JPH0789916B2 - マルトテトラオ−ス生成アミラ−ゼとその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ＜産業上の利用分野＞ 本発明は、新規マルトテトラオース生成アミラーゼとそ
の製造方法に関する。

＜従来の技術＞ グルコースやマルトースは、澱粉を各種アミラーゼで糖
化することによって工業的に製造されている。

近年、より高分子のマルトオリゴを製造するための各種
アミラーゼに関する研究が活発になってきた。

とりわけ、マルトテトラオースが、低甘味、低糖度の澱
粉部分分解物として注目されており、その工業的製造方
法の確立が望まれている。

澱粉からマルトテトラオースを生成する酵素、すなわち
マルトテトラオース生成アミラーゼ（EC3.2.1.60）につ
いては、古くからシュードモナス スツッツェリ（Pseu
domonas stutzeri）NRRL Ｂ−3389から産生されるこ
とが知られている。例えば、米国特許第3,654,082号明
細書に記載されており、またジョン エフ ロビト ア
ンド ロザリエ ゼイ アッカーマン（John F.Robyt
and Rosalie J.Ackerman）が、アーカイブス オブ
バイオケ ミストリー アンド バイオフィジックス
（Archives of Biochemistry and Biophisics）、
第145巻、第105乃至114頁（1971年）に報告し、ユンゲ
ル シュミット アンド ミハエル ジョン（Jurgen
Schmidt and Michael John）が、ビオキミカ エト
ビオフィジカ アクタ（Biochimica et Biophisica
Acta）、第566巻、第88乃至99頁（1979年）に報告
し、更に、坂野好幸等が、澱粉科学、第29巻、第２号、
第131乃至137頁（1982年）、アグリカルチュラル アン
ド バイオロジカル ケミストリー（Agricultural an
d Biological Chemistry）、第46巻、第３号、第636
乃至646頁（1982年）および同誌、第47巻、第８号、第1
761乃至1768頁（1983年）に報告している。

しかしながら、これら報告に見られるシュードモナス
スツッツェリ NRRL Ｂ−3389からのマルトテトラオー
ス生成アミラーゼは、至適温度、安定温度が低く、工業
的に利用する上で耐熱性が不充分である。

その上、このマルトテトラオース生成アミラーゼについ
て小林昭一等が、特開昭61−202687号公報、第２頁右上
欄第１乃至４行において、「この酵素は、シュードモナ
ス スツェチェリ（Pseudomonas stutzeri）から生産
されるものであるが、生産性が低い（２〜5IU/ml）。」
と記載していることからも明らかなように、工業的に利
用する上できわめて不利である。

＜問題点を解決するための手段＞ 本発明者等は、工業的に有利に使用しうるマルトテトラ
オース生成アミラーゼについて鋭意研究を続けた。

その結果、意外にも、シュードモナス スツッツェリか
ら耐熱性の向上した新規なマルトテトラオース生成アミ
ラーゼが産生しうることを見いだし、その製造方法を確
立して本発明を完成した。

以下、本発明のマルトテトラオース生成アミラーゼの理
化学的性質について述べる。

（ａ）作用 澱粉に作用して、主にマルトテトラオースを生成する。

（ｂ）基質特異性 澱粉、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲンおよ
びβ−リミットデキストリンに作用し、シクロデキスト
リン、デキストラン、プルランおよびエルシナンには、
実質的に作用しない。

（ｃ）至適pH 40℃、20分間で、pH7.0乃至7.5附近。

（ｄ）安定pH 40℃、１時間で、pH6.5乃至9.5附近。

（ｅ）至適温度 pH7.0、20分間で、50℃附近。

（ｆ）安定温度 pH7.0、１時間で、45℃附近まで。但し、カルシウムイ
オン共存下では、50℃附近まで活性をほぼ完全に残存
し、55℃附近で約70％の活性を残存する。

（ｇ）阻害、安定化 水銀イオンにより活性が阻害される。

カルシウムイオンにより熱安定性が向上する。

（ｈ）分子量 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、46,00
0±1,000。

超遠心分析法により、47,000±2,000。

（ｉ）等電点 ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法により、pI4.
8附近。

（ｊ）紫外部吸収 275乃至280nm附近。

（ｋ）精製方法 通常の酵素の精製方法に準じて行うことができる。その
具体例は、実施例２で述べる。

（ｌ）活性測定方法 1.0w/v％可溶性澱粉（pH7.0）5mlに酵素液0.2mlを加え4
0℃で20分間反応させ、反応液にソモジー（Somogyi）試
薬を加えて反応を停止させた。

生成した還元糖をネルソン−ソモジー（Nelson−Somogy
i）法で測定し、１分間に１マイクロモルのグルコシド
結合を切断する酵素量を１単位とした。

以上の理化学的性質のうち、その主な性質について、ア
グリカルチュラルアンド バイオロジカル ケミストリ
ー第47巻、第８号、第1761乃至第1768頁（1983年）に報
告されているシュードモナス スツッツェリ NRRL Ｂ
−3389からのマルトテトラオース生成アミラーゼの性質
と比較すると、次の通りである。

（１）至適pHでは、本発明の酵素がpH7.0乃至7.5附近と
広いpH範囲範囲であるのに対し、NRRL Ｂ−3389からの
それは、pH8.0附近である。

（２）安定pHでは、本発明の酵素がpH6.5乃至9.5附近と
広いpH範囲範囲であるのに対し、NRRL Ｂ−3389からの
それはpH6.5乃至8.5附近である。

（３）至適温度では、本発明の酵素が50℃附近と高温で
あるのに対し、NRRL Ｂ−3389からのそれは45℃附近で
ある。

（４）安定温度では、本発明の酵素が45℃附近（カルシ
ウムイオン共存下では50℃附近）までと高温であるのに
対し、NRRL Ｂ−3389からのそれは40℃附近までであ
る。

（５）分子量では、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法において、本発明の酵素が46,000±1,000である
のに対して、NRRL Ｂ−3389からのそれは55,000であ
る。

（６）等電点では、本発明の酵素が4.8附近であるのに
対し、NRRL Ｂ−3389からのそれは5.6または5.3であ
る。

以上のように、本発明のマルトテトラオース生成アミラ
ーゼは、NRRL Ｂ−3389からのそれと比較して、pH安定
性、耐熱性に優れ、工業的に有利に使用しうる新規なマ
ルトテトラオース生成アミラーゼということができる。

本発明のマルトテトラオース生成アミラーゼを産生させ
る微生物は問わない。以下に例示するシュードモナス
スツッツェリ MO−19または、その変異株などは、本発
明に有利に用いることができる。

シュードモナス スツッツェリ MO−19は、岡山県上房
郡賀陽町の土壌から発見、分離されたものであり、昭和
62年２月16日、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
申請され、微生物受託番号FERM BP−1682で寄託されて
いる。

以下、シュードモナス スツッツェリ MO−19の菌学的
性質を記載する。

A.形態的性質 （ａ）細胞の形及び大きさ 桿菌、0.5乃至0.6×1.0乃至1.2μｍ 第１図に電子顕微鏡写真（×10,000）を示す。

（ｂ）細胞の多形性の有無 無 （ｃ）運動性の有無 有 （ｄ）鞭毛の着性状態 極毛で１本 （ｅ）胞子及び胞子のう 胞子、胞子のうは形成せず （ｆ）グラム染色性 陰性 （ｇ）抗酸性 陰性 B.培養的性質 （ａ）肉汁寒天板培養（28℃、２日） 菌の生育は速く、１乃至3mmのコロニーを形成する。コ
ロニーは、不透明で湿光をもち、褐色がかった黄色の円
形で、表面は平滑である。

（ｂ）肉汁寒天斜面培養（28℃、２日） 菌の生育は中程度である。コロニーは、不透明で湿光を
もち、褐色がかった黄色黄色の羽毛状で、扁平状の隆起
を持つ。可溶性色素は生成しない。

（ｃ）肉汁液体培養（28℃、２日） 培養１日では、やや濁る程度だが、培養２日では強く濁
り、よく生育する。

表面は膜状のものを形成し、ガス、色素は生成しない。

（ｄ）肉汁穿刺培養（28℃、２日） 穿刺部に連鎖状の生育をする。

（ｅ）肉汁ゼラチン穿刺培養 ゼラチンは変化しない。

（ｆ）リトマスミルク（28℃、５日） 培養５日までにアルカリ性となり、キルクは凝固する。

C.生理学的性質 （ａ）硝酸塩の還元 陽性 （ｂ）脱窒反応 陽性 （ｃ）MRテスト 陰性 （ｄ）NRテスト 陰性 （ｅ）インドールノ生成 陰性 （ｆ）硫化水素の生成 陽性 （ｇ）デンプンの分解 分解する （ｈ）クエン酸の利用 利用する （ｉ）無機態窒素の利用法 アンモニウム塩、硝
酸塩共に利用する （ｊ）色素の生成 可溶性色素は生成し
ない （ｋ）オキシダーゼ 陽性 （ｌ）カタラーゼ 陽性 （ｍ）生育の範囲 pH4乃至７でよく成育し、pH2以下またはpH8以上では生
育せず、温度16乃至35℃でよく生育し、２℃以下または
42℃以上では生育せず。

（ｎ）酸素に対する態度 好気性 （ｏ）Ｏ−Ｆテスト 酸化型（ｏ） （ｐ）糖類からの酸及びガス生成の有無 Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、乳糖、マルトース、
デンプンから酸が生成されるが、Ｌ−アラビノース、Ｄ
−キシロース、Ｄ−フラクトース、ショ糖、グリセロー
ルからは酸が生成されない。Ｄ−マンノースからガスの
生成がみられるが、他の前記の糖類からはガスが生成さ
れない。

（ｑ）生育pH pH7.7（プロテオース ペプトン グルコース培地） （ｒ）セスロースの分解 陰性 以上の菌学的性質について、バージーズ マニュアル
オブ デターミネティブ バクテリオロジー（Bergey′
ｓ Mannual of Determinative Bacteriology）第７
版（1957年）および第８版（1974年）を参照して分類す
れば、シュードモナス スツッツェリと同定され、本菌
をシュードモナス スツッツェリ MO−19と命名した。

本発明のマルトテトラオース生成アミラーゼを製造する
ための培養は、細菌の通常の培養方法に準じて液体培
養、固体培養などが行なわれる。液体培養の場合には、
静置でもよいが、振とう培養または通気攪拌培養の方が
好ましい。培養に用いられる培地としては、シュードモ
ナス属に属する細菌が必要とする栄養源を含有するもの
であればよく、炭素源、窒素源、無機塩などを含有する
合成培地、半合成培地、天然培地などが適宜選ばれる。
特に、本発明のマルトテトラオース生成アミラーゼの産
生量を高めるためには、澱粉、アミロペクチン、アミロ
ース、澱粉部分加水分解物などの澱粉質やカルシウム塩
などを含有する培地が好ましい。

一般にはpHを中性乃至微アルカリ性にした培地にシュー
ドモナス属に属する最近を植菌し、約20乃至35℃で約0.
5乃至５日間培養が行なわれる。

以上のようにして得られる培養物は、通常、そのまま用
いられるか、または培養物から菌体を除去した上清また
は瀘液が用いられる。

必要ならば、常法に従って、硫安、硫酸ナトリウムなど
による塩析法、アセトン、エタノールなどによる沈殿
法、その他、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィ
ー、アフィニティクロマトグラフィーなどにより精製し
て利用することも、更にこれら酵素を常法に従って、担
体結合法、架橋法、包括法などによって固定下して利用
することも有利に実施できる。

本発明のマルトテトラオース生成アミラーゼを利用して
マルトテトラオース高含有物を製造するに際しては、工
業的には、澱粉、アミロペクチン、アミロース、澱粉部
分加水分解物などの澱粉質を気質として反応させるのが
好ましい。

また、必要ならば、澱粉質含有飲食物の製造に際して、
澱粉質含有飲食物にマルトテトラオース生成アミラーゼ
を作用させ、飲食物にマルトテトラオースを生成含有せ
しめ、澱粉質の老化を防止し、飲食物の日持ちを延長す
ることもできる。

一般的には、５乃至45w/w％程度の澱粉質溶液に、本発
明のマルトテトラオース生成アミラーゼを澱粉質グラム
当り約１乃至20単位の割合で加え、pH5乃至９、反応温
度約40乃至70℃で0.5乃至３日間反応させる。

この際、反応液に塩化カルシウムなどのカルシウム塩を
濃度0.0005乃至0.05モル程度共存させることによって、
マルトテトラオース生成アミラーゼの耐熱性を向上さ
せ、反応をより容易に進めることも有利に実施できる。

また、反応物中のマルトテトラオース含量をできるだけ
高めるためには、澱粉質の酸またはα−アミラーゼによ
る液化の程度をできるだけ低く、DE15未満、望ましくは
DE6未満にとどめたものに、マルトテトラオース生成ア
ミラーゼを作用させるのが好ましい。

また、反応に際して、マルトテトラオース生成アミラー
ゼとともに、他の澱粉質関連酵素、例えば、シクロマル
トデキストリングルカノトランスフェラーゼ（EC2.4.1.
19）、α−アミラーゼ（EC3.2.1.1）、β−アミラーゼ
（EC3.2.1.2）、グルコアミラーゼ（EC3.2.1.3）、α−
グルコシダーゼ（EC3.2.1.20）、プルラナーゼ（EC3.2.
1.41）、イソアミラーゼ（EC3.2.1.68）などを併用し
て、得られるマルトテトラオース高含有物の組成を変え
たり、マルトテトラオース含量を高めたりすることも自
由である。とりわけ、プルラナーゼやイソアミラーゼな
どの澱粉枝切酵素を併用して、マルトテトラオース含量
を固形物当り60乃至80w/w％に高めることも有利に実施
できる。

このようにして得られるマルトテトラオース含量が固形
物当り40乃至80w/w％程度のマルトテトラオース高含有
物を原料として、分画法などにより夾雑する糖類、デキ
ストリンなどを除去し、マルトテトラオースの含量を更
に高めることも自由である。

分画法としては、例えば、特開昭48−4647号公報に記載
される半透膜の利用、特開昭49−102854号公報に記載さ
れる有機沈殿剤の利用、特開昭59−148794号公報に記載
される強酸性カチオン交換樹脂の利用などが適宜選択さ
れ、必要ならば、98w/w％以上の最高純度のマルトテト
ラオース高含有物を採取することも容易に実施できる。

次いで、これらのマルトテトラオース高含有物は、通
常、濾過し、活性炭による脱色およびＨ型、OH型イオン
交換樹脂による脱塩などの精製工程を経た後、濃縮し、
シラップ状製品にする。必要ならば、更に乾燥し、粉末
状製品にすることも自由である。

このようにして得られるマルトテトラオース高含有物に
は、通常、マルトテトラオースを固形物当り40w/w％以
上含有する。

更に、マルトテトラオース高含有物を還元して、化学的
により安定なマルトテトライトール高含有物を製造する
ことも有利に実施できる。

例えば、マルトテトラオース高含有物を、濃度約40乃至
60％水溶液にし、オートクレーブに入れ、触媒としてラ
ネーニッケルを約８乃至10％添加し、攪拌しながら温度
を90乃至140℃に上げ、水素圧を20乃至150kg/cm²に上げ
て水素添加を完了させた後、ラネーニッケルを除去し、
次いで、マルトテトラオース高含有物製造の場合と同様
に、活性炭、イオン交換樹脂で精製し、濃縮してシラッ
プ状製品とするか、更に乾燥して粉末状製品とする。

このようにして製造されるマルトテトライトール高含有
物には、通常、マルトテトライトールを固形物当り40w/
w％以上含有する。

以上述べた方法で製造されるマルトテトラオース高含有
物、更にはマルトテトライトール高含有物は、低甘味の
甘味剤として、また、ボディー付与剤、粘度調節剤、保
湿剤、照付与剤、接着剤、保香剤、結晶防止剤、キャン
ディーのダレ防止剤、澱粉老化防止剤などとして、更に
は、栄養補給用剤なとどして広く飲食物に利用される。

例えば、マルトテトラオース高含有物、更にはマルトテ
トライトール高含有物のシラップ品を加熱し、食品表面
に塗布するなどの利用方法では、他の糖質甘味料と比較
して、その硬化、乾きが速く、たれが少ない特徴を有す
る。しかも、その表面の照、艶は良好である。

また、甘味剤としての利用は、単品で利用されるばかり
でなく、必要ならば、他の甘味剤、例えば、グルコー
ス、マルトース、異性化糖、砂糖、蜂蜜、メープルシュ
ガー、ソルビトール、マルチトール、パラチノース、ジ
ヒドロカルコン、ステビオシド、α−グルコシルステビ
オシド、ラカンカ甘味物、グリチルチリン、α−グルコ
シルグリチルリチン、Ｌ−アスパラチル Ｌ−フェニル
アラニンメチルエステル、サッカリン、グリシン、アラ
ニンなどと配合して使用することも自由である。

マルトテトラオース高含有物、更にはマルトテトラライ
トール高含有物は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味
など他の呈味を有する各種物質とよく調和し、耐熱性も
大きいので、広く飲食物の甘味付に、呈味改善に、調味
に自由に利用できる。

例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひ
しお、フリカケ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三
杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソー
ス、ケチャップ、焼肉のタレ、カレールウ、シチューの
素、スープ素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みり
ん、テーブルシラップ、コーヒーシュガーなど各種調味
料として自由に使用できる。

また、例えば、せんべい、あられ、おこし、餅類、まん
じゅう、ういろう、あん類、羊羹、水羊羹、錦玉、ゼリ
ー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケッ
ト、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリ
ーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフ
ル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、ちゅー
インガム、キャラメル、キャンディーなどの各種洋菓
子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実の
シロップ漬、氷蜜などのシロップ類、麺類、米飯類、人
造肉などの穀類加工品類、フラワーペースト、ピーナッ
ツペースト、フルーツペースト、スプレットなどのペー
スト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果など
の果実、野菜の加工食品類、福神漬、べったら漬、千枚
漬、らつきょう漬などの漬物類、たくあん漬の素、白菜
漬の素などの漬物の素類、ハム、ソーセージなどの畜肉
製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、カマボコ、チク
ワ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酢コン
ブ、さきするめ、ふぐのみりん干しなどの各種珍味類、
のり、山菜、するめ、小魚、貝などで製造されるつくだ
煮類、煮豆、ポテトサラダ、コンブ巻などのそう菜類、
プロセスチーズ、粉乳などの乳製品、魚肉、畜肉、果
実、野菜のビン詰、缶詰類、合成酒、果実酒、洋酒など
の酒類、コーヒー、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸
飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、
ホットケーキミックス、即席ジュース、即席コーヒー、
即席しるこ、即席スープなど即席飲食品などの各種飲食
品への甘味剤、呈味改良剤、物性改良剤なとどして自由
に利用できる。

また、これら飲食品を正常に摂取することの困難な病人
や病後の虚弱者、乳幼児、高齢者などに対しては、本発
明のマルトテトライトール高含有物、とりわけ、消化吸
収の良好なマルトテトラオース高含有物を経管流動食や
透析用栄養剤、離乳食などの栄養補給用剤として利用す
ることも有利に実施できる。

その際、液状の栄養補給用剤を製造し、そのままの形状
で利用することも、また、粉末、顆粒などの固状の栄養
補給用剤を製造し、水、塩類溶液、果汁、牛乳などに溶
解して利用することも自由である。

また、マルトテトラオース高含有物、更には、マルトテ
トライトール高含有物を例えば、家畜、家禽、その他、
蜂蜜、蚕、魚など飼育動物のための飼料、餌料などの嗜
好性を向上させる目的に利用することもできる。

その他、タバコ、練歯みがき、口紅、リップクリーム、
内服薬、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香
錠、うがい薬などの味覚を味わうことのできる嗜好物、
化粧品、医薬品などへの甘味剤、呈味改良剤、品質改良
剤などとしても利用することができる。

以上述べたように、本発明でいう飲食物とは、味覚を味
わうことのできる経口摂取物のみならず、経管流動食な
どの栄養補給用剤をも意味する。

また、これら飲食物に、本発明のマルトテトラオース高
含有物、更には、マルトテトライトール高含有物を含有
せしめる方法は、その製品が完成するまでの工程で含有
せしめればよく、例えば、混和、混捏、溶解、融解、浸
漬、浸透、散布、塗布、噴霧、注入などの公知の方法が
適宜選ばれる。

以下、本発明の実施例と優れた効果を述べる。

実施例1.マルトテトラオース生成アミラーゼ 溶性澱粉3w/v％、コーン スティープ リカー0.5w/v
％、ポリペプトン・0.2w/v％、リン酸二カリウム 0.2w
/v％、塩化カルシウム・２水塩0.05w/v％および水から
なる液体培地をpH7.2に調整し、この100mlずつを500ml
容振とうフラスコにとり、120℃で20分間オートクレー
ブした後、シュードモナス スツッツェリ MO−19を１
白金耳ずつ植菌し、27℃で３日間振とう培養した。

培養液のマルトテトラオース生成アミラーゼ活性は、ml
当り約250単位であった。

培養液を遠心分離し、得られる上清の酵素液は、澱粉質
からマルトテトラオース高含有物製造に有利に利用でき
る。

実施例2.マルトテトラオース生成アミラーゼ 液化澱粉4w/v％、コーン スティープ リカー1.0w/v
％、ポリペプトン 0.5w/v％、硝酸アンモニウム0.2w/v
％、リン酸二カリウム0.2w/v％、塩化カルシウム・２水
塩0.05w/v％、および水からなる液体培地を30容ジャ
ーファーメンターに15入れ、pH7.0に調整し、120℃で
20分間殺菌した後、シュードモナス スツッツェリ MO
−19の種培養液1v/v％植菌し、28℃で４日間、通気攪拌
培養した。培養液のマルトテトラオース生成アミラーゼ
活性は、ml当り約220単位であった。培養液を膜濾過
し、得られる瀘液を硫安で塩析し、0.2乃至0.4飽和沈殿
画分を採取して透析し、次いで、陰イオン交換クロマト
グラフィー（東洋曹達株式会社製造、商品名、DEAE−To
yopear−１ 650sを使用し、更に、スウェーデン国ファ
ルマシア社製造、商品名MOno Ｑを使用）を行ってポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で単一バンドを示す高純度
マルトテトラオース生成アミラーゼ溶液を採取した。

この精製工程によって比活性は、約4.3倍に増加し、マ
ルトテトラオース生成アミラーゼの回収率は約48％であ
った。

なお、得られたマルトテトラオース生成アミラーゼは、
比活性680±60（単位/mg蛋白質）を示し、次のような理
化学的性質を有する。

（ａ）作用 澱粉に作用して、主にマルトテトラオースを生成する。

（ｂ）気質特異性 澱粉、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲンおよ
びβ−リミットデキストリンに作用し、シクロデキスト
リン、デキストラン、プルランおよびエルシナンには、
実質的に作用しない。

（ｃ）至適pH 40℃、20分間で、pH7.0乃至7.5附近。

（ｄ）安定pH 40℃、１時間で、pH6.5乃至9.5附近。

（ｅ）至適温度 pH7.0、20分間で、50℃附近。

（ｆ）安定温度 pH7.0、１時間で、45℃附近まで。但し、カルシウムイ
オン共存下では、50℃附近まで活性をほぼ完全に残存
し、55℃附近で約70％の活性を残存する。

（ｇ）阻害、安定化 水銀イオンにより活性が阻害される。

カルシウムイオンにより熱安定性が向上する。

（ｈ）分子量 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、46,00
0±1,000。

超遠心分析法により、偏比容×密度＝0.75としたとき、
47,000±2,000。

（ｉ）等電点 ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法により、pI4.
8附近。

（ｊ）紫外部吸収 275乃至280nm附近。

また、この高純度マルトテトラオース生成アミラーゼを
約1.0w/v％含有する10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）を
４℃で１ケ月間放置したところ、結晶が析出した。本結
晶の顕微鏡写真（×220）を第２図に示す。

更に、この高純度マルトテトラオース生成アミラーゼを
用いて、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミスト
リー（Journal of Biological Chemistry）、第256
巻、第7990乃至7997頁（1981年）の記載に準じて、気相
プロテイン シークエンサーによりエドマン分解し、そ
の分解物を高速液体クロマトグラフィーで同定した。そ
の結果、本酵素のＮ末端アミノ酸から20個までのアミノ
酸配列は、アスパラギン酸−グルタミン−アラニン−グ
リシン−リジン−セリン−プロリン−アスパラギン−ア
ラニン−バリン−アルギニン−チロシン−ヒスチジン−
グリシン−グリシン−アスパラギン酸−グルタミン酸−
イソロイシン−イソロイシン−ロイシン−（但し、いず
れのアミノ酸残基もＬ−アミノ酸残基を示す。）の順で
あった。本実施例で得られる高純度マルトテトラオース
生成アミラーゼも、実施例１の酵素液の場合と同様に、
澱粉質からのマルトテトラオース高含有物の製造に有利
に利用できる。

参考例1.マルトテトラオース高含有物 コーンスターチ１重量部を澱粉当り0.1w/w％の割合にα
−アミラーゼ（デンマーク、ノボ社、商品名ターマミー
ル60L）を含む水3.0重量部に攪拌混合し、pH6.5に調整
後、この懸濁液を95乃至100℃に保ち糊化と液化を同時
に起させ、さらに反応を進めてDE4.5になった時に、120
℃に５分間加熱し、これを60℃にまで急速に冷却し、こ
れに実施例１の方法で得たマルトテトラオース生成アミ
ラーゼ液（上清）を澱粉グラム当り４単位の割合で加
え、pH6.5、55℃で46時間糖化した。

本糖化物を加熱し、酵素を失活させ、濾過し、活性炭に
て脱色し、Ｈ型、OH型イオン交換樹脂にて脱塩し、濃縮
して水分25w/w％のシラップ状マルトテトラオース高含
有物を原料澱粉固形物当り95％の収率で得た。

本品は、グルコース固形物当り約２％含有し、かつ、DE
約24であって、マルトテトラオースを固形物当り約55％
含有しており、また、その甘味度は砂糖のそれの約25％
であった。

本品は、低甘味、低糖度の消化吸収良好な甘味剤とし
て、また、ボディー付与剤、粘度調節剤、保湿剤、照付
与剤、接着剤、保香剤、結晶防止剤、キャンディーのダ
レ防止剤などとして広く飲食物に利用される。

参考例2.マルトテトラオース高含有物 馬鈴薯澱粉１重量部を澱粉当り0.01w/w％の割合にα−
アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社、商品名、ネオ
スピターゼ）を含む水６重量部に攪拌混合し、pH6.0に
調整後、この懸濁液を85乃至90℃に保ち、糊化と液化を
同時に起させ、直ちに120℃に５分間加熱してDE1.0未満
にとどめ、これを55℃に急冷し、pH7.0に調整し、これ
に株式会社林原生物化学研究所製造、商品名プルラナー
ゼ（EC 3.2.1.41）および実施例２の方法で得た高純度
マルトテトラオース生成アミラーゼ溶液をそれぞれ澱粉
グラム当り150単位および８単位の割合で加え、pH7.0、
50℃で36時間糖化した。

本糖化物を、参考例１と同様に精製濃縮し、更に噴霧乾
燥して水分1w/w％未満の粉末状マルトテトラオース高含
有物を原料澱粉固形物当り約93％の収率で得た。

本品は、グルコースを固形物当り約２％含有し、かつ、
DE約24であって、マルトテトラオースを固形物当り約76
％含有しており、また、その甘味度は砂糖のそれの25％
であった。

本品は、低甘味、低糖度の消化吸収良好な甘味剤とし
て、参考例１の場合と同様に広く飲食物に利用できる。

参考例3.マルトテトラオース高含有物 参考例２の方法で得たマルトテトラオース高含有物を強
酸性カチオン交換樹脂を用いて、そのマルトテトラオー
ス含量を高めた。

参考例２の方法で製造したマルトテトラオース高含有物
の濃度60w/w％にして原糖液とした。

樹脂は、アルカリ金属型強酸性カチオン交換樹脂（東京
有機化学工業株式会社製造、商品名XT−1007、Na⁺型、
架橋度６％）を使用し、内径5.4cmのジャケット付ステ
ンレス製カステラ４本を連結して樹脂層全長を20mとし
た。カラム内温度を55℃に維持しつつ、原糖液を樹脂に
対して5v/v％加え、これに55℃の温水をSV 0.13で流し
て分画し、マルトテトラオース含量90％以上のマルトテ
トラオース高含有画分を採取し、参考例１と同様に精製
し、濃縮して、水分25w/w％のシラップ状マルトテトラ
オース高含有物を原糖固形物当り約60％の収率で得た。

本品は、マルトテトラオースを固形物当り約93％含有し
ており、また、その甘味度は砂糖のそれの約25％であっ
た。

本品は、低甘味、低糖度の消化吸収良好な甘味剤とし
て、参考例１の場合と同様に広く飲食物に利用できる。

参考例4.マルトテトライトール高含有物 参考例１の方法で得たマルトテトラオース高含有物を濃
度50％水溶液にし、オートクレーブに入れ、触媒として
ラネーニッケル10％を添加し、攪拌しながら温度を90乃
至125℃に上げ、水素圧を20乃至100kg/cm²に上げて水素
化を完了させた。次いで、ラネーニッケルを除去した
後、参考例１と同様に精製し濃縮して、水分25w/w％の
シラップ状マルトテトライトール高含有物を原料のマル
トテトラオース高含有物固形物当り約92％の収率で得
た。

本品は、マルトテトライトールを固形物当り約55％含有
しており、また、その甘味度は砂糖のそれの約30％であ
った。本品は、低甘味、非還元製甘味剤として、また、
ボディー付与剤、粘度調節剤、保湿剤、照付与剤、接着
剤、保香剤、結晶防止剤、キャンディーのダレ防止剤な
どとして広く飲食物に利用される。

参考例5.マルトテトライトール高含有物 参考例２の方法で得たマルトテトラオース高含有物を参
考例４の方法で準じて水素化し、精製濃縮して水分25w/
w％のシラップ剤マルトテトライトール高含有物を原料
のマルトテトラオース高含有物固形物当り約92％の収率
で得た。本品は、マルトテトライトールを固形物当り約
76％含有しており、また、その甘味度は砂糖のそれの約
30％であった。

本品は、低甘味、非還元性甘味剤として、参考例４の場
合と同様に広く飲食物に利用できる。

参考例6.甘味料 参考例３の方法で得たシラップ状マルトテトラオース高
含有物１重量部にα−グリコシルステビオシド（東洋精
糖株式会社製造、商品名α−Ｇ スィート）0.02重量部
を均一に混合して得たシラップ状甘味料は、甘味の質が
すぐれ、砂糖の約２倍の甘味を有し、カロリーは甘味度
当り砂糖の約1/2となる。従って、本甘味料は、低カロ
リー甘味利用として、カロリーの摂取を制限している
人、例えば、肥満者、糖尿病者などのための低カロリー
飲料物などに対する甘味付に好適である。

また、本甘味料は、虫歯誘発菌によって酸の生成も少な
く、不溶成グルカンの生成も少ないことより、虫歯を抑
制する飲食物などに対する甘味付にも好適である。

参考例7.カスタードクリーム コーンスターチ500重量部、参考例２の方法で得た粉末
状マルトテトラオース高含有物400重量部、マルトース5
00重量部および食塩５重量部を、篩を通して充分に混合
し、鶏卵1,400重量部を加えて攪拌し、これに沸騰した
牛乳を5,000重量部を徐々に加え、更にこれをとろ火に
かけて、攪拌を続け、コーンスターチが完全に糊化して
全体が半透明になったとき火を止め、これを冷却して少
量のバニラ香料を加えることによりカスタードクリーム
を製造した。

本品は、なめらかで光沢を有し、甘味が強すぎず美味で
ある。

参考例8.ういろう 米粉90重量部に、コーンスターチ20重量部、砂糖20重量
部、抹茶粉末１重量部、参考例５の方法で得たシラップ
状マルトテトライトール高含有物90重量部および水の適
量を加えて混練した後、これを容器に入れて60分間蒸し
て抹茶ういろうを製造した。

本品は、照り、口当りも良好で、風味もよかった。ま
た、澱粉の老化も抑制され、長期間安定であった。

参考例9.ハードキャンディー 参考例３の方法で得たシラップ状マルトテトラオース高
含有物70重量部に砂糖90重量部を混合溶解し、減圧下で
水分約2w/w％未満になるまで加熱濃縮して、これにクエ
ン酸0.15重量部および少量のレモン香料と着香料とを混
和し、次いで、常法に従って成形し、ハードキャンディ
ーを製造した。

本品は、吸湿性少なく、ダレを起しにくい歯切れのよい
ハードキャンディーである。

参考例10.つくだ煮 常法に従って砂取り、酸処理して角切りした昆布250重
量部に、醤油212重量部、アミノ酸液300重量部、砂糖40
重量部および参考例１の方法で得たシラップ状マルトテ
トラオース高含有物20重量部を加えて煮込みつつ、更に
グルタミン酸ソーダ12重量部、カラメル８重量部および
味淋21重量部を加えて煮き上げて昆布の佃煮を製造し
た。

本品は、味、薫りだけでなく、色、艶も充分で食欲をそ
そる昆布のつくだ煮である。

参考例11.べったら漬 参考例６の方法で得たシラップ状甘味料４重量部、天草
製剤0.05重量部、リンゴ酸0.008重量部、グルタミン酸
ナトリウム0.07重量部、ソルビン酸カリウム0.03重量部
およびプルラン0.2重量部を均一に混合してべったら漬
の素を製造した。

大根30kgを常法に従って食塩により下漬けし、次いで砂
糖で中漬したものを、本べったら漬の素4kgで調製した
調味液に漬けて、べったら漬を製造した。本品は、色
艶、香気共に良好で、適度の甘味を有し歯切れもよかっ
た。

参考例12.経管流動食 参考例２の方法で得た粉末状マルトテトラオース高含有
物550重量部、無水結晶マルトース（林原株式会社製
造、登録商標ファイントース）50重量部、乾燥卵黄190
重量部、脱脂粉乳209重量部、塩化ナトリウム4.4重量
部、塩化カリウム1.85重量部、硫酸マグネシウム４重量
部、チアミン0.01重量部、アスコルビン酸ナトリウム0.
1重量部、ビタミンＥアセテート0.6重量部及びニコチン
酸アミド0.04重量部からなる配合物を調製する。

この配合物25gずつをラミネートアルミ製小包に充填
し、ヒートシールして固状の栄養補給用剤を製造した。

本品は、低温貯蔵の必要もなく、室温下で長期間安定で
あり、流動性、溶解分散性も良好である。

本品は、１袋分を約150乃至300mlの水に溶解して経管流
動食とし、経管方法により、鼻腔、食道、胃、腸などへ
投与して使用する。

参考例13.錠剤 アスピリン50重量部に参考例２の方法で得た粉末状マル
トテトラオース高含有物６重量部およびコーンスターチ
８重量部を充分に混合した後、常法に従って、打錠機に
より打錠して、厚さ5.25mm、１錠680mgの錠剤を製造し
た。

本品は、吸湿性が低く、物理的強度も充分であり、しか
も水中での崩壊はきわめて良好であった。

＜発明の効果＞ 上記したことから明らかなように、本発明は、新規マル
トテトラオース生成アミラーゼを解明し、その製造方法
を確立するものである。

本発明の新規マルトテトラオース生成アミラーゼは、至
適pH、安定pHにおけるpH域が広く、また至適温度、安定
温度における温度が高く、更に産生微生物からの酵素産
生量も高く、澱粉質からのマルトテトラオース高含有物
およびマルトテトライトール高含有物の製造に有利に利
用しうることが判明し、その工業的意義はきわめて大き
い。

更に、このようにして製造されるマルトテトラオース高
含有物は、更に、それを水素添加して得られるマルトテ
トライトール高含有物は、低甘味性の甘味剤として、ま
たボディー付与剤、粘度調節剤、保湿剤、照付与剤など
として、更には、栄養補給用剤などとして広く飲食物に
供しうることも大きな特徴である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、電子顕微鏡で10,000倍に拡大したシュードモ
ナス スツッツェリ MO−19（FERM−BP−1682）の細胞
の形状の一例を示す写真である。 第２図は、顕微鏡で220倍に拡大したマルトテトラオー
ス生成アミラーゼの結晶の一例を示す写真である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の理化学的性質を有するマルトテトラ
   オース生成アミラーゼ。 （ａ）作用 澱粉に作用して、主にマルトテトラオースを生成する。 （ｂ）基質特異性 澱粉、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲンおよ
   びβ−リミットデキストリンに作用し、シクロデキスト
   リン、デキストラン、プルランおよびエルシナンには、
   実質的に作用しない。 （ｃ）至適pH 40℃、20分間で、pH7.0乃至7.5附近。 （ｄ）安定pH 40℃、１時間で、pH6.5乃至9.5附近。 （ｅ）至適温度 pH7.0、20分間で、50℃附近。 （ｆ）安定温度 pH7.0、１時間で、45℃付近まで。但し、カルシウムイ
   オン共存下では、50℃付近まで活性をほぼ完全に残存
   し、55℃付近で約70％の活性を残存する。 （ｇ）阻害、安定化 水銀イオンにより活性が阻害される。 カルシウムイオンにより熱安定性が向上する。 （ｈ）分子量 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、46,00
   0±1,000。 超遠心分析法により、47,000±2,000。 （ｉ）等電点 ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法により、pI4.
   8附近。 （ｊ）紫外部吸収 475乃至280nm附近。
2. 【請求項２】Ｎ末端領域のアミノ酸配列として、Ｎ末端
   からアスパラギン酸−グルタミン−アラニン−グリシン
   −リジン−セリン−プロリン−アスパラギン−アラニン
   −バリン−を有していることを特徴とする特許請求の範
   囲第（１）項のマルトテトラオース生成アミラーゼ。
3. 【請求項３】シュードモナス属に属するマルトテトラオ
   ース生成アミラーゼ産生能を有する細菌を、栄養培地で
   培養し、下記の理化学的性質を有するマルトテトラオー
   ス生成アミラーゼを産生せしめ、これを採取することを
   特徴とするマルトテトラオース生成アミラーゼの製造方
   法。 （ａ）作用 澱粉に作用して、主にマルトテトラオースを生成する。 （ｂ）基質特異性 澱粉、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲンおよ
   びβ−リミットデキストリンに作用し、シクロデキスト
   リン、デキストラン、プルランおよびエルシナンには、
   実質的に作用しない。 （ｃ）至適pH 40℃、20分間で、pH7.0乃至7.5附近。 （ｄ）安定pH 40℃、１時間で、pH6.5乃至9.5附近。 （ｅ）至適温度 pH7.0、20分間で、50℃附近。 （ｆ）安定温度 pH7.0、１時間で、45℃附近まで。但し、カルシウムイ
   オン共存下では、50℃附近まで活性をほぼ完全に残存
   し、55℃附近で約70％の活性を残存する。 （ｇ）阻害、安定化 水銀イオンにより活性が阻害される。 カルシウムイオンにより熱安定性が向上する。 （ｈ）分子量 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、46,00
   0±1,000。 超遠心分析法により、47,000±2,000。 （ｉ）等電点 ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法により、pI4.
   8附近。 （ｊ）紫外部吸収 275乃至280nm附近。
4. 【請求項４】細菌がシュードモナス スツッツェリであ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第（３）項記載のマ
   ルトテトラオース生成アミラーゼの製造方法。
5. 【請求項５】細菌が、シュードモナス スツッツェリ
   MO−19、FERM BP−1682であることを特徴とする請求の
   範囲第（３）項または第（４）項記載のマルトテトラオ
   ース生成アミラーゼの製造方法。
6. 【請求項６】マルトテトラオース生成アミラーゼが、Ｎ
   末端領域のアミノ酸配列として、Ｎ末端からアスパラギ
   ン酸−グルタミン−アラニン−グリシン−リジン−セリ
   ン−プロリン−アスパラギン−アラニン−バリン−をゆ
   うしていることを特徴とする特許請求の範囲第（３）
   項、第（４）項または第（５）項記載のマルトテトラオ
   ース生成アミラーゼの製造方法。