべきである。
ここで、「相同体」なる用語は、対象アミノ酸配列および対象ヌクレオチド配列とある相同性を有する物質を意味する。ここで、「相同性」なる用語は、「同一性」と同等と見なすことができる。
この文脈において、相同配列は、対象配列と、少なくとも７５、８０、８５または９０％同一、好ましくは、少なくとも９５、９６、９７、９８または９９％同一であるアミノ酸配列を包含すると解釈される。典型的には、相同体は対象アミノ酸配列と同じ活性部位などを含む。相同性は、類似性（すなわち、類似した化学的特性／機能を有するアミノ酸配列）に関して考えることができるが、本明細書の文脈において、相同性を配列同一性に関して表すのが好ましい。
この文脈において、相同配列は、ＰＳ４改変体ポリペプチド酵素（例えば、ＰＳ４改変体核酸）をエンコードするヌクレオチド配列と、少なくとも７５、８０、８５または９０％同一、好ましくは、少なくとも９５、９６、９７、９８または９９％同一であるヌクレオチド配列を包含すると解釈される。典型的には、相同体は対象配列と同じ、活性部位などをコードする配列を含む。相同性は、類似性（すなわち、類似した化学的特性／機能を有するアミノ酸配列）で考えることができるが、本明細書の文脈において、相同性を配列同一性で表すのが好ましい。
相同性比較は、目視により、またはさらに一般的には、容易に入手可能な配列比較プログラムを用いて行うことができる。これらの商業的に入手可能なコンピュータプログラムは、２以上の配列間の相同性（％）を計算することができる。
相同性（％）は、隣接した配列全体にわたって計算することができる。すなわち、１つの配列を他の配列と並べ、１つの配列中の各アミノ酸を他の配列中の対応するアミノ酸と、１つの残基を同時に直接比較する。これは、「ギャップのない」整列と呼ばれる。典型的には、このようなギャップのない整列は、比較的短い数の残基全体にわたって行われる。
これは非常に簡単で一貫した方法であるが、例えば、それ以外では同一の配列対において、１つの挿入または欠失は、次のアミノ酸残基を整列からはずれさせることを考慮しておらず、かくして、全体的な整列が行われる場合、相同性において大きな減少（％）が潜在的にもたらされる。従って、ほとんどの配列比較法は、全体的な相同性特定に不当な不利益をもたらすことなく、可能な挿入および欠失を考慮する最適な整列をもたらすように設計される。このことは、「ギャップ」を配列整列中に挿入して、局所同一性を最大にすることを試みることにより達成される。
しかしながら、これらのより複雑な方法は、配列中に存在する各ギャップに「ギャップペナルティー」を与え、かくして、同じ数の同じアミノ酸に関して、可能な限りギャップが少ない配列整列（２つの比較配列間のより高い関連性を反映する）は、多くのギャップを有するものよりも高い得点を得る。ギャップの存在に対して比較的高いコストを課し、ギャップ中のそれぞれの次の残基により少ないペナルティーを課す、「アフィン（Ａｆｆｉｎｅ）ギャップコスト」が典型的に使用される。これは、最も一般的に使用されるギャップ採点システムである。高いギャップペナルティーは、もちろん、ギャップがより少ない、最適化された配列をもたらす。ほとんどの整列プログラムは、ギャップペナルティーを変更されることを許容する。しかしながら、かかるソフトウェアを配列比較に用いる場合、初期値を用いるのが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列の初期ギャップペナルティーは、ギャップについて−１２であり、各鎖について−４である。
従って、最大相同性（％）の計算は、まず、最適整列を生成させて、ギャップペナルティーを考慮することを必要とする。このような整列を行うために適したコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２ ｐ３８７）である。配列比較を行うことができる以外のソフトウェアの例は、これに限定されないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９ Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版 −Ｃｈａｐｔｅｒ １８参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３−４１０）および比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳソフトウェアパッケージを包含する。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡはどちらもオフラインおよびオンライン検索により入手可能である（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ページ７−５８から７−６０参照）。
しかしながら、いくつかの用途に関して、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを用いるのが好ましい。ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる新しいツールも、タンパク質およびヌクレオチド配列の比較のために利用可能である（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １９９９ １７４（２）：２４７−５０；ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １９９９ １７７（１）：１８７−８およびｔａｔｉａｎａ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）。
最終相同性（％）は、同一性で測定できるが、整列プログラムそれ自体は典型的にはオール・オア・ナッシングの対比較に基づかない。その代わり、化学的類似性または進化距離に基づいた各対ごとの比較に点数を割り当てる、段階的な類似性スコアマトリックスが、一般的に用いられる。一般的に用いられる、このようなマトリックスの例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（ＢＬＡＳＴプログラムパッケージの初期マトリックス）である。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般的に周知の初期値または、もし提供されるならば、特注の記号比較表のいずれかを使用する（さらなる詳細についてはユーザーマニュアルを参照）。いくつかの用途に関して、ＧＣＧパッケージについて周知の初期値、または他のソフトウェアの場合、初期マトリックス、例えばＢＬＯＳＵＭ６２を用いるのが好ましい。
別法として、相同性のパーセンテージは、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ ＆ Ｓｈａｒｐ ＰＭ（１９８８）、Ｇｅｎｅ ７３（１）、２３７−２４４）と類似したアルゴリズムに基づき、ＤＮＡＳＩＳTM（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）における複数の整列機構を用いて計算することができる。
ソフトウェアが最適整列を生成したら、相同性（％）、好ましくは、配列同一性（％）を計算することが可能である。ソフトウェアは典型的には、これを配列比較の一部として行い、数値結果を提供する。
配列はまた、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有し、これは静的変化をもたらし、機能的に等価な物質を生じる。意図的なアミノ酸置換をアミノ酸特性（例えば、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性）における類似性に基づいて行うことができ、従って、アミノ酸を官能基に分類するのが有用である。アミノ酸はその側鎖の性質のみに基づいて分類することができる。しかしながら、突然変異データも含めることがさらに有用である。このようにして誘導したアミン酸の集団は、構造的理由から保存される可能性が高い。これらの集団は、Ｖｅｎｎ図（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｃ．Ｄ．およびＢａｒｔｏｎ Ｇ．Ｊ．（１９９３） “Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ：ａ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕｅ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ” Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ．９：７４５−７５６）（Ｔａｙｌｏｒ Ｗ．Ｒ．（１９８６） “Ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ アミノ酸 ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ” Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１１９；２０５−２１８）の形態において記載することができる。保存的置換は、例えば、一般的に認められているアミノ酸分類のＶｅｎｎ図を記載する下記の表に従って行うことができる。
Figure 2008544751
 本発明者らは、起こり得る相同性置換（置換および交換はどちらも本明細書において既存のアミノ酸残基の別の残基との交換を意味する）、すなわち、塩基性と塩基性、酸性と酸性、極性と極性などの同種置換を含む配列をさらに開示する。非相同性置換、すなわち、ある種類の残基から別の種類のものへ、あるいは非天然アミノ酸、例えば、オルニチン（以下、Ｚと称する）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下、Ｂと称する）、ノルロイシンオルニチン（以下、Ｏと称する）、ピリイルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニンおよびフェニルグリシンを含む置換も起こり得る。
改変体アミノ酸配列は、アルキル基、例えば、メチル、エチルまたはプロピル基をアミノ酸スペーサー、例えば、グリシンまたはβ−アラニン残基に加えて包含する、配列の任意の２つのアミノ酸残基間に挿入され得る好適なスペーサー基を含み得る。バリエーションのさらなる形態は、ペプトイド形態の１以上のアミノ酸残基の存在を含み、当業者には十分理解されるであろう。誤解を避けるために、「ペプトイド形態」は、α−炭素置換基が残基のα−炭素ではなく、窒素原子上にある、改変体アミノ酸残基を意味する。ペプトイド形態のペプチドの調製法は、当該分野において公知であり、例えば、Ｓｉｍｏｎ ＲＪら、ＰＮＡＳ（１９９２）８９（２０）、９３６７−９３７１およびＨｏｒｗｅｌｌ ＤＣ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）１３（４）、１３２−１３４。
本明細書において記載され、本明細書において記載される方法および組成物に適したヌクレオチド配列（例えば、ＰＳ４改変体核酸）は、その内部に、合成または修飾ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドに対する多くの異なる種類の修飾は当該分野において公知である。これらは、メチルホスホネートおよびホルホロチオエート骨格および／または分子の３’および／または５’末端でのアクリジンまたはポリリシンの付加を包含する。本明細書の目的に関して、本明細書において記載されるヌクレオチド配列は、当該分野において利用可能な任意の方法により修飾できる。このような修飾は、ヌクレオチド配列のインビボ活性または寿命を向上させるために行うことができる。
本発明者らは、本明細書において記載される配列、またはその誘導体、フラグメントまたは誘導体に相補的なヌクレオチド配列の使用を記載する。配列がそのフラグメントに対して相補性であるならば、この配列は、他の生物における類似のコーディング配列などを同定するためのプローブとして用いることができる。
ＰＳ４改変体配列と１００％相同性でないポリヌクレオチドは、多くの方法で得ることができる。本明細書において記載される配列の他の改変体は、例えば、様々な個体、例えば、異なる集団からの個体から造られたＤＮＡライブラリーをプローブすることにより得ることができる。加えて、他の相同体を得ることができ、このような相同体およびそのフラグメントは、一般に、本明細書における配列表に示される配列と選択的にハイブリッド形成できる。このような配列は、他の種から造られたｃＤＮＡライブラリーまたは他の種からのゲノムＤＮＡライブラリーをプローブし、添付の配列表における配列のいずれかの全部または一部を含むプローブを用いて、中から高ストリンジェンシーの条件下でこのようなライブラリーをプローブすることにより得ることができる。本明細書において記載されるポリペプチドまたはヌクレオチド配列の種相同体および対立遺伝子多型を得ることについて同様に考慮される。
改変体および株／種相同体も、保存アミノ酸配列をエンコードする改変体および相同体内の配列を標的にするために設計されたプライマーを使用する、縮退ＰＣＲを用いて得ることができる。保存配列は、いくつかの改変体／相同体からのアミノ酸配列を整列させることにより、予想できる。配列整列は、当該分野において公知のコンピュータソフトウェアを用いて行うことができる。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＰｉｌｅＵｐプログラムが広く用いられている。
縮退ＰＣＲにおいて用いられるプライマーは、１以上の縮退位置を含有し、既知配列に対して１つの配列プライマーを用いて配列をクローンするために用いられるものよりも低いストリンジェンシー条件で用いられる。
別法として、このようなポリヌクレオチドは、特徴化された配列の部位特異的突然変異誘発法により得ることができる。これは、例えば、ポリヌクレオチド配列が発現される、特定の宿主細胞についてのコドン選択性を最適化するためにサイレントコドン配列変化が必要とされる場合に有用である。他の配列変化は、制限酵素部位を導入するために、またはポリヌクレオチド配列によりエンコードされるポリペプチドの性質または機能を変更するために望ましい。
ポリヌクレオチド（ヌクレオチド配列）、例えば、本明細書において記載されるＰＳ４改変体核酸は、プライマー、例えばＰＣＲプライマー、交互増幅反応用プライマー、プローブ、例えば 放射性または非放射性標識を用いた慣用の手段による暴露標識で標識されたものを産生するために用いることができるか、またはポリヌクレオチドをベクター中にクローンすることができる。このようなプライマー、プローブおよび他のフラグメントは、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、例えば少なくとも２５、３０または４０のヌクレオチド長であり、ポリヌクレオチドなる用語に含まれる。
ポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡポリヌクレオチドおよびプローブを組み換え、合成、または当業者に利用可能な任意の手段により生成させることができる。これらはまた、標準的技術によりクローンすることもできる。一般に、所望の核酸配列、１つのヌクレオチドを一度に段階的に製造することを含む合成的手段によりプライマーを生成させる。自動化技術を用いた、これを行うための技術は当該分野において容易に利用可能である。
さらに長いポリヌクレオチドは一般に、組み換え手段を用いて、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を用いて生成させる。プライマーは、好適な制限酵素認識部位を含有して、増幅されたＤＮＡが好適なクローニングベクター中にクローンされ得るものであるように設計することができる。好ましくは、改変体配列などは、本明細書において提示された配列と少なくとも同程度に生物学的に活性である。
本明細書において用いられる場合、「生物学的に活性」とは、天然に存在する配列と類似した構造機能（同程度である必要はない）、および／または類似した調節機能（同程度である必要はない）、および／または類似した生化学的機能（同程度である必要はない）を有する配列を意味する。
（ハイブリダイゼーション）
本発明者らは、ＰＳ４改変体の核酸配列または、ＰＳ４改変体配列またはこれに相補的な配列のいずれかとハイブリッド形成できる配列と相補的である配列をさらに記載する。
「ハイブリダイゼーション」なる用語は、本明細書において用いられる場合、「核酸の鎖が塩基対合により相補性鎖と結合するプロセス」ならびにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術において行われるような増幅のプロセスを包含する。したがって、本発明者らは、本明細書において記載される配列、その誘導体と相補的である配列とハイブリッド形成できるヌクレオチド配列、フラグメントまたは誘導体の使用を開示する。
「改変体」なる用語は、本明細書において記載されるヌクレオチド配列とハイブリッド形成できる配列と相補性である配列も包含する。
好ましくは、「改変体」なる用語は、ストリンジェントな条件（例えば、５０℃および０．２ｘＳＳＣ｛１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸三ナトリウム ｐＨ ７．０｝）下で、本明細書において記載されるヌクレオチド配列とハイブリッド形成できる配列と相補性である配列を包含する。さらに好ましくは、「改変体」なる用語は、高ストリンジェントな条件（例えば ６５℃および０．１ｘＳＳＣ｛１ｘＳＳＣ＝０．１５ Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸三ナトリウム ｐＨ ７．０｝）下で、本明細書において記載されるヌクレオチド配列とハイブリッド形成できる配列と相補性である配列を包含する。
本発明者らはさらに、ＰＳ４改変体のヌクレオチド配列（本明細書において記載されるものの相補配列を含む）、ならびにＰＳ４改変体のヌクレオチド配列とハイブリッド形成できる配列と相補性であるヌクレオチド配列（本明細書において記載されるものの相補配列を含む）とハイブリッド形成できるヌクレオチド配列を開示する。本発明者らはさらに、中間から最大のストリンジェンシー条件下で、本明細書において記載されるヌクレオチド配列とハイブリッド形成できるヌクレオチド配列を記載する。
好ましい態様において、本発明者らは、ＰＳ４改変体核酸のヌクレオチド配列、またはその補体とストリンジェントな条件（例えば、５０℃および０．２ｘＳＳＣ）下でハイブリッド形成できるヌクレオチド配列を開示する。さらに好ましくは、ヌクレオチド配列は、 ＰＳ４改変体のヌクレオチド配列、またはその補体と、ストリンジェントな条件（例えば ６５℃および０．１ｘＳＳＣ）下でハイブリッド形成できる。
（部位特異的突然変異誘発）
一旦、酵素エンコード化ヌクレオチド配列が単離されると、または推定酵素エンコード化ヌクレオチド配列が同定されると、酵素を調製するために、配列を突然変異させることが望ましい。従って、ＰＳ４改変体配列を親配列から調製することができる。合成オリゴヌクレオチドを用いて、突然変異を導入することができる。これらのオリゴヌクレオチドは望ましい突然変異部位と隣接するヌクレオチド配列を含有する。
好適な方法が、Ｍｏｒｉｎａｇａら、｛Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４） ２、ｐ６４６−６４９）において開示されている。酵素エンコード化ヌクレオチド配列中に突然変異を導入する別の方法は、ＮｅｌｓｏｎおよびＬｏｎｇ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８９）、１８０、ｐ １４７−１５１）において開示されている。さらに別の方法が、ＳａｒｋａｒおよびＳｏｍｍｅｒ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９０）、８、ｐ４０４−４０７ −“Ｔｈｅ ｍｅｇａｐｒｉｍｅｒ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”）において記載されている。
一つの態様において、本明細書において記載される方法および組成物において用いられる配列は組み換え配列、すなわち、組み換えＤＮＡ技術を用いて調製された配列である。これらの組み換えＤＮＡ技術は、当業者の能力の範囲内である。このような技術は、文献、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｂｏｏｋｓ １−３、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓにおいて説明されている。
一つの態様において、本明細書において記載される方法および組成物において用いられる配列は、合成配列、すなわち、インビトロで化学的または酵素合成により調製された配列である。これは、例えば、メチロトローフ酵母ＰｉｃｈｉａおよびＨａｎｓｅｎｕｌａなどの宿主生物について最適のコドン使用で造られた配列を包含するが、これに限定されない。
本明細書において記載される方法および組成物において用いられるヌクレオチド配列 は、組み換え複製可能なベクター中に組み入れることができる。ベクターは、ヌクレオチド配列を、酵素形態で、適合性宿主細胞において、および／または適合性宿主細胞から複製し、発現するために用いることができる。発現は、制御配列、例えば、調節配列を用いて制御することができる。宿主組み換え細胞により、ヌクレオチド配列の発現により産生される酵素は、用いられる配列および／またはベクターに応じて、分泌されるか、または細胞内に含まれ得る。コーディング配列は、特定の原核または真核細胞膜を通して物質コード化配列の分泌を行うシグナル配列を用いて設計される。
（ＰＳ４核酸およびポリペプチドの発現）
ＰＳ４ポリヌクレオチドおよび核酸は、合成または天然起源両方のＤＮＡおよびＲＮＡを包含し、このＤＮＡまたはＲＮＡは修飾または未修飾デオキシ−またはジデオキシ−ヌクレオチドまたはその類似体を含有する。ＰＳ４核酸は一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖またはＲＮＡ／ＤＮＡコポリマーとして存在することができ、ここで、「コポリマー」なる用語は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方を含む１つの核酸鎖を意味する。ＰＳ４核酸はさらには、発現をさらに増大させるために最適化されたコドンであってもよい。
「合成」なる用語は、本明細書において用いられる場合、インビトロで化学的または酵素による合成により産生されるものとして定義される。これは、メチロトローフ酵母ＰｉｃｈｉａおよびＨａｎｓｅｎｕｌａなどの宿主生物についての最適のコドン使用で調製されたＰＳ４核酸を包含するが、これに限定されない。
ポリヌクレオチド、例えば、本明細書において記載される改変体ＰＳ４ポリヌクレオチドは、組み換え複製可能なベクター中に組み入れることができる。ベクターは、適合性宿主細胞において核酸を複製するために使用できる。ポリヌクレオチド配列を含むベクターは、好適な宿主細胞中に形質転換できる。好適な宿主は、細菌、酵母、昆虫および真菌細胞を包含する。
「形質転換された細胞」は、組み換えＤＮＡ技術の使用により形質転換された細胞を包含する。形質転換は、典型的には、１以上のヌクレオチド配列を形質転換される細胞中に挿入することにより起こる。挿入されたヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列（すなわち、形質転換される細胞に対して自然でない配列）である。付加的に、または選択的に、挿入されたヌクレオチド配列は、相同性ヌクレオチド配列（すなわち、形質転換される細胞に対して自然な配列）であってもよく、従って、細胞は、その中にすでに存在するヌクレオチド配列の１以上の余分なコピーを受容する。
従って、さらなる実施形態において、本発明者らは、ポリヌクレオチドを複製可能なベクター中に導入し、ベクターを適合性宿主細胞中に導入し、ベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることにより、ＰＳ４改変体ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを調製する方法を提供する。ベクターは、宿主細胞から回収することができる。
（発現構築物）
ＰＳ４核酸は、興味のある宿主細胞において活性な、転写よび翻訳調節エレメント操作可能に結合させることができる。ＰＳ４核酸はまた、シグナル配列、例えば、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓからのグルコアミラーゼ遺伝子由来のもの、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのα−因子接合型遺伝子およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅからのＴＡＫＡ−アミラーゼなどを含む融合タンパク質をエンコードすることができる。別法として、ＰＳ４核酸は膜結合ドメインを含む融合タンパク質をエンコードすることができる。
（発現ベクター）
発現ベクターを用いて、宿主細部において望ましいレベルでＰＳ４核酸を発現することができる。
ＰＳ４核酸を含む発現ベクターは、選択された宿主生物においてＰＳ４核酸をエンコードする遺伝子を発現できる任意のベクターであり、ベクターの選択は、これが導入される宿主細胞に依存する。従って、ベクターは、自発的に複製するベクター、すなわち、エピソーム物質として存在するベクターであり、その複製が染色体複製に依存しないもの、例えば、プラスミド、バクテリオファージまたはエピソームエレメント、ミニ染色体または人工染色体である。別法として、ベクターは、宿主細胞中に導入された場合、宿主細胞ゲノム中に組み入れられ、染色体とともに複製されるものである。
（発現ベクターの成分）
発現ベクターは典型的には、クローニングベクターの成分、例えば、特定の選択された宿主生物においてベクターの自発的複製を許容するエレメントおよび選択目的の１以上の表現型上で検出可能なマーカーを含む。発現ベクターは通常、プロモーターをエンコードする制御ヌクレオチド配列、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナルおよび場合により、リプレッサー遺伝子または１以上のアクチベーター遺伝子を含む。さらに、発現ベクターは、ペルオキシソームなどの宿主細胞オルガネラまたは特定の宿主細胞コンパートメントをＰＳ４改変体ポリペプチドの標的とさせるアミノ酸配列をコードする配列を含み得る。このようなターゲティング配列は、これに限定されないが、配列ＳＫＬを含む。この文脈において、「発現シグナル」は、前記調節配列、リプレッサーまたはアクチベーター配列のいずれかを含む。調節配列のもとでの発現について、核酸配列ＰＳ４改変体ポリペプチドは調節配列と発現に関して適切な方法で操作可能に結合する。
好ましくは、ベクター中のポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコーティング配列の発現を提供できる調節配列と操作可能に結合する。すなわち、ベクターは発現ベクターである。「操作可能に結合する」とは、記載される成分が、これらが意図される方法で機能することを許容する関係にあることを意味する。コーディング配列と「操作可能に結合した」制御配列は、コーディング配列の発現が、調節配列と適合する条件下で達成されるような方法で結紮される。
調節配列は、例えば、さらなる転写制御エレメントの添加により修飾することができ、 調節配列による転写のレベルが転写モジュレーターに対してより反応性になる。調節配列 は特にプロモーターを含むことができる。
（プロモーター）
ベクターにおいて、改変体ＰＳ４ポリペプチドをエンコードする核酸配列は、好適なプロモーター配列と操作可能に組み合わせられる。プロモーターは、最適の宿主生物において転写活性を有する任意のＤＮＡ配列であってよく、宿主生物と同種または異種の遺伝子から誘導することができる。
（細菌プロモーター）
細菌宿主において、修飾されたヌクレオチド配列、例えばＰＳ４核酸の転写を行うために適したプロモーターの例は、イー・コリのｌａｃオペロンのプロモーター ｏｐｅｒｏｎ ｏｆ Ｅ． ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ ａｇａｒａｓｅ遺伝子ｄａｇＡプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ糖産生アミラーゼｇｅｎｅ（ａｍｙＭ）のプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓα−アミラーゼｇｅｎｅ（ａｍｙＱ）のプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｘｙｌＡ ａｎｄ ｘｙｌＢ遺伝子のプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｐｒＥ遺伝子のプロモーターおよびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ種由来のプロモーター、例えば、Ｐ１７０プロモーターを包含する。ＰＳ４改変体ポリペプチドをエンコードする遺伝子が細菌種、例えば、イー・コリにおいて発現される場合、好適なプロモーターを、例えば、Ｔ７プロモーターおよびファージラムダプロモーターを包含するバクテリオファージプロモーターから選択することができる。
（真菌プロモーター）
真菌種における転写について、有用なプロモーターの例は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸 アスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼ、Ａ． ｎｉｇｅｒ酸安定性α−９９５ アミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースホスフェートイソメラーゼまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアセタミダーゼをエンコードする遺伝子由来のものである。
（酵母プロモーター）
酵母種における発現の好適なプロモーターの例は、これに限定されないが、Ｇａｌ １およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧａｌ １０プロモーターおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＯＸｌまたはＡＯＸ２プロモーターを包含する。
（宿主生命体）
（Ｉ）細菌宿主生命体
好適な細菌宿主生命体の例は、グラム陽性菌種、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを包含するＢａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ種、例えば、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓを包含する乳酸菌種、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉを包含するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ種、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ種およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種である。別法として、イー・コリを包含するＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅに属するグラム陰性菌種の菌株を宿主生命体として選択することができる。
（ＩＩ）酵母宿主生命体
好適な酵母宿主生命体は、バイオテクノロジー上関連する酵母種、例えばこれに限定されないが、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ種またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉｎｉａ種またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを包含するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの種またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅに属する種、例えば、Ｓ．Ｐｏｍｂｅ種から選択することができる。
好ましくは、メチロトローフ酵母種の菌株Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは宿主生命体として用いられる。好ましくは、宿主生命体は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ種である。
（ＩＩＩ）真菌宿主生命体
糸状菌のうち好適な宿主生命体は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの種、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓを包含する。別法として、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種の菌株、例えば Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍまたはＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ種の菌株、例えば、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉを宿主生命体として用いることができる。他の好適な菌株は、ＴｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓおよびＭｕｃｏｒ種を包含する。
好適な真菌宿主生命体は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種（特に、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ 以前は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ；Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａとも呼ばれる）を包含する。
（タンパク質発現および精製）
ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を用いて、ポリペプチド、例えば、改変体ＰＳ４ポリペプチド、そのフラグメント、相同体、改変体または誘導体を発現することができる。タンパク質の発現を可能にする好適な条件下で宿主細胞を培養することができる。ポリペプチドの発現は構造的であるので、これらは連続して産生されるか、または誘発性であり、発現を開始するために刺激を必要とする。誘発性発現の場合において、タンパク質産生は、例えば、インデューサー物質を培地、例えば、必要ならば、デキサメタゾンまたはＩＰＴＧに添加することにより開始することができる。
ポリペプチドは、宿主細胞から、酵素、化学および／または浸透圧溶解および物理的破壊を包含する、当該分野において公知の様々な技術により抽出することができる。ポリペプチドは、組み替えによって、インビトロ無細胞系、例えば、ＴｎＴTM（Ｐｒｏｍｅｇａ）ウサギ網状赤血球系において組み換え的に産生することもできる。
（実施例１ ＰＳ４のクローニング）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｈａｒｏｐｈｉｌａ非糖産生エキソアミラーゼＰＳ４のクローニングおよびプラスミドｐＣＳｍｔａおよびｐＣＳｍｔａ−ＳＢＤの生成は、 ＷＯ ２００５／００３３３９、特に、実施例１において記載されている。
部位特異的突然変異誘発法（ＳＤＭ）は、ＷＯ ２００５／００３３３９、特に、この文献の実施例２において記載される方法を用いて行うことができる。
（実施例２ マルチＳＤＭ）
ＰＳ４改変体は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ部位特異的突然変異誘発法キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造業者のプロトコルに従い、記載されるようないくつかの変更を加えて用いて生成させた。
段階１：突然変異鎖合成反応（ＰＣＲ）
１０ｍｌＦａｌｃｏｎ管中に３ｍｌのＬＢ（２２ｇ／ｌ Ｌｅｎｎｏｘ Ｌ Ｂｒｏｔｈ Ｂａｓｅ、Ｓｉｇｍａ）＋抗生物質（０，０５μｇ／ｍｌカナマイシン、Ｓｉｇｍａ）を接種する。
３７℃、約２００ｒｐｍでインキュベートする。
遠心分離（５０００ｒｐｍ／５分）により細胞を沈降させる。
培地を捨てる。
ＱＩＡＧＥＮプラスミドミニ精製プロトコルを用いて、ｄｓ−ＤＮＡテンプレートを調製する。
１．温度サイクリング用突然変異体鎖合成反応は、次のようにして調製した：
ＰＣＲミックス：
２，５μｌ １０Ｘ ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ反応緩衝液
０，７５μｌ ＱｕｉｃｋＳｏｌｕｔｉｏｎ
Ｘμｌ プライマー
プライマー長 ２８−３５ｂｐ→１０ｐｍｏｌ
プライマー長 ２４−２７ｂｐ→７ｐｍｏｌ
プライマー長 ２０−２３ｂｐ→５ｐｍｏｌ
１μｌ ｄＮＴＰミックス
Ｘμｌ ｄｓ−ＤＮＡテンプレート（２００ｎｇ）
１μｌ ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ酵素ブレンド（２，５Ｕ／μｌ）（ＰｆｕＴｕｒｂｏ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ）
Ｘμｌ ｄＨ２Ｏ（最終体積２５μｌにする）
全ての成分をピペット操作により混合し、および反応混合物を短時間沈降させる。
２．次のパラメータを用いて反応を循環させる：変性３５サイクル（９６℃／１ｍｍ）
プライマーアニーリング（６２，８℃／１分）
伸長（６５℃／１５分）
次いで４℃で保持。
ＰＣＲ器の蓋を１０５℃に、プレートを９５℃に予熱した後、ＰＣＲ管を機械（エッペンドルフサーマルサイクラー）中に入れる。
段階２：Ｄｐｎ Ｉ消化
１．２μｌのＤｐｎ Ｉ制限酵素（１０Ｕ／μｌ）を各増幅反応に添加し、ピペット操作により混合し、混合物を沈降させる。
２．３７℃で〜時間インキュベートする。
段階３：ＸＬＩＯ−Ｇｏｌｄ（登録商標）ウルトラコンピテント細胞の形質転換
１．ＸＬｌ０−Ｇｏｌｄ細胞を氷上で解凍する。突然変異誘発反応ごとに４５μｌをあらかじめ冷却されたＦａｌｃｏｎ管に等分する。
２．水浴（４２℃）を作動させ、ＮＺＹ＋ブロスを含む試験管を浴中に入れて予熱する。
３．２μｌのβ−メルカプトエタノールミックスを各試験管に添加する。回転させ、優しくたたき、２分ごとに回転させながら、１０分間氷上でインキュベートする。
４．１，５μｌのＤｐｎ Ｉ処理されたＤＮＡを細胞の各アリコートに添加し、回転させて混合し、氷上で３０分間インキュベートする。
５．試験管を４２℃の水浴中で３０分間熱パルスし、氷上に２分間置く。
６．０．５ｍｌの予熱されたＮＺＹ＋ブロスを各試験管に添加し、３７℃で１時間、２２５−２５０ｒｐｍで振とうしながらインキュベートする。
７．１％デンプンおよび０，０５μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＬＢプレート（３３，６ｇ／１ Ｌｅｎｎｏｘ Ｌ Ａｇａｒ、Ｓｉｇｍａ）上に各形質転換反応物２００μｌをプレートする。
８．形質転換プレートを３７℃で一夜インキュベートする。
ＷＯ ２００５／００３３３９の実施例２において記載される方法を用いて、特定の位置を修飾するために、「ＳＤＭ」プライマーを用いることができる。本明細書における実施例３に記載される方法を用いて、「ＭＳＤＭ」プライマーを用いることができる。
Figure 2008544751
 （実施例３ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓへの形質転換（プロトプラスト形質転換））
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＤＢ１０４Ａ株；Ｓｍｉｔｈら、１９８８；Ｇｅｎｅ ７０、３５１−３６１）を突然変異プラスミドで下記のプロトコルに従って突然変異させる。
Ａ．プロトプラスト化および形質転換用培地
２ｘＳＭＭ１リットルあたり：３４２ｇシュークロース（１Ｍ）；４．７２ｇマレイン酸ナトリウム（０．０４Ｍ）；８：１２ｇ ＭｇＣｌ２，６Ｈ２０（０．０４Ｍ）；濃ＮａＯＨでｐＨ６．５にする。５０−ｍｌずつに分配し、１０分間オートクレーブ処理する。
４ｘ ＹＴ（１／２ＮａＣｌ）
ＳＭＭＰ
ＰＥＧ
２ｇ酵母エキス＋３．２ｇトリプトン＋０．５ｇ ＮａＣｌ／１００ｍｌ。
等体積の２ｘＳＭＭおよび４ｘＹＴを混合する。
２５ｍｌ １ｘＳＭＭ（１０分間オートクレーブ処理する。）中１０ｇポリエチレングリコール６０００（ＢＤＨ）または８０００（Ｓｉｇｍａ）。
Ｂ．プレーティング／再生用培地
寒天 ４％Ｄｉｆｃｏ最小寒天。１５分間オートクレーブ処理する。
コハク酸ナトリウム ２７０ｇ／ｌ（１Ｍ）、ＨＣｌでｐＨ７．３にする。１５分間オートクレーブ処理する。
リン酸塩緩衝液１００ｍｌあたり、３．５ｇ Ｋ２ＨＰＯ４＋１．５ｇ ＫＨ２ＰＯ４。１５分間オートクレーブ処理する。
ＭｇＣｌ２１００ｍｌあたり、２０．３ｇＭｇＣｌ２、６Ｈ２Ｏ（１Ｍ）。
カザミノ酸 ５％（ｗ／ｖ）溶液。１５分間オートクレーブ処理する。
酵母エキス １００ｍｌあたり１０ｇ、１５分間オートクレーブ処理する。
グルコース ２０％（ｗ／ｖ）溶液。１０分間オートクレーブ処理する。
ＤＭ３再生培地：６０℃（水浴；５００−ｍｌ瓶）で混合する：
２５０ｍｌ コハク酸ナトリウム
５０ｍｌ カザミノ酸
２５ｍｌ 酵母エキス
５０ｍｌ リン酸塩緩衝液
１５ｍｌ グルコース
１０ｍｌ ＭｇＣｌ２
１００ｍｌ 溶融寒天
適切な抗生物質：クロラムフェニコールおよびテトラサイクリン、５ｕｇ／ｍｌ；エリスロマイシン、１ｕｇ／ｍｌを添加する。カナマイシンの選択は、ＤＭ３培地中では問題がある：２５０ｕｇ／ｍｌの濃度が必要である。
Ｃ．プロトプラストの調製
１．洗剤不要のプラスチックまたはガラス製品を最初から最後まで使用する。
２．１０ｍｌの２ｘ ＹＴ培地を単一コロニーから１００−ｍｌフラスコ中に接種する。培養物を２５−３０℃でシェーカー（２００回転／分）中、一夜増殖させる。
３．培養物を１００ｍｌの新鮮な２ｘＹＴ ｍｅｄｉｕｍ（２５０ｍｌフラスコ）中で２０倍に一夜希釈し、ＯＤ６００＝０．４−０．５（約２時間）になるまで、３７℃でシェーカー（２００−２５０回転／分）中で増殖させる。
４．遠心分離（９０００ｇ、２０分、４℃）により細胞を収穫する。
５．上清をピペットで除去し、細胞を５ｍｌのＳＭＭＰ＋５ｍｇリソザイム中に再懸濁させ、滅菌濾過する。
６．３７℃で水浴シェーカー（１００回転／分）中でインキュベートする。
３０分後、およびその後１５分間隔で、２５ｕｌのサンプルを顕微鏡法により調べる。細胞の９９％がプロトプラスト化（球状の外観）されるまでインキュベーションを続ける。遠心分離（４０００ｇ、２０分、ＲＴ）によりプロトプラストを収穫し、上清をピペットで捨てる。ペレットをやさしく１−２ｍｌのＳＭＭＰ中に再懸濁させる。
プロトプラストは現在使える状態である。さらなる使用（グリセロール添加は必要ない）のために、（一部（例えば０．１５ｍｌ）をマイナス８０℃で凍結させることができる。この結果、形質転換可能性が若干減少するが、ＤＮＡ１ｕｇあたり１０６の形質転換体を凍結プロトプラストとともに得ることができる。
Ｄ．形質転換
１．４５０ｕｌのＰＥＧをミクロ試験管に移す。
２．１−１０ｕｌのＤＮＡ（０．２ｕｇ）を１５０ｕｌのプロトプラストと混合し、混合物をＰＥＧとともにミクロ試験管に添加する。直ちに、ただし優しく混合する。
３．２分間室温で放置し、次に１．５ｍｌのＳＭＭＰを添加し、混合する。
４．ミクロ遠心分離（１０分、１３．０００回転／分（１０−１２．０００ｇ））によりプロトプラストを収穫し、上清を捨てる。ティッシュペーパーで残りの液滴を除去する。
３００ｕｌのＳＭＭＰ（撹拌しない）を添加し、６０−９０分間３７℃で、水浴シェーカー（１００回転／分）中でインキュベートして、抗生物質耐性マーカーを発現させる。（プロトプラストは水浴の振とう作用により十分に再懸濁される）。１ｘＳＳＭ中に適切に希釈し、０．１ ｍｌをＤＭ３プレート上にプレートする。
（実施例４ ＰＳ４改変体のシェークフラスコ中での発酵）
シェークフラスコを次のようにして調製する：
Figure 2008544751
 オートクレーブ処理の前に、基質を４Ｎ硫酸または水酸化ナトリウムでｐＨ６．８に調節する。１つのバッフルを有する５００ｍｌフラスコ中に１００ｍｌの基質を入れ、３０分間オートクレーブ処理する。続いて、６ｍｌの無菌デキストロースシロップを添加する。デキストロースシロップは、１体積の５０％ｗ／ｖデキストロースを１体積の水と混合し、続いて２０分間オートクレーブ処理することにより調製する。
シェークフラスコに改変体を接種し、２４時間、３５℃／１８０ｒｐｍで、インキュベーター中でインキュベートする。インキュベーション後、細胞をブロスから遠心分離（１０分で１０．０００ｘｇ）により分離し、最後に、０．２μｍで精密濾過により上清は無細胞になる。無細胞上清を分析および適用試験に使用する。
（実施例５ アミラーゼ分析）
Ｂｅｔａｍｙｌ分析
１Ｂｅｔａｍｙｌ単位を１分あたり０，０３５１ミリモルのＰＮＰ結合マルトペントースを分解し、１分あたり０，０３５１ミリモルのＰＮＰを過剰のａ−グルコシダーゼにより分析ミックス中に放出させることができる活性として定義される。分析ミックスは、５０ｕｌの５０ｍＭクエン酸Ｎａ、５ｍＭ ＣａＣ１２、ｐＨ６，５と２５ｕｌの酵素サンプルおよび２５ｕｌのＭｅｇａｚｙｍｅ、Ｉｒｅｌａｎｄ（１０ｍｌ水中に溶解させた１バイアル）から得られるＢｅｔａｍｙｌ基質（Ｇｌｃ５−ＰＮＰおよびａ−グルコシダーゼ）とともに含有する。分析ミックスを３０分間、４０℃でインキュベートし、次に、１５０ｕｌ ４％Ｔｒｉｓを添加することにより停止させる。ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４２０ｎｍでの吸硬度を測定し、Ｂｅｔａｍｙｌ活性を活性＝Ａ４２０＊ｄ（Ｂｅｔａｍｙｌ単位／分析される酵素サンプルｍｌ）に基づいて計算する。
エンドアミラーゼ分析
エンドアミラーゼ分析は、製造業者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＡＢ）に従って行われるＰｈａｄｅｂａｓ分析と同じである。
エキソ特異性
エキソアミラーゼ活性のＰｈａｄｅｂａｓ活性に対する比を用いてエキソ特異性を評価した。
比活性
ｐＳａｃ−Ｄ１４、ｐＳａｃ−Ｄ２０およびｐＳａｃ−Ｄ３４改変体について、本発明者らは、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２、２４８）に従って測定された精製タンパク質１マイクログラムあたり１０Ｂｅｔａｍｙｌ単位の平均比活性を見出した。この比活性は、適用試験において用いられる用量を計算するために、活性に基づいて用いられる。
（実施例６ 半減期決定）
ｔｌ／２は、その間に、酵素活性の半分が所定の熱条件下で不活性化する時間（分）として定義される。酵素の半減期を決定するために、サンプルを１−４０分間、６０℃から９０℃の一定温度で加熱する。半減期は、残留Ｂｅｔａｍｙｌ分析により計算される。
手順：Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆバイアル中、１０００μｌの緩衝液を少なくとも１０分間、６０℃以上で予熱する。サンプルの熱処理を開始し、１００μｌのサンプルを余熱された緩衝液に、加熱インキュベーター（Ｔｅｒｍｏｍｉｘｅｒ ｃｏｍｆｏｒｔ ｆｒｏｍ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆバイアルの連続混合下（８００ｒｐｍ）で添加する。０、２、４、６、８および９分のインキュベーションの後、４５μｌのサンプルを２０℃で平衡化された１０００μｌの緩衝液に移し、１分間、１５００ｒｐｍ、２０℃でインキュベートすることにより、処理を停止する。残存活性をＢｅｔａｍｙｌ分析により測定する。
計算：ｔｌ／２の計算は、残留Ｂｅｔａｍｙｌ活性のインキュベーション時間に対するｌｏｇ１０（１０を底とする対数）の勾配に基づき、ｔｌ／２は、勾配／０．３０１＝ｔｌ／２として計算される。
（実施例７ モデルシステムベーキング試験）
ファリノグラフ中、３０．０℃で生地を作る。１０．００ｇの改良粉を量り分け、ファリノグラフに添加する；１分混合後、参照／サンプル（参照＝緩衝液または水、サンプル＝酵素＋緩衝液または水）を無菌ピペットで、混練タンクの穴から添加する。３０秒後、粉を端部からこすり落とし、これもまた混練タンクの穴から行う。サンプルを７分間混練する。
最終参照試験を行う前に、緩衝液または水を用いた試験をファリノグラフで行う。ＦＵ を４００で参照すべきであり、もし参照されないならば、例えば、液体の量で調節するべきである。参照／サンプルをスパチュラで除去し、手に取り（使い捨て手袋をはめる）、その後、小さなガラス製試験管（長さ約４．５ｃｍ）中に充填し、これをＮＭＲ管中に入れ、栓をする。生地ごとに７つの試験管を調製する。
全てのサンプルを調製したら、試験管を３３℃（栓なし）の（プログラム可能な）水浴中に２５分間入れ、その後、水浴を５分間３３℃であるように設定し、次いで５６分にわたって９８℃に加熱し（１．１℃／分）、最後に５分間９６℃にする。
試験管をサーモカバード中、２０．０℃で保存する。クラムの固形分を、Ｂｒｕｋｅｒ ＮＭＳ １２０ Ｍｉｎｉｓｐｅｃ ＮＭＲを用いて、１、３および７日に、図２において０．０５、１および２ｐｐｍのｐＳａｃ−Ｄ３４で調製されたクラムサンプルについて示されるように、プロトンＮＭＲ分析器により測定する。長時間にわたって固形分の増加が少ないことは、アミロペクチン老化の減少を表す。７日２０．０℃でサーモカバード中で保存した後、１０−２０ｍｇのクラムのサンプルを量り分け、４０μｌのアルミニウム製標準的ＤＳＣカプセル中に入れ、２０℃で保持する。
カプセルをＭｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＤＳＣ ８２０装置での示差走査熱量測定法に使用する。パラメータとして、２０−９５℃で１０℃／分の加熱サイクル、加熱および気体／流れ：Ｎ２／８０ｍｌ／分が使用される。結果を分析し、老化したアミロペクチンの溶融のエンタルピーをＪ／ｇで計算する。
（実施例８ 老化防止効果）
モデルパンクラムを実施例７に従って調製し、測定する。ＰＳ４改変体は、対象に対する比較において、示差走査熱量測定法により測定すると、ベーキング後にアミロペクチンの強力な減少を示す。ＰＳ４改変体は明確な用量効果を示す。
（実施例９ ベーキング試験のレシピ）
米国トーストの標準的精白パンスポンジおよび生地レシピを用いて、ベーキング試験を行った。スポンジ生地を、１４００ｇの粉「金メダル（Ｇｏｌｄ Ｍｅｄａｌ）」（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｌｌｓ、ＵＳＡから入手）、８００ｇの水、４０ｇの菜種油、７，５ｇのＧＲＩＮＤＳＴＥＤTM ＳＳＬ Ｐ５５ Ｖｅｇ、１０ｇの乳化剤ＤＩＭＯＤ ＡＮTMＰＨ２００および６０ｇの圧搾酵母から調製する。スポンジを１分間、低速で混合し、続いて、３分間、Ｈｏｂａｒｔスパイラルミキサーでスピード２で混合する。スポンジを続いて３時間、２５℃、８５％ＲＨで発酵させる。
その後、６００ｇの「金メダル」粉、１８ｇの圧搾酵母、５ｇのプロピオン酸カルシウム、１６０ｇのシュークロース、５ｇのプロピオン酸カルシウム、４３２ｇの水およびアスコルビン酸（６０ｐｐｍ最終濃度）およびＡＤＡ（アゾジカルボンアミド；４０ｐｐｍ最終濃度）をスポンジに添加する。結果として得られる生地を、Ｄｉｏｓｎａミキサーで、１分間、低速で、次いで２分間拘束で混合する。次に、３０ｇの紙を生地に添加する。
生地を５分間、周囲温度で休ませ、次５５０ｇの生地片を量り、Ｇｌｉｍｅｋシーター（１：４、２：４、３：１５、４：１２の設定、および両端での幅８）で成形し、ベーキング形態にする。６５分間、４３℃、９５％ＲＨでプローフィング後、生地を２６分間、２００℃で、ＭＩＷＥオーブン中で焼く。
（実施例１０ デニッシュロールの体積の制御）
２０００ｇのＤａｎｉｓｈ改良粉（Ｃｅｒｅａｌｉａから入手）、１２０ｇの圧搾酵母、３２ｇの塩、および３２ｇのシュークロースに基づいた生地から、デニッシュロールを調製する。従来の水最適化に従って、生地に水を添加する。
生地をＤｉｏｓｎａミキサー（低速で２分、高速で５分）で混合する。混合後の生地温度を２６℃に保つ。１３５０ｇの生地を量り、加熱キャビネット中、３０℃で１０分間休ませる。ロールをＦｏｒｔｕｎａ成型機で成形し、４５分間、３４℃、相対湿度８５％ＲＨで発酵で検査する。続いて、ロールをＢａｇｏ ２オーブン中、１８分間２５０℃で、最初の１３秒で蒸気を用いて焼く。ベーキング後、ロールを２５分間冷却した後、秤量し、体積を測定する。
クラスト外観、クラム均一性、クラストのキャッピング、ａｕｓｂｕｎｄおよび比体積（菜種置換法で体積を測定する）に関して、ロールを評価する。
これらの基準に基づいて、ＰＳ４改変体は比体積を増大させ、デニッシュロールの質パラメータを改良することが見出される。従って、ＰＳ４改変体は焼き製品の体積を成業することができる。
（実施例１１ 硬度、弾力性および凝集性の評価のためのプロトコル）
パンのテクスチャー特性分析
硬度、弾力性および凝集性は、Ｔｅｘｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｅｒ Ｆｒｏｍ Ｓｔａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＫを用いるテクスチャー特性分析により決定される。硬度および弾力性の計算はＳｔａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏ Ｓｙｓｔｅｍ、ＵＫにより供給される標準に従っておこなわれる。使用されるプローブはアルミニウム周囲５０ｍｍである。
パンを幅１２．５ｍｍにスライスする。スライスを直径４５ｍｍの円形片に型抜きし、個々に測定する。
次の設定を使用する：
予備試験速度：２ｍｍ／ｓ
試験速度：２ｍｍ／ｓ
後試験速度：１０ｍｍ／ｓ
破壊試験距離：１％
距離：４０％
力：０．０９８Ｎ
時間：５．００秒
カウント：５
ロードセル：５ｋｇ
トリガーの種類：自動 −０．０１Ｎ
圧縮様式は、標準法ＡＡＣＣ ７４−０９において用いられるものの改良法である。サンプルを試験において２回圧縮する。図１は、テクスチャー分析から得られるグラフの一例を示す。
（実施例１２ 硬度の評価のためのプロトコル）
硬度は、最初の圧縮の間の４０％圧縮で決定される。図は、スライスを全体の厚さの５０％まで圧縮するために必要な力である。値が少ないほど、パンは柔らかい。硬度は圧力として、例えば、ｈＰａで表される。
この分析は、「硬度評価プロトコル」と呼ばれる。
（実施例１３ 弾力性の評価のためのプロトコル）
グラフの曲線の下の面積は、試験中に加えられた仕事の測定値である。最初の圧縮中の圧縮部分（Ａ１）および回復部分（Ａ２）の曲線の下の面積を図１に示す。
Ａ１とＡ２の間の比は、サンプルの弾力性として定義され、弾力性単位として表される。真の弾性材料は、第一部分の間に加えられる力は第二部分で加えられる力と等しいので対称的な曲線をもたらす。パンまたはパン様物質について、Ａ２は、圧縮中の構造の妨害のために、通常、Ａ２よりも小さい。従って、弾力性は常に１よりも小さい。
この分析は、「弾力性評価プロトコル」と呼ばれる。
（実施例１４ 凝集性評価のためのプロトコル）
凝集性は、第二圧縮下の面積の第一圧縮下の面積の比（Ａ３／Ａ１＋Ａ２）として定義され、凝集性単位として表される。これは、圧縮中のサンプルの崩壊の尺度である。サンプルが第一圧縮後にその形状を回復する能力が高いほど、この値は１に近くなる。パンおよびパン様物質にとって、凝集性は常に１よりも小さい。
この分析は、「凝集性評価プロトコル」と呼ばれる。
（実施例１５ 突然変異２７２Ｑを有するＰＳ４改変体ポリペプチドの向上したエキソ特異性）
Ｎ３３Ｙ Ｄ３４Ｎ Ｇ１２１Ｆ Ｇ１３４Ｒ Ａ１４１Ｐ Ｙ１４６Ｇ Ｉ１５７Ｌ Ｓ１６１Ａ Ｌ１７８Ｆ Ａ１７９Ｔ Ｇ２２３Ｅ Ｓ２２９Ｐ Ｈ２７２Ｑ Ｇ３０３Ｅ Ｈ３０７Ｌ Ａ３０９Ｐ Ｓ３３４Ｐでアミノ酸突然変異を有するＰＳ４改変体ポリペプチドをエキソ特異性について試験する。このポリペプチドは下記の表において示すように改良されたエキソ特異性を示す。
Figure 2008544751
 半減期ｔ１／２−８５は、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、５ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ６．５緩衝液を用いた、ＰＤ−１０カラム（ｆｒｏｍ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのサンプルのゲル濾過後、実施例６に従って決定される。
（実施例１６ ベーキング試験におけるｐＭＤ２２９、２４８、２５３および２７１の硬度効果）
ベーキング試験は、実施例１０において記載されるＵＳトーストについての標準的精白パンスポンジおよび生地レシピを用いて行われる。ｐＭＤ２２９、２４８、２５３および２７１のサンプルを粉１ｋｇあたり０．１から２０ｍｇの間隔の投与量で適用した。酵素サンプルをスポンジ発酵後に残りの成分とともに生地に添加する。
硬度測定値から、酵素が１日から７日で発生する硬度を著しく減少させ、酵素用量が増加すると、さらに高い効果を示すことがわかる。
（実施例１７ ＰＳ４改変体ポリペプチドで処理された食品の改良された取り扱い特性：硬度）
パンを４０，０００ Ｂｅｔａｍｙｌ単位／ｋｇのｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９とともに焼き、パンの硬度を実施例１２において記載されたプロトコルに従って、ベーキング後様々な時間で試験する。パンをさらに、 ４０，０００ Ｂｅｔａｍｙｌ単位／ｋｇのｐＳａｃ−Ｄ３４／ｐＭＤ３（配列番号２）とともに焼く。パンの硬度を試験する。対照として、酵素なしで焼いたパンの硬度も測定する。
図２は、ｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９で処理されたパンの硬度をｐＳａｃ−Ｄ３４で処理されたパンの硬度と比較する、ベーキング試験の結果を示す。
（実施例１８ ＰＳ４改変体ポリペプチドで処理された食品の改良された取り扱い特性：弾力性）
パンを４０，０００Ｂｅｔａｍｙｌ単位／ｋｇ のｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９とともに焼き、パンの弾力性を実施例１３に記載されたプロトコルに従って、ベーキング後の様々な時点で試験する。パンをさらに、４０，０００Ｂｅｔａｍｙｌ単位／ｋｇのｐＳａｃ−Ｄ３４／ｐＭＤ３（配列番号：２）とともに焼く。パンの弾力性を試験する。対照として、酵素なしで焼いたパンの弾力性も測定する。
図３は、ｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９で処理されたパンの弾力性をｐＳａｃ−Ｄ３４で処理されたパンの弾力性と比較する、ベーキング試験の結果を示す。
（実施例１９ ＰＳ４改変体ポリペプチドで処理された食品の改良された取り扱い特性：凝集性）
パンを４０，０００ Ｂｅｔａｍｙｌ単位／ｋｇのｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９とともに焼き、パンの凝集性を実施例１４において記載されたプロトコルに従い、ベーキング後の様々な時点で試験する。パンをさらに、４０，０００ Ｂｅｔａｍｙｌ単位／ｋｇのｐＳａｃ−Ｄ３４／ｐＭＤ３（配列番号２）とともに焼く。パンの凝集性を試験する。対照として、酵素なしで焼いたパンの凝集性も測定する。
図４はｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９で処理されたパンの凝集性が、ｐＳａｃ−Ｄ３４で処理されたパンの凝集性と比較されるベーキング試験の結果を示す。
（参考文献）
Figure 2008544751
 本明細書において記載される特許出願、ならびに上記特許出願および特許（審査中の特許出願を含む）のそれぞれにおいて引用されるかまたは参照される文書のそれぞれ（出願引用文書）、ならびに上記出願および文書のそれぞれにおいて、および出願引用文書のいずれかにおいて引用されるかまたは記載される、あらゆる製品についてのあらゆる製造業者らの説明書またはカタログは、本明細書中で参考として援用される。さらに、本文において引用される全ての文書、および本文において引用される文書において引用または参照される全ての文書、ならびに本文において引用または記載される任意の製品についてのあらゆる製造業者の説明書またはカタログは、本明細書中で参考として援用される。
記載された方法および本発明のシステムの様々な修正および変更は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には明らかになるであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関して記載されているが、請求される本発明は、このような特定の実施形態に不当に制限されるべきではないと理解されるべきである。実際、分子生物学または関連する分野の当業者に明らかな、本発明を行うための記載された様式の様々な修正は、特許請求の範囲内にあることが意図される。
Figure 2008544751
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テクスチャー分析器から得られる曲線の一例を示す。 改良された硬度効果、すなわち、ベーキング後の貯蔵期間で、ｐＳａｃ−Ｄ３４で処理されたパンに対してｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９で処理されたパンの硬度が低いことを示す。図２は、ベーキング試験の結果を示し、ここでは、ｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９、ｐＳａｃ−Ｄ３４で処理されたパンおよび未処理のパンの硬度が試験される。Ｘ軸は日数を示し、Ｙ軸は硬度単位で表された硬度を示す。菱形：４００００Ｂｅｔａｍｙｌ単位／ｋｇのｐＳａｃ−Ｄ３４。四角：４０，０００Ｂｅｔａｍｙｌ単位／ｇのｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９。×：対照（酵素なし）。 改良された弾力性効果、すなわち、ベーキング後の貯蔵期間で、ｐＳａｃ−Ｄ３４で処理されたパンに対してｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９で処理されたパンの弾力性が高いことを示す。図３は、ベーキング試験の結果を示し、ここでは、ｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９、ｐＳａｃ−Ｄ３４で処理されたパンおよび未処理のパンの弾力性が試験される。Ｘ軸は日数を示し、Ｙ軸は弾力性単位で表された弾力性を示す。菱形：４００００Ｂｅｔａｍｙｌ単位／ｋｇのｐＳａｃ−Ｄ３４。四角：４０，０００Ｂｅｔａｍｙｌ単位／ｇのｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９。×：対照（酵素なし）。 改良された凝集性効果、すなわち、ベーキング後の貯蔵期間でのｐＳａｃ−Ｄ３４で処理されたパンに対してｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９で処理されたパンの凝集性が高いことを示す。図４は、ベーキング試験の結果を示し、ここでは、ｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９、ｐＳａｃ−Ｄ３４で処理されたパンおよび未処理のパンの凝集性が試験される。Ｘ軸は日数を示し、Ｙ軸は凝集性単位で表された凝集性を示す。菱形：４００００Ｂｅｔａｍｙｌ単位／ｋｇのｐＳａｃ−Ｄ３４。四角：４０，０００Ｂｅｔａｍｙｌ単位／ｇのｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９。×：対照（酵素なし）。

Claims (65)

  1. 配列番号１として示されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａエキソアミラーゼ配列の位置ナンバリングに準拠して：
    （ａ）３３、３４、１２１、１３４、１４１、１４６、１５７、１６１、１７８、１７９、２２３、２２９、２７２、３０３、３０７、３０９および３３４位のそれぞれでアミノ酸突然変異を含むポリペプチド；
    （ｂ）３３、３４、１２１、１３４、１４１、１４５、１４６、１５７、１７８、１７９、２２３、２２９、２７２、３０３、３０７および３３４位のそれぞれでアミノ酸突然変異を含むポリペプチド；
    （ｃ）３３、３４、１２１、１３４、１４１、１４６、１５７、１７８、１７９、２２３、２２９、２７２、３０３、３０７、３０９および３３４位のそれぞれでアミノ酸突然変異を含むポリペプチド；
    （ｄ）３、３３、３４、７０、１２１、１３４、１４１、１４６、１５７、１７８、１７９、２２３、２２９、２７２、３０３、３０７、３０９および３３４位のそれぞれでアミノ酸突然変異を含むポリペプチド；
    からなる群から選択される、アミラーゼ活性を有する親ポリペプチドから誘導できるＰＳ４改変体ポリペプチド。
  2. ポリペプチド（ａ）におけるアミノ酸突然変異のそれぞれが：
    Figure 2008544751
     からなる群から独立して選択される、請求項１記載のＰＳ４改変体ポリペプチド。
  3. 配列ｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９（配列番号１３）を含む、請求項１または２記載のＰＳ４改変体ポリペプチド。
  4. ポリペプチド（ｂ）におけるアミノ酸突然変異のそれぞれが：
    Figure 2008544751
     からなる群から独立して選択される、請求項１記載のＰＳ４改変体ポリペプチド。
  5. 配列ｐＳａｃ−ｐＭＤ２４８（配列番号１５）を含む請求項１または４記載のＰＳ４改変体ポリペプチド。
  6. ポリペプチド（ｃ）におけるアミノ酸突然変異のそれぞれが：
    Figure 2008544751
     からなる群から独立して選択される、請求項１記載のＰＳ４改変体ポリペプチド。
  7. 配列ｐＳａｃ−ｐＭＤ２５３（配列番号１７）を含む請求項１または６記載のＰＳ４改変体ポリペプチド。
  8. ポリペプチド（ｄ）におけるアミノ酸突然変異のそれぞれが：
    Figure 2008544751
     からなる群から独立して選択される、請求項１記載のＰＳ４改変体ポリペプチド。
  9. 配列ｐＳａｃ−ｐＭＤ２７１（配列番号１９）を含む請求項１または８記載のＰＳ４改変体ポリペプチド。
  10. 前記親ポリペプチドが、エキソアミラーゼ活性、好ましくは、非糖産生エキソアミラーゼ、さらに好ましくは、グルカン１，４−アルファ−マルトテトラヒドロラーゼ（ＥＣ ３．２．１．６０）を含む、前記請求項のいずれか１項記載のＰＳ４改変体ポリペプチド。
  11. 前記親ポリペプチドが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、好ましくは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉであるか、またはこれらから誘導できる、前記請求項のいずれか１項記載のＰＳ４改変体ポリペプチド。
  12. 前記親ポリペプチドが、配列番号１または配列番号５として示される配列を有する、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａエキソアミラーゼからの非糖産生エキソアミラーゼである、前記請求項のいずれか１項記載のＰＳ４改変体ポリペプチド。
  13. 配列番号１または配列番号５と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有する、前記請求項のいずれか１項記載のＰＳ４改変体ポリペプチド。
  14. 前記親ポリペプチド が、配列番号７または配列番号１１として示される配列を有する、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ由来の非糖産生エキソアミラーゼである、請求項１から１０のいずれか１項記載のＰＳ４改変体ポリペプチド。
  15. 配列番号７または配列番号１１と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１から１０または１４のいずれか１項記載のＰＳ４改変体ポリペプチド。
  16. 前記ＰＳ４改変体ポリペプチドが、同じ条件下で試験された場合に、前記親ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドと比較して、より高い耐熱性を有する、前記請求項のいずれか１項記載のＰＳ４改変体ポリペプチド。
  17. 半減期（ｔｌ／２）、好ましくは６０℃での半減期が、前記親ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドに対して、１５％以上、好ましくは５０％以上、最も好ましくは１００％以上増大している、前記請求項のいずれか１項記載のＰＳ４改変体ポリペプチド。
  18. 前記ＰＳ４改変体ポリペプチドが、同じ条件下で試験された場合に前記親ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドよりも高いエキソ特異性を有する、前記請求項のいずれか１項記載のＰＳ４改変体ポリペプチド。
  19. 前記ＰＳ４改変体ポリペプチドが、前記親ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドと比較して、１０％以上、好ましくは２０％以上、好ましくは５０％以上のエキソ特異性を有する、前記請求項のいずれか１項記載のＰＳ４改変体ポリペプチド。
  20. 前記ＰＳ４改変体ポリペプチドで処理された食品が、親ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドで処理された食品と比較して、次の特性：（ａ）より低い硬度；（ｂ）より高い弾力性；および（ｃ）より高い凝集性、のいずれか１以上、好ましくは全部を有する、前記請求項のいずれか１項記載のＰＳ４改変体ポリペプチド。
  21. 前記食品の弾力性または凝集性が、親ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドで処理された食品に対して、１５％以上、好ましくは５０％以上、最も好ましくは１００％以上独立して増大している、請求項２０記載のＰＳ４改変体ポリペプチド。
  22. 前記ＰＳ４改変体ポリペプチドで処理された食品の弾力性および凝集性のそれぞれが、親ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドで処理された食品と比較して増大している、請求項２０または２１記載のＰＳ４改変体ポリペプチド。
  23. 前記食品の硬度が、親ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドで処理された食品に対して、１５％以上、好ましくは、５０％以上、最も好ましくは１００％以上、独立して増大している、請求項２０記載のＰＳ４改変体ポリペプチド。
  24. 前記ＰＳ４改変体ポリペプチドで処理された食品の硬度が、親ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドで処理された食品と比較して増大している、請求項２０または２３記載のＰＳ４改変体ポリペプチド。
  25. 前記ＰＳ４改変体ポリペプチド配列の１以上の残基での突然変異により、前記請求項のいずれか１項記載のＰＳ４改変体ポリペプチドから誘導できるであって、前記ポリペプチドが、前記ＰＳ４改変体ポリペプチドの親ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドと比較して、より高い耐熱性またはより高いエキソ特異性、または両者を有するか、もしくは前記ＰＳ４改変体ポリペプチドで処理された食品が、親ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドで処理された食品と比較して、次の特性：（ａ）より低い硬度；（ｂ）より高い弾力性；または（ｃ）より高い凝集性、のいずれか１以上、好ましくは全部を有する、ポリペプチド。
  26. 前記請求項のいずれか１項記載のＰＳ４改変体ポリペプチドの少なくとも２０残基のフラグメントを含むポリペプチドであって、非糖産生エキソアミラーゼ活性を有するポリペプチド。
  27. 前記ＰＳ４改変体ポリペプチド配列の１以上の残基での突然変異により前記請求項のいずれか１項記載のポリペプチドから誘導できるポリペプチドであって、前記ＰＳ４改変体ポリペプチドの親ポリペプチドまたは野生型ポリペプチドと比較して、より高い耐熱性またはより高いエキソ特異性、または両者を有するポリペプチド。
  28. 食品添加物または試料添加物としての前記請求項のいずれか１項記載のポリペプチドの使用。
  29. 請求項１から２５のいずれか１項記載のポリペプチドとデンプンを接触させ、前記ポリペプチドがデンプンから１以上の直鎖生成物を生成させることを含む、デンプンの処理法。
  30. 食品または飼料製品の調製における、請求項１から２５のいずれか１項記載のポリペプチドの使用。
  31. 請求項１から２５のいずれか１項記載のポリペプチドと食品または飼料成分とを混合することを含む、食品または飼料製品を調製する方法。
  32. 前記食品が生地または生地製品、好ましくは加工された生地製品を含む、請求項３０に記載の使用、または請求項３１記載の方法。
  33. 前記食品がベーカリー製品である、請求項２８から３２のいずれか１項記載の使用または方法。
  34. ベーカリー製品を製造する方法であって：（ａ）デンプン媒体を提供し；（ｂ）前記デンプン媒体に請求項１から２５のいずれか１項記載のポリペプチドを添加し；（ｃ）段階（ｂ）の間または後に前記デンプン媒体に熱を加えて、ベーカリー製品を製造することを含む方法。
  35. 請求項２８から３４のいずれか１項記載の方法により得られるか、または得ることができる食品、飼料製品、生地製品またはベーカリー製品。
  36. 生地用の改良剤組成物であって、請求項１から２５のいずれか１項記載のポリペプチド、および少なくとも１つのさらなる生地成分または生地添加剤を含む改良剤組成物。
  37. 粉および請求項１から２５のいずれか１項記載のポリペプチドを含む組成物。
  38. 生地製品において、前記生地製品の老化、好ましくは有害な老化を遅らせるか、または軽減するための、請求項１から２５のいずれか１項記載のポリペプチドの使用。
  39. 生地製品において、前記生地製品の硬度、弾力性または凝集性の１以上を改良するための、前記請求項のいずれか１項記載のＰＳ４改変体ポリペプチドの使用。
  40. 前記請求項のいずれか１項記載のＰＳ４改変体ポリペプチドの、Ｎｏｖａｍｙｌ、またはその改変体、相同体、または突然変異体との組み合わせであって、糖産生アルファ−アミラーゼ活性を有する組み合わせ。
  41. 前記請求項のいずれか１項記載の用途に関する、請求項４０記載の組み合わせの使用。
  42. 請求項４０記載の組み合わせでの処理により製造される食品または飼料製品。
  43. 請求項１から２５のいずれか１項記載のポリペプチドをエンコードする核酸。
  44. 配列番号６または配列番号１２と少なくとも７５％同一である核酸配列を有する、請求項４３記載の核酸。
  45. 請求項４３または４４記載の核酸の少なくとも６０残基のフラグメントを含む核酸であって、非糖産生エキソアミラーゼ活性を有するポリペプチドをエンコードできる核酸。
  46. アミラーゼをエンコードできる親配列から誘導できる核酸配列であって、前記核酸が、下記の特定される位置での突然変異：
    Figure 2008544751
     （配列番号１として示されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａエキソアミラーゼ配列の位置ナンバリングに準拠）の１以上をエンコードするように、前記核酸配列が１以上の残基での置換を含む、核酸配列。
  47. １以上のヌクレオチド残基の置換により非糖産生エキソアミラーゼをエンコードする親配列から誘導される、請求項４３から４６のいずれか１項記載の核酸配列。
  48. ｐＳａｃ−ｐＭＤ２２９（配列番号１４）、ｐＳａｃ−ｐＭＤ２４８（配列番号１６）、ｐＳａｃ−ｐＭＤ２５３（配列番号１８）およびｐＳａｃ−ｐＭＤ２７１（配列番号２０）からなる群から選択される、請求項４３から４７のいずれか１項記載の核酸配列。
  49. 請求項４３から４８のいずれか１項記載のＰＳ４核酸を含むプラスミド。
  50. 請求項４３から４９のいずれか１項記載のＰＳ４核酸を含むか、または請求項１から２５のいずれか１項記載のポリペプチドを発現できる、発現ベクター。
  51. 請求項４９記載のプラスミドまたは請求項５０記載の発現ベクターを含み、好ましくは、これで形質転換された宿主細胞。
  52. 請求項１から２５のいずれか１項記載のポリペプチドを発現できる細胞。
  53. 細菌、真菌または酵母細胞である、請求項５１記載の宿主細胞、または請求項５２記載の細胞。
  54. ＰＳ４改変体ポリペプチドを発現する方法であって、請求項５１、５２または５３記載の宿主細胞または細胞を得、前記細胞または宿主細胞からポリペプチドを発現し、場合により前記ポリペプチドを精製することを含む方法。
  55. Figure 2008544751
     （配列番号１として示されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａエキソアミラーゼ配列の位置ナンバリングに準拠）からなる群から選択されるアミノ酸置換を、アミラーゼ活性を有する親ポリペプチド中に導入することによる、ポリペプチドの配列を変更する方法。
  56. Figure 2008544751
     （配列番号１として示されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａエキソアミラーゼ配列の位置ナンバリングに準拠）からなる群から選択される置換を導入することによる、非糖産生エキソアミラーゼの配列を変更する方法。
  57. 前記非糖産生エキソアミラーゼをエンコードする核酸の配列を変更することにより、前記非糖産生エキソアミラーゼの配列が変更される、請求項５５または５６記載の方法。
  58. ＰＳ４ポリペプチド改変体を産生する方法であって、アミラーゼ活性を有する親ポリペプチド中にアミノ酸置換を導入することを含み、前記アミノ酸置換が：
    Figure 2008544751
     （配列番号１として示されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａエキソアミラーゼ配列の位置ナンバリングに準拠）からなる群から選択される方法。
  59. 請求項５５または５６記載の方法であって、前記親ポリペプチドをエンコードする核酸の配列が、前記アミノ酸置換を導入するために変更される方法。
  60. 非糖産生エキソアミラーゼをエンコードする核酸の配列を変更する方法であって：
    Figure 2008544751
     （配列番号１として示されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａエキソアミラーゼ配列の位置ナンバリングに準拠）からなる群から選択されるアミノ酸残基をエンコードするコドンを前記配列中に導入することを含む方法。
  61. ポリペプチドの耐熱性、またはエキソ特異性、または両者を増大させる方法であって、請求項５５から６０のいずれか１項記載の段階を含む方法。
  62. 前記ポリペプチドが単離されているか、または精製されているか、または両方である、請求項５５から６１のいずれか１項記載の方法。
  63. 請求項５５から６２のいずれか１項記載の方法により得ることができるポリペプチド。
  64. 請求項５５から６２のいずれか１項記載の方法により得たポリペプチド。
  65. 実質的に添付の図面を参照して前述される、また添付の図面に示される、ＰＳ４改変体ポリペプチド、使用、プロセス、食品、飼料製品、生地製品、ベーカリー製品、改良剤組成物、組成物、核酸、ベクターまたは宿主細胞。
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