KR102409435B1 - 말토올리고당 함유 당류의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 말토테트라오스를 특정 함량 포함하는 말토올리고당 함유 당류의 제조방법에 관한 것이다.

Description

말토올리고당 함유 당류의 제조방법{Method of producing saccharide comprising malto oligosaccharides}

본 발명은 말토올리고당 함유 당류의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 말토올리고당은 특정 함량으로 말토테르라오스를 포함하는 것이며, 더욱 자세하게는 말토테트라오스 전환 아밀라아제 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여, 말토테르라오스를 특정 함량으로 함유하는 말토올리고당 함유 당류의 제조방법에 관한 것이다.

말토올리고당은 식품의 부드러운 식감 부여, 마스킹(masking) 기능 등의 특성을 가져 식품 기술분야에서 이용되는 기능성 당류이다. 말토올리고당은 말토오스(G2, maltose), 말토트라이오스(G3, maltotriose), 말토테트라오스 (G4, maltotetraose) 및 말토펜타오스(G5, maltopentaose), 말토헥사오스(G6, maltohexaose), 말토헵타오스(G7, maltoheptaose), 말토옥타오스(G8, maltooctaose), 말토노나오스(G9, maltononaose)등을 포함한다.

말토테트라오스 (G4)는 포도당 4개가 α-1,4결합으로 이루어져 있는 물질로, 제품에 첨가될 경우 부드러운 바디감을 실어주는 역할을 하며, 일반적인 물엿에 비해 착색과 갈변 현상이 적은 당질이다. 또한, 제품의 윤기와 보습력을 향상 시키고, 전분 및 단백질 변성 억제 효과가 우수하며, 프리바이오틱 특성을 가지고 있다. 따라서, 말토올리고당 내의 말토테트라오스 함량을 조절하여 흡습성, 품질 및 저장 안정성을 개선하고, 양호한 풍미 발현성을 가지며 부드러운 바디감을 주는 올리고당을 함유하는 말토올리고당 함유 당류를 제조하기 위한 연구가 지속적으로 요구되고 있다.

이에, 본 발명은 말토올리고당, 특히 말토테트라오스가 30% 이상 함유된 당시럽을 제조하기 위하여 아밀라아제를 생산하는 균주를 탐색하였으며, 돌연변이를 통해 효소의 활성을 높이는 연구를 수행하였다. 본 발명의 일예에 의하면 전분, 덱스트린 등을 기질로 하여 말토테트라오스 함량이 30중량% 이상인 말토올리고당 시럽을 제조할 수 있으며, 단당류와 이당류 함량이 7% 이하인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 예는, 말토올리고당 함유 당류의 고형분 함량 100중량%를 기준으로, 말토테트라오스를 30 내지 60중량%로 포함하는 말토올리고당 함유 당류의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 일 예는, 말토올리고당 함유 당류의 고형분 함량 100중량%를 기준으로, 말토테트라오스를 30 내지 60중량%로 포함하는 말토올리고당 함유 당류의 생산용 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 일 예는, 다당류를 기질로 이용하여, 당류의 고형분 함량 100중량%를 기준으로 말토테트라오스를 30 내지 60중량%로 포함하는 말토올리고당 함유 당류를 생산하는 효소를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 일 예는, 당류의 고형분 함량 100중량%를 기준으로, 말토테트라오스 함량이 30 내지 60중량%이 되도록 다당류로부터 말토테트라오스를 전환하는 활성을 가지는, 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri) 균주를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 일예는 말토테트라오스 생성 아밀라아제 효소, 말토테트라오스 생성 아밀라아제 효소를 생산하는 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 배양 상등액, 상기 미생물의 배양 상등액의 농축물, 및 이들의 분말로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 이용하여, 말토올리고당 함유 당류를 생산하는 단계를 포함하는, 말토올리고당 함유 당류의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 추가 일예는 말토테트라오스 생성 아밀라아제 효소, 말토테트라오스 생성 아밀라아제 효소를 생산하는 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 배양 상등액, 상기 미생물의 배양 상등액의 농축물, 및 이들의 분말로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 말토올리고당 함유 당류의 제조용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일예에서 말토올리고당 함유 당류는 말토올리고당을 포함한다. 상기 "말토올리고당"은, 말토올리고당 함유 당류로 포함될 수 있으며, 상기 말토올리고당 함유 당류는, 당류 고형분 함량을 기준으로 G3 내지 G7의 합이 40중량% 이상, 50중량% 이상, 60중량% 이상, 70중량% 이상, 80중량% 이상, 90중량% 이상, 95중량% 이상, 99중량% 이상, 또는 100중량%인 말토올리고당 함유 당류를 의미할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 말토올리고당 함유 당류는, 말토올리고당 함유 시럽일 수 있다. 상기 말토올리고당 함유 당류는 1당류 및 2당류, G3 내지 G7의 당류, 및 G8 이상의 당류를 포함할 수 있다. 통상적으로, 말토올리고당은 말토트리오스 (G3, maltoriose), 말토테트라오스 (G4, maltotetraose), 말토펜타오스 (G5, maltopentaose), 말토헥사오스 (G6, maltohexaose), 말토헵타오스 (G7, maltoheptaose) 등의 총합이 시럽 1g 대비 40중량% 이상, 50중량% 이상, 60중량% 이상, 70중량% 이상, 80중량% 이상, 90중량% 이상, 95중량% 이상, 99중량% 이상, 또는 100중량%인 것을 칭한다.

본 발명의 일예에서 말토올리고당 함유 당류는 말토테트라오스(G4)를 특정 함량 이상으로 포함하는 말토테트라오스 함유 당류일 수 있으며, 예를 들면 말토테트라오스(G4)를 30 내지 60 중량% 함유하는 당류를 의미할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 말토올리고당 함유 당류는, 상기 말토올리고당 함유 당류의 고형분 함량 100중량%를 기준으로, 말토테트라오스(G4)를 30 내지 60중량%, 30 내지 55중량%, 30 내지 54중량%, 30 내지 53중량%, 30 내지 52중량%, 30 내지 51중량%, 35 내지 60중량%, 35 내지 55중량%, 35 내지 54중량%, 35 내지 53중량%, 35 내지 52중량%, 35 내지 51중량%, 40 내지 60중량%, 40 내지 55중량%, 40 내지 54중량%, 40 내지 53중량%, 40 내지 52중량%, 40 내지 51중량%, 45 내지 60중량%, 45 내지 55중량%, 45 내지 54중량%, 45 내지 53중량%, 45 내지 52중량%, 45 내지 51중량%, 48 내지 60중량%, 48 내지 55중량%, 48 내지 54중량%, 48 내지 53중량%, 48 내지 52중량%, 48 내지 51중량%, 48.5 내지 60중량%, 48.5 내지 55중량%, 48.5 내지 54중량%, 48.5 내지 53중량%, 48.5 내지 52중량%, 48.5 내지 51중량%, 49 내지 60중량%, 49 내지 55중량%, 49 내지 54중량%, 49 내지 53중량%, 49 내지 52중량%, 또는 49 내지 51중량%로 포함하는 것일 수 있다.

상기 말토올리고당 함유 당류는, 상기 말토올리고당 함유 당류의 고형분 함량 100중량%를 기준으로, 단당류 및 이당류 함량의 상한값이 10중량% 이하, 9중량% 이하, 8중량% 이하, 또는 7중량% 이하일 수 있고, 단당류 및 이당류 함량의 하한값이 1중량% 이하, 2중량% 이하, 3중량% 이상, 4중량% 이상, 5중량% 이상, 5.5중량% 이상, 6중량% 이상, 또는 6.5중량% 이상일 수 있으며, 상기 말토올리고당 함유 당류의 단당류 및 이당류 함량은 상기 상한값과 상기 하한값의 조합으로 설정될 수 있다.

상기 말토올리고당 함유 당류는, 상기 말토올리고당 함유 당류의 고형분 함량 100중량%를 기준으로, 말토테트라오스를 30 내지 60중량%로 포함하고, DP10 이상 당류를 25 내지 55중량%로 포함하며, 나머지 당류의 함량이 15 내지 45중량%인 것일 수 있다.

상기 말토올리고당 함유 당류는 말토올리고당 함유 액상 또는 분말일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따른 말토올리고당 함유 당류의 제조방법은, 10 내지 50중량%, 10 내지 40중량%, 10 내지 35중량%, 20 내지 50중량%, 20 내지 40중량%, 20 내지 35중량%, 30 내지 50중량%, 30 내지 40중량%, 또는 30 내지 35중량%의 전분 원료 (전분질 용액)에, 말토테트라오스 생성 아밀라아제 효소를 전분 원료 고형분 1g 당 1 내지 20 단위, 1 내지 15 단위, 5 내지 20 단위, 또는 5 내지 15 단위의 비율로 첨가하여, pH 5 내지 9, pH 5 내지 8, pH 5 내지 7, pH 6 내지 8, pH 7 내지 8, 또는 pH 7초과 내지 8미만의 조건에서, 반응온도 40 내지 70℃, 50 내지 70℃, 55 내지 70℃, 55 내지 65℃, 또는 55 내지 60℃ 에서 반응하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 말토올리고당 함유 당류를 생산하는 단계에서 사용되는 기질은 전분 원료 및 이의 가수분해물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 전분 원료는 감자전분, 고구마전분, 옥수수 전분, 밀 전분, 타피오카 전분, 쌀 전분, 아밀로스, 및 아밀로펙틴으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 전분질 원료의 분해물은 가용성 전분, 덱스트린, 아밀로덱스트린, 에리트로덱스트린, 아크로덱스트린, 및 말토덱스트린으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

말토테트라오스 생성 아밀라아제와 함께 기타 전분질 분해 효소, 예컨대 시클로댁스트린 글루카노트란스퍼라아제(EC 2.4.1.19), α-아밀라아제(EC 3.2.1.1), β-아밀라아제(EC 3.2.1.2), 글루코아밀라아제(EC 3.2.1.3), α-글루코시다아제(EC 3.2.1.20), 풀룰라나아제(EC 3.2.1.41), 또는 이소아밀라아제(EC 3.2.1.68) 등을 병용함으로써 생성물인 말토테트라오스 고함유물의 조성을 변경하거나 말토테트라오스 함량을 높일 수 있다. 더욱이, 말토테트라오스 생성 아밀라아제와 더불어 전분 디브랜칭 효소(deberanching enzyme), 예를 들면 풀룰라나아제 또는 이소아밀라아제 중 한가지 이상을 병용하여, 말토테트라오스 고함유물의 함량을 60~80w/w%까지 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일예에 따른 말토올리고당 함유 당류는, 말토테트라오스 전환 활성을 가지는 아밀라아제 효소, 또는 말토테트라오스 전환 활성을 가지는 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 제조될 수 있다.

본 발명의 일예에 따른 말토테트라오스 생성 아밀라아제 효소를 생산하는 미생물은, 야생형 균주를 개량한 변이 균주인 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 말토테트라오스 생성 아밀라아제 효소를 생산하는 미생물은, 야생형 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri) 균주를 개량한 변이 균주인 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 말토테트라오스 생성 아밀라아제 효소를 생산하는 균주는, 기탁번호 KCCM12578P를 가지는 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri) SYC-G4 균주일 수 있다.

상기 야생형 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri) 균주를 개량한 변이 균주는, 상기 야생형 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri) 균주에서 유래하는 야생형 말토테트라오스 생성 아밀라아제 효소 (서열번호 3)와 동일 또는 상이한 서열을 가지는 효소를 생산할 수 있으며, 예를 들어 서열번호 3의 아미노산 서열, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 7의 아미노산 서열, 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 서열, 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열로 이루어지는 효소를 생산할 수 있다. 상기 변이 균주가 상기 야생형 균주의 동일한 아미노산 서열을 가지는 효소를 생산할 경우에도, 상기 변이 균주는 돌연변이 유발에 의해 균주 배양 시 효소의 발현량이 증가하여, 상기 변이 균주의 균체, 상기 균주의 균체 파쇄물, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 배양 상등액, 상기 균주의 배양 상등액의 농축물 등의 단위 부피 (ml) 당 효소 역가가, 상기 야생형 균주의 균체, 상기 야생형 균주의 균체 파쇄물, 상기 야생형 균주의 배양물, 상기 야생형 균주의 배양 상등액, 상기 야생형 균주의 배양 상등액의 농축물 등의 단위 부피 (ml) 당 효소 역가 대비 증가한 것일 수 있다.

본 발명의 일예에 따른 말토테트라오스 생성 아밀라아제 효소는, 야생형 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri) 균주로부터 유래한 말토테트라오스 생성 아밀라아제 효소 대비 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 15배 이상, 20배 이상, 25배 이상, 30배 이상, 31배 이상, 또는 32배 이상의 말토테트라오스 생산 활성을 가질 수 있다.

본 발명의 일예에 따른 말토테트라오스 생성 아밀라아제 효소는 20 내지 600 U/ml, 30 내지 600 U/ml, 35 내지 600 U/ml, 40 내지 600 U/ml, 50 내지 600 U/ml, 100 내지 600 U/ml, 150 내지 600 U/ml, 200 내지 600 U/ml, 300 내지 600 U/ml, 350 내지 600 U/ml, 380 내지 600 U/ml, 390 내지 600 U/ml, 400 내지 600 U/ml, 430 내지 600 U/ml, 450 내지 600 U/ml, 20 내지 550 U/ml, 30 내지 550 U/ml, 35 내지 550 U/ml, 40 내지 550 U/ml, 50 내지 550 U/ml, 100 내지 550 U/ml, 150 내지 550 U/ml, 200 내지 550 U/ml, 300 내지 550 U/ml, 350 내지 550 U/ml, 380 내지 550 U/ml, 390 내지 550 U/ml, 400 내지 550 U/ml, 430 내지 550 U/ml, 450 내지 550 U/ml, 20 내지 500 U/ml, 30 내지 500 U/ml, 35 내지 500 U/ml, 40 내지 500 U/ml, 50 내지 500 U/ml, 100 내지 500 U/ml, 150 내지 500 U/ml, 200 내지 500 U/ml, 300 내지 500 U/ml, 350 내지 500 U/ml, 380 내지 500 U/ml, 390 내지 500 U/ml, 400 내지 500 U/ml, 430 내지 500 U/ml, 또는 450 내지 500 U/ml의 활성을 가지는 것일 수 있다.

본 발명의 일예에 따른 말토테트라오스 생성 아밀라아제 효소는, 상기 효소의 말토테트라오스 전환 활성이 특정 pH 범위에서 안정한 것일 수 있으며, 예를 들어 말토테트라오스 전환 활성이 안정한 pH 범위가 5 내지 10, 5 내지 9.5, 5 내지 9, 5 내지 8.5, 5 내지 8, 5 내지 7.9, 5 내지 7.8, 5 내지 7.7, 5 내지 7.6, 5 내지 7.5, 5.5 내지 10, 5.5 내지 9.5, 5.5 내지 9, 5.5 내지 8.5, 5.5 내지 8, 5.5 내지 7.9, 5.5 내지 7.8, 5.5 내지 7.7, 5.5 내지 7.6, 5.5 내지 7.5, 6 내지 10, 6 내지 9.5, 6 내지 9, 6 내지 8.5, 6 내지 8, 6 내지 7.9, 6 내지 7.8, 6 내지 7.7, 6 내지 7.6, 6 내지 7.5, 6.5 내지 10, 6.5 내지 9.5, 6.5 내지 9, 6.5 내지 8.5, 6.5 내지 8, 6.5 내지 7.9, 6.5 내지 7.8, 6.5 내지 7.7, 6.5 내지 7.6, 6.5 내지 7.5, 7 내지 10, 7 내지 9.5, 7 내지 9, 7 내지 8.5, 7 내지 8, 7 내지 7.9, 7 내지 7.8, 7 내지 7.7, 7 내지 7.6, 7 내지 7.5, 7.1 내지 10, 7.1 내지 9.5, 7.1 내지 9, 7.1 내지 8.5, 7.1 내지 8, 7.1 내지 7.9, 7.1 내지 7.8, 7.1 내지 7.7, 7.1 내지 7.6, 7.1 내지 7.5, 7.2 내지 10, 7.2 내지 9.5, 7.2 내지 9, 7.2 내지 8.5, 7.2 내지 8, 7.2 내지 7.9, 7.2 내지 7.8, 7.2 내지 7.7, 7.2 내지 7.6, 7.2 내지 7.5, 7.3 내지 10, 7.3 내지 9.5, 7.3 내지 9, 7.3 내지 8.5, 7.3 내지 8, 7.3 내지 7.9, 7.3 내지 7.8, 7.3 내지 7.7, 7.3 내지 7.6, 7.3 내지 7.5, 7.4 내지 10, 7.4 내지 9.5, 7.4 내지 9, 7.4 내지 8.5, 7.4 내지 8, 7.4 내지 7.9, 7.4 내지 7.8, 7.4 내지 7.7, 7.4 내지 7.6, 7.4 내지 7.5, 7.5 내지 10, 7.5 내지 9.5, 7.5 내지 9, 7.5 내지 8.5, 7.5 내지 8, 7.5 내지 7.9, 7.5 내지 7.8, 7.5 내지 7.7, 또는 7.5 내지 7.6의 pH 범위일 수 있으며, 일예로 pH 7.5에서 안정한 것일 수 있다.

상기 말토테트라오스 생성 아밀라아제 효소는, 효소 반응 pH 7.5에서의 말토테트라오스(G4) 전환율이, 효소 반응 pH 5.8에서의 말토테트라오스(G4) 전환율의 1배 초과 내지 1.5배, 1배 초과 내지 1.4배, 1배 초과 내지 1.3배, 1배 초과 내지 1.2배, 1배 초과 내지 1.1배, 1.01 내지 1.5배, 1.01 내지 1.4배, 1.01 내지 1.3배, 1.01 내지 1.2배, 1.01 내지 1.1배, 1.05 내지 1.5배, 1.05 내지 1.4배, 1.05 내지 1.3배, 1.05 내지 1.2배, 또는 1.05 내지 1.1배 일 수 있다 (도 5).

본 발명의 일예에 따른 말토테트라오스 생성 아밀라아제 효소는, 상기 효소의 말토테트라오스 전환 활성이 특정 온도 범위에서 안정한 것일 수 있으며, 예를 들어 말토테트라오스 전환 활성이 안정한 온도 범위가 40 내지 70℃, 40 내지 65℃, 40 내지 64℃, 40 내지 63℃, 40 내지 62℃, 40 내지 61℃, 40 내지 60℃, 45 내지 70℃, 45 내지 65℃, 45 내지 64℃, 45 내지 63℃, 45 내지 62℃, 45 내지 61℃, 45 내지 60℃, 50 내지 70℃, 50 내지 65℃, 50 내지 64℃, 50 내지 63℃, 50 내지 62℃, 50 내지 61℃, 50 내지 60℃, 55 내지 70℃, 55 내지 65℃, 55 내지 64℃, 55 내지 63℃, 55 내지 62℃, 55 내지 61℃, 55 내지 60℃, 56 내지 70℃, 56 내지 65℃, 56 내지 64℃, 56 내지 63℃, 56 내지 62℃, 56 내지 61℃, 56 내지 60℃, 57 내지 70℃, 57 내지 65℃, 57 내지 64℃, 57 내지 63℃, 57 내지 62℃, 57 내지 61℃, 57 내지 60℃, 58 내지 70℃, 58 내지 65℃, 58 내지 64℃, 58 내지 63℃, 58 내지 62℃, 58 내지 61℃, 58 내지 60℃, 59 내지 70℃, 59 내지 65℃, 59 내지 64℃, 59 내지 63℃, 59 내지 62℃, 59 내지 61℃, 또는 59 내지 60℃의 온도 범위에서 안정한 것일 수 있으며, 일예로 60℃ 온도에서 안정한 것일 수 있다.

상기 말토테트라오스 생성 아밀라아제 효소는, 효소 반응 온도 60℃에서의 말토테트라오스(G4) 전환율이, 효소 반응 온도 50℃에서의 말토테트라오스(G4) 전환율의 1배 초과 내지 1.5배, 1배 초과 내지 1.4배, 1배 초과 내지 1.3배, 1배 초과 내지 1.2배, 1배 초과 내지 1.15배, 1배 초과 내지 1.1배, 1.01배 내지 1.5배, 1.01배 내지 1.4배, 1.01배 내지 1.3배, 1.01배 내지 1.2배, 1.01배 내지 1.15배, 또는 1.01배 내지 1.1배 일 수 있다 (도 6).

본 발명의 일예에 따른 말토테트라오스 생성 아밀라아제 효소는 분말화된 효소일 수 있다. 본 발명의 일예에 따른 말토테트라오스 생성 아밀라아제 효소는 분말화된 효소일 수 있으며, 상기 효소는 분말화에 의해 활성이 증가한 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 말토테트라오스 생성 아밀라아제 효소는 분말화에 의해 활성이 1배 초과, 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상, 또는 10배 이상 증가한 것일 수 있고, 이 때 분말화에 의한 활성 증가율의 상한값은 20배 이하, 15배 이하, 12배 이하, 또는 11배 이하일 수 있다.

본 발명의 일예에 따른 말토테트라오스 생성 아밀라아제 효소는 특정 온도 범위에서 일정 시간 보관한 뒤의 활성이 초기 활성과 유사하거나, 초기 활성보다 증가하여 장기 보관이 가능한 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일예에 따른 말토테트라오스 생성 아밀라아제 효소는 특정 온도 범위에서, 일정 시간 보관한 뒤의 상대적 활성이, 초기 활성의 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 100% 이상, 105% 이상, 110% 이상, 115% 이상, 120% 이상, 125% 이상, 또는 130% 이상 (이 때, 상대적 활성의 상한값은 초기 활성의 200% 이하, 190% 이하, 180% 이하, 170% 이하, 160% 이하, 150% 이하, 140% 이하, 130% 이하, 120% 이하, 110% 이하, 105% 이하, 100% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 또는 70% 이하일 수 있다) 일 수 있다. 일예로, 본 발명의 일예에 따른 말토테트라오스 생성 아밀라아제 효소는 특정 온도 범위에서 일정 시간 보관한 뒤의 활성이 초기 효소의 활성보다 높은 것일 수 있다.

상기 특정 온도 범위는 0 내지 50℃, 0 내지 45℃, 0 내지 40℃, 0 내지 35℃, 5 내지 50℃, 5 내지 45℃, 5 내지 40℃, 5 내지 35℃, 8 내지 50℃, 8 내지 45℃, 8 내지 40℃, 또는 8 내지 35℃의 온도 범위일 수 있다.

상기 일정 시간은 1주 이상, 2주 이상, 3주 이상, 4주 이상, 5주 이상, 6주 이상, 7주 이상, 8주 이상, 9주 이상, 10주 이상, 11주 이상, 12주 이상, 13주 이상, 14주 이상, 15주 이상, 16주 이상, 17주 이상, 18주 이상, 19주 이상, 또는 20주 이상일 수 있으며, 이 때 보관 기간의 상한값은 100주 이하, 80주 이하, 60주 이하, 52주 이하, 50주 이하, 40주 이하, 30주 이하, 25주 이하, 또는 20주 이하일 수 있다.

본 발명의 일예에 따른 말토테트라오스 생성 아밀라아제 효소는, 서열번호 3의 아미노산 서열, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 7의 아미노산 서열, 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 서열, 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하거나 가지는 것일 수 있다. 또는, 상기 말토테트라오스 생성 아밀라아제 효소는, 서열번호 3의 아미노산 서열, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 7의 아미노산 서열, 서열번호 9의 아미노산 서열, 서열번호 11의 아미노산 서열, 또는 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드일 수 있다.

본 발명의 일 예에 따른 말토테트라오스 생성 아밀라아제 효소는, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 또는 서열번호 12의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 예는, 다당류로부터 말토테트라오스를 전환하는 활성을 가지는, 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri) 균주를 제공하며, 상기 균주는 효소 반응물 (말토올리고당 함유 당류)의 고형분 함량 100중량%를 기준으로, 말토테트라오스 함량이 30 내지 60중량%, 30 내지 55중량%, 30 내지 54중량%, 30 내지 53중량%, 30 내지 52중량%, 30 내지 51중량%, 35 내지 60중량%, 35 내지 55중량%, 35 내지 54중량%, 35 내지 53중량%, 35 내지 52중량%, 35 내지 51중량%, 40 내지 60중량%, 40 내지 55중량%, 40 내지 54중량%, 40 내지 53중량%, 40 내지 52중량%, 40 내지 51중량%, 45 내지 60중량%, 45 내지 55중량%, 45 내지 54중량%, 45 내지 53중량%, 45 내지 52중량%, 45 내지 51중량%, 48 내지 60중량%, 48 내지 55중량%, 48 내지 54중량%, 48 내지 53중량%, 48 내지 52중량%, 48 내지 51중량%, 48.5 내지 60중량%, 48.5 내지 55중량%, 48.5 내지 54중량%, 48.5 내지 53중량%, 48.5 내지 52중량%, 48.5 내지 51중량%, 49 내지 60중량%, 49 내지 55중량%, 49 내지 54중량%, 49 내지 53중량%, 49 내지 52중량%, 또는 49 내지 51중량%가 되도록 다당류로부터 말토테트라오스를 전환하는 활성을 가질 수 있다.

상기 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri) 균주는, 당류의 고형분 함량 100중량%를 기준으로, 단당류 및 이당류 함량의 상한값이 10중량% 이하, 9중량% 이하, 8중량% 이하, 또는 7중량% 이하가 되도록 다당류로부터 말토테트라오스를 전환하는 활성을 가질 수 있고, 단당류 및 이당류 함량의 하한값이 1중량% 이하, 2중량% 이하, 3중량% 이상, 4중량% 이상, 5중량% 이상, 5.5중량% 이상, 6중량% 이상, 또는 6.5중량%이 되도록 다당류로부터 말토테트라오스를 전환하는 활성을 가질 수 있으며, 상기 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri) 균주는, 상기 상한값과 상기 하한값의 조합으로 설정되는 범위의 단당류 및 이당류 함량을 가지도록 다당류로부터 말토테트라오스를 전환하는 활성을 가지는 것일 수 있다.

본 발명의 일예에 따른 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri) 균주는 야생형 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri) 균주를 개량한 변이 균주인 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri) 균주는 기탁번호 KCCM12578P를 가지는 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri) SYC-G4 균주일 수 있다.

본 발명의 일예에 따른 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri) 균주는, pH 5 내지 10, pH 5 내지 9.5, pH 5 내지 9, pH 5 내지 8.5, pH 5 내지 8, pH 5 내지 7.9, pH 5 내지 7.8, pH 5 내지 7.7, pH 5 내지 7.6, pH 5 내지 7.5, pH 5.5 내지 10, pH 5.5 내지 9.5, pH 5.5 내지 9, pH 5.5 내지 8.5, pH 5.5 내지 8, pH 5.5 내지 7.9, pH 5.5 내지 7.8, pH 5.5 내지 7.7, pH 5.5 내지 7.6, pH 5.5 내지 7.5, pH 6 내지 10, pH 6 내지 9.5, pH 6 내지 9, pH 6 내지 8.5, pH 6 내지 8, pH 6 내지 7.9, pH 6 내지 7.8, pH 6 내지 7.7, pH 6 내지 7.6, pH 6 내지 7.5, pH 6.5 내지 10, pH 6.5 내지 9.5, pH 6.5 내지 9, pH 6.5 내지 8.5, pH 6.5 내지 8, pH 6.5 내지 7.9, pH 6.5 내지 7.8, pH 6.5 내지 7.7, pH 6.5 내지 7.6, pH 6.5 내지 7.5, pH 7 내지 10, pH 7 내지 9.5, pH 7 내지 9, pH 7 내지 8.5, pH 7 내지 8, pH 7 내지 7.9, pH 7 내지 7.8, pH 7 내지 7.7, pH 7 내지 7.6, pH 7 내지 7.5, pH 7.1 내지 10, pH 7.1 내지 9.5, pH 7.1 내지 9, pH 7.1 내지 8.5, pH 7.1 내지 8, pH 7.1 내지 7.9, pH 7.1 내지 7.8, pH 7.1 내지 7.7, pH 7.1 내지 7.6, pH 7.1 내지 7.5, pH 7.2 내지 10, pH 7.2 내지 9.5, pH 7.2 내지 9, pH 7.2 내지 8.5, pH 7.2 내지 8, pH 7.2 내지 7.9, pH 7.2 내지 7.8, pH 7.2 내지 7.7, pH 7.2 내지 7.6, pH 7.2 내지 7.5, pH 7.3 내지 10, pH 7.3 내지 9.5, pH 7.3 내지 9, pH 7.3 내지 8.5, pH 7.3 내지 8, pH 7.3 내지 7.9, pH 7.3 내지 7.8, pH 7.3 내지 7.7, pH 7.3 내지 7.6, pH 7.3 내지 7.5, pH 7.4 내지 10, pH 7.4 내지 9.5, pH 7.4 내지 9, pH 7.4 내지 8.5, pH 7.4 내지 8, pH 7.4 내지 7.9, pH 7.4 내지 7.8, pH 7.4 내지 7.7, pH 7.4 내지 7.6, pH 7.4 내지 7.5, pH 7.5 내지 10, pH 7.5 내지 9.5, pH 7.5 내지 9, pH 7.5 내지 8.5, pH 7.5 내지 8, pH 7.5 내지 7.9, pH 7.5 내지 7.8, pH 7.5 내지 7.7, 또는 pH 7.5 내지 7.6의 pH 범위에서 말토테트라오스 전환 활성이 안정한 것일 수 있으며, 일예로 pH 7.5에서 말토테트라오스 전환 활성이 안정한 것일 수 있다.

본 발명의 일예에 따른 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri) 균주는, 40 내지 70℃, 40 내지 65℃, 40 내지 64℃, 40 내지 63℃, 40 내지 62℃, 40 내지 61℃, 40 내지 60℃, 45 내지 70℃, 45 내지 65℃, 45 내지 64℃, 45 내지 63℃, 45 내지 62℃, 45 내지 61℃, 45 내지 60℃, 50 내지 70℃, 50 내지 65℃, 50 내지 64℃, 50 내지 63℃, 50 내지 62℃, 50 내지 61℃, 50 내지 60℃, 55 내지 70℃, 55 내지 65℃, 55 내지 64℃, 55 내지 63℃, 55 내지 62℃, 55 내지 61℃, 55 내지 60℃, 56 내지 70℃, 56 내지 65℃, 56 내지 64℃, 56 내지 63℃, 56 내지 62℃, 56 내지 61℃, 56 내지 60℃, 57 내지 70℃, 57 내지 65℃, 57 내지 64℃, 57 내지 63℃, 57 내지 62℃, 57 내지 61℃, 57 내지 60℃, 58 내지 70℃, 58 내지 65℃, 58 내지 64℃, 58 내지 63℃, 58 내지 62℃, 58 내지 61℃, 58 내지 60℃, 59 내지 70℃, 59 내지 65℃, 59 내지 64℃, 59 내지 63℃, 59 내지 62℃, 59 내지 61℃, 또는 59 내지 60℃의 온도 범위에서 말토테트라오스 전환 활성이 안정한 것일 수 있으며, 일예로 60℃ 온도에서 말토테트라오스 전환 활성이 안정한 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일예는, 당류의 고형분 함량 100중량%를 기준으로, 말토테트라오스 함량이 30 내지 60중량%이 되도록 다당류로부터 말토테트라오스를 전환하는 활성을 가지는, 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri) 균주의 균체, 상기 균주가 생산하는 효소, 상기 균주의 배양물, 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 말토올리고당 함유 당류 제조용 조성물에 관한 것이다.

상기 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri) 균주는 전술한 바와 같다.

상기 말토올리고당 함유 당류는 전술한 바와 같다.

상기 배양물은 상기 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri) 균주로부터 생산된 효소를 포함하는 것으로, 상기 균주를 포함하거나, 균주를 포함하지 않는 cell-free 형태일 수 있다.

상기 파쇄물은 상기 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri) 균주를 파쇄한 파쇄물 또는 상기 파쇄물을 원심분리하여 얻어진 상등액을 의미하는 것으로, 상기 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri) 균주로부터 생산된 효소를 포함하는 것이다.

본 발명은 말토테트라오스 생산 활성이 현저히 증가한 변이 균주 및 상기 균주가 생산하는 효소를 제공하여, 종래의 말토테트라오스 생산방법 대비 효소 첨가량이 현저히 감소함에도 불구하고 동등한 수준의 말토테트라오스 함유 당류를 제조할 수 있는 방법을 제공 가능하다.

도 1은 본 발명의 일 예에 따른 말토테트라오스 생성 아밀라아제 효소를 이용하여 pH 5.5 조건에서 효소 반응 후 말토테트라오스가 생성된 것을 확인한 HPLC 분석 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 예에 따른 말토테트라오스 생성 아밀라아제 효소를 이용하여 pH 7.0 조건에서 효소 반응 후 말토테트라오스가 생성된 것을 확인한 HPLC 분석 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 예에 따른 돌연변이 균주의 말토테트라오스 생성효소의 활성 (Activity, U/ml) 그래프를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 예에 따른 돌연변이 균주의 배양 상등액을 SDS-PAGE 분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 예에 따른 연변이 균주의 말토올리고당 생산 효소의 반응 pH 별 말토테트라오스 생산량을 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 예에 따른 돌연변이 균주의 말토올리고당 생산 효소의 반응 온도 별 말토테트라오스 생산량을 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 예에 따른 돌연변이 균주의 말토테트라오스 생성효소의 저장기간 별 효소 활성을 나타낸 도면이다.
도 8는 기탁번호 KCCM12578P의 돌연변이 균주를 사용하여 생산한 말토올리고당의 HPLC 분석결과를 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 말토테트라오스 전환 활성을 갖는 야생주의 분리

(1) 균주 배양 및 분리

말토테트라오스를 생산하는 미생물을 탐색하기 위해 경기도 고양시, 성남시, 광주시 일대의 토양으로부터 시료를 채취하였다. 채취한 시료 1g을 0.85% NaCl 10mL에 현탁하고, 현탁액 100ul를 Nutrient agar plate (Seed 배지 Nutrient broth, 표 1)에 도말한 후 30℃에서 2~3일간 배양하였다. 고체배지에서 자란 콜로니 중에서 모양과 크기가 각기 다른 것을 선별하여 분리한 후 표 2에 따른 생산배지에 30℃에서 2~3일간 진탕배양 하였다. 상기 각 배지의 조성은 아래 표 1 및 표 2에 나타내었다.

조성	농도 (g/L)
Beef extract	10
Peptone	5
pH6.8, 30℃

조성	농도 (g/L)
Carbon source (200g/L)	10
Yeast extract	5
K2HPO4	1.4
KH2PO4	0.7
MgSO4 7H2O (100g/L)	0.1
CaCl2 (100g/L)	0.4
pH 7.0, 30℃

(2) 균주 선정

상기 (1)에서 배양된 미생물들을 각각 원심분리하여 상등액을 취하고, 이 상등액을 crude enzyme으로 사용하였다. 1% soluble starch를 기질로 사용하여 Crude enzyme으로 40℃에서 20분 동안 반응하였으며, 환원당 분석법(DNS method)과 HPLC 분석을 통해 생성된 amylase 역가(activity)를 확인하였다.

배양된 균주들 가운데 가장 활성이 높게 확인된 균주 2종을 선별하였다. 선별된 균주 2종에 대해 동정을 진행한 결과 각각 Pseudomonas stutzeri, 및 Pseuodmonas saccharophila 로 확인되었다. 이 중 배양 균체 농도와 효소 활성이 우수한 P. stutzeri를 대상으로 추후 실험을 진행하였다.

(3) 균주의 말토테트라오스 생산 확인

실시예 1의 (2)에서 Amylase 역가가 확인된 분리 균주 P. stutzeri 배양 상등액을 덱스트린과 반응하였을 때의 당조성과 말토테트라오스 생산성을 확인하기 위하여 다음과 같이 수행하였다.

구체적으로, Pseudomonas stutzeri 야생주를 배양하고 원심분리하여 배양 상등액을 회수하였다. 말토테트라오스 생산성을 확인하기 위하여 감자 전분을 기질로 사용하였으며, 100mM sodium phosphate buffer pH7.0과 McIlvaine buffer pH5.5에 각각 1% 농도로 가열하여 용해시켰다. 기질 500 μl에 효소 500μl를 첨가하여 50℃에서 반응하였으며 효소 첨가량은 기질 g 당 8 unit을 첨가하였다. 반응 결과는 HPLC 분석을 통해 확인하였으며 컬럼은 42A (Bio-rad)를 사용하였다.

HPLC 분석 결과, 효소 반응 20시간 후 pH에 상관없이 모두 말토테트라오스 (G4)를 생성함이 확인하였다. 구체적으로, pH 5.5 조건에서의 반응 결과 크로마토그램을 도 1에 나타내었고, 반응 결과 당조성을 표 3에 나타내었다. 또한, pH 7.0 조건에서의 반응 결과 크로마토그램을 도 2에 나타내었고, 반응 결과 당조성을 표 4에 나타내었다.

pH 5.5	G1~G2	G4	G3+
P. stutzeri 야생주	3.8	33.6	96.2

pH 7.2	G1~G2	G4	G3+
P. stutzeri 야생주	5.1	36.4	94.9

실시예 2: 돌연변이 균주의 제조

실시예 1에서 분리된 P. stutzeri 야생주(모균주)로부터 말토테트라오스를 특이적으로 많이 생산하는 G4 amylase 효소의 활성이 증가한 돌연변이 균주를 제조하였다.

(1) 모균주 배양 및 회수

P. stutzeri 야생주 또는 변이주의 glycerol stock을, soluble starch가 함유된 M9 minimal salt 액체배지에 접종 후 30℃에서 24간 동안 1차 배양하였다. 1차 배양액 50ul를 취하여 새로운 배지 3ml에 접종하고 30℃에서 12시간 동안 배양하였다. 배양액의 600nm에서의 흡광도를 측정하여 균체 농도를 확인하였고, 대수증식기에 도달하였을 때 효소 활성이 증가한 우수 돌연변이 균주를 선별하기 위해 균체를 회수하였다. 액체배양액을 원심분리(12,000rpm, 10분) 하여 균체만 회수하고, TM buffer (표 5)로 2회 세척하여 배지 성분을 제거하였다.

조성	농도 (g/L)
50mM Tris-HCl	7.9
8mM Magnesium sulfate	2.0
pH 7.2

(2) 돌연변이 유발

세척한 균체는 멸균증류수로 희석하여 M9 agar plate (표 6)에 100ul를 분주하여 도말하고 30℃에서 배양하였다. 균체를 도말한 평판배지로부터 15cm 간격을 두고 254nm 파장의 UV를 일정 시간(10~30초) 조사한 후 30℃에서 배양하며 콜로니가 자라는지 확인하였다.

조성		농도 (g/L)	첨가량 (ml)	최종농도 (g/L)
Soluble starch		400	5	2
10X M9 salt	Na2HPO4	60	100	-
	KH2PO4	30
	NaCl	5
	NH4Cl	10
MgSO47H2O		246	2	0.5
CaCl22H2O		147	0.1	0.015
Agar		20 g
DW		900 ml
pH 7.0~7.4, 30℃

(3) 콜로니 선별 및 배양

UV 조사 후 평판배지에서 자란 단일 콜로니를 선별하여 Starch agar plate에 접종하였다. 30℃에서 24시간 배양 후 amylase 역가를 확인하기 위해 콜로니가 자란 평판배지 표면에 Lugol's solution (표 7) 용액을 증류수와 3 : 7로 혼합 후 평판배지 위에 골고루 분사하였다. 효소의 역가가 높을수록 starch 분해능이 증가하여 clear zone의 직경이 크고 선명하게 확인되었다. 평판배지에서 선별된 균주는 생산배지 (표 8) 3ml이 분주된 14ml round bottom tube에 접종하여 30℃에서 3일간 배양하였다. 배양액 일부를 취하여 원심분리 후 상등액을 회수하고 DNS법을 이용하여 효소 활성을 최종 확인하였다. Test tube에서 1차 활성 측정 결과 모균주 보다 역가가 높은 균주를 starch agar plate에 도말하여 균주 안정화를 위한 단일 콜로니를 여러 개 선별하였다.

조성	농도 (g/100 ml)
Potassium iodide	10
Iodine crystal	5

조성	농도(g/L)
Dextrin(M040)	30
MgSO4·7H2O	0.5
Yeast extract (or C.S.L)	10
Casein peptone	0.5
NH4H2PO4	5
(NH4)2HC6H5O7	2.5
KH2PO4	1
CaCl2·2H2O	0.5
FeSO4·7H2O (5g/L stock)	0.005
ZnSO4·4H2O (1g/L stock)	0.001
pH 7.2~7.4

실시예 3: 돌연변이 균주의 G4-amylase 고생산 활성 확인

(1) G4-amylase 고생산 돌연변이 균주의 G4-amlyase 효소 활성 분석

-70℃에서 보관중인 실시예 3에서 선별된 돌연변이 균주의 glycerol stock 을 표 9에 따른 seed 배지에 50ul 접종하여 30℃에서 24시간 종배양 하였다. 생산배지 #3 (표 10) 40ml이 담긴 플라스크에 종배양액 3ml을 모두 접종하고 30℃에서 4일 간 본배양 하였다. 배양액의 균체 농도를 측정하고, 1ml 샘플링 후 원심분리 하여 (12,000rpm, 10분) DNS 방법으로 상등액의 G4 생성효소의 활성을 분석하였다. 그 결과를 표 11 및 도 3에 나타내었다. 표 11에서 알 수 있듯이, 돌연변이 균주의 활성 (Activity, U/ml)이 야생형 균주 대비 현저히 높았으며, 특히 Mutant E 돌연변이 균주는 야생형 균주 대비 30배 이상의 활성을 가짐을 알 수 있었다.

조성	농도 (g/L)
Dextrin	25
MgSO4·7H2O	0.5
Yeast extract	10
Casein peptone	0.5
NH4H2PO4	10
(NH4)2HC6H5O7	5
KH2PO4	1
CaCl2·2H2O	0.5
pH 7.2~7.4

조성	농도 (g/L)
덱스트린 (DE10~12)	30
MgSO4·7H2O	0.05
Yeast extract	10
Corn steep powder	10
Casein peptone	1
(NH4)H2PO4	5
K2HPO4	3
KH2PO4	1
CaCl2 2H2O (250 g/L stock)	0.5

Sample	Activity				Protein
	ΔAbs	Dilution	Glucose	U/ml	Abs(562nm)	Dilution	mg/ml
Wild type	0.237	100	25.1	13.94	0.29	10	3.3
Mutant A	0.721	100	65.3	36.25	0.299	10	3.5
Mutant B	0.633	500	289.8	160.98	0.241	20	4.7
Mutant C	0.405	1000	390.3	216.86	0.242	20	4.8
Mutant D	0.363	2000	711	394.99	0.245	20	4.9
Mutant E	0.433	2000	827.2	459.53	0.249	20	5.1

(2) 돌연변이 균주의 배양 상등액 단백질 농도 및 SDS-PAGE 분석

활성 분석 진행 균주와 동일한 배양액을 사용하여 분석을 진행하였으며, 본배양액 중 일부를 취하여 원심분리 후 상등액을 시료로 사용하였다. BCA 법을 이용하여 상등액 내의 단백질 농도를 측정하였다. 그 결과를 표 11에 나타내었다.

단백질 농도 측정 결과 확인 후 각 시료의 단백질 농도를 일정하게 맞추기 위해 증류수로 희석 한 후 SDS-PAGE 분석을 진행하였다. 10~16% gradient gel 판을 준비하고 샘플을 10ul loading 하였다. 135V로 30분 동안 전개시키고 gel을 회수하여 1시간 동안 staining buffer로 염색 시킨 후 24시간 이상 de-staining buffer에서 보관하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

상기 SDS-PAGE 분석 결과로부터, G4 생성효소 (G4 amylase)의 단백질 사이즈는 약 45~ 50 kDa 이었다. 효소 활성과 단백질 농도 분석 및 SDS-PAGE 결과를 토대로 개량이 진행될수록 (Mutant A~E) G4 amylase 단백질 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 야생주에서 돌연변이 균주 Mutant C의 G4 amylase 활성이 증가함에 따라 효소 발현량도 증가하는 추세를 보인 반면 8차 돌연변이 (Lane 5) Mutant D는 (lane 4) 균주 Mutant C 대비 G4 amylase 발현량은 크게 증가하지 않았으나 impurity 단백질의 발현이 줄어든 것을 확인하였다. 최종적으로 G4 생성효소의 활성이 가장 높은 균주 Mutant E를 선별하였으며, 이 균주를 Pseudomonas stutzeri SYC-G4 균주로 명명하여 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM12578P를 부여받았다.

실시예 4: 돌연변이주의 효소 분리 및 분석

(1) 야생주의 동정 및 효소 염기서열 분석

실시예 1에서 분리된 야생주의 16s rRNA의 서열은 서열번호 1에 나타냈다. 그 결과, Pseudomonas stutzeri CP002881와 98%의 상동성을 보여, Pseudomonas stutzeri 로 동정되었다.

균주	16s rRNA	서열번호
야생주	GCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGAAGAGAGCTTGCTCTCTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTATGGCAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGGCTAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGATCCTTGAGATCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAGCTCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTGGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGATAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTGTGGGGGGCACAGGTAGCCAGCAGAT	1

실시예 1에서 분리된 야생주의 말토테트라오스 생산효소에 대해 Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer)를 사용하여 genomic DNA 추출 후 G4-amylase 효소의 염기 서열을 분석하였다. 상기 분석된 야생주 효소의 염기서열을 NCBI에서 blast 한 결과 Pseudomonas stutzeri strain 19SMN4와 약 97%의 상동성을 보였다.

(2) 변이주의 효소 서열 분석

실시예 2에서 제조된 변이주들에서 얻어진 G4-amylase 효소의 염기서열 또는 아미노산 서열에 변화를 확인하기 위하여 Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer)를 사용하여, genomic DNA 추출 후 G4-amylase 효소의 염기 서열을 분석하였다 (표 13).

구분		효소서열	서열번호
Wild type	염기서열	TGTGTCCGTCGTTCGCGAGCGCCCAACGACTGGTACAACATCCTCCGCCAACAGGCCTCGACCATCGCTGCCGACGGCTTCTCGTCAATCTGGATGCCGGTGCCCTGGCGTGACTTCTCCAGCTGGAGCGAAGGCGGCAAGTCCGGCGGCGGCGAAGGTTACTTCTGGCACGACTTCAACAAGAACGGCCGCTATGGCAGCGATGCCCAGCTGCGCCAGGCCGCCGGGGCGCTGGGTGGTGCCGGGGTGAAGGTGCTCTACGACGTGGTGCCCAACCACATGAACCGCGGCTACCCGAACAAGGAAATCAACCTGCCGGCCGGTCAGGGCTTCTGGCGCAACGACTGCGCCGATCCGGGCAATTATCCCAATGACTGCGACGACGGCGACCGTTTCGTCGGCGGCGATGCAGACCTCAACACCAGCCATCCGCAGGTCTACGGCATGTTCCGCGACGAGTTCGCCAATCTGCGCAGCCAGTACGGCGCCGGCGGTTTTCGCTTCGATTTTGTTCGCGGCTTCGCACCGGAGCGGGTCAACAGCTGGATGACCGACAGTGCCGACAACAGCTTCTGCGTCGGCGAGCTGTGGAAAGGTCCCTCGGAATACCCGAGCTGGGACTGGCGCAACACCGCCAGCTGGCAGCAGATCATCAAGGACTGGTCCGATCGGGCCAAGTGCCCGGTGTTCGACTTCGCCCTCAAGGAGCGCATGCAGAACGGCTCGATCGCCGACTGGAAGAACGGGCTGAATGGCAACCCGAACCCGCGCTGGCGCGAGGTGGCGGTGACCTTTGTCGACAACCACGACACCGGCTACTCGCCTGGGCAGAACGGCGGGCAGCACCACTGGGCGCTGCAGGACGGGCTGATCCGTCAGGCCTACGCCTACATCCTCACCAGCCCCGGCACGCCGGTGGTGTACTGGTCGCACATGTACGACTGGGGCTACGGTGACTTCATCCGCCAGCTGATTCAGGTGCGTCGCGCCGCTGGCGTGCGTGCCGATTCGGCGATCAGCTTCCACAGCGGCTACAGCGGCCTGGTCGCCACCGTCAGCGGAACCCAGCAAACCCTGGTGGTGGCGCTCAACTCCAACCTGAGCAATCCCGGCCAGGTCGCCAGCGGCAGCTTCAGCGAGGCGGTCAATGCCAGCAACGGGCAGGTGCGGGTATGGCGCAGCGGCGCTGGGAGCGGTGGCGATAACGGTGGTGGTGAGCCCGGCGCCTTGGTCAGCGTCAACTTCCGCTGCGACAACGGCGTGACGCAGCCCGGCGATAGCGTCTACGCGGCCGGTAACGTCAGCCAGCTTGGCAACTGGAGCCCAACATCGGCCGTGCGCCTGACCGATACCAGCGGCTACCCGACCTGAAAGGCAGCATCTCGTTGCCGCCC	2
	아미노산	RQQASTIAADGFSSIWMPVPWRDFSSWSEGGKSGGGEGYFWHDFNKNGRYGSDAQLRQAAGALGGAGVKVLYDVVPNHMNRGYPNKEINLPAGQGFWRNDCADPGNYPNDCDDGDRFVGGDADLNTSHPQVYGMFRDEFANLRSQYGAGGFRFDFVRGFAPERVNSWMTDSADNSFCVGELWKGPSEYPSWDWRNTASWQQIIKDWSDRAKCPVFDFALKERMQNGSIADWKNGLNGNPNPRWREVAVTFVDNHDTGYSPGQNGGQHHWALQDGLIRQAYAYILTSPGTPVVYWSHMYDWGYGDFIRQLIQVRRAAGVRADSAISFHSGYSGLVATVSGTQQTLVVALNSNLSNPGQVASGSFSEAVNASNGQVRVWRSGAGSGGDNGGGEPGALVSVNFRCDNGVTQPGDSVYAAGNVSQLGNWSPTSAVRLTDTSGYPT	3
Mutant A	염기서열	ACGGTGGTAGTCGTCGCGAGCGCCCACGACTGGTACAACATCCTCCGCCAACAGGCCTCGACCATCGCTGCCGACGGCTTCTCGTCAATCTGGATGCCGGTGCCCTGGCGTGACTTCTCCAGCTGGAGCGAAGGCGGCAAGTCCGGCGGCGGCGAAGGTTACTTCTGGCACGACTTCAACAAGAACGGCCGCTATGGCAGCGATGCCCAGCTGCGCCAGGCCGCCGGGGCGCTGGGTGGTGCCGGGGTGAAGGTGCTCTACGACGTGGTGCCCAACCACATGAACCGCGGCTACCCGAACAAGGAAATCAACCTGCCGGCCGGTCAGGGCTTCTGGCGCAACGACTGCGCCGATCCGGGCAATTATCCCAATGACTGCGACGACGGCGACCGTTTCGTCGGCGGCGATGCAGACCTCAACACCAGCCATCCGCAGGTCTACGGCATGTTCCGCGACGAGTTCGCCAATCTGCGCAGCCAGTACGGCGCCGGCGGTTTTCGCTTCGATTTTGTTCGCGGCTTCGCACCGGAGCGGGTCAACAGCTGGATGACCGACAGTGCCGACAACAGCTTCTGCGTCGGCGAGCTGTGGAAAGGTCCCTCGGAATACCCGAGCTGGGACTGGCGCAACACCGCCAGCTGGCAGCAGATCATCAAGGACTGGTCCGATCGGGCCAAGTGCCCGGTGTTCGACTTCGCCCTCAAGGAGCGCATGCAGAACGGCTCGATCGCCGACTGGAAGAACGGGCTGAATGGCAACCCGAACCCGCGCTGGCGCGAGGTGGCGGTGACCTTTGTCGACAACCACGACACCGGCTACTCGCCTGGGCAGAACGGCGGGCAGCACCACTGGGCGCTGCAGGACGGGCTGATCCGTCAGGCCTACGCCTACATCCTCACCAGCCCCGGCACGCCGGTGGTGTACTGGTCGCACATGTACGACTGGGGCTACGGTGACTTCATCCGCCAGCTGATTCAGGTGCGTCGCGCCGCTGGCGTGCGTGCCGATTCGGCGATCAGCTTCCACAGCGGCTACAGCGGCCTGGTCGCCACCGTCAGCGGAACCCAGCAAACCCTGGTGGTGGCGCTCAACTCCAACCTGAGCAATCCCGGCCAGGTCGCCAGCGGCAGCTTCAGCGAGGCGGTCAATGCCAGCAACGGGCAGGTGCGGGTATGGCGCAGCGGCGCTGGGAGCGGTGGCGATAACGGTGGTGGTGAGCCCGGCGCCTTGGTCAGCGTCAACTTCCGCTGCGACAACGGCGTGACGCAGCCCGGCGATAGCGTCTACGCGGCCGGTAACGTCAGCCAGCTTGGCAACTGGAGCCCAACATCGGCCGTGCGCCTGACCGATACCAGCGGCTACCCGACCTGAAAGGCAGCTCTCGTGTTCGCTTTT	4
	아미노산	RQQASTIAADGFSSIWMPVPWRDFSSWSEGGKSGGGEGYFWHDFNKNGRYGSDAQLRQAAGALGGAGVKVLYDVVPNHMNRGYPNKEINLPAGQGFWRNDCADPGNYPNDCDDGDRFVGGDADLNTSHPQVYGMFRDEFANLRSQYGAGGFRFDFVRGFAPERVNSWMTDSADNSFCVGELWKGPSEYPSWDWRNTASWQQIIKDWSDRAKCPVFDFALKERMQNGSIADWKNGLNGNPNPRWREVAVTFVDNHDTGYSPGQNGGQHHWALQDGLIRQAYAYILTSPGTPVVYWSHMYDWGYGDFIRQLIQVRRAAGVRADSAISFHSGYSGLVATVSGTQQTLVVALNSNLSNPGQVASGSFSEAVNASNGQVRVWRSGAGSGGDNGGGEPGALVSVNFRCDNGVTQPGDSVYAAGNVSQLGNWSPTSAVRLTDTSGYPT	5
Mutant B	염기서열	CCACTTCAGTCGTCCGCGAGCGCCACGACTGGTACAACATCCCTC C CGCCAACAGGCCTCGACCATCGCTGCCGACGGCTTCTCGTCAATCTGGATGCCGGTGCCCTGGCGTGACTTCTCCAGCTGGAGCGAAGGCGGCAAGTCCGGCGGCGGCGAAGGTTACTTCTGGCACGACTTCAACAAGAACGGCCGCTATGGCAGCGATGCCCAGCTGCGCCAGGCCGCCGGGGCGCTGGGTGGTGCCGGGGTGAAGGTGCTCTACGACGTGGTGCCCAACCACATGAACCGCGGCTACCCGAACAAGGAAATCAACCTGCCGGCCGGTCAGGGCTTCTGGCGCAACGACTGCGCCGATCCGGGCAATTATCCCAATGACTGCGACGACGGCGACCGTTTCGTCGGCGGCGATGCAGACCTCAACACCAGCCATCCGCAGGTCTACGGCATGTTCCGCGACGAGTTCGCCAATCTGCGCAGCCAGTACGGCGCCGGCGGTTTTCGCTTCGATTTTGTTCGCGGCTTCGCACCGGAGCGGGTCAACAGCTGGATGACCGACAGTGCCGACAACAGCTTCTGCGTCGGCGAGCTGTGGAAAGGTCCCTCGGAATACCCGAGCTGGGACTGGCGCAACACCGCCAGCTGGCAGCAGATCATCAAGGACTGGTCCGATCGGGCCAAGTGCCCGGTGTTCGACTTCGCCCTCAAGGAGCGCATGCAGAACGGCTCGATCGCCGACTGGAAGAACGGGCTGAATGGCAACCCGAACCCGCGCTGGCGCGAGGTGGCGGTGACCTTTGTCGACAACCACGACACCGGCTACTCGCCTGGGCAGAACGGCGGGCAGCACCACTGGGCGCTGCAGGACGGGCTGATCCGTCAGGCCTACGCCTACATCCTCACCAGCCCCGGCACGCCGGTGGTGTACTGGTCGCACATGTACGACTGGGGCTACGGTGACTTCATCCGCCAGCTGATTCAGGTGCGTCGCGCCGCTGGCGTGCGTGCCGATTCGGCGATCAGCTTCCACAGCGGCTACAGCGGCCTGGTCGCCACCGTCAGCGGAACCCAGCAAACCCTGGTGGTGGCGCTCAACTCCAACCTGAGCAATCCCGGCCAGGTCGCCAGCGGCAGCTTCAGCGAGGCGGTCAATGCCAGCAACGGGCAGGTGCGGGTATGGCGCAGCGGCGCTGGGAGCGGTGGCGATAACGGTGGTGGTGAGCCCGGCGCCTTGGTCAGCGTCAACTTCCGCTGCGACAACGGCGTGACGCAGCCCGGCGATAGCGTCTACGCGGCCGGTAACGTCAGCCAGCTTGGCAACTGGAGCCCAACATCGGCCGTGCGCCTGACCGGATACCAGCGGCTACCCGACCTGAAAGGCAGCATCTC	6
	아미노산	RQQASTIAADGFSSIWMPVPWRDFSSWSEGGKSGGGEGYFWHDFNKNGRYGSDAQLRQAAGALGGAGVKVLYDVVPNHMNRGYPNKEINLPAGQGFWRNDCADPGNYPNDCDDGDRFVGGDADLNTSHPQVYGMFRDEFANLRSQYGAGGFRFDFVRGFAPERVNSWMTDSADNSFCVGELWKGPSEYPSWDWRNTASWQQIIKDWSDRAKCPVFDFALKERMQNGSIADWKNGLNGNPNPRWREVAVTFVDNHDTGYSPGQNGGQHHWALQDGLIRQAYAYILTSPGTPVVYWSHMYDWGYGDFIRQLIQVRRAAGVRADSAISFHSGYSGLVATVSGTQQTLVVALNSNLSNPGQVASGSFSEAVNASNGQVRVWRSGAGSGGDNGGGEPGALVSVNFRCDNGVTQPGDSVYAAGNVSQLGNWSPTSAVRLTGYQRLPD	7
Mutant C	염기서열	GCCGTTGTCGTCGCGAGCGCCCAACGACTGGTACAACATCCTCCGCCAACAGGCCTCGACCATCGCTGCCGACGGCTTCTCGTCAATCTGGATGCCGGTGCCCTGGCGTGACTTCTCCAGCTGGAGCGAAGGCGGCAAGTCCGGCGGCGGCGAAGGTTACTTCTGGCACGACTTCAACAAGAACGGCCGCTATGGCAGCGATGCCCAGCTGCGCCAGGCCGCCGGGGCGCTGGGTGGTGCCGGGGTGAAGGTGCTCTACGACGTGGTGCCCAACCACATGAACCGCGGCTACCCGAACAAGGAAATCAACCTGCCGGCCGGTCAGGGCTTCTGGCGCAACGACTGCGCCGATCCGGGCAATTATCCCAATGACTGCGACGACGGCGACCGTTTCGTCGGCGGCGATGCAGACCTCAACACCAGCCATCCGCAGGTCTACGGCATGTTCCGCGACGAGTTCGCCAATCTGCGCAGCCAGTACGGCGCCGGCGGTTTTCGCTTCGATTTTGTTCGCGGCTTCGCACCGGAGCGGGTCAACAGCTGGATGACCGACAGTGCCGACAACAGCTTCTGCGTCGGCGAGCTGTGGAAAGGTCCCTCGGAATACCCGAGCTGGGACTGGCGCAACACCGCCAGCTGGCAGCAGATCATCAAGGACTGGTCCGATCGGGCCAAGTGTCCGGTGTTCGACTTCGCCCTCAAGGAGCGCATGCAGAACGGCTCGATCGCCGACTGGAAGAACGGGCTGAATGGCAACCCGAACCCGCGCTGGCGCGAGGTGGCGGTGACCTTTGTCGACAACCACGACACCGGCTACTCGCCTGGGCAGAACGGCGGGCAGCACCACTGGGCGCTGCAGGACGGGCTGATCCGTCAGGCCTACGCCTACATCCTCACCAGCCCCGGCACGCCGGTGGTGTACTGGTCGCACATGTACGACTGGGGCTACGGTGACTTCATCCGCCAGCTGATTCAGGTGCGTCGCGCCGCTGGCGTGCGTGCCGATTCGGCGATCAGCTTCCACAGCGGCTACAGCGGCCTGGTCGCCACCGTCAGCGGAACCCAGCAAACCCTGGTGGTGGCGCTCAACTCCAACCTGAGCAATCCCGGCCAGGTCGCCAGCGGCAGCTTCAGCGAGGCGGTCAATGCCAGCAACGGGCAGGTGCGGGTATGGCGCAGCGGCGCTGGGAGCGGTGGCGATAACGGTGGTGGTGAGCCCGGCGCCTTGGTCAGCGTCAACTTCCGCTGCGACAACGGCGTGACGCAGCCCGGCGATAGCGTCTACGCGGCCGGTAACGTCAGCCAGCTTGGCAACTGGAGCCCAACATCGGCCGTGCGCCTGACCGATACCAGCGGCTACCCGACCTGAAAGGCACCTCTCGCGCAGCTAC	8
	아미노산	RQQASTIAADGFSSIWMPVPWRDFSSWSEGGKSGGGEGYFWHDFNKNGRYGSDAQLRQAAGALGGAGVKVLYDVVPNHMNRGYPNKEINLPAGQGFWRNDCADPGNYPNDCDDGDRFVGGDADLNTSHPQVYGMFRDEFANLRSQYGAGGFRFDFVRGFAPERVNSWMTDSADNSFCVGELWKGPSEYPSWDWRNTASWQQIIKDWSDRAKCPVFDFALKERMQNGSIADWKNGLNGNPNPRWREVAVTFVDNHDTGYSPGQNGGQHHWALQDGLIRQAYAYILTSPGTPVVYWSHMYDWGYGDFIRQLIQVRRAAGVRADSAISFHSGYSGLVATVSGTQQTLVVALNSNLSNPGQVASGSFSEAVNASNGQVRVWRSGAGSGGDNGGGEPGALVSVNFRCDNGVTQPGDSVYAAGNVSQLGNWSPTSAVRLTDTSGYPT	9
Mutant D	염기서열	CAAGGTAGTCGTCGCGAGCGCCCAACGACTGGTACAACATCCTCCGCCAACAGGCCTCGACCATCGCTGCCGACGGCTTCTCGTCAATCTGGATGCCGGTGCCCTGGCGTGACTTCTCCAGCTGGAGCGAAGGCGGCAAGTCCGGCGGCGGCGAAGGTTACTTCTGGCACGACTTCAACAAGAACGGCCGCTATGGCAGCGATGCCCAGCTGCGCCAGGCCGCCGGGGCGCTGGGTGGTGCCGGGGTGAAGGTGCTCTACGACGTGGTGCCCAACCACATGAACCGCGGCTACCCGAACAAGGAAATCAACCTGCCGGCCGGTCAGGGCTTCTGGCGCAACGACTGCGCCGATCCGGGCAATTATCCCAATGACTGCGACGACGGCGACCGTTTCGTCGGCGGCGATGCAGACCTCAACACCAGCCATCCGCAGGTCTACGGCATGTTCCGCGACGAGTTCGCCAATCTGCGCAGCCAGTACGGCGCCGGCGGTTTTCGCTTCGATTTTGTTCGCGGCTTCGCACCGGAGCGGGTCAACAGCTGGATGACCGACAGTGCCGACAACAGCTTCTGCGTCGGCGAGCTGTGGAAAGGTCCCTCGGAATACCCGAGCTGGGACTGGCGCAACACCGCCAGCTGGCAGCAGATCATCAAGGACTGGTCCGATCGGGCCAAGTGTCCGGTGTTCGACTTCGCCCTCAAGGAGCGCATGCAGAACGGCTCGATCGCCGACTGGAAGAACGGGCTGAATGGCAACCCGAACCCGCGCTGGCGCGAGGTGGCGGTGACCTTTGTCGACAACCACGACACCGGCTACTCGCCTGGGCAGAACGGCGGGCAGCACCACTGGGCGCTGCAGGACGGGCTGATCCGTCAGGCCTACGCCTACATCCTCACCAGCCCCGGCACGCCGGTGGTGTACTGGTCGCACATGTACGACTGGGGCTACGGTGACTTCATCCGCCAGCTGATTCAGGTGCGTCGCGCCGCTGGCGTGCGTGCCGATTCGGCGATCAGCTTCCACAGCGGCTACAGCGGCCTGGTCGCCACCGTCAGCGGAACCCAGCAAACCCTGGTGGTGGCGCTCAACTCCAACCTGAGCAATCCCGGCCAGGTCGCCAGCGGCAGCTTCAGCGAGGCGGTCAATGCCAGCAACGGGCAGGTGCGGGTATGGCGCAGCGGCGCTGGGAGCGGTGGCGATAACGGTGGTGGTGAGCCCGGCGCCTTGGTCAGCGTCAACTTCCGCTGCGACAACGGCGTGACGCAGCCCGGCGATAGCGTCTACGCGGCCGGTAACGTCAGCCAGCTTGGCAACTGGAGCCCAACATCGGCCGTGCGCCTGACCGATACCAGCGGCTACCCGACCTGAAAGCAGCTCTCGTGTTCACCTC	10
	아미노산	RQQASTIAADGFSSIWMPVPWRDFSSWSEGGKSGGGEGYFWHDFNKNGRYGSDAQLRQAAGALGGAGVKVLYDVVPNHMNRGYPNKEINLPAGQGFWRNDCADPGNYPNDCDDGDRFVGGDADLNTSHPQVYGMFRDEFANLRSQYGAGGFRFDFVRGFAPERVNSWMTDSADNSFCVGELWKGPSEYPSWDWRNTASWQQIIKDWSDRAKCPVFDFALKERMQNGSIADWKNGLNGNPNPRWREVAVTFVDNHDTGYSPGQNGGQHHWALQDGLIRQAYAYILTSPGTPVVYWSHMYDWGYGDFIRQLIQVRRAAGVRADSAISFHSGYSGLVATVSGTQQTLVVALNSNLSNPGQVASGSFSEAVNASNGQVRVWRSGAGSGGDNGGGEPGALVSVNFRCDNGVTQPGDSVYAAGNVSQLGNWSPTSAVRLTDTSGYPT	11
Mutant E	염기서열	CCCGTTAGTCGTCCGCGAGCGCCCACGACTGGTACAACATCCTCCGCCAACAGGCCTCGACCATCGCTGCCGACGGCTTCTCGTCAATCTGGATGCCGGTGCCCTGGCGTGACTTCTCCAGCTGGAGCGAAGGCGGCAAGTCCGGCGGCGGCGAAGGTTACTTCTGGCACGACTTCAACAAGAACGGCCGCTATGGCAGCGATGCCCAGCTGCGCCAGGCCGCCGGGGCGCTGGGTGGTGCCGGGGTGAAGGTGCTCTACGACGTGGTGCCCAACCACATGAACCGCGGCTACCCGAACAAGGAAATCAACCTGCCGGCCGGTCAGGGCTTCTGGCGCAACGACTGCGCCGATCCGGGCAATTATCCCAATGACTGCGACGACGGCGACCGTTTCGTCGGCGGCGATGCAGACCTCAACACCAGCCATCCGCAGGTCTACGGCATGTTCCGCGACGAGTTCGCCAATCTGCGCAGCCAGTACGGCGCCGGCGGTTTTCGCTTCGATTTTGTTCGCGGCTTCGCACCGGAGCGGGTCAACAGCTGGATGACCGACAGTGCCGACAACAGCTTCTGCGTCGGCGAGCTGTGGAAAGGTCCCTCGGAATACCCGAGCTGGGACTGGCGCAACACCGCCAGCTGGCAGCAGATCATCAAGGACTGGTCCGATCGGGCCAAGTGTCCGGTGTTCGACTTCGCCCTCAAGGAGCGCATGCAGAACGGCTCGATCGCCGACTGGAAGAACGGGCTGAATGGCAACCCGAACCCGCGCTGGCGCGAGGTGGCGGTGACCTTTGTCGACAACCACGACACCGGCTACTCGCCTGGGCAGAACGGCGGGCAGCACCACTGGGCGCTGCAGGACGGGCTGATCCGTCAGGCCTACGCCTACATCCTCACCAACCCCGGCACGCCTGTGGTGTACTGGTCGCACATGTACAACTGGGGCTACAGTGACTTCATCCGCCAGCTGATTCAGGTGCGTCCCGCCGCTGGCGTGCATGCCGATTCGGCGATCAACTTCCACAGCGGCTACAACGGCCTGGTCGGCACCGTCATCGGAACCCAGCAAACCCTGGTGGTGGCGCTCAACTCCAACCTGAGCAATCCCGGCCAGGTCGCCAGCGGCAGCTTCAGCGAGGCGGTCAATGCCAGCAACGGGCAGGTGCGGGTATGGCGCAGCGGCGCTGGGAGCGGTGGCGATAACGGTGGTGGTGAGCCCGGCGCCTTGGTCAGCGTCAACTTCCGCTGCGACAACGGCGTGACGCAGCCCGGCGATAGCGTCTACGCGGCCGGTAACGTCAGCCAGCTTGGCAACTGGAGCCCAACATCGGCCGTGCGCCTGACCGGATACCAGCGGCTACCCGACCTGAAAGGCAGCATCTCGCGTAGCTTC	12
	아미노산	RQQASTIAADGFSSIWMPVPWRDFSSWSEGGKSGGGEGYFWHDFNKNGRYGSDAQLRQAAGALGGAGVKVLYDVVPNHMNRGYPNKEINLPAGQGFWRNDCADPGNYPNDCDDGDRFVGGDADLNTSHPQVYGMFRDEFANLRSQYGAGGFRFDFVRGFAPERVNSWMTDSADNSFCVGELWKGPSEYPSWDWRNTASWQQIIKDWSDRAKCPVFDFALKERMQNGSIADWKNGLNGNPNPRWREVAVTFVDNHDTGYSPGQNGGQHHWALQDGLIRQAYAYILTNPGTPVVYWSHMYNWGYSDFIRQLIQVRPAAGVHADSAINFHSGYNGLVGTVIGTQQTLVVALNSNLSNPGQVASGSFSEAVNASNGQVRVWRSGAGSGGDNGGGEPGALVSVNFRCDNGVTQPGDSVYAAGNVSQLGNWSPTSAVRLTGYQRLPD	13

Pseudomonas stutzeri SYC-G4 균주의 경우 야생주와 7개의 아미노산 서열이 차이가 있었다. 따라서 서열이 바뀐 site가 G4 생산 효소의 활성 또는 기질 특이성에 영향을 줄 것으로 판단되며 돌연변이 과정을 거치면서 서열이 변하였음을 확인하였다.

실시예 6: 돌연변이 효소의 특성 확인

돌연변이를 통해 제조한 Pseudomonas stutzeri SYC-G4 균주를 배양하여 G4 생성효소의 특성을 분석하였다.

(1) 최적 pH 분석

효소의 최적 pH 확인하고자 20mM sodium phosphate를 사용하여 pH 5.8, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0 구간에서 G4함량 최대인 구간을 선정하였다. 기질은 DE 8~10의 덱스트린을 30Brix~ 35Brx 농도로 하여 사용하였으며, 효소량은 기질의 고형분 1g당 15 uni을 첨가해 50℃에서 2시간 반응하여 말토테트라오스 생산량을 확인하였다. 반응 pH별 G4 생산량을 나타낸 결과를 도 5에 나타내었다. 그 결과, 효소의 최적 pH를 분석하기 위하여 pH 5.8 내지 8.0 구간에서 초기반응 2시간 반응시 pH 7 내지 8 구간에서 최적 활성을 가지며, 특히 pH 7.5에서 가장 높은 활성을 가짐을 확인하였다.

pH	말토테트라오스 전환율 (%)
5.8	37.22
6	38.79
6.5	39.77
7	40.26
7.5	40.73
8	40.44

(2) 최적 온도 분석

말토테트라오스 생산에 적절한 반응 온도를 확인하기 위하여 20mM sodium phosphate buffer를 pH5.8로 적정하고 DE8~10의 덱스트린을 30Brix~ 35Brx 농도로 용해하였다. 효소 반응은 50℃와 60℃에서 실시하였으며, 50℃ 및 60℃ 모두에서 말토테트라오스를 생산 가능하였고, 60℃에서 더 많은 함량의 말토테트라오스를 생산하는 것을 확인하였다 (도 6).

	50℃ (%)	60℃ (%)	50℃ 대비 60℃에서의 G4 함량 (배)
3hr	41.7	47.97	1.15
4hr	46.41	49.93	1.08
5hr	47.57	50.66	1.06
6hr	49.75	51.34	1.03
7hr	50.46	52.5	1.04

실시예 7: 돌연변이 효소의 분말화

Pseudomonas stutzeri SYC-G4를 배양하여 활성 890 U/ml의 상등액을 확보하고 2,107U/ml 까지 농축하였다. 농축 효소는 Spray dryer (BUCHI Mini spray dryer B-191)를 사용하여 효소 분말화를 진행하였고, 분말화 전과 후의 효소 활성 확인 및 저장 온도별 안정성을 확인하였다.

(1) 분말화 효소의 활성 측정

농축 후 활성 2,107U/ml를 나타내는 액상효소를 분말화 했을 때 분말효소 g당 22,000unit 정도의 활성을 확인하였다 (표 16).

구분	활성(U/ml)	분말효소 활성(U/g)
액상효소	890	9,245
농축효소	2,107	22,120

(2) 분말화 효소의 온도별 안정성

분말화된 Pseudomonas stutzeri SYC-G4 유래 G4 효소를 각각 온도 8℃, 16℃, 25℃, 또는 35℃에 보관하며 실험을 진행하였다. 시간 경과에 따라 효소의 활성(DNS효소 활성측정법)을 측정하였다. 분말효소의 활성 측정 시 분말효소 0.05g을 취하여 0.5ml 50mM sodium phosphate buffer(pH7.0)로 re-suspension 시켰다. 그 결과, 분말화 한 G4 생성효소의 경우 각 온도 (8℃, 16℃, 25℃, 또는 35℃)에서 20주 이상의 저장기간 동안 안정적인 효소의 활성 유지 결과를 확보하였다 (도 7). 따라서, 분말화 했을 때 장기간 효소의 안정적 보관 및 유통을 위해 효소의 분말화 적용 바람직한 것으로 확인 되었다.

실시예 8: 말토올리고당 시럽 생산

UV 돌연변이 균주 Pseudomonas stutzeri SYC-G4를 사용하여 말토테트라오스 (G4)가 고함유된 말토올리고당시럽을 제조하였다. 최종 제품의 색가 및 단당류, 이당류 함량이 7% 미만이 되도록 하는 당조성을 고려하여 효소 첨가량을 정하고, 반응 후 시럽의 당조성을 확인하였다.

기질은 말토덱스트린 (DE8-10)을 사용하였으며, 반응 초기 pH는 6.2가 되도록 0.5N NaOH로 적정하였다. 상기 말토덱스트린은 고형분 함량 35중량%의 용액이었다. 효소량은 기질의 고형분 중량 (g) 대비 10 unit을 첨가하여 60℃에서 효소반응을 진행하였다. 반응시간 기준 16~20시간 내 효소 사용량 7.5 내지 10 U/g 사용시 적합하며 효소 사용량 높을수록 색가가 높아짐을 확인하였다.

효소반응 결과는 HPLC를 사용하였으며 G4 올리고당 함량이 45 내지 50% 이상일 때 단당류, 이당류의 함량이 6 내지 10% 미만으로 확인되었으며, 야생주 대비 효소 첨가량이 30배 감소하였다 (도 8 및 표 17).

균주	함량(%)
	G1~G2	G4	G3~G7
Pseudomonas stutzeri SYC-G4	6.7	50.8	60.3
야생주	5.1	48.2	63.5

균주 돌연변이를 통해 말토테트라오스 생산 효소의 활성은 증가하였으나 덱스트린에 효소를 첨가하여 시럽을 생산하였을 때 야생주와 최종 선별주간의 올리고당 및 단당류 이당류의 조성은 크게 변하지 않는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명에서 돌연변이를 통해 획득한 균주를 통해 효소 원가를 절감을 기대할 수 있다.

한국미생물보존센터(국외) KCCM12578P 20190827

<110> SAMYANG CORPORATION <120> Method of producing saccharide comprising malto oligosaccharides <130> DPP20193567KR <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1451 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16s rRNA of Pseudomonas stutzeri <400> 1 gctcagattg aacgctggcg gcaggcctaa cacatgcaag tcgagcggat gaagagagct 60 tgctctctga ttcagcggcg gacgggtgag taatgcctag gaatctgcct attagtgggg 120 gacaacgttt cgaaaggaac gctaataccg catacgtcct acgggagaaa gcaggggacc 180 ttcgggcctt gcgctaatag atgagcctag gtcggattag ctagttggtg aggtaaaggc 240 tcaccaaggc gacgatccgt aactggtctg agaggatgat cagtcacact ggaactgaga 300 cacggtccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tggacaatgg gcgaaagcct 360 gatccagcca tgccgcgtgt gtgaagaagg tcttcggatt gtaaagcact ttaagttggg 420 aggaagggca gtaagttaat accttgctgt tttgacgtta ccgacagaat aagcaccggc 480 taacttcgtg ccagcagccg cggtaatacg aagggtgcaa gcgttaatcg gaattactgg 540 gcgtaaagcg cgcgtaggtg gttcgttaag ttggatgtga aagccccggg ctcaacctgg 600 gaactgcatc caaaactggc gagctagagt atggcagagg 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Thr Ser Pro Gly 275 280 285 Thr Pro Val Val Tyr Trp Ser His Met Tyr Asp Trp Gly Tyr Gly Asp 290 295 300 Phe Ile Arg Gln Leu Ile Gln Val Arg Arg Ala Ala Gly Val Arg Ala 305 310 315 320 Asp Ser Ala Ile Ser Phe His Ser Gly Tyr Ser Gly Leu Val Ala Thr 325 330 335 Val Ser Gly Thr Gln Gln Thr Leu Val Val Ala Leu Asn Ser Asn Leu 340 345 350 Ser Asn Pro Gly Gln Val Ala Ser Gly Ser Phe Ser Glu Ala Val Asn 355 360 365 Ala Ser Asn Gly Gln Val Arg Val Trp Arg Ser Gly Ala Gly Ser Gly 370 375 380 Gly Asp Asn Gly Gly Gly Glu Pro Gly Ala Leu Val Ser Val Asn Phe 385 390 395 400 Arg Cys Asp Asn Gly Val Thr Gln Pro Gly Asp Ser Val Tyr Ala Ala 405 410 415 Gly Asn Val Ser Gln Leu Gly Asn Trp Ser Pro Thr Ser Ala Val Arg 420 425 430 Leu Thr Asp Thr Ser Gly Tyr Pro Thr 435 440 <210> 10 <211> 1392 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pseudomonas stutzeri Mutant D <400> 10 caaggtagtc gtcgcgagcg cccaacgact ggtacaacat cctccgccaa caggcctcga 60 ccatcgctgc cgacggcttc tcgtcaatct ggatgccggt gccctggcgt gacttctcca 120 gctggagcga aggcggcaag tccggcggcg gcgaaggtta cttctggcac gacttcaaca 180 agaacggccg ctatggcagc gatgcccagc tgcgccaggc cgccggggcg ctgggtggtg 240 ccggggtgaa ggtgctctac gacgtggtgc ccaaccacat gaaccgcggc tacccgaaca 300 aggaaatcaa cctgccggcc ggtcagggct tctggcgcaa cgactgcgcc gatccgggca 360 attatcccaa tgactgcgac gacggcgacc gtttcgtcgg cggcgatgca gacctcaaca 420 ccagccatcc gcaggtctac ggcatgttcc gcgacgagtt cgccaatctg cgcagccagt 480 acggcgccgg cggttttcgc ttcgattttg ttcgcggctt cgcaccggag cgggtcaaca 540 gctggatgac cgacagtgcc gacaacagct tctgcgtcgg cgagctgtgg aaaggtccct 600 cggaataccc gagctgggac tggcgcaaca ccgccagctg gcagcagatc atcaaggact 660 ggtccgatcg ggccaagtgt ccggtgttcg acttcgccct caaggagcgc atgcagaacg 720 gctcgatcgc cgactggaag aacgggctga atggcaaccc gaacccgcgc tggcgcgagg 780 tggcggtgac ctttgtcgac aaccacgaca ccggctactc gcctgggcag aacggcgggc 840 agcaccactg ggcgctgcag gacgggctga tccgtcaggc ctacgcctac atcctcacca 900 gccccggcac gccggtggtg tactggtcgc acatgtacga ctggggctac ggtgacttca 960 tccgccagct gattcaggtg cgtcgcgccg ctggcgtgcg tgccgattcg gcgatcagct 1020 tccacagcgg ctacagcggc ctggtcgcca ccgtcagcgg aacccagcaa accctggtgg 1080 tggcgctcaa ctccaacctg agcaatcccg gccaggtcgc cagcggcagc ttcagcgagg 1140 cggtcaatgc cagcaacggg caggtgcggg tatggcgcag cggcgctggg agcggtggcg 1200 ataacggtgg tggtgagccc ggcgccttgg tcagcgtcaa cttccgctgc gacaacggcg 1260 tgacgcagcc cggcgatagc gtctacgcgg ccggtaacgt cagccagctt ggcaactgga 1320 gcccaacatc ggccgtgcgc ctgaccgata ccagcggcta cccgacctga aagcagctct 1380 cgtgttcacc tc 1392 <210> 11 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pseudomonas stutzeri Mutant D <400> 11 Arg Gln Gln Ala Ser Thr Ile Ala Ala Asp Gly Phe Ser Ser Ile Trp 1 5 10 15 Met Pro Val Pro Trp Arg Asp Phe Ser Ser Trp Ser Glu Gly Gly Lys 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Glu Gly Tyr Phe Trp His Asp Phe Asn Lys Asn Gly 35 40 45 Arg Tyr Gly Ser Asp Ala Gln Leu Arg Gln Ala Ala Gly Ala Leu Gly 50 55 60 Gly Ala Gly Val Lys Val Leu Tyr Asp Val Val Pro Asn His Met Asn 65 70 75 80 Arg Gly Tyr Pro Asn Lys Glu Ile Asn Leu Pro Ala Gly Gln Gly Phe 85 90 95 Trp Arg Asn Asp Cys Ala Asp Pro Gly Asn Tyr Pro Asn Asp Cys Asp 100 105 110 Asp Gly Asp Arg Phe Val Gly Gly Asp Ala Asp Leu Asn Thr Ser His 115 120 125 Pro Gln Val Tyr Gly Met Phe Arg Asp Glu Phe Ala Asn Leu Arg Ser 130 135 140 Gln Tyr Gly Ala Gly Gly Phe Arg Phe Asp Phe Val Arg Gly Phe Ala 145 150 155 160 Pro Glu Arg Val Asn Ser Trp Met Thr Asp Ser Ala Asp Asn Ser Phe 165 170 175 Cys Val Gly Glu Leu Trp Lys Gly Pro Ser Glu Tyr Pro Ser Trp Asp 180 185 190 Trp Arg Asn Thr Ala Ser Trp Gln Gln Ile Ile Lys Asp Trp Ser Asp 195 200 205 Arg Ala Lys Cys Pro Val Phe Asp Phe Ala Leu Lys Glu Arg Met Gln 210 215 220 Asn Gly Ser Ile Ala Asp Trp Lys Asn Gly Leu Asn Gly Asn Pro Asn 225 230 235 240 Pro Arg Trp Arg Glu Val Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr 245 250 255 Gly Tyr Ser Pro Gly Gln Asn Gly Gly Gln His His Trp Ala Leu Gln 260 265 270 Asp Gly Leu Ile Arg Gln Ala Tyr Ala Tyr Ile Leu Thr Ser Pro Gly 275 280 285 Thr Pro Val Val Tyr Trp Ser His Met Tyr Asp Trp Gly Tyr Gly Asp 290 295 300 Phe Ile Arg Gln Leu Ile Gln Val Arg Arg Ala Ala Gly Val Arg Ala 305 310 315 320 Asp Ser Ala Ile Ser Phe His Ser Gly Tyr Ser Gly Leu Val Ala Thr 325 330 335 Val Ser Gly Thr Gln Gln Thr Leu Val Val Ala Leu Asn Ser Asn Leu 340 345 350 Ser Asn Pro Gly Gln Val Ala Ser Gly Ser Phe Ser Glu Ala Val Asn 355 360 365 Ala Ser Asn Gly Gln Val Arg Val Trp Arg Ser Gly Ala Gly Ser Gly 370 375 380 Gly Asp Asn Gly Gly Gly Glu Pro Gly Ala Leu Val Ser Val Asn Phe 385 390 395 400 Arg Cys Asp Asn Gly Val Thr Gln Pro Gly Asp Ser Val Tyr Ala Ala 405 410 415 Gly Asn Val Ser Gln Leu Gly Asn Trp Ser Pro Thr Ser Ala Val Arg 420 425 430 Leu Thr Asp Thr Ser Gly Tyr Pro Thr 435 440 <210> 12 <211> 1394 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pseudomonas stutzeri Mutant E <400> 12 cccgttagtc gtccgcgagc gcccacgact ggtacaacat cctccgccaa caggcctcga 60 ccatcgctgc cgacggcttc tcgtcaatct ggatgccggt gccctggcgt gacttctcca 120 gctggagcga aggcggcaag tccggcggcg gcgaaggtta cttctggcac gacttcaaca 180 agaacggccg ctatggcagc gatgcccagc tgcgccaggc cgccggggcg ctgggtggtg 240 ccggggtgaa ggtgctctac gacgtggtgc ccaaccacat gaaccgcggc tacccgaaca 300 aggaaatcaa cctgccggcc ggtcagggct tctggcgcaa cgactgcgcc gatccgggca 360 attatcccaa tgactgcgac gacggcgacc gtttcgtcgg cggcgatgca gacctcaaca 420 ccagccatcc gcaggtctac ggcatgttcc gcgacgagtt cgccaatctg cgcagccagt 480 acggcgccgg cggttttcgc ttcgattttg ttcgcggctt cgcaccggag cgggtcaaca 540 gctggatgac cgacagtgcc gacaacagct tctgcgtcgg cgagctgtgg aaaggtccct 600 cggaataccc gagctgggac tggcgcaaca ccgccagctg gcagcagatc atcaaggact 660 ggtccgatcg ggccaagtgt ccggtgttcg acttcgccct caaggagcgc atgcagaacg 720 gctcgatcgc cgactggaag aacgggctga atggcaaccc gaacccgcgc tggcgcgagg 780 tggcggtgac ctttgtcgac aaccacgaca ccggctactc gcctgggcag aacggcgggc 840 agcaccactg ggcgctgcag gacgggctga tccgtcaggc ctacgcctac atcctcacca 900 accccggcac gcctgtggtg tactggtcgc acatgtacaa ctggggctac agtgacttca 960 tccgccagct gattcaggtg cgtcccgccg ctggcgtgca tgccgattcg gcgatcaact 1020 tccacagcgg ctacaacggc ctggtcggca ccgtcatcgg aacccagcaa accctggtgg 1080 tggcgctcaa ctccaacctg agcaatcccg gccaggtcgc cagcggcagc ttcagcgagg 1140 cggtcaatgc cagcaacggg caggtgcggg tatggcgcag cggcgctggg agcggtggcg 1200 ataacggtgg tggtgagccc ggcgccttgg tcagcgtcaa cttccgctgc gacaacggcg 1260 tgacgcagcc cggcgatagc gtctacgcgg ccggtaacgt cagccagctt ggcaactgga 1320 gcccaacatc ggccgtgcgc ctgaccggat accagcggct acccgacctg aaaggcagca 1380 tctcgcgtag cttc 1394 <210> 13 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pseudomonas stutzeri Mutant E <400> 13 Arg Gln Gln Ala Ser Thr Ile Ala Ala Asp Gly Phe Ser Ser Ile Trp 1 5 10 15 Met Pro Val Pro Trp Arg Asp Phe Ser Ser Trp Ser Glu Gly Gly Lys 20 25 30 Ser Gly Gly Gly Glu Gly Tyr Phe Trp His Asp Phe Asn Lys Asn Gly 35 40 45 Arg Tyr Gly Ser Asp Ala Gln Leu Arg Gln Ala Ala Gly Ala Leu Gly 50 55 60 Gly Ala Gly Val Lys Val Leu Tyr Asp Val Val Pro Asn His Met Asn 65 70 75 80 Arg Gly Tyr Pro Asn Lys Glu Ile Asn Leu Pro Ala Gly Gln Gly Phe 85 90 95 Trp Arg Asn Asp Cys Ala Asp Pro Gly Asn Tyr Pro Asn Asp Cys Asp 100 105 110 Asp Gly Asp Arg Phe Val Gly Gly Asp Ala Asp Leu Asn Thr Ser His 115 120 125 Pro Gln Val Tyr Gly Met Phe Arg Asp Glu Phe Ala Asn Leu Arg Ser 130 135 140 Gln Tyr Gly Ala Gly Gly Phe Arg Phe Asp Phe Val Arg Gly Phe Ala 145 150 155 160 Pro Glu Arg Val Asn Ser Trp Met Thr Asp Ser Ala Asp Asn Ser Phe 165 170 175 Cys Val Gly Glu Leu Trp Lys Gly Pro Ser Glu Tyr Pro Ser Trp Asp 180 185 190 Trp Arg Asn Thr Ala Ser Trp Gln Gln Ile Ile Lys Asp Trp Ser Asp 195 200 205 Arg Ala Lys Cys Pro Val Phe Asp Phe Ala Leu Lys Glu Arg Met Gln 210 215 220 Asn Gly Ser Ile Ala Asp Trp Lys Asn Gly Leu Asn Gly Asn Pro Asn 225 230 235 240 Pro Arg Trp Arg Glu Val Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr 245 250 255 Gly Tyr Ser Pro Gly Gln Asn Gly Gly Gln His His Trp Ala Leu Gln 260 265 270 Asp Gly Leu Ile Arg Gln Ala Tyr Ala Tyr Ile Leu Thr Ser Pro Gly 275 280 285 Thr Pro Val Val Tyr Trp Ser His Met Tyr Asp Trp Gly Tyr Gly Asp 290 295 300 Phe Ile Arg Gln Leu Ile Gln Val Arg Arg Ala Ala Gly Val Arg Ala 305 310 315 320 Asp Ser Ala Ile Ser Phe His Ser Gly Tyr Ser Gly Leu Val Ala Thr 325 330 335 Val Ser Gly Thr Gln Gln Thr Leu Val Val Ala Leu Asn Ser Asn Leu 340 345 350 Ser Asn Pro Gly Gln Val Ala Ser Gly Ser Phe Ser Glu Ala Val Asn 355 360 365 Ala Ser Asn Gly Gln Val Arg Val Trp Arg Ser Gly Ala Gly Ser Gly 370 375 380 Gly Asp Asn Gly Gly Gly Glu Pro Gly Ala Leu Val Ser Val Asn Phe 385 390 395 400 Arg Cys Asp Asn Gly Val Thr Gln Pro Gly Asp Ser Val Tyr Ala Ala 405 410 415 Gly Asn Val Ser Gln Leu Gly Asn Trp Ser Pro Thr Ser Ala Val Arg 420 425 430 Leu Thr Gly Tyr Gln Arg Leu Pro Asp 435 440

Claims (21)

1. 말토테트라오스 생성 아밀라아제 효소, 상기 효소를 생산하는 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 배양 상등액, 상기 미생물의 배양 상등액의 농축물 및 이들의 분말로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 이용하여 말토올리고당 함유 당류를 생산하는 단계를 포함하며,
   상기 효소는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 효소, 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 효소, 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 효소, 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지는 효소, 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어지는 효소로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상이고,
   상기 말토올리고당 함유 당류는, 상기 말토올리고당 함유 당류의 고형분 함량 100중량%를 기준으로, 말토테트라오스를 30 내지 60중량%로 포함하며, DP10 이상 당류를 25 내지 55중량%로 포함하는 것인,
   말토올리고당 함유 당류의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 말토올리고당 함유 당류는, 상기 말토올리고당 함유 당류의 고형분 함량 100중량%를 기준으로, 말토테트라오스를 30 내지 60중량%로 포함하고, 단당류 및 이당류 함량이 7중량% 이하인, 제조방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 말토올리고당 함유 당류는, 상기 말토올리고당 함유 당류의 고형분 함량 100중량%를 기준으로, 말토테트라오스를 30 내지 60중량%로 포함하고, DP10 이상 당류를 25 내지 55중량%로 포함하며, 나머지 당류의 함량이 15 내지 45중량%인, 제조방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 말토올리고당 함유 당류는 액상 시럽인, 제조방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 말토올리고당 함유 당류를 생산하는 단계에서 사용되는 기질은 전분 원료 및 이의 가수분해물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 제조방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 전분 원료는 감자 전분, 고구마 전분, 옥수수 전분, 밀 전분, 타피오카 전분, 쌀 전분, 아밀로스, 및 아밀로펙틴으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 제조방법.
7. 제5항에 있어서, 상기 전분 원료의 가수분해물은 가용성 전분, 덱스트린, 아밀로덱스트린, 에리트로덱스트린, 아크로덱스트린, 및 말토덱스트린으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 제조방법.
8. 삭제
9. 제1항에 있어서, 상기 미생물은, 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri) 인, 제조방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 효소의 말토테트라오스 전환 활성은 pH 7 내지 8의 pH 범위에서 안정한 것인, 제조방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 효소의 말토테트라오스 전환 활성은 40 내지 70℃의 온도 범위에서 안정한 것인, 제조방법.
12. 제1항에 있어서, 상기 효소는 분말화된 효소인, 제조방법.
13. 제1항에 있어서, 상기 효소는 분말화된 효소이며, 20주 저장 후 효소의 상대적 활성이 초기 효소 활성의 60 내지 150%인 것을 특징으로 하는 것인, 제조방법.
14. 제1항에 있어서, 상기 효소는 분말화된 효소이며, 0 내지 50℃의 온도에서 20주 저장 후의 효소 활성이 초기 효소 활성의 60 내지 150%인 것을 특징으로 하는 것인, 제조방법.
15. 제1항에 있어서, 상기 효소는 야생형 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri) 균주로부터 유래한 말토테트라오스 생성 아밀라아제 효소 대비 2배 이상의 말토테트라오스 생산 활성을 가지는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
16. 제1항에 있어서, 상기 효소는 20 내지 600 U/ml의 활성을 가지는 것인, 제조방법.
17. 다당류로부터 말토올리고당을 전환하는 말토올리고당 함유 당류 생산용 효소로서,
    상기 효소는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 효소, 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 효소, 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 효소, 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지는 효소, 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어지는 효소로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상이고,
    상기 말토올리고당 함유 당류는, 상기 말토올리고당 함유 당류의 고형분 함량 100중량%를 기준으로, 말토테트라오스를 30 내지 60중량%로 포함하며, DP10 이상 당류를 25 내지 55중량%로 포함하는 것인, 효소.
18. 삭제
19. 제17항에 있어서, 상기 효소는 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri) 균주로부터 유래한 것인, 효소.
20. 당류의 고형분 함량 100중량%를 기준으로, 말토테트라오스 함량이 30 내지 60중량%이 되고, DP10 이상 당류 함량이 25 내지 55중량%가 되도록 다당류로부터 말토테트라오스를 전환하는 활성을 가지며,
    서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 효소, 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 효소, 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 효소, 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어지는 효소, 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어지는 효소로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 효소를 생산하는,
    슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri) 균주.
    
21. 삭제

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