CN102388133A

CN102388133A - 使用嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶变体产生麦芽四糖糖浆

Info

Publication number: CN102388133A
Application number: CN2010800160918A
Authority: CN
Inventors: G·段; S·H·李; Y·钱; R·F·萨拉; J·K·舍蒂
Original assignee: Danisco USA Inc
Current assignee: Danisco USA Inc; Danisco US Inc
Priority date: 2009-04-10
Filing date: 2010-04-08
Publication date: 2012-03-21
Also published as: US20130288309A1; WO2010118269A2; WO2010118269A3; US20120301927A1; EP2417255A2

Abstract

嗜糖假单胞菌G4形成淀粉酶(PS4)的变体可以有利地催化高温糖化，以由例如衍生自玉米淀粉的淀粉液化产物或颗粒淀粉产生麦芽四糖糖浆。PS4变体可以用于淀粉糖化工艺中，有利地产生显著量的麦芽四糖，其可以在下游麦芽四糖糖浆生产工艺中使用。在一个实施方案中，提供热稳定的PS4变体，其可以产生基于总糖含量约40％-约60％重量的麦芽四糖。

Description

使用嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶变体产生麦芽四糖糖浆

优先权

本申请要求美国临时专利申请系列号61/168,437的优先权，所述美国临时专利申请于2009年4月10日提交，并且在此整体引入作为参考。

序列表

本申请附有序列表，包括SEQ ID NOS：1-4，其整体引入作为参考。

技术领域

来自嗜糖假单胞菌(PSEUDOMONAS SACCHAROPHILA)的变体α-淀粉酶和编码其的核酸可以用于例如生产麦芽四糖(G4)糖浆。

发明背景

麦芽四糖(G4或DP4)糖浆是来自淀粉的酶促处理的许多商业上重要的产物之一。植物淀粉特别是玉米淀粉至麦芽四糖和低级糖例如葡萄糖或麦芽糖的转换是快速扩大的工业。

目前过程由2个顺次酶催化的步骤组成，这导致葡萄糖或麦芽糖产生。第一个酶催化的步骤是淀粉液化作用。一般地，淀粉悬浮液通过快速加热至约85℃或更高进行糊化。α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)用于将粘性液化产物(liquefact)降解为麦芽糖糊精。α-淀粉酶是内切水解酶，催化内部a-1，4-D-糖苷键的随机断裂。随着a-淀粉酶对淀粉的分解，粘度下降。因为液化作用一般在高温进行，所以热稳定的α-淀粉酶例如来自芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)的α-淀粉酶优选用于这个步骤。

第二个酶催化的糖化步骤需要分解麦芽糖糊精。葡糖淀粉酶和/或生麦芽糖α-淀粉酶通常用于催化在液化作用后形成的麦芽糖糊精的非还原末端水解，释放D-葡萄糖、麦芽糖和异麦芽糖。脱支酶例如支链淀粉酶可以用于帮助糖化。糖化一般在酸性条件下在升高温度例如60℃，pH 4.3发生。

与蔗糖糖浆比较，G4(也称为DP4)糖浆具有许多有利性质。例如，在食物中用G4糖浆部分地替换蔗糖可以减少食物的甜味，而不影响其味道或香味。G4糖浆在食物中具有高保水性，并且由于其较低的葡萄糖和麦芽糖含量，显示较不有害的美拉德(Maillard)反应产物。G4糖浆还具有比蔗糖更高的粘度，从而改善食物质地。与蔗糖或高果糖糖浆相比，G4糖浆较少地降低水的冰点，因此G4糖浆可以更好地控制冷冻食品的冰点。在摄入后，与蔗糖相比，G4糖浆还较少地影响渗透压。总之，这些品质使得G4糖浆理想地适合作为食物和医学产品中的成分。G4糖浆在其他工业中也是有用的。例如，G4糖浆赋予光泽并且可以有利地用作纸张施胶剂。参见例如Kimura等人，“Maltotetraose，a new saccharide of tertiaryproperty，”Starch 42：151-57(1990)。

嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)表达有用的G4形成淀粉酶。嗜糖假单胞菌G4形成淀粉酶在本领域有多种名称，称为嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶、“Amy3A”、“PSA”、“SAS”或“PS4”。SAS和PS4在本文中可互换使用。编码PS4的核苷酸序列已得到测定。参见Zhou等人，“Nucleotide sequence of the maltotetraohydrolase gene fromPseudomonas saccharophila，”FEBS Lett.255：37-41(1989)；GenBank登记号X16732。PS4作为具有N末端21残基信号肽的前体蛋白质表达。PS4前体的氨基酸序列在SEQ ID NO：1中显示。切割信号肽，形成包含530个氨基酸残基的成熟形式的PS4。成熟形式具有在N末端的催化结构域和在C末端的淀粉结合结构域。PS4的C末端淀粉结合结构域可以被去除，留下具有SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的PS4的催化活性部分。PS4展示内切和外切α-淀粉酶活性。虽然内切α-淀粉酶活性对于降低糊化淀粉的粘度是特别有用的，但外切α-淀粉酶活性对于将麦芽糖糊精分解为更小糖类例如G4是特别有用的。

G4形成淀粉酶例如斯氏假单胞菌(P.stutzeri)G4形成淀粉酶可以在将液化淀粉转换为麦芽四糖的连续工艺中使用。在此工艺中，G4形成淀粉酶可以连同支链淀粉酶一起固定化。参见例如，Kimura等人，“Continuousproduction of maltotetraose using a dual immobilized enzyme system ofmaltotetraose-forming amylase and pullulanase，”Biotech.Bioeng’g 36：790-96(1990)。连续反应工艺的有用性受到固定化的G4形成淀粉酶的温度依赖性半衰期的限制。参见上引文。

发明概述

嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶(PS4)变体在高温例如约60-70℃由液化淀粉或其他来源的麦芽糖糊精有利地产生显著量的麦芽四糖。变体PS4尤其可以用于产生麦芽四糖糖浆。

本发明提供包括PS4变体的淀粉加工组合物。PS4变体衍生自具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的野生型PS4，并且具有α-淀粉酶活性。与SEQ ID NO：2的氨基酸序列比较，PS4变体可以包括G233E氨基酸置换和不超过10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个的额外氨基酸缺失、添加、插入或置换。可替代地，PS4变体可以与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少约70％、约80％、约90％或约95％序列同一性。在一个实施方案中，PS4变体具有氨基末端甲硫氨酸残基。在另一个实施方案中，与SEQ ID NO：2的氨基酸序列比较，PS4变体包括具有不超过5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个额外氨基酸置换的多肽序列。PS4变体可以包括一个或多个下述氨基酸置换：N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、S229P、H307K、A309P或S334P。在一个实施方案中，变体PS4包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列(即SAS3)。变体PS4可以是分离或纯化的。

在某些实施方案中，与野生型PS4比较，PS4的变体具有改变的性质。例如，与野生型PS4比较，变体PS4可以具有改变的，例如更高的热稳定性。与野生型PS4比较，变体PS4可以具有改变的，例如更高的pH稳定性。pH稳定性可以为在pH约5.0-约7.0比野生型PS4更稳定。变体可以具有比野生型PS4高的外切α-淀粉酶活性，或可以具有比野生型PS4少的内切α-淀粉酶活性。淀粉加工组合物可以包括上文的任何PS4变体。

本发明还提供制备糖(例如麦芽四糖)糖浆的方法，包括将PS4变体或包括该变体的组合物加入淀粉液化产物中，使淀粉液化产物糖化以形成糖浆。PS4变体可以以基于溶解固体约0.001％重量-约0.1％重量的范围，加入淀粉液化产物中。在一个实施方案中，变体可以以基于溶解固体约0.0025％重量-约0.01％重量的范围，加入淀粉液化产物中。浓度单位在本文中也可以表示为kg变体PS4/每公吨干固形物(MTDS)，其中1kg/MTDS＝0.1％重量溶解固体。液化淀粉溶液可以是约20-35％w/w干固形物的液化淀粉浆。淀粉可以得自玉米、玉米穗轴、小麦、大麦、黑麦、蜀黍(milo)、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯。淀粉液化产物可以在约60℃-约65℃糖化。淀粉液化产物可以在约pH 5.0-约pH 7.0糖化。支链淀粉酶、异淀粉酶、普鲁兰酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶或其任何组合，可以与变体PS4组合加入淀粉液化产物中。在一个实施方案中，糖浆可以发酵以产生乙醇。通过本发明方法产生的糖浆可以包括基于总糖含量至少约40％、约45％、约50％、约55％或约60％重量的麦芽四糖。

在另一个方面，本发明提供制备糖浆的方法，包括将PS4变体和α-淀粉酶加入颗粒淀粉中，使颗粒淀粉水解以形成糖浆。在一个实施方案中，PS4变体以基于溶解固体约0.001％重量-约0.1％重量的范围加入颗粒淀粉中。在另一个实施方案中，PS4变体以基于溶解固体约0.0025％重量-约0.01％重量的范围加入颗粒淀粉中。颗粒淀粉可以得自来自玉米、玉米穗轴、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯的淀粉。

在一个特定实施方案中，颗粒淀粉在约60℃-约65℃糖化。在另一个实施方案中，颗粒淀粉在约pH 5.0-约pH 7.0糖化。考虑该方法还可以包括发酵糖浆以产生乙醇。

在一个实施方案中，该方法包括将具有脱支活性的酶加入颗粒淀粉中的步骤。具有脱支活性的酶可以包括但不限于异淀粉酶、支链淀粉酶、异支链淀粉酶、新支链淀粉酶或其任何组合。也考虑该方法可以任选地包括将蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、果胶裂解酶或其任何组合加入颗粒淀粉中的再一步骤。

在一个实施方案中，糖浆包括基于总糖含量至少约40％重量的麦芽四糖。可替代地，糖浆包括基于总糖含量至少约45％重量的麦芽四糖。在另一个实施方案中，糖浆包括基于总糖含量至少约50％重量的麦芽四糖。在一个进一步的实施方案中，糖浆包括基于总糖含量约45％重量-约60％重量的麦芽四糖。

考虑该方法的PS4变体可以是固定化的。

在另一个方面，提供了用于制备IMO的方法，包括将a)PS4变体、b)α-淀粉酶和c)转葡糖苷酶加入淀粉液化产物或颗粒淀粉形式的淀粉中，使淀粉糖化以形成IMO。考虑IMO可以以至少30、至少40和/或至少45的IMO数形成。在一个实施方案中，淀粉得自玉米、玉米穗轴、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯。

本发明还提供纺织品退浆组合物，其包括在水性溶液中的PS4变体，和任选地其他酶。使纺织品退浆的方法包括在足以使纺织品退浆的时间和条件下，使纺织品退浆组合物与纺织品接触。

附图简述

附图并入本说明书中且构成本说明书的部分，其举例说明各种实施方案。在下述附图中，“PS4”由缩写“SAS”替换。这两个缩写指相同蛋白质且是可互换的。

图1描述了使用SAS3(SEQ ID NO：3)糖化的液化玉米淀粉的示例性HPLC色谱图。色谱图证实通过PS4变体的G4(“DP4”)形成。

图2描述了在60℃、pH 6.5的条件下18小时，麦芽糖糊精浆的对照样品的HPLC色谱图。这些反应条件在图3-图5中所述的实验中使用。

图3描述了在与图2中所用相同的条件下，用SAS3(SEQ ID NO：3)以0.025kg/公吨干固形物(MTDS)处理的麦芽糖糊精浆的HPLC色谱图。

图4描述了在与图2中所用相同的条件下，用SAS3(SEQ ID NO：3)以0.05kg/MTDS处理的麦芽糖糊精浆的HPLC色谱图。

图5描述了在与图2中所用相同的条件下，用SAS3(SEQ ID NO：3)以0.1kg/MTDS处理的麦芽糖糊精浆的HPLC色谱图。

图6描述了对于在pH 5.5，60℃用0.007kg/MTDS SAS3(SEQ ID NO：3)处理的麦芽糖糊精浆，作为时间(小时)的函数的DP1、DP2、DP3、DP4和DP5+累积(％总糖)。

图7描述了对于在与图6中所用相同的条件下用0.012kg/MTDS SAS3(SEQ ID NO：3)处理的麦芽糖糊精浆，作为时间(小时)的函数的DP1、DP2、DP3、DP4和DP5+累积(％总糖)。

图8描述了对于在与图6中所用相同的条件下用0.024kg/MTDS SAS3(SEQ ID NO：3)处理的麦芽糖糊精浆，作为时间(小时)的函数的DP1、DP2、DP3、DP4和DP5+累积(％总糖)。

图9描述了对于在60℃用0.025kg/MTDS SAS3(SEQ ID NO：3)处理的麦芽糖糊精浆，在各种pHs的DP4累积百分比。

图10描述了对于在pH 5.0用0.025kg/MTDS SAS3(SEQ ID NO：3)处理的麦芽糖糊精浆，在各种温度的DP4累积百分比。

图11描述了在pH 5.0，60℃在麦芽糖糊精浆中，在各种浓度的SAS3(SEQ ID NO：3)下的DP4累积百分比。

图12描述了在pH 5.0，65℃在用0.025kg/MTDS SAS3(SEQ ID NO：3)处理的麦芽糖糊精浆中，在各种浓度的支链淀粉酶下的DP4累积百分比。

图13描述了对于在pH 5.0，60℃用0.01kg/MTDS SAS3(SEQ ID NO：3)和1kg/MTDS支链淀粉酶处理的麦芽糖糊精浆，在各种底物浓度(％DS淀粉)下的DP4累积百分比。

发明详述

嗜糖假单胞菌G4形成淀粉酶(PS4)的变体可以有利地催化高温糖化，以由淀粉液化产物，例如衍生自玉米淀粉的淀粉液化产物，产生麦芽四糖糖浆。PS4变体可以用于淀粉糖化工艺中，有利地产生显著量的麦芽四糖，其可以在产生麦芽四糖糖浆的下游工艺中使用。在一个实施方案中，提供热稳定的PS4变体，其可以产生基于总糖含量约40％-约60％重量的麦芽四糖。PS4在说明书和附图中可以有时被称为SAS。“PS4”和“SAS”是同义词。例如，“SAS3”在所有情况下均指PS4变体。

1.定义和缩写

在本详述中，应用下述缩写和定义。应注意，在本文中，单数形式“a”、“an”和“the”涵盖对复数的提及，除非上下文明确指出并非如此。因此，例如提及“酶”包括多个此类酶，提及“制剂”包括提及一个或多个制剂及本领域技术人员已知的其等价物，等等。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解相同的含义。为了清楚起见，定义了下述术语。

1.1.定义

“淀粉酶”指尤其是能够催化淀粉降解的酶。内切作用淀粉酶活性以随机方式断裂淀粉分子内的α-D-(1→4)O-糖苷键。相对地，外切作用淀粉分解活性从底物的非还原末端切割淀粉分子。当涉及PS4时，术语“内切作用淀粉酶活性”、“内切活性”、“内切特异性活性”和“内切特异性”是同义的。对于用于外切活性的相应术语，也同样如此。来自芽孢杆菌属物种的有用α-淀粉酶包括但不限于

FRED和ALPHA(Danisco US Inc.，Genencor Division)。

“变体”指多肽或核酸。术语“变体”可与术语“突变体”互换使用。变体包括在氨基酸或核苷酸序列的一个或多个位置上的插入、添加、缺失、置换、颠换、截短和/或倒位。短语“变体多肽”和“变体酶”指，具有自野生型PS4的氨基酸序列已进行过修饰的氨基酸序列的PS4蛋白质。变体多肽包括与亲本酶具有一定百分比，例如至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％(或这些数值之间的任何整数值)，的序列同一性的多肽。与野生型PS4比较，变体多肽特别可以具有一定数目的氨基酸添加、缺失或置换。例如，PS4变体可以具有1-25个，例如1-5、1-10、1-15或1-20个氨基酸添加、缺失或置换。

如本文使用的，“亲本酶”、“亲本序列”、“亲本多肽”、“野生型PS4”和“亲本多肽”是指，作为变体多肽的基础的酶和多肽，例如SEQ ID NO：1的PS4。“亲本核酸”意指编码亲本多肽的核酸序列。“野生型”PS4天然存在，并且包括SEQ ID NO：1的PS4的天然存在的等位基因变体。“变体”的信号序列可以与野生型PS4相同或可以不同。变体可以作为包含异源多肽的融合蛋白表达。例如，变体可以包括其它蛋白质的信号肽、或设计用于帮助鉴定或纯化所表达的融合蛋白的序列，例如His-Tag序列。

“变体核酸”可以包括如下杂交序列的互补序列，所述杂交序列为能够与本文给出的核苷酸序列杂交的序列。例如，变体序列可以与能够在严格条件，例如50℃和0.2×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠，pH 7.0)，和本文给出的核苷酸序列杂交的序列互补。更特别地，术语变体涵盖与如下杂交序列互补的序列，所述杂交序列为能够在高度严格条件例如65℃和0.1×SSC，和本文给出的核苷酸序列杂交的序列。变体核酸的解链温度(Tm)可以比野生型核酸的Tm低1、2或3℃。变体核酸包括与编码亲本酶的核酸具有一定百分比例如至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的多核苷酸。

为了描述各种变体，采用下述命名法以便方便提及。当置换包括数字和字母例如141P时，这指{根据编号系统的位置/置换的氨基酸}。因此，例如，对于在位置141的氨基酸至脯氨酸的置换，命名为141P。当置换包括字母、数字和字母例如A141P时，这指{原始氨基酸/根据编号系统的位置/置换的氨基酸}。因此，例如，对于在位置141以脯氨酸置换丙氨酸，将命名为A141P。

当在特定位置上可以有2种或更多种置换时，这将通过连续字母命名，所述连续字母可以任选地通过斜杠标记“/”分开，例如G303ED或G303E/D。

序列同一性可以使用本领域已知的标准技术进行确定(参见例如，Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)；程序例如Wisconsin Genetics软件包(Genetics Computer Group，Madison，WI)中的GAP、BESTHT、FASTA和TFASTA；和Devereux等人，Nucleic Acid Res.，12：387-395(1984))。

“核酸序列同一性百分比(％)”或“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为，候选序列中与起始序列的核苷酸残基或氨基酸残基相同的核苷酸残基或氨基酸残基的百分率。序列同一性可以在起始序列的全长上进行确定。

“序列同一性”在本文中通过序列比对的方法确定。为了本公开的目的，比对方法是由Altschul等人，(Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)；和Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))描述的BLAST。一个特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(参见Altschul等人，Meth.Enzymol.266：460-480(1996))。WU-BLAST-2使用几个搜索参数，其中大多数可以设为默认值。对于可调整参数，可以使用下述值设置：重叠跨度＝1，重叠分数＝0.125，字阈值(T)＝11。HSP S和HSP S2参数是动态值，取决于具体序列的组成和以该目的序列进行搜索的具体数据库的组成，由程序自身确立。然而，可以调整这些值以增加灵敏度。％氨基酸序列同一性值通过比对区域中匹配的相同残基的数目除以“较长”序列的总残基数目而确定。“较长”序列是在比对区域中具有最多的实际残基的序列(忽略为使比对得分最大化而通过WU-Blast-2引入的空位)。

如本文使用的，术语“表达”指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译两者。

术语“分离的”指，当物质是天然存在的时，自该天然环境中取出的该物质。

“纯化的”蛋白质或酶指，至少部分纯化至同质的蛋白质。在某些实施方案中，如通过SDS-PAGE测定的，纯化的蛋白质或酶为10％以上纯的、可选地20％以上纯的、和可选地30％以上纯的。本发明公开的其他方面涵盖，如通过SDS-PAGE测定的，高度纯化形式的蛋白质(即，40％以上纯、60％以上纯、80％以上纯、90％以上纯、95％以上纯、97％以上纯、和甚至99％以上纯)。

“热稳定的”或“热稳定性”意指，酶在暴露于升高温度后保留活性。酶的热稳定性通过其半衰期(t_1/2)度量，其中，到半衰期时，半数酶活性丧失。半衰期值在规定条件下通过测量残留的淀粉酶活性计算。为了测定酶的半衰期，可以将样品加热至测试温度1-10分钟，使用标准的PS4活性测定试验，例如试验(Megazyme，爱尔兰)测量活性。

如本文使用的，“最适pH”意指，在该pH，PS4或PS4变体在标准PS4活性测定试验中展示出活性，以pH范围度量。

如本文使用的，“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在某些情况下，“氨基酸序列”与术语“肽”同义；在某些情况下，“氨基酸序列”与术语“酶”同义。

如本文使用的，“核苷酸序列”或“核酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列及其变体、同源物、片段和衍生物。核苷酸序列可以为基因组、合成或重组起源，并且可以是双链或单链，无论代表有义链还是反义链。如本文使用的，术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。

“同源物”意指与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定程度同一性或“同源性”的实体。“同源序列”包括该多核苷酸或多肽与另一序列具有一定百分比例如70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％(或任何两个数值之间的整数值)的序列同一性。同一性百分比指，在比对的情况下，比较2个序列时，相同碱基或氨基酸残基的百分比。当与主题序列比较，氨基酸被置换、缺失或添加时，氨基酸序列是不同的。序列同一性百分比一般就主题蛋白质的成熟序列进行测量，即，例如在信号序列去除后。一般地，同源物将包括与主题氨基酸序列相同的活性位点残基。同源物还保留淀粉酶活性，但同源物可以与野生型PS4具有不同的酶学性质。

如本文使用的，“杂交”包括核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程，以及如在聚合酶链反应(PCR)技术中执行的扩增过程。变体核酸可以作为单或双链DNA或RNA、RNA/DNA异源双链体或RNA/DNA共聚物存在。如本文使用的，“共聚物”指包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的单一核酸链。变体核酸可以进行密码子优化以进一步增加表达。

如本文使用的，“合成的”化合物通过体外化学或酶促合成产生。它包括但不限于以对于宿主生物最佳的密码子使用制备的变体核酸，所述宿主生物可以为例如酵母细胞宿主或选择的其他表达宿主。

如本文使用的，“转化的细胞”包括已经通过使用重组DNA技术转化的细胞，包括细菌和真菌细胞。转化一般通过将一个或多个核苷酸序列插入细胞内而发生。所插入的核苷酸序列可以是异源核苷酸序列，即，对于待转化的细胞并非天然的序列，例如融合蛋白。

如本文使用的，“可操作地连接”意指，所述组分处于允许其以其预期方式起作用的关系中。例如，对于与编码序列可操作地连接的调节序列，其连接方式使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下达到。

如本文使用的，“生物学活性”指，序列具有与天然存在的序列相似但程度不一定相同的结构、调节或生物化学功能。

如本文使用的，术语“淀粉”指由植物例如玉米的复杂多糖碳水化合物构成的任何物质，包括直链淀粉和支链淀粉，具有式(C₆H₁₀O₅)_x，其中X可以是任何数。术语“颗粒淀粉”指生淀粉，即未蒸煮的淀粉，例如尚未经过糊化的淀粉。

术语“液化作用”指淀粉转化中的阶段，其中糊化淀粉被水解，产生低分子量的可溶性糊精，即多糖。如本文使用的，术语“糖化”指淀粉、液化淀粉或麦芽糖糊精至糖例如葡萄糖的酶促转化。术语“聚合度”(DP)指在一个给定糖中脱水吡喃葡萄糖单位的数目(n)。DP1的例子是单糖，葡萄糖和果糖。DP2的例子是二糖，麦芽糖和蔗糖。如本文使用的，DP4的一个例子是麦芽四糖(G4)。

如本文使用的，术语“干固形物含量”或可替代地“溶解的固体”(ds)指在浆或溶液中的总固体，以干重百分比计。术语“浆”(slurry)指包含不溶性固体的水性混合物。

短语“同时糖化和发酵(SSF)”指在生物化学品生产中的工艺，其中微生物生物例如产乙醇微生物和至少一种酶例如PS4或其变体存在于相同工艺步骤期间。SSF指，例如在相同反应器中，同时发生颗粒淀粉底物水解为糖和该糖发酵成醇。

如本文使用的，“产乙醇微生物”指具有将糖或寡糖转化为乙醇的能力的微生物。

1.2.缩写

除非另有说明，否则下述缩写适用：

2.嗜糖假单胞菌α-淀粉酶(PS4)变体

本发明提供包括变体PS4的分离和/或纯化的多肽。在一个实施方案中，变体PS4是成熟形式的多肽，其中21个氨基酸的前导序列被切除，从而多肽的N末端起始于SEQ ID NO：1的位置22的天冬氨酸(D)残基。PS4变体包括C末端淀粉结合结构域被去除的PS4。其中淀粉结合结构域被去除的成熟PS4的一个代表性氨基酸序列示于SEQ ID NO：2。其他PS4变体包括，相对于野生型PS4或SEQ ID NO：2的PS4，已经有1-约25个氨基酸残基添加或缺失的变体。在一个方面，PS4变体具有SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，其中1-约25之间的任何数目的氨基酸已被置换。在另一个方面，PS4变体可以具有加至SEQ ID NO：2的PS4的N末端的一个或多个氨基酸，并且同一变体可以在同一序列中包括已被置换的1-约25个氨基酸。这些变体的一个代表性实施方案显示在SEQ ID NO：3中。

在另一个方面，PS4变体具有野生型PS4的序列，其中1-约25之间的任何数目的氨基酸已被置换。具有单个氨基酸置换的PS4变体的代表性例子在表5中显示。具有氨基酸置换组合的PS4变体的实例在表6中显示。表6描述了已进行修饰以形成SEQ ID NO：3的序列(SAS3)的各种氨基酸。除表5-6中列出的氨基酸残基修饰外，可以修饰的其他特定PS4残基包括A3、S44、A93、G103、V109、G172、A211、G265、N302、G313和G342。PS4变体可以具有本文公开的氨基酸置换的各种组合。使用PS4变体的工艺可以包括使用单种PS4变体、或PS4变体的组合或混合物。

在一个实施方案中，PS4变体包括N末端甲硫氨酸。在多肽的氨基末端添加甲硫氨酸可以例如，增加发酵产率。

PS4变体在利于麦芽四糖形成的糖化工艺中可以是特别有用的。例如，可以形成包括基于溶解固体，即基于总糖含量，至少约40％重量麦芽四糖的糖浆。在一个典型实施方案中，可以形成包括基于溶解固体，即基于总糖含量，至少约45％重量麦芽四糖的糖浆。在另一个典型实施方案中，可以形成包括基于溶解固体，即基于总糖含量，至少约50％重量麦芽四糖的糖浆。在另外一个典型实施方案中，糖浆包括基于溶解固体，即基于总糖含量，至少约45％-约60％重量的麦芽四糖。

用于形成麦芽四糖的一个代表性PS4变体是在SEQ ID NO：3中所示的SAS3。这个变体与野生型PS4比较具有维持或增加热稳定性和pH稳定性的十六(16)个置换：N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、G223E、S229P、H307K、A309P和S334P。此外，这个变体包括加至N末端的甲硫氨酸残基。在一个实施方案中，PS4变体包括一个或多个下述置换：N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、S229P、H307K、A309P或S334P。可以制备另外氨基酸置换，例如：G121D、G223A、H272Q、G303E和H307L。

其他特别有用的变体包括其中影响底物结合的残基被置换的变体。涉及底物结合的PS4残基包括W66、I157、E160、S161、R196、W221、K222、H307和W308。影响底物结合的残基的置换可以影响PS4变体的内切或外切活性的相对程度。增加外切活性的置换例如有利地促进DP4和DP3糖的形成。影响底物结合的突变的代表性例子包括E160G、E160P、E160F、E160R、E160S、E160L、W66S、R196V、R196H、R196P、H307L、H307K、W221A、W308A、W308S、W308L、W308S和K222T。PS4的这些和另外变体在U.S.S.N.12/318,513中描述，其于2008年12月30日提交，且整体引入本文作为参考。

考虑的PS4变体可以与具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的天然存在PS4具有至少约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％或约99％序列同一性。此外，与具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的PS4比较，PS4变体可以展示一种或多种改变的性质。改变的性质可以包括改变的热稳定性、在给定pH范围改变的稳定性、改变的外切α-淀粉酶活性、或改变的内切α-淀粉酶活性。与具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的PS4比较，PS4变体可以展示改善的热稳定性和/或在约5.0-约7.0的pH改善的稳定性。与具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的PS4比较，PS4变体可以展示增加的外切α-淀粉酶活性或降低的内切α-淀粉酶活性。

本发明还提供编码上文多肽的核酸。在一个实施方案中，编码PS4变体的核酸是编码SEQ ID NO：2的蛋白质的cDNA，其中包含编码置换氨基酸的密码子修饰。例如，该cDNA可以具有天然mRNA的相应序列，如SEQ ID NO：4中所示。参见GenBank登记号X16732。如本领域技术人员理解的，遗传密码具有简并性，即，在一些情况下多个密码子可以编码相同氨基酸。核酸包括编码PS4变体的基因组DNA、mRNA和cDNA。

2.1.PS4变体表征

酶变体可以通过其核酸和一级多肽序列，通过三维结构建模和/或通过其比活性进行表征。PS4变体的另外特征包括例如改变的稳定性、最适pH、氧化稳定性、外切淀粉酶活性与内切淀粉酶活性的比值、和热稳定性。使用本领域技术人员已知的标准测定试验，可以评价表达水平和酶活性。在另一个方面，变体表现相对于野生型酶改善的性能特征，例如在高温例如约60-70℃改善的稳定性。PS4变体可以有利地用于要求升高温度的糖化工艺或其他工艺。例如，热稳定的PS4变体可以在约55℃-约85℃或更高的温度降解淀粉。

当变体在特定宿主细胞中产生时，表达特征指改变的变体表达水平。表达一般涉及经过给定的一段时间后使用本领域已知的标准技术可从发酵肉汤中回收的活性变体的量。表达还可以涉及在宿主细胞内产生或由宿主细胞分泌的变体量或速率。表达还可以涉及编码变体酶的mRNA的翻译速率。

本发明提供与编码本文所述任何PS4变体的核酸互补的核酸。另外，提供能够与该互补核酸杂交的核酸。在另一个实施方案中，用于本文描述的方法和组合物的序列是合成序列。它包括但不限于由对于宿主生物例如酵母或细菌中的表达而言优化的密码子使用制备的序列。

3.PS4变体的产生

本文提供的PS4变体可以根据本领域公知的方法合成或通过在宿主细胞中重组表达而产生。所表达的PS4变体任选地在使用前分离。在另一个实施方案中，PS4变体在表达后被纯化。前导或信号序列可以被切除。遗传修饰和重组产生PS4变体的方法可以参见例如美国专利号7,371,552，7,166,453；6,890,572；和6,667,065；以及美国公开申请号2007/0141693；2007/0072270；2007/0020731；2007/0020727；2006/0073583；2006/0019347；2006/0018997；2006/0008890；2006/0008888；和2005/0137111中的描述。这些公开内容的相关教导，包括PS4编码多核苷酸序列、引物、载体、选择方法、宿主细胞、所表达PS4变体的纯化和重构、以及PS4变体的表征，包括用于酶学测定试验的缓冲液、pH范围、Ca²⁺浓度、底物浓度和酶浓度，均特此引入作为参考。

在另一个实施方案中，适宜的宿主细胞包括选自下述的革兰氏阳性菌：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(S.murinus)；或革兰氏阴性菌，其中所述革兰氏阴性菌是大肠埃希杆菌(Escherichia coli)或假单胞菌属(Pseudomonas)物种。在一个实施方案中，宿主细胞是枯草芽孢杆菌，并且所表达的蛋白质被改造为包括枯草芽孢杆菌信号序列，如下文进一步详细阐述的。

在某些实施方案中，宿主细胞经过遗传改造而表达与野生型PS4具有至少约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的氨基酸序列的PS4变体。在某些实施方案中，编码PS4变体的多核苷酸具有编码SEQ ID NO：2的蛋白质的核酸序列，或与编码SEQ ID NO：2的蛋白质的核酸具有至少约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性的核酸序列。在一个实施方案中，核酸序列与SEQ IDNO：4的核酸具有至少约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％序列同一性。

3.1.载体

在某些实施方案中，包括编码PS4变体的核酸的DNA构建体在表达载体中转移至宿主细胞，所述表达载体包括与PS4编码序列可操作地连接的调节序列。载体可以是当引入宿主细胞内时可整合到真菌宿主细胞基因组内且复制的任何载体。FGSC菌株目录，University of Missouri，列出了适宜载体。适宜表达和/或整合载体的另外实例在Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第3版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(2001)；Bennett等人，MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI，Academic Press，SanDiego(1991)，第396-428页；和美国专利号5,874,276中提供。示例性载体包括pFB6、pBR322、PUC18、pUC100和pENTR/D、pDON^TM201、pDONR^TM221、pENTR^TM、和

用于在细菌细胞中使用的示例包括允许在大肠杆菌(E.coli)中复制的pBR322和pUC19，和例如允许在芽孢杆菌(Bacillus)中复制的pE194。

在某些实施方案中，编码PS4变体的核酸与适宜启动子可操作地连接，所述适宜启动子允许在宿主细胞中转录。启动子可以源自对于宿主细胞同源或异源的编码蛋白质的基因。启动子的适宜非限制性例子包括cbh1、cbh2、egl1和egl2启动子。在一个实施方案中，启动子是宿主细胞天然的启动子。例如，当嗜糖假单胞菌是宿主时，启动子可以是天然嗜糖假单胞菌启动子。“诱导型启动子”是在环境或发育调节下具有活性的启动子。在另一个实施方案中，启动子是对于宿主细胞异源的启动子。

在某些实施方案中，编码序列与信号序列可操作地连接。编码信号序列的DNA可以是与待表达的PS4核酸天然连接的DNA序列。在其他实施方案中，编码信号序列的DNA由编码来自非嗜糖假单胞菌的物种的信号序列的核苷酸序列替换。在此实施方案中，编码信号序列的多核苷酸在编码多肽的多核苷酸的紧下游并在读框内。信号序列可以选自与宿主细胞相同的物种。在一个非限制性例子中，信号序列是来自芽孢杆菌属物种的环糊精葡聚糖转移酶(CGTase；EC 2.4.1.19)信号序列，并且PS4变体在枯草芽孢杆菌宿主细胞中表达。甲硫氨酸残基可以加至信号序列的N末端。

在另外实施方案中，待引入真菌宿主细胞内的DNA构建体或载体中包含的信号序列和启动子序列源自相同来源。在某些实施方案中，表达载体还包括终止序列。在一个实施方案中，终止序列和启动子序列源自相同来源。在另一个实施方案中，终止序列对于宿主细胞是同源的。

在某些实施方案中，表达载体包括选择标记。适宜的选择标记的实例包括赋予对于抗微生物剂例如潮霉素或腐草霉素的抗性的那些。营养选择标记也是适宜的，并且包括amdS、argB和pyr4。在一个实施方案中，选择标记是编码乙酰胺酶的amdS基因；它允许转化细胞在作为氮源的乙酰胺上生长。构巢曲霉(A.nidulans)amdS基因作为选择标记的使用在Kelley等人，EMBO J.4：475-479(1985)和Penttila等人，Gene 61：155-164(1987)中描述。

包括具有编码PS4变体的多核苷酸的DNA构建体的适宜表达载体可以是能够在给定宿主生物中自主复制或整合到宿主的DNA内的任何载体。在某些实施方案中，表达载体是质粒。在某些实施方案中，考虑用于获得基因表达的2类表达载体。第一种表达载体包括DNA序列，在该序列中启动子、PS4编码区和终止子都源自待表达的基因。在某些实施方案中，通过缺失不希望有的DNA序列，例如编码C末端淀粉结合结构域的DNA，获得基因截短，从而留下待表达的结构域在其自身转录和翻译调节序列的控制下。第二类表达载体可以预装配，且包含高水平转录所需的序列和选择标记。在某些实施方案中，将PS4基因的编码区或其部分插入此通用目的表达载体内，从而使得它在表达构建体的启动子和终止序列的转录控制下。在某些实施方案中，将基因或其部分插入强cbh1启动子的下游。在某些实施方案中，考虑所表达的PS4变体的C末端截短。例如，α-淀粉酶的C末端截短描述在Ohdan等人，Applied and Environ.Microbiol.65：4652-4658(1999)中。

3.2.宿主细胞的转化、表达和培养

将DNA构建体或载体引入宿主细胞内的技术包括，诸如转化；电穿孔；核显微注射；转导；转染例如lipofection介导的和DEAE-葡聚糖介导的转染；与磷酸钙DNA沉淀物孵育；用DNA包被的微粒进行高速轰击；和原生质体融合。一般转化技术是本领域已知的。参见例如，Ausubel等人(1987)，同上，第9章；Sambrook等人(2001)，同上；和Campbell等人，Curr.Genet.16：53-56(1989)。异源蛋白质在木霉(Trichoderma)中的表达例如在美国专利号6,022,725；美国专利号6,268,328；Harkki等人，Enzyme Microb.Technol.13：227-233(1991)；Harkki等人，BioTechnol.7：596-603(1989)；EP 244,234；和EP 215,594中描述。在一个实施方案中，用载体系统构建遗传上稳定的转化体，由此编码PS4变体的核酸稳定整合到宿主细胞染色体内。转化体随后通过已知技术进行纯化。

在一个非限制性例子中，包括amdS标记的稳定转化体通过其更快速的生长速度和在包含乙酰胺的固体培养基上形成具有平滑而不是粗糙轮廓的环形菌落，而与非稳定转化体区分。另外，在某些情况下，可以通过下述进行稳定性的进一步测试：在固体非选择培养基例如缺乏乙酰胺的培养基上生长转化体，自此培养基收集孢子，测定随后在包含乙酰胺的选择培养基上萌发且生长的孢子的百分率。本领域已知的其他方法也可以用于选择转化体。

3.3.PS4活性的鉴定

为了评估PS4变体在宿主细胞中的表达，试验可以测量所表达的蛋白质、相应mRNA或α-淀粉酶活性。例如，适宜测定试验包括：使用适当标记的杂交探针进行RNA和DNA印迹、RT-PCR(逆转录酶聚合酶链反应)、和原位杂交。适宜测定试验还包括测量样品中的PS4活性。PS4变体的外切活性的适宜测定试验包括但不限于

测定试验(Megazyme，爱尔兰)。PS4变体的内切活性的适宜测定试验包括但不限于Phadebas蓝测定试验(Magle Life Sciences)。测定试验还包括对PS4变体存在下制备的糖浆的HPLC分析。通过使DP4糖与反应混合物中的其他糖分开，HPLC例如可以用于测量淀粉酶活性。

3.4.用于纯化PS4的方法

一般而言，在细胞培养中产生的PS4变体被分泌到培养基内，并且可以纯化或分离，例如通过自细胞培养基中去除不希望有的组分而纯化或分离。在某些情况下，PS4变体可以从细胞裂解物中回收。在此类情况下，可以使用由本领域技术人员常规采用的技术，将酶从产生它的细胞中纯化出来。实例包括但不限于亲和色谱、离子交换色谱法，包括在磺化的苯乙烯-二乙烯基苯离子交换树脂上的高分辨率离子交换，包括HPLC、疏水作用色谱、两相分配、乙醇沉淀、反相HPLC、在硅胶或阳离子交换树脂上的色谱例如DEAE、色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、凝胶渗透色谱(GPC)、和例如使用Sephadex G-75的凝胶过滤(尺寸排阻色谱)。

4.PS4变体的组合物和使用

通过上述方法产生且纯化的PS4变体对于各种工业应用是有用的。在一个实施方案中，PS4变体在淀粉转化工艺中有用，特别是在淀粉例如玉米淀粉、小麦淀粉或大麦淀粉的糖化工艺中使用。所需终产物可以是任何可以通过淀粉底物的酶促转化而产生的产物。例如，所需产物可以是富含麦芽四糖的糖浆，其可以用于食物特别是冷冻食物的制造中，或用作药物中的组分。

取决于由PS4变体展示的总体性质以及相对地具体应用的要求，使用特定PS4变体可能是期望的。例如，与野生型PS4比较，对于淀粉转化工艺有用的PS4变体可以具有实质性的内切淀粉酶活性，和/或与野生型PS4比较，具有较低的外切对内切淀粉酶活性。此类PS4变体尤其可以用于如下工艺中，在该工艺中复杂分支糖的内部切割在降低底物粘度中有用。取决于应用，有用的PS4变体可以包括具有比野生型PS4更多或更少的外切淀粉酶活性的那些。组合物可以包括一种PS4变体、或PS4变体的组合(每一个均可以展示一组不同的性质)。

4.1.淀粉底物的制备

制备淀粉底物的方法是本领域公知的。例如，有用的淀粉底物可以得自块茎、根、茎、豆类、谷物或谷粒。更特别地，颗粒淀粉可以来自产生大量淀粉的植物。例如，颗粒淀粉可以得自玉米、玉米穗轴、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯。玉米包含约60-68％淀粉；大麦包含约55-65％淀粉；粟包含约75-80％淀粉；小麦包含约60-65％淀粉；精米包含70-72％淀粉。尤其考虑的淀粉底物是玉米淀粉、小麦淀粉和大麦淀粉。来自谷粒的淀粉可以是经研磨的或是完整的，包括玉米固形物例如玉米仁、糠和/或玉米穗轴。淀粉可以是高度精制的生淀粉、或淀粉精制工艺的进料。多种淀粉也是商购可得的。例如，玉米淀粉可从Cerestar、Sigma和Katayama Chemical Industry Co.(日本)获得；小麦淀粉可从Sigma获得；甘薯淀粉可从Wako Pure ChemicalIndustry Co.(日本)获得；马铃薯淀粉可从Nakaari ChemicalPharmaceutical Co.(日本)获得。

在本发明的实施方案中可以使用麦芽糖糊精作为淀粉底物。麦芽糖糊精包括具有约20或更少个葡萄糖(dextrose)单位的淀粉水解产物。一般的商业麦芽糖糊精含有包括约3-约19个连接的葡萄糖单位的多糖的混合物。麦芽糖糊精由FDA定义为具有20以下的葡萄糖当量(DE)的产物。它们是一般公认安全的(GRAS)人用食物成分。葡萄糖当量(DE)是相对于100的葡萄糖标准而量度的还原力。DE越高，淀粉解聚程度越大，导致更小的平均聚合物(多糖)大小，和更大甜味。特别有用的麦芽糖糊精是得自玉米淀粉的

可从Grain Processing Corp.(Muscatine，Iowa)获得：DE 4.0-7.0；体积密度0.51g/cc；测量的含水量6.38％重量。

淀粉底物可以是来自研碎的全谷粒的粗淀粉，包含非淀粉的级分例如胚芽残留物和纤维。研磨可以包括湿磨或干磨。在湿磨中，全粒浸泡在水或稀酸中，以分离成其组成部分，例如淀粉、蛋白质、胚芽、油、谷粒纤维。湿磨可以有效地分离胚芽和粗粉(即淀粉颗粒和蛋白质)，特别适用于糖浆生产。在干磨中，不经谷粒分级分离成其组成部分，将全粒研磨成细粉并进行加工。除淀粉外，干磨后的谷粒因此将包括显著量的非淀粉碳水化合物的化合物。可替代地，待加工的淀粉可以具有高度精制的淀粉质量，例如至少90％、至少95％、至少97％或至少99.5％纯的。

4.2.液化淀粉的糖化

如本文使用的，术语“液化作用”或“液化”是指，将淀粉转变成粘性较低和链较短的糊精的工艺。此工艺涉及在PS4变体添加同时或在PS4变体添加后对淀粉的糊化。热稳定的PS4变体一般用于此应用。任选地可以添加另外的液化作用诱导酶。

在某些实施方案中，如上所述制备的淀粉或麦芽糖糊精底物用水成浆。淀粉或麦芽糖糊精浆可以包含约10-55％、约20-45％、约30-45％、约30-40％或可选地约30-35％干固形物重量百分比的淀粉。α-淀粉酶例如细菌α-淀粉酶，包括芽孢杆菌α-淀粉酶，可以以例如约1500单位/kg淀粉干物质提供。为了优化α-淀粉酶的稳定性和活性，浆的pH可以调整至α-淀粉酶的最适pH。可以加入其他α-淀粉酶，其可能需要不同的最适条件。液化后浆中残留的细菌α-淀粉酶可以通过在后续反应步骤中降低pH或通过自浆中去除钙，而失活。

淀粉浆可以通过喷射式蒸煮器连续泵出，蒸汽加热至约85℃-高达105℃。糊化在此条件下非常快速地发生，酶活性与显著剪切力组合使得淀粉底物开始水解。喷射式蒸煮器中的停留时间极短。可以使部分糊化的淀粉通过维持在约85-105℃的一系列保持管且保持约5分钟，完成糊化过程。这些槽可以包含挡板以阻挡逆向混合。如本文使用的，术语“二级液化”指在初级液化后的液化步骤，此时浆被允许冷却至室温。这个冷却步骤可以是约30分钟至约180分钟，例如约90分钟至约120分钟。

PS4变体可以以约0.01-约1.0kg/MTDS加入通过上述工艺获得的液化淀粉或麦芽糖糊精浆。1kg/MTDS＝0.1％重量溶解固体。在一个实施方案中，PS4变体可以以基于溶解固体约0.001％重量-约0.01％重量的处理水平加入液化淀粉或麦芽糖糊精浆。在一个典型实施方案中，PS4变体可以以基于溶解固体约0.0025％重量-约0.01％重量的处理水平加入液化淀粉或麦芽糖糊精浆。在一个实施方案中，PS4变体是固定化的，并且液化淀粉或麦芽糖糊精底物在连续反应中经过固定的PS4变体且转换为产物。在这个实施方案中，PS4变体可以与其它酶例如支链淀粉酶一起固定化。

麦芽四糖的生产可以进一步包括使液化淀粉或其他来源的麦芽糖糊精与异淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶或其任何组合接触。

5.纺织品退浆组合物和用途

本发明还考虑，使用PS4变体处理织物(例如，使纺织品退浆)的组合物和方法。织物处理方法是本领域公知的(参见例如美国专利号6,077,316)。例如，在一个方面，织物的触感和外观可以通过如下方法改善，所述方法包括将织物与PS4变体在溶液中接触。在一个方面，织物在压力下用溶液处理。

在一个方面，PS4变体在纺织品纺织期间或之后、或在退浆阶段或者一个或多个其他织物加工步骤的过程中施加。在纺织品纺织期间，纺线暴露于相当大的机械张力。在机械织机上纺织之前，径纱通常涂上淀粉或淀粉衍生物浆料，以增加其抗张强度并防止断裂。可以在编织过程中或之后施加PS4变体，以除去这些淀粉或淀粉衍生物浆料。在纺织后，可以用PS4变体除去浆料涂层，之后再进一步加工织物，以确保均一和耐洗效果。

PS4变体可以，例如在水性组合物中，作为洗涤添加剂，单独使用或与其他退浆化学试剂和/或退浆酶一起使用，使织物(包括含棉织物)退浆。PS4变体也可用于组合物和方法中在靛蓝染色的粗斜棉布织物和衣服上产生石洗外观。为生产衣服，织物可以剪裁并缝纫成衣服或衣物，之后进行整理(finish)。特别是，为生产粗斜棉布牛仔服，已研发了不同的酶促整理方法。粗斜棉布衣服的整理通常始于酶促退浆步骤，在此期间淀粉分解酶作用于衣服，以使织物柔软，并使该棉布更易于接受随后的酶促整理步骤。PS4变体可用于整理粗斜棉布衣服(例如“生物打磨”(bio-stoning))、酶促退浆及为织物提供柔软度的方法，和/或整理操作中。

6.使用PS4来自颗粒淀粉生产DP4

在另一个方面，提供了制备糖浆的方法，包括将PS4变体和α-淀粉酶加入颗粒淀粉中，使颗粒淀粉水解以形成糖浆。在一个实施方案中，PS4变体以基于溶解固体约0.001％重量-约0.1％重量的范围加入颗粒淀粉。在另一个实施方案中，PS4变体以基于溶解固体约0.0025％重量-约0.01％重量的范围加入颗粒淀粉。颗粒淀粉可以得自玉米、玉米穗轴、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯的淀粉。

在一个特定实施方案中，颗粒淀粉在约60℃-约65℃糖化。在另一个实施方案中，颗粒淀粉在约pH 5.0-约pH 7.0糖化。考虑该方法还可以包括使糖浆发酵以产生乙醇。

在一个实施方案中，该方法包括将具有脱支活性的酶加入颗粒淀粉中的步骤。具有脱支活性的酶可以包括但不限于异淀粉酶、支链淀粉酶、异支链淀粉酶、新支链淀粉酶或其任何组合。还设想该方法可以任选地包括将蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、果胶裂解酶或其任何组合加入颗粒淀粉中的再一步骤。

在一个实施方案中，糖浆包括基于总糖含量至少约40％重量的麦芽四糖。可替代地，糖浆包括基于总糖含量至少约45％重量的麦芽四糖。在另一个实施方案中，糖浆包括基于总糖含量至少约50％重量的麦芽四糖。在再一实施方案中，糖浆包括基于总糖含量约45％重量-约60％重量的麦芽四糖。

考虑该方法的PS4变体可以是固定化的。

7.使用PS4的IMO生产

在另一个方面，提供了用于制备IMO的方法，包括将a)PS4变体、b)α-淀粉酶和c)转葡糖苷酶加入淀粉液化产物或颗粒淀粉形式的淀粉中，使淀粉糖化以形成IMO。可以使用众多转葡糖苷酶(TG)中的任何一种，例如TRANSGLUCOSIDASE

(Danisco US Inc.，Genencor Division)。

考虑IMO可以以至少30、至少40和/或至少45的IMO数形成。在一个实施方案中，淀粉得自玉米、玉米穗轴、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯。

实施例

除非另有说明，所有百分比以重量百分比表示。采用HPLC色谱以测定糖产物的分布。

实施例1：DP4生产

麦芽糖糊精(340g：DE 9.9％；含湿量6.03％)溶解于自来水(660g)中，以制备32％DS的浆。浆的pH调整至pH 5.5、pH 6.0或pH 7.0，并且加入0.025kg/MTDS SAS3。取出2个100g等分试样，并且置于2个150mL烧瓶内，在60℃或63℃维持22小时和26小时。反应产物通过HPLC进行分析。用HPLC级水0.25∶10稀释，之后通过0.45微米滤器过滤，以制备用于HPLC分析的样品。HPLC条件：Phenomenex Rezex ROA-OrganicAcid(H+)柱；移动相：水；于60℃，16分钟运行时间；20μL注射量；RI检测器。

在各种反应中产生的糖显示于表1中。DP4+指具有4或更大聚合度的寡糖(例如DP4、DP5、DP6、DP7等)。DP4百分比随着反应时间延长而轻微降低；然而，在测试的pH范围，DP4产率一般大于40％的总糖含量。此外，酶看起来在测试的温度范围中是相对热稳定的，因为DP4产率在60℃和63℃是大致相同的。

表1

实施例2：DP4产生。

生玉米淀粉(745g；含湿量14％)溶解于自来水(1,255g)中，以制备32％DS的浆。通过将0.4kg/MTDS GC828，SPEZYME FRED和SPEZYMEXTRA的混合物(Danisco US Inc，Genencor Division，Wuxi，中国)，加入浆中，并且使温度在95℃保持45分钟，产生中间液化产物。将此中间液化产物分成100g等分试样，于150mL烧瓶中在60℃维持。pH用20％硫酸调整至6.0或7.0。SAS3以表2和3中所示的浓度加入，并且再进行液化15小时、19小时或40小时。使用实施例1中所述的程序，通过液化产物的HPLC分析，确定各种DPn糖的水平。产物液化产物糖浆的糖谱显示于表2和3中。

表2

表3

如表2和3中所示，DP4产率随着反应时间的延长和在较高酶剂量下降低。在ph 6.0，DP4产率随着延长的反应时间发生实质性降低。尽管在pH 7.0时DP4产率也随着延长的反应时间降低，但DP4产率较稳定，并且几个样品提供了大于45％总糖含量的DP4产率。例如，在0.01％的SAS3剂量，在pH 6.0和7.0在15小时反应后，DP4水平升高到45％以上。在pH 7.0及以下的大多数样品中，DE达到30-40的期望范围。图1描述了在0.01％SAS3，pH7.0根据上述程序糖化19小时的液化玉米淀粉的示例性色谱图。

实施例3：DP4产生。

生玉米淀粉如实施例2中液化，以提供包含0.577％DP1、3.145％DP2、6.489％DP3和89.789％DP4+且具有DE 21.13的中间液化产物。将此中间液化产物分为100g等分试样在6个150mL烧瓶中，并且在pH 7.0以3个酶剂量一式两份地测试。施用表4中所示的SAS3量后，振荡每个烧瓶且在60℃水浴中加热16小时、19小时和40小时。如实施例1中，通过液化产物的HPLC分析，测定DPn糖的相对水平。产物液化产物糖浆的糖谱显示于表4中。

表4

如表4中所示，DP4产率在低至0.05kg/MTDS的SAS3浓度下维持稳定。这个酶水平提供了基于总糖在35-39％重量范围中的有用DP4水平，而DE在35-40的期望范围中。此外，与在这些条件下的先前实施例比较，DP3的产率略微更高。

实施例4：PS4变体SAS3的表达。

根据已知方法，使用IPTG诱导型pET表达载体，在地衣芽孢杆菌中表达SAS3。在纯化、过滤和浓缩后，分离包含酶的包涵体，酶在60℃在50mM柠檬酸钠(pH 6.5)中复性。贮存液以3mg/mL的酶浓度制备。

实施例5：用SAS3处理麦芽糖糊精。

M040(含水量6.38％重量)溶解于自来水中，以制备32％DS的浆。pH使用0.1M碳酸钠调整至6.5。浆以2、3或4克的等分试样加入玻璃试管内。样品管用塑料盖盖上，搅动，置于60℃水浴中。以测量的时间间隔取出等分试样(0.02mL)，溶解于0.01N硫酸中，并且通过HPLC分析。

使用配备带保护柱的Aminex HPX-87H柱(300×7.8mm)的Agilent1200Series(Agilent Technologies，Palo Alto，California)，60℃执行HPLC分析，其中，洗脱剂0.01N硫酸；流速0.6mL/分钟；55℃，折射率(RI)检测器；运行时间15或24分钟。注射0.02mL体积的样品(2％孵育混合物，在0.01N硫酸中)。葡萄糖(DP1)、麦芽糖(DP2)、麦芽三糖(DP3)、麦芽四糖(DP4)、麦芽五糖(DP5)和麦芽六糖(DP6)的商业标准品以4个不同浓度用于校正样品的RI反应。使用ChemStation for LC 3D软件(Agilent Technologies)进行信号的处理。

用SAS3以0(对照)、0.025、0.05和0.1kg/MTDS的浓度接种麦芽糖糊精浆(2.0g/样品)。如图2中所示，对照样品未显示底物的分解。而在0.025kg/MTDS SAS3的存在下，底物的显著分解是显而易见的，如图3中所示。同样地，图4描述了使用0.05kg/MTDS SAS3的底物分解，图5描述了使用0.1kg/MTDS SAS3的底物分解。与产生葡萄糖或麦芽糖的其他淀粉酶不同，SAS3优先产生麦芽四糖(DP4)，如图3-5中所示。在这些条件下，基于总糖，麦芽四糖的产率超过55％重量。

实施例6：麦芽四糖生产的时间进展曲线

实施例5的麦芽糖糊精浆调整至pH 5.5(4g/样品)，且用SAS3以0.007、0.012和0.024kg/MTDS的浓度接种。样品在60℃水浴中加热，且通过HPLC监控72小时。图6-8显示了分别使用0.007、0.012和0.024kg/MTDS SAS3，随着时间过去以DP1、DP2、DP3、DP4和DP5+表示的反应产物的出现。

与实施例5形成对比，所产生的麦芽四糖(DP4)最大量是约50％，但使用不同SAS3浓度，该DP4最大量在不同时间产生。如通过在较低酶浓度下DP4的持续产生证明的，SAS3在30小时后保持活性。

实施例7：通过HPLC的麦芽四糖含量测定。

在下述实施例中，通过由树脂柱(phenomenex Rezex-ROA-H+)和Reference检测器(RI，Agilent Co，USA)组成的HPLC系统，测定用SAS3处理的糖浆中的麦芽四糖含量。注射样品(20μL，1％w/v)，并且用0.05N硫酸的线性梯度以0.6mL/分钟洗脱柱。柱和检测器分别维持在60℃和35℃。

实施例8：SAS3的最适pH。

在此实施例中，进行实验以测量SAS3的最适操作pH，以产生最高含量的麦芽四糖糖浆。根据6.03％麦芽糖糊精湿度，麦芽糖糊精(213g，DE 9.9，pH 5.3，0.1％灰分)和自来水(787g)混合，以制备DS 20％浆。浆以100克量等分到150ml烧瓶内，并且pH用20％(w/v)硫酸调整为pH 4.0到pH 8.0。SAS3在施用前用RO水1∶100稀释，将0.025kg/MTDS SAS3加入每个烧瓶。反应在60℃运行，并且在17小时、22小时和48小时取样。如图9中所示，SAS3麦芽四糖生产的最适pH范围是约5.0-5.5。

实施例9：SAS3的最适温度。

在此实施例中，进行实验以测量SAS3的最适操作温度，以产生最高含量的麦芽四糖糖浆。根据6.03％麦芽糖糊精湿度，麦芽糖糊精(213g，DE9.9，pH 5.3，0.1％灰分)和自来水(787g)混合，以制备DS 20％浆。浆以100克量等分到150ml烧瓶内，并且用20％(w/v)硫酸调整pH至5.0。SAS3在施用前用RO水1∶100稀释。将0.025kg/MTDS SAS3加入每个烧瓶。反应在50℃-70℃运行，在17小时和22小时获得样品。如图10中所示，SAS3麦芽四糖生产的最适温度范围是约60℃-65℃。

实施例10：SAS3的最适剂量。

在此实施例中，进行实验以测量最适SAS 3剂量用于产生最高含量的麦芽四糖糖浆。根据麦芽糖糊精湿度6.03％，麦芽糖糊精(213g，DE 9.9，pH5.3，0.1％灰分)和自来水(787g)混合，以制备DS 20％浆。浆以100克量等分到150ml烧瓶内，并且用20％(w/v)硫酸调整pH至5.0。SAS3在施用前用RO水1∶100稀释。SAS3以0.01、0.025、0.05和0.1kg/MTDS加入。反应在60℃运行，并且在17小时和22小时获得样品。如图11中所示，SAS3麦芽四糖生产的最适剂量在这些条件下是0.025kg/MDTS。

实施例11：加入支链淀粉酶以增加麦芽四糖产率。

在此实施例中，进行实验证实支链淀粉酶可以帮助SAS 3以增加麦芽四糖产率且测试支链淀粉酶剂量。根据麦芽糖糊精湿度6.03％，麦芽糖糊精(213g，DE 9.9，pH 5.3，0.1％灰分)和自来水(787g)混合，以制备DS 20％浆。浆以100克量等分到150ml烧瓶内，并且用20％(w/v)硫酸调整pH至5.0。SAS3和支链淀粉酶(Optimax L-1000，Danisco US Inc，Genencor Division)在施用前用RO水1∶100稀释。SAS3以0.025kg/MTDS加入，支链淀粉酶以0.1、0.25、0.5、1.或1.5kg/MTDS加入。反应在60℃运行，并且在17小时和22小时获取样品。如图12中所示，麦芽四糖产率随着支链淀粉酶剂量增加而增加。

实施例12：起始干固形物含量对麦芽四糖产率的影响。

根据麦芽糖糊精湿度6.03％，麦芽糖糊精(DE 9.9，pH 5.3，0.1％灰分)10.6g、21.3g和34g，以及自来水89.4g、78.7g和66g混合，以分别制备DS 10％、20％和32％浆。浆用20％(w/v)硫酸调整pH至5.0。SAS3和支链淀粉酶(Optimax L-1000，Danisco US Inc，Genencor Division)在施用前用RO水1∶100稀释。加入0.01kg/MDTS SAS3和1kg/MDTS支链淀粉酶。反应在65℃运行，并且在17小时和22小时获取样品。如图13中所示，20％DS的底物浓度提供了最高麦芽四糖产率。

实施例13.使用

ALPHA+SAS3自颗粒淀粉产生DP4

材料与方法

将100g 32％ds淀粉浆的pH调整至5.3，然后给予2AAU/gds

ALPHA和0.03BMK/gds SAS3，在60℃用于DP4产生。在取出样品前，反应执行多达15小时。离心样品，产生上清液，所述上清液在沸水中处理以灭活酶。通过每种样品的白利糖度与完全溶解样品的白利糖度的比，计算溶解度百分比。

取0.5ml样品，将之与4.5ml RO水组合，稀释酶灭活的样品。混合物随后通过0.45μm Whatman滤器过滤，置于小瓶内用于HPLC分析。HPLC分析使用具有保护柱的REZEX^TM ROA-有机酸H+柱执行。

结果和讨论

表7.

如表7中所示，SAS3在15小时中产生DP4作为主要产物，达40.65％，溶解度54.3％。对于常规底物，即液化淀粉，SAS3典型地产生高达45～50％的DP4，但在本情况中，DP4较低而DP2和DP3较高。较高的DP2和DP3可能是由于底物中的α-淀粉酶活性所致，因为据报道残留α-淀粉酶活性可以在糖化作用过程中导致增加的DP2和DP3。这个结果说明，颗粒淀粉是在α-淀粉酶的存在下用于DP4生产的适宜SAS3底物。

实施例14.使用SAS3+TRANSGLUCOSIDASE

(DaniscoUS Inc.，Genencor Division)自

FRED液化淀粉产生IMO

材料与方法

FRED淀粉液化产物(～9.1DE)用NaOH调整pH至5.35，这之后施用SAS3+TRANSGLUCOSIDASE

各100g液化产物分别在60℃孵育进行糖化。反应执行多达48小时，期间定期取样。样品在沸水中处理以灭活酶。

取0.5ml样品，将之与4.5ml RO水组合，稀释酶灭活的样品。样品随后通过0.45μm Whatman滤器过滤，并且置于小瓶内用于HPLC分析。HPLC分析使用REZEX^TM ROA-有机酸H+柱随后用Shodex RSpakDC-613执行，以鉴定具有α-1，6键的IMO。

结果与讨论

表8.

表8显示SAS3+TRANSGLUCOSIDASE

组合成功地产生了显著量的异麦芽寡糖，例如异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖，给出46.89的IMO数，其中IMO数基于所有异麦芽寡糖的％量总和进行计算。这个结果说明，可以使用更经济的底物例如液化淀粉，代替在常规工艺中相对昂贵的高麦芽糖糖浆，用于IMO生产。

对于本领域技术人员显而易见的是，可以对本发明组合物及其使用方法进行各种修饰和变动，而不背离预期的精神或范围。因此，后附权利要求的范围涵盖这些修饰和变动及其等价物。本文引用的所有参考文献为了所有目的整体引入本文作为参考。

表5

A3S

G70D

V113I

G134C

G158T

A179N

G223P

W232P

G303L

R316P

A3T

G70K

N116D

R137C

G158F

A179R

G223I

W232Q

G303E

R316K

P7S

G70E

N119S

N138D

G158P

A179E

G223L

W232R

G303D

W323M

A8N

G70S

N119G

N138E

G158I

A179T

G223V

W232S

Q305E

T324L

G9A

G70Q

N119Y

N138S

G158A

R182S

G223C

W232Y

Q305T

T324M

H13R

G70A

N119E

C140R

G158V

R182H

G223T

W232T

Q305L

T324A

N26E

G70V

G121W

C140A

G158L

R182M

G223S

R233H

H307D

S325G

N26D

G70L

G121A

A141S

G158Q

R182D

G223Y

N234R

H307L

S334R

P32S

G70P

G121F

A141P

G158C

R182G

G223W

A236E

H307R

S334Q

N33Y

K71R

G121L

D142N

E160D

S183G

G223Q

S237G

H307K

S334H

D34N

K71M

G121T

D142G

S161V

G184Q

G223N

S237D

H307G

S334A

I38M

S72E

G121S

D142E

S161A

G188A

G223D

W238Q

H307P

S334M

I46F

S72K

G121E

P143T

S161T

G188H

G223H

W238G

H307I

S334L

D49V

S72N

G121K

G144E

S161K

G188T

G223K

W238K

H307S

S334P

D62N

S72T

G121R

N145D

S161P

G188S

G223R

W238R

H307M

H335M

F63L

G73M

G121H

N145S

S161G

F192Y

G223M

W238P

H307Q

W339E

F63A

G73S

G121M

Y146G

S161R

F192F

G223A

W238E

H307V

W339A

F63D

G73T

G121V

Y146E

S161H

F192M

G223E

Q239L

H307W

Y341E

F63E

G73N

G121P

Y146D

L163M

V195D

G223F

V253G

H307Y

Y341C

F63V

G73L

G121I

N148S

N164R

R196P

S225G

D255V

H307C

D343E

S64T

G73E

G121D

N148K

G166N

R196Q

S225E

A257V

H307F

R353T

S64N

G73D

Y122W

D149V

P168L

R196T

S225V

F260R

H307F

R358A

T67V

G74S

Y122A

D149L

Q169R

R196K

E226W

F260K

W308C

R358T

T67K

G75C

Y122Q

D149H

Q169K

R196Y

E226C

N264D

W308T

R358L

T67Q

G75S

Y122E

C150A

Q169V

R196S

F226D

V267I

W308K

R358V

T67H

G75R

P123S

D151W

Q169G

R196G

E226G

D269V

W308N

R358Q

T67R

G75Y

D124S

D151A

Q169E

R196A

Y227G

D269S

W308R

R358E

T67G

G75F

K125E

D151V

Q169N

R196V

Y227T

D269N

W308S

R358N

T67N

G75W

K125G

G153D

Q169D

Y198W

Y227D

K271L

W308G

R358G

D68C

G75E

K125A

S334K

I170M

Y198F

Y227K

K271Q

W308Q

S367R

D68E

E76V

K125W

S334T

I170E

A199P

Y227C

K271A

W308A

S367Q

G69M

G100A

K125D

G153A

I170L

P200G

S229N

H272Q

A309T

S379G

G69I

G100S

K125Q

D154G

I170K

P200A

S229P

G276R

A309E

D390E

G69H

G104R

K125P

D154E

I170N

R202K

W232F

W282S

A309M

S399P

G69E

G104N

E126N

D154Y

L178N

S208T

W232G

V285A

A309V

S420G

G69A

G106K

E126D

F156Y

L178W

S213N

W232H

V290I

A309I

D422N

G69R

V107M

N128E

I157L

L178Q

L220A

W232I

T295C

A309P

D422Q

G69P

L110F

P130S

I157V

L178F

L220T

W232K

Y297H

D312E

D422P

G69T

D112E

A131T

I157M

A179P

K222Y

W232L

G300E

R316Q

G424S

G69K

G134R

G158S

A179S

K222M

W232N

N302K

R316S

G424D

Claims

1.嗜糖假单胞菌淀粉酶(PS4)的变体，其为具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的野生型PS4的变体，包括：

(i)G233E氨基酸置换，和

(ii)与SEQ ID NO：2的氨基酸序列比较，不超过24个的另外氨基酸缺失、添加、插入或置换；或

(iii)与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少70％序列同一性，

其中所述PS4变体具有α-淀粉酶活性。

2.权利要求1的PS4变体，其进一步包括在所述多肽序列氨基末端的甲硫氨酸。

3.权利要求1的PS4变体，其中所述PS4变体包括，与SEQ ID NO：2的氨基酸序列比较，具有不超过15个的另外氨基酸置换的多肽序列。

4.权利要求3的PS4变体，其包括一个或多个下述氨基酸置换：N33Y、D34N、G70D、G121F、G134R、A141P、Y146G、I157L、S161A、L178F、A179T、S229P、H307K、A309P或S334P。

5.权利要求4的PS4变体，其中所述PS4变体包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

6.权利要求1的PS4变体，其中所述PS4变体与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少80％序列同一性。

7.权利要求6的PS4变体，其中所述PS4变体与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。

8.权利要求7的PS4变体，其中所述PS4变体与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少95％序列同一性。

9.权利要求1的PS4变体，其中所述PS4变体是纯化的。

10.权利要求1的PS4变体，其中与所述野生型PS4比较，所述PS4变体具有改变的热稳定性。

11.权利要求10的PS4变体，其中所述PS4变体比所述野生型PS4具有更大热稳定性。

12.权利要求1的PS4变体，其中在pH约5.0-约7.0，所述PS4变体比所述野生型PS4更稳定。

13.权利要求1的PS4变体，其中所述PS4变体具有比野生型PS4更高的外切α-淀粉酶活性。

14.权利要求1的PS4变体，其中所述PS4变体具有比野生型PS4更高的内切α-淀粉酶活性。

15.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1的PS4变体。

16.一种表达载体，其包括权利要求15的多核苷酸。

17.一种宿主细胞，其包括权利要求16的表达载体。

18.一种宿主细胞，其表达权利要求15的多核苷酸。

19.一种淀粉加工组合物，其包括权利要求1的PS4变体。

20.一种制备糖浆的方法，其包括将权利要求1的PS4变体加入淀粉液化产物中，使所述淀粉液化产物糖化以形成所述糖浆。

21.权利要求20的方法，其中所述PS4变体以基于溶解固体约0.001％重量-约0.1％重量的范围，加入所述淀粉液化产物中。

22.权利要求21的方法，其中所述PS4变体以基于溶解固体约0.0025％重量-约0.01％重量的范围，加入所述淀粉液化产物中。

23.权利要求20的方法，其中所述淀粉液化产物得自来自玉米、玉米穗轴、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯的淀粉。

24.权利要求20的方法，其中所述淀粉液化产物在约60℃-约65℃糖化。

25.权利要求20的方法，其中所述淀粉液化产物在约pH 5.0-约pH7.0糖化。

26.权利要求20的方法，其进一步包括发酵所述糖浆以产生乙醇。

27.权利要求20的方法，其进一步包括将具有脱支活性的酶加入所述淀粉液化产物中的步骤。

28.权利要求27的方法，其中具有脱支活性的所述酶是异淀粉酶、支链淀粉酶、异支链淀粉酶、新支链淀粉酶或其任何组合。

29.权利要求27的方法，其任选地包括将蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、果胶裂解酶或其任何组合加入所述淀粉液化产物中的再一步骤。

30.权利要求20的方法，其中所述糖浆包括基于总糖含量至少约40％重量的麦芽四糖。

31.权利要求30的方法，其中所述糖浆包括基于总糖含量至少约45％重量的麦芽四糖。

32.权利要求31的方法，其中所述糖浆包括基于总糖含量至少约50％重量的麦芽四糖。

33.权利要求32的方法，其中所述糖浆包括基于总糖含量约45％重量-约60％重量的麦芽四糖。

34.权利要求20的方法，其中所述PS4变体是固定化的。

35.一种制备糖浆的方法，其包括将权利要求1的PS4变体和α-淀粉酶加入颗粒淀粉中，使所述颗粒淀粉水解以形成所述糖浆。

36.权利要求35的方法，其中所述PS4变体以基于溶解固体约0.001％重量-约0.1％重量的范围，加入颗粒淀粉。

37.权利要求35的方法，其中所述PS4变体以基于溶解固体约0.0025％重量-约0.01％重量的范围，加入颗粒淀粉。

38.权利要求35的方法，其中所述颗粒淀粉得自来自玉米、玉米穗轴、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯的淀粉。

39.权利要求35的方法，其中所述颗粒淀粉在约60℃-约65℃糖化。

40.权利要求35的方法，其中所述颗粒淀粉在约pH 5.0-约pH 7.0糖化。

41.权利要求35的方法，其进一步包括发酵所述糖浆以产生乙醇。

42.权利要求35的方法，其进一步包括将具有脱支活性的酶加入所述颗粒淀粉中的步骤。

43.权利要求42的方法，其中具有脱支活性的所述酶是异淀粉酶、支链淀粉酶、异支链淀粉酶、新支链淀粉酶或其任何组合。

44.权利要求42的方法，其任选地包括将蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、果胶裂解酶或其任何组合加入所述颗粒淀粉中的再一步骤。

45.权利要求35的方法，其中所述糖浆包括基于总糖含量至少约40％重量的麦芽四糖。

46.权利要求45的方法，其中所述糖浆包括基于总糖含量至少约45％重量的麦芽四糖。

47.权利要求46的方法，其中所述糖浆包括基于总糖含量至少约50％重量的麦芽四糖。

48.权利要求47的方法，其中所述糖浆包括基于总糖含量约45％重量-约60％重量的麦芽四糖。

49.权利要求35的方法，其中所述PS4变体是固定化的。

50.一种用于制备IMO的方法，其包括将a)权利要求1的PS4变体、b)α-淀粉酶和c)转葡糖苷酶加入淀粉液化产物或颗粒淀粉形式的淀粉中，使所述淀粉糖化以形成IMO。

54.权利要求50的方法，其中所述淀粉得自玉米、玉米穗轴、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯。

55.一种纺织品退浆组合物，其包括在水性溶液中的权利要求1的PS4变体，和任选地其它酶。

56.一种使纺织品退浆的方法，其包括使权利要求37的退浆组合物与纺织品接触足以使所述纺织品退浆的一段时间。