JP3557272B2 - 組換え型酵素とその製造方法並びに用途 - Google Patents
組換え型酵素とその製造方法並びに用途 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3557272B2 JP3557272B2 JP05825895A JP5825895A JP3557272B2 JP 3557272 B2 JP3557272 B2 JP 3557272B2 JP 05825895 A JP05825895 A JP 05825895A JP 5825895 A JP5825895 A JP 5825895A JP 3557272 B2 JP3557272 B2 JP 3557272B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- reducing
- trehalose
- producing
- recombinant enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
この発明は、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する新規な組換え型酵素とその製造方法並びに用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トレハロースは、グルコース２分子が還元性基同士結合した二糖類であり、天然には細菌、真菌、藻類、昆虫などに微量存在する。トレハロースは分子中に還元性基を持たないので、アミノ酸類の存在下で加熱しても褐変反応を起こすことがなく、着色や変質の懸念なく飲食物を甘味付けできる利点がある。しかしながら、従来の製造方法では所望量を入手するのが難しく、実際に飲食物の甘味付けに使われることは殆ど無かった。
【０００３】
これまでの製造方法は、微生物の菌体を利用する方法と、糖質に複合酵素系を作用させる方法とに大別される。前者の方法は、特開昭５０−１５４４８５号公報などにも見られるように、細菌、酵母などの微生物を栄養培地で増殖させ、培養物中の菌体からトレハロースを採取するものである。一方、後者の方法は、特開昭５８−２１６６９５号公報などにも見られるように、基質にマルトースを使用し、これにマルトース・フォスフォリラーゼとトレハロース・フォスフォリラーゼからなる複合酵素系を作用させ、生成したトレハロースを系外に取出すものである。前者の方法は、微生物そのものの増殖は比較的容易なものの、トレハロースを菌体から採取するのに一連の繁雑な工程を要し、しかも、菌体に含まれるトレハロースが１５％（ｗ／ｗ）と僅少であるという問題があった。後者の方法は、トレハロースそのものの分離は比較的容易なものの、反応自体が２種類の酵素による平衡反応であり、しかも、その平衡が常時グルコース燐酸側に傾いていることから、基質を高濃度にして反応させ、トレハロースの収量を上げることが原理的に難しかった。
【０００４】
斯かる状況に鑑み、本発明者が、澱粉糖からトレハロース構造を有する糖質を生成する酵素につき鋭意検索したところ、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１やアルスロバクター・スピーシーズＱ３６などの微生物が、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成するという、従来未知の全く新規な酵素を産生することが判明した。この知見とあい前後して、この非還元性糖質は、同じくリゾビウム・スピーシーズＭ−１１やアルスロバクター・スピーシーズＱ３６が産生する別の酵素により、ほぼ定量的にトレハロースとグルコース及び／又はマルトオリゴ糖に加水分解されることが判明した。これら酵素を併用することにより、澱粉を原料に所望量のトレハロースが比較的容易に得られることとなり、トレハロースに係わる前記課題は悉く解決されていくものと期待される。しかしながら、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１もアルスロバクター・スピーシーズＱ３６も当該酵素の産生能が充分でなく、トレハロースや末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を大規模に製造しようとすると、微生物を大量に培養しなければならないという問題がある。
【０００５】
一方、昨今の組換えＤＮＡ技術の進歩には目覚しいものがある。今日では、全アミノ酸配列が解明されていない酵素であっても、これをコードする遺伝子を単離し、その塩基配列を解明できれば、その酵素をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを作製し、これを微生物や動植物の細胞に導入して得られる形質転換体を培養することにより、比較的容易に所望量の酵素が取得できるようになった。斯かる状況に鑑み、両酵素をコードする遺伝子を突き止め、その塩基配列を解明するのが急務となっている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
この発明の目的は、組換えＤＮＡ技術を応用して斯かる酵素を創製することにある。
【０００７】
この発明の別の目的は、その創製された酵素の製造方法を提供することにある。
【０００８】
この発明のさらに別の目的は、その創製された酵素を使用する還元性澱粉糖の変換方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この発明は、前記第一の課題を、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する組換え型酵素により解決するものである。
【００１０】
この発明は、前記第二の課題を、その組換え型酵素を産生する形質転換体を培養し、培養物から組換え型酵素を採取する組換え型酵素の製造方法により解決するものである。
【００１１】
この発明は、前記第三の課題を、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖に組換え型酵素を作用させて該澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成させる工程を含んでなる還元性澱粉糖の変換方法により解決するものである。
【００１２】
【作用】
この発明による組換え型酵素は、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖に作用して末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する。
【００１３】
この発明の製造方法にしたがって形質転換体を培養すれば、所望量の組換え型酵素が比較的容易に得られる。
【００１４】
この発明の変換方法により、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖は、末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質に変換される。
【００１５】
この発明は、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する、従来未知の全く新規な酵素の発見に基づくものである。斯かる酵素はリゾビウム・スピーシーズＭ−１１やアルスロバクター・スピーシーズＱ３６の培養物から得ることができ（以下、それぞれ「酵素Ｍ−１１」又は「酵素Ｑ３６」と云う。）、本発明者がカラムクロマトグラフィーを中心とする種々の精製方法を組合せてこの酵素を単離し、その性質・性状を調べたところ、その本質はポリペプチドであり、次のような理化学的性質を有することが判明した。
（１） 作用
グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する。
（２） 分子量
約７６，０００乃至８７，０００ダルトン（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
（３） 等電点
約３．６乃至４．６（等電点電気泳動）
（４） 至適温度
ｐＨ７．０で６０分間インキュベートすると、３５乃至４０℃付近に至適温度を示す。
（５） 至適ｐＨ
４０℃で６０分間インキュベートすると、ｐＨ６．４乃至７．２付近に至適ｐＨを示す。
（６） 熱安定性
ｐＨ７．０で６０分間インキュベートすると、３５乃至４０℃付近まで安定である。
（７） ｐＨ安定性
２５℃で１６時間インキュベートすると、ｐＨ５．５乃至１１．０付近まで安定である。
【００１６】
次に、これら理化学的性質を解明すべく行なった実験について説明する。
【００１７】
【実験例１ 精製酵素の調製】
【００１８】
【実験例１−１ 酵素Ｍ−１１の精製】
５００ｍｌ容三角フラスコにマルトース２．０％（ｗ／ｖ）、ペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸水素二ナトリウム０．１％（ｗ／ｖ）及び燐酸二水素カリウム０．１％（ｗ／ｖ）を含む液体培地（ｐＨ７．０）を１００ｍｌずつとり、１２０℃で２０分間オートクレーブして滅菌した。冷却後、三角フラスコ内の液体培地にリゾビウム・スピーシーズＭ−１１を植菌し、回転振盪下、２７℃で２４時間種培養した。別途、３０ｌ容ジャーファーメンタに上記と同組成の液体培地を２０ｌとり、滅菌後、上記で得た種培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、液体培地をｐＨ６乃至８に保ちつつ、３０℃で２４時間通気撹拌培養した。
【００１９】
次に、上記で得た培養物約１８ｌを超高圧菌体破砕装置にとり、菌体を破砕後、遠心分離により採取した上清約１６ｌに硫酸アンモニウムを２０％飽和になるように加え、４℃で１時間静置後、遠心分離により沈澱部を除去した。得られた上清に６０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、４℃で２４時間静置後、沈澱部を遠心分離により採取し、最少量の１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して２４時間透析後、遠心分離により不溶物を除去した。得られた上清を予め１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化させておいた東ソー製イオン交換クロマトグラフィー用カラム『ＤＥＡＥ−トヨパール』に負荷し、０Ｍから０．５Ｍに上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液した。溶出液より酵素を含む画分を採取し、２Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して１０時間透析後、遠心分離により不溶物を除去した。その後、上清を予め２Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化させておいた東ソー製疎水クロマトグラフィー用カラム『ブチルトヨパール』に負荷し、２Ｍから０Ｍに低下する硫酸アンモニウムの濃度勾配下、カラムに５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液した。溶出液から酵素を含む画分を採取し、予め５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化させておいた東ソー製ゲル濾過カラムクロマトグラフィー用カラム『トヨパールＨＷ−５５』に負荷し、カラムに５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液し、溶出液から酵素を含む画分を採取した。このようにして精製した酵素Ｍ−１１の比活性は約１９５単位／ｍｇ蛋白質であり、収量は培養物１ｌ当たり約２２０単位であった。
【００２０】
なお、この発明を通じて、酵素の活性は次の方法により測定した活性値（単位）で表示する。すなわち、マルトペンタオースを１．２５％（ｗ／ｖ）含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を４ｍｌとり、これに酵素液を１ｍｌ加え、４０℃で６０分間インキュベートして反応させた後、反応液を１００℃で１０分間加熱して反応を停止させる。反応液を蒸留水で１０倍希釈した後、ソモギ・ネルソン法により還元力を測定する。当該酵素の１単位とは、上記条件下において、１分間にマルトペンタオース１μｍｏｌに相当する還元力を低下させる酵素の量と定義する。
【００２１】
【実験例１−２ 酵素Ｑ３６の精製】
実験例１−１と同様にアルスロバクター・スピーシーズＱ３６を培養し、培養物を処理したところ、比活性約２００単位／ｍｇ蛋白質の精製酵素Ｑ３６が、培養物１ｌ当たり、約２９５単位の収量で得られた。
【００２２】
【実験例２ 酵素の理化学的性質】
【００２３】
【実験例２−１ 作用】
基質としてグルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース又はマルトヘプタオースを２０％（ｗ／ｖ）含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に実験例１で得た精製酵素Ｍ−１１又は精製酵素Ｑ３６を基質１ｇ当たり２単位加え、４０℃で４８時間反応させた。常法により反応物を脱塩した後、和光純薬製高速液体クロマトグラフィー用カラム『ＷＢ−Ｔ−３３０』に負荷し、溶出液の糖濃度を東ソー製示差屈折計『ＲＩ−８０１２型』でモニターしながら、室温下にてカラムに蒸留水を０．５ｍｌ／分の流速で通液することにより、反応物に含まれる糖質を分離した。表１及び表２に、それぞれ、酵素Ｍ−１１または酵素Ｑ３６を加えた場合の反応物の糖組成を示す。 なお、表中の糖質Ｐ１乃至Ｐ５は、反応により生成した糖質をグルコース重合度の小さい順に命名したものである。
【００２４】
【表１】
【００２５】
【表２】
【００２６】
表１及び表２の結果から明らかなように、酵素Ｍ−１１及び酵素Ｑ３６は、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース及びマルトヘプタオースなどのグルコース重合度が３以上の還元性澱粉糖からは新たな糖質を生成するけれども、グルコース重合度が３を下回るグルコースやマルトースからは新たな糖質を生成しない。また、反応により生成した糖質はそれぞれ糖質Ｐ１乃至Ｐ５のみであり、糖質Ｐ２乃至Ｐ５の含量は固形分当たり８５％以上と著しく高かった。
【００２７】
次に、糖質Ｐ１乃至Ｐ５を分離すべく、東京有機化学工業製強酸性カチオン交換樹脂『ＸＴ−１０１６（Ｎａ＋型）』を内径２．０ｃｍ、長さ１ｍのジャケット付きステンレス製カラム３本に充填し、これらカラムを直列に連結した。そして、カラム内の温度を５５℃に保ちつつ、カラムに糖質Ｐ１乃至Ｐ５のいずれかを含む前記反応物を別々に負荷した後、カラムに５５℃の蒸留水をＳＶ０．１３の流速で通液した。溶出液の糖組成を調べ、糖質Ｐ１乃至Ｐ５のいずれかを固形分で９７％以上含む画分を採取し、真空乾燥により粉末化した。このようにして精製した糖質Ｐ１乃至Ｐ５の還元力をソモギ・ネルソン法により調べたところ、いずれの糖質にも実質的な還元力は認められなかった。
【００２８】
さらに、糖質Ｐ１乃至Ｐ５を同定すべく、これら糖質のいずれかを５０ｍｇとり、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）１ｍｌに溶解後、グルコアミラーゼを１単位加え、４０℃で６時間インキュベートした。表１及び表２に示す反応物の糖組成を高速液体クロマトグラフィーにより分析したところ、それぞれ表３及び表４に示すように、全ての反応物からグルコースとトレハロースが検出された。同様にして、糖質Ｐ１乃至Ｐ５にβ−アミラーゼを作用させたところ、糖質Ｐ１及びＰ２がβ−アミラーゼの作用を受けなかったのに対して、糖質Ｐ３は１分子のマルトースと糖質Ｐ１を、糖質Ｐ４は１分子のマルトースと糖質Ｐ２を、また、糖質Ｐ５は２分子のマルトースと糖質Ｐ１を与えた。
【００２９】
【表３】
【００３０】
【表４】
【００３１】
表３及び表４の結果は、糖質Ｐ１乃至Ｐ５が１分子のトレハロースと１乃至５分子のグルコースにより構成されることを強く示唆している。また、グルコアミラーゼがマルトオリゴ糖におけるα−１，４結合及びα−１，６結合に特異的に切断することと、β−アミラーゼがマルトオリゴ糖におけるα−１，４結合をその末端よりマルトース単位で切断することから、糖質Ｐ１乃至Ｐ５は、グルコース又はグルコース重合度が２乃至５のマルトオリゴ糖の末端にトレハロース残基が１個結合した構造を有していると推定される。
【００３２】
以上の結果を総合的に判断すると、糖質Ｐ１乃至Ｐ５は、それぞれ、α−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース又はα−マルトペンタオシルトレハロースと同定され、このことは、当該酵素にグルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する作用のあることを裏付けている。
【００３３】
【実験例２−２ 分子量】
ユー・ケー・レムリが『ネーチャー』、第２２７巻、第６８０〜６８５頁（１９７０年）に報告している方法に準じて精製酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動したところ、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、分子量約７６，０００乃至８７，０００ダルトンに相当する位置に単一バンドが観察された。なお、このときの分子量マーカは、ミオシン（２００，０００ダルトン）、β−ガラクトシダーゼ（１１６，２５０ダルトン）、フォスフォリラーゼＢ（９７，４００ダルトン）、血清アルブミン（６６，２００ダルトン）及びオボアルブミン（４５，０００ダルトン）であった。
【００３４】
【実験例２−３ 等電点】
等電点電気泳動法により測定したところ、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、約３．６乃至４．６に等電点を示した。
【００３５】
【実験例２−４ 至適温度】
常法により、５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で６０分間インキュベートする条件で試験したところ、図１又は図２に示すように、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、３５乃至４０℃付近に至適温度を示した。
【００３６】
【実験例２−５ 至適ｐＨ】
常法により、ｐＨの相違する５０ｍＭ酢酸緩衝液、燐酸緩衝液又は炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液中、４０℃で６０分間インキュベートする条件で試験したところ、図３又は図４に示すように、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、ｐＨ６．４乃至７．２付近に至適ｐＨを示した。
【００３７】
【実験例２−６ 熱安定性】
常法により、５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で６０分間インキュベートする条件で試験したところ、図５又は図６に示すように、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、３５乃至４０℃付近まで安定であった。
【００３８】
【実験例２−７ ｐＨ安定性】
常法により、ｐＨの相違する５０ｍＭ酢酸緩衝液、燐酸緩衝液又は炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液中、２５℃で１６時間インキュベートする条件で試験したところ、図７又は図８に示すように、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、ｐＨ５．５乃至１１．０付近まで安定であった。
【００３９】
【実験例２−８ Ｎ末端アミノ酸配列】
常法により、アプライッド・バイオシステム製気相プロテイン・シーケンサ『４７０Ａ型』を使用して分析したところ、酵素Ｍ−１１は、Ｎ末端に配列表における配列番号７に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００４０】
同様に分析したところ、酵素Ｑ３６は、Ｎ末端に配列表における配列番号８に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００４１】
【実験例２−９ 部分アミノ酸配列】
実験例１−１で得た精製酵素Ｍ−１１を適量とり、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して４℃で１８時間透析後、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて酵素濃度を約１ｍｇ／ｍｌとした。この溶液を約１ｍｌとり、リジルエンドペプチダーゼを１０μｇ加え、３０℃で２２時間インキュベートして酵素を部分加水分解した。加水分解物を、予め１６％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸により平衡化させておいた資生堂製逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム『カプセルパックＣ１８』に負荷し、次いで、１６％（ｖ／ｖ）から６４％（ｖ／ｖ）に上昇するアセトニトリルの濃度勾配下、カラムに０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を０．９ｍｌ／分の流速で通液した。そして、通液開始から約２８分後又は約４０分後に溶出したペプチド断片（以下、それぞれ「ペプチド断片Ａ」又は「ペプチド断片Ｂ」と云う。）を含む画分を別々に採取し、真空乾燥後、５０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸に溶解した。以後、実験例２−８と同様に分析したところ、ペプチド断片Ａ及びＢは、配列表における配列番号９及び１０に示すアミノ酸配列を有していることが判明した
【００４２】
別途、実験例１−２で得た精製酵素Ｑ３６を上記と同様にして部分加水分解し、予め２４％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸により平衡化させておいた日本ミリポア・リミテッド製逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム『マイクロボンダパックＣ１８』に負荷し、２４％（ｖ／ｖ）から４４％（ｖ／ｖ）に上昇する水性アセトニトリルの濃度勾配下、カラムに０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を０．９ｍｌ／分の流速で通液した。そして、通液開始から約２２分後又は約４０分後に溶出したペプチド断片（以下、それぞれ「ペプチド断片Ｃ」又は「ペプチド断片Ｄ」と云う。）を含む画分を採取し、真空乾燥後、５０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸に溶解した。以後、上記と同様に分析したところ、ペプチド断片Ｃ及びＤは、配列表における配列番号１１及び１２に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００４３】
以上のような理化学的性質を有する酵素は未だ知られておらず、新規物質であると判断される。なお、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１は岡山県岡山市の土壌から分離され、平成４年１２月２４日以降、茨城県つくば市東１丁目１番３号にある通商産業省、工業技術院、生命工学工業技術研究所、特許微生物寄託センターに寄託番号『ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３０』で寄託されている。一方、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６は岡山県総社市の土壌から分離されたものであり、平成５年６月３日以降、同センターに寄託番号『ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１６』で寄託されている。同じ出願人による特願平５−３４９２１６号明細書には、酵素の性質・性状とともに、両微生物の菌学的性質が詳細に開示されている。
【００４４】
そこで、本発明者が、実験例２−９で明らかにした酵素Ｍ−１１の部分アミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブに使用し、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１の染色体ＤＮＡを鋭意検索した結果、配列表における配列番号３に示す塩基配列を有する２，３１６塩基対からなるＤＮＡ断片が得られた。そして、その塩基配列を解読したところ、酵素Ｍ−１１は７７２個のアミノ酸からなる配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００４５】
一方、酵素Ｑ３６の部分アミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブにし、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６の染色体ＤＮＡを同様に検索したところ、配列表における配列番号４に示す塩基配列を有する２，３２５塩基対からなるＤＮＡ断片が得られた。この塩基配列を解読したところ、酵素Ｑ３６は７７５個のアミノ酸からなり、配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００４６】
配列表における配列番号１乃至４に示す塩基配列及びアミノ酸配列を解明するに到った一連の工程を要約すると、次のようになる。
（１） 供与体微生物の培養物から当該酵素を分離し、高度に精製した。精製酵素をプロテアーゼにより部分加水分解後、加水分解物から２種類のペプチド断片を単離し、そのアミノ酸配列を決定した。
（２） 別途、供与体微生物の菌体より染色体ＤＮＡを分離し、精製後、制限酵素により部分的に切断して約３，０００乃至７，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。ＤＮＡリガーゼにより、このＤＮＡ断片を予め制限酵素で切断しておいたプラスミドベクターに連結し、組換えＤＮＡを作製した。
（３） 大腸菌に組換えＤＮＡを導入して形質転換体を作製し、前記部分アミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブとするコロニーハイブリダイゼーションにより当該酵素をコードするＤＮＡを含む形質転換体を選択した。
（４） 形質転換体から組換えＤＮＡを採取し、プライマーとともにアニーリング後、ＤＮＡポリメラーゼを作用させてプライマーを伸長し、得られた相補鎖ＤＮＡをジデオキシ・チェーン・ターミネータ法により分析して塩基配列を決定した。そして、その塩基配列から推定されるアミノ酸配列と前記部分アミノ酸配列とを比較し、その塩基配列が当該酵素をコードしていることを確認した。
【００４７】
次の実験例３乃至６では、上記の工程（２）乃至（４）を具体的に説明するが、これら実施例で用いる手法自体は斯界において公知のものであり、例えば、ジェー・サムブルック等『モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル』、第２版、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス発行などにも詳述されている。
【００４８】
【実験例３ リゾビウム・スピーシーズＭ−１１に由来するＤＮＡを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製】
【００４９】
【実験例３−１ 染色体ＤＮＡの調製】
リゾビウム・スピーシーズＭ−１１をバクト・ニュートリエント・ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、２７℃で２４時間回転振盪培養した。遠心分離により培養物から菌体を分離し、ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に浮遊させ、リゾチームを０．０５％（ｗ／ｖ）加えた後、３７℃で３０分間インキュベートした。処理物を−８０℃で１時間凍結後、ＴＳＳ緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて６０℃に加温し、ＴＥＳ緩衝液／フェノール混液を加え、氷冷後、遠心分離により上清を採取した。この上清に２倍容の冷エタノールを加え、沈澱した粗染色体ＤＮＡを採取し、ＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解後、リボヌクレアーゼとプロテアーゼをそれぞれ７．５μｇ又は１２５μｇ加え、３７℃で１時間インキュベートして反応させた。その後、反応物にクロロフォルム／イソアミルアルコール混液を加えて染色体ＤＮＡを抽出し、冷エタノールを加え、生成した染色体ＤＮＡを含む沈澱を採取した。このようにして得た精製染色体ＤＮＡを濃度約１ｍｇ／ｍｌになるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、溶液を−８０℃で凍結した。
【００５０】
【実験例３−２ 組換えＤＮＡ ｐＢＭＴ７と形質転換体ＢＭＴ７の調製】実験例３−１で得た精製染色体ＤＮＡ溶液を約１ｍｌとり、これに制限酵素Ｓａｕ ３ＡＩを約３５単位加え、３７℃で約２０分間反応させて染色体ＤＮＡを部分切断した後、蔗糖密度勾配超遠心法により約３，０００乃至７，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。別途、プラスミドベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）を１μｇとり、常法により制限酵素Ｂａｍ ＨＩを作用させて完全に切断した後、上記で得たＤＮＡ断片１０μｇとＴ４ ＤＮＡリガーゼを２単位加え、４℃で一夜静置することによりＤＮＡ断片をベクター断片に連結した。そして、得られた組換えＤＮＡに東洋紡績製コンピテントセル『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ』を３０μｌ加え、氷冷下に３０分間静置後、４２℃に加温し、ＳＯＣブロスを加えて３７℃で１時間インキュベートすることにより、組換えＤＮＡを大腸菌に導入した。
【００５１】
次に、上記で得た形質転換体を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド５０μｇ／ｍｌを含む寒天平板培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で１８時間培養後、培地上にナイロン膜を載置し、培地上に形成された約４，４００個のコロニーをナイロン膜に固定した。別途、常法により、配列表における配列番号９に示すアミノ酸配列における第１７乃至２１番目のＰｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓで表される配列に基づき５′−ＣＣＮＧＡＲＴＧＧＧＡＲＡＡ−３′で表される塩基配列のプローブ１を化学合成し、同位体３２Ｐで標識後、前記ナイロン膜上に固定した形質転換体のコロニーにハイブリダイズさせ、顕著な会合が認められた９種類の形質転換体を選択した。
【００５２】
常法により、これら９種類の形質転換体から組換えＤＮＡを採取し、配列表における配列番号１０に示すアミノ酸配列における第１６乃至２０番目のＴｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ａｓｐで表される配列に基づき化学合成した５′−ＡＣＮＧＡＲＴＴＹＴＧＧＧＡ−３′で表される塩基配列のプローブ２をイー・エム・サザーン『ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー』、第９８巻、第５０３〜５１７頁（１９７５年）に記載されている方法に準じてハイブリダイズさせ、プローブ２と顕著な会合を示した組換えＤＮＡを選択した。以上のようにして選択した組換えＤＮＡと形質転換体を、それぞれ、『ｐＢＭＴ７』又は『ＢＭＴ７』と命名した。
【００５３】
上記で得た形質転換体ＢＭＴ７をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常一般のアルカリ法により組換えＤＮＡを菌体外に溶出させた。処理物を常法により精製し、分析したところ、組換えＤＮＡ ｐＢＭＴ７は約９，３００塩基対からなり、図９に示す制限酵素地図で表される構造を有していた。図９に示すように、酵素Ｍ−１１をコードする２，３１６塩基対からなるＤＮＡは、制限酵素Ｐｓｔ Ｉによる切断部位付近の下流に位置していることが判明した。
【００５４】
【実験例３−３ 形質転換体による酵素の産生】
マルトース２．０％（ｗ／ｖ）、ペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸水素二ナトリウム０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸二水素カリウム０．１％（ｗ／ｖ）を含む液体培地をｐＨ７．０に調整し、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加え、１２０℃で２０分間加熱滅菌し、冷却後、実験例３−２で得た形質転換体ＢＭＴ７を植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去後、上清中の酵素活性を測定したところ、培養物１ｌ当たりに換算して、約３，０００単位の酵素が産生していた。
【００５５】
別途、対照として、大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株及びリゾビウム・スピーシーズＭ−１１をアンピシリン無含有の同じ液体培地に植菌し、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１の場合、培養温度を３０℃に設定した以外は上記と同様に培養・処理した。処理物の活性を測定したところ、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１による酵素の産生は培養物１ｌ当たり約１，５００単位と、形質転換体ＢＭＴ７と比較して有意に低いものであった。なお、宿主に使用した大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株は、当該酵素を全く産生しなかった。
【００５６】
その後、形質転換体ＢＭＴ７が産生した酵素を実験例１−１と同様に精製し、その性質・性状を調べたところ、組換え型酵素はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量値約７６，０００乃至８７，０００ダルトンを、また、等電点電気泳動で約３．６乃至４．６に等電点を示すなど、実験例２で得られた酵素Ｍ−１１のものと同様の理化学的性質を有することが判明した。このことは、組換えＤＮＡ技術によっても当該酵素を製造でき、且つ、酵素の生産性も有意に向上することを示唆している。
【００５７】
【実験例４ リゾビウム・スピーシーズＭ−１１に由来する相補鎖ＤＮＡの調製とその塩基配列、アミノ酸配列の決定】
実験例３−２で得た組換えＤＮＡ ｐＢＭＴ７を、常法に従って、各種制限酵素で分解し、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）にサブクローニングして、塩基配列決定用ＤＮＡとした。これら塩基配列決定用ＤＮＡを２μｇとり、これに２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加えて変性させた後、適量の冷エタノールを加え、生成したテンプレートＤＮＡを含む沈澱を採取し、真空乾燥した。このテンプレートＤＮＡに化学合成した５′−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３′で表される塩基配列のプライマー１を５０ｐｍｏｌ／ｍｌと、２０ｍＭ塩化マグネシウムと５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を１０μｌ加え、６５℃で２分間インキュベートしてアニーリングした後、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰをそれぞれ７．５μＭ含む水溶液を２μｌと、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（２ｍＣｉ／ｍｌ）を０．５μｌと、０．１Ｍジチオスレイトールを１μｌと、１．５単位／ｍｌのＴ７ ＤＮＡポリメラーゼを２μｌ加え、２５℃で５分間インキュベートすることによりプライマー１を５′末端から３′末端に向かって伸長させ、相補鎖ＤＮＡを生成させた。
【００５８】
次に、上記で得た相補鎖ＤＮＡを含む反応物を四等分し、それぞれにｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ及びｄｄＴＴＰのいずれかを８μＭと８０μＭ ｄＮＴＰを含む５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液を２．５μｌ加え、３７℃で５分間インキュベートして反応させ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）ブロムフェノールブルー及び０．０５％（ｗ／ｖ）キシレンシアノールを含む９５％（ｖ／ｖ）水性ホルムアミド溶液を４μｌ加えて反応を停止させた。反応物を沸騰水浴中で３分間加熱後、６％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル上にとり、約２，０００Ｖの定電圧を印加しながら電気泳動してＤＮＡ断片を分離し、次いで、常法によりゲルを固定し、乾燥させた後、オートラジオグラフィーした。
【００５９】
ラジオグラム上に分離したＤＮＡ断片を解析した結果、相補鎖ＤＮＡは配列表における配列番号５に示す２，９３６塩基対からなる塩基配列を含んでいることが判明した。この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は配列表における配列番号５に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と配列表における配列番号７、９又は１０に示す酵素Ｍ−１１のＮ末端アミノ酸配列、部分アミノ酸配列を比較したところ、配列番号７のＮ末端アミノ酸配列は配列表における配列番号５における第１乃至２０番目の配列に、また、配列番号９又は１０の部分アミノ酸配列は配列表における配列番号５における第４８６乃至５０６番目又は第６０６乃至６２６番目の配列に一致した。これは、酵素Ｍ−１１が配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有するものであり、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１においては、酵素Ｍ−１１が配列表における配列番号３に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示している。
【００６０】
【実験例５ アルスロバクター・スピーシーズＱ３６に由来するＤＮＡを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製】
【００６１】
【実験例５−１ 染色体ＤＮＡの調製】
実験例３−１と同様にしてアルスロバクター・スピーシーズＱ３６から染色体ＤＮＡを分離・精製し、濃度約１ｍｇ／ｍｌになるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、−８０℃で凍結した。
【００６２】
【実験例５−２ 組換えＤＮＡ ｐＢＱＴ１３と形質転換体ＢＱＴ１３の調製】
実験例５−１で得た精製染色体ＤＮＡ溶液を実験例３−２と同様に部分切断した後、蔗糖密度勾配超遠心法により約３，０００乃至６，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。その後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用し、このＤＮＡ断片を実験例３−２と同様に制限酵素Ｂａｍ ＨＩによるベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）の消化物に連結し、得られた組換えＤＮＡを大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株に導入した。得られた形質転換体を実験例３−２と同様に５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシドを含む寒天平板培地で培養し、生成した約４，５００個のコロニーをナイロン膜上に固定する一方、配列表における配列番号１２に示すアミノ酸配列における第１１乃至１６番目のＰｈｅ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ａｓｐで表される配列に基づき５′−ＴＴＹＧＡＹＧＴＮＧＡＹＴＧＧＧＡ−３′で表される塩基配列のプローブ３を化学合成し、同位体３２Ｐで標識後、前記ナイロン膜上に固定した形質転換体のコロニーにハイブリダイズさせ、顕著な会合が認められた８種類の形質転換体を選択した。
【００６３】
実験例３−２と同様にして、これら８種類の形質転換体から組換えＤＮＡを採取し、配列表における配列番号１１に示すアミノ酸配列における第１６乃至２０番目のＴｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ａｓｐで表される配列に基づき化学合成した５′−ＡＣＮＧＡＲＴＴＹＴＧＧＧＡ−３′で表される塩基配列のプローブ４をハイブリダイズさせ、顕著な会合を示した組換えＤＮＡを選択した。以上のようにして選択した組換えＤＮＡと形質転換体を、それぞれ、『ｐＢＱＴ１３』又は『ＢＱＴ１３』と命名した。
【００６４】
その後、この形質転換体ＢＱＴ１３をアンピシリンを含むＬ−ブロス培地で実験例３−２と同様に培養し、培養物より採取した菌体から組換えＤＮＡを溶出させ、精製し、分析したところ、組換えＤＮＡ ｐＢＱＴ１３は約７，２００塩基対からなり、図１０に示す制限酵素地図で表される構造を有していた。図１０に示すように、酵素Ｑ３６をコードする２，３２５塩基対からなるＤＮＡは、制限酵素Ｘｍｎ Ｉによる切断部位付近の下流に位置していることが判明した。
【００６５】
【実験例５−３ 形質転換体ＢＱＴ１３による酵素の産生】
マルトース２．０％（ｗ／ｖ）、ペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸水素二ナトリウム０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸二水素カリウム０．１％（ｗ／ｖ）を含む液体培地をｐＨ７．０に調整し、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加え、１２０℃で２０分間加熱滅菌し、冷却後、実験例５−２で得た形質転換体ＢＱＴ１３を植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去後、上清中の酵素活性を測定したところ、培養物１ｌ当たりに換算して、約２，４５０単位の酵素が産生していた。
【００６６】
別途、対照として、大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株及びアルスロバクター・スピーシーズＱ３６をアンピシリン無含有の同じ組成の液体培地に植菌し、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６の場合、培養温度を３０℃に設定した以外は上記と同様に培養・処理した。処理物の活性を測定したところ、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６による酵素の産生は培養物１ｌ当たり約１，２００単位と、形質転換体ＢＱＴ１３と比較して有意に低いものであった。なお、宿主に使用した大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株は、当該酵素を産生しなかった。
【００６７】
その後、形質転換体ＢＱＴ１３が産生した酵素を実験例１−１と同様に精製し、その性質・性状を調べたところ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量約７６，０００乃至８７，０００ダルトンを、また、等電点電気泳動で約３．６乃至４．６に等電点を示すなど、実験例２で得られた酵素Ｑ３６のものと同様の理化学的性質を有することが判明した。このことは、組換えＤＮＡ技術によっても当該酵素を製造でき、且つ、酵素の生産性も有意に向上することを示唆している。
【００６８】
【実験例６ アルスロバクター・スピーシーズＱ３６に由来する相補鎖ＤＮＡの調製とその塩基配列、アミノ酸配列の決定】
実験例５−２で得た組換えＤＮＡ ｐＢＱＴ１３を実験例４と同様に処理してテンプレートＤＮＡとし、これをプライマー１とともにアニーリング後、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼを作用させてプライマー１を５′末端から３′末端に向かって伸長させ、相補鎖ＤＮＡを生成させた。実験例４と同様に、この相補鎖ＤＮＡにジデオキシ・チェーン・ターミネータ法を適用し、ラジオグラム上に分離したＤＮＡ断片を解析した結果、相補鎖ＤＮＡは配列表における配列番号６に示す３，０７３塩基対からなる塩基配列を含んでいることが判明した。この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は配列表における配列番号６に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と配列表における配列番号８、１１又は１２に示すＮ末端アミノ酸配列、部分アミノ酸配列を比較したところ、配列番号８のＮ末端アミノ酸配列は配列表における配列番号６における第１乃至２０番目の配列に、また、配列番号１１又は１２の部分アミノ酸配列は配列表における配列番号６における第６０６乃至６２５番目又は第１１０乃至１２９番目の配列に一致した。これは、酵素Ｑ３６が配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列を有するものであり、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６においては、酵素Ｑ３６が配列表における配列番号４に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示している。
【００６９】
以上説明したように、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する酵素は、本発明者が長年に亙る研究の一成果として見出されたものであり、従来公知の酵素には見られない独特の理化学的性質を具備している。この発明は、組換えＤＮＡ技術を応用することにより、この酵素を創製しようというものである。以下、実施例等を参照しながら、この発明の組換え型酵素とその製造方法並びに用途につき、具体的に説明する。
【００７０】
この発明でいう組換え型酵素とは、組換えＤＮＡ技術により創製され、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する酵素全般を意味する。この発明の組換え型酵素は、通常、解明されたアミノ酸配列を有しており、その一例として、例えば、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列かそれに相同的なアミノ酸配列が挙げられる。配列表における配列番号１又は２のアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有する変異体は、所期の酵素作用を実質的に変えることなく、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列における構成アミノ酸の１個又は２個以上を他のアミノ酸で置換することにより得ることができる。なお、同じＤＮＡであっても、それを導入する宿主や、そのＤＮＡを含む形質転換体の培養に使用する栄養培地の成分・組成、培養温度・ｐＨなどに依っては、宿主内酵素によるＤＮＡ発現後の修飾などにより、所期の酵素反応は保持しているものの、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列におけるＮ末端付近のアミノ酸が１個又は２個以上欠失したり、Ｎ末端に１個又は２個以上のアミノ酸が新たに付加した変異体の産生することがある。斯かる変異体も、それがグルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成するかぎり、当然、この発明の組換え型酵素に包含される。
【００７１】
この発明による組換え型酵素は、特定のＤＮＡを含む形質転換体の培養物から採取することができる。この発明で使用する形質転換体は、例えば、配列表における配列番号３又は４に示す塩基配列かそれに相同的な塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列のＤＮＡを適宜宿主に導入することにより得ることができる。なお、上記塩基配列は、遺伝子コードの縮重を利用して、コードするアミノ酸配列を変えることなく、塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置き換えてもよい。また、ＤＮＡが宿主中で実際に当該酵素の産生を発現するために、当該酵素又はその相同変異体をコードする塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で適宜置換し得ることはいうまでもない。
【００７２】
この発明で使用するＤＮＡは、それが前述のような配列を有するかぎり、それが天然に由来するものか人為的に合成されたものであるかは問わない。天然の給源としては、例えば、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３０）、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１６）、ブレビバクテリウム・ヘロボルム（ＡＴＣＣ１１８２２）、フラボバクテリウム・アクアチレ（ＩＦＯ３７７２）、ミクロコッカス・ルテウス（ＩＦＯ３０６４）、ミクロコッカス・ロゼウス（ＡＴＣＣ１８６）、クルトバクテリウム・シトレウム（ＩＦＯ１５２３１）、マイコバクテリウム・スメグマチス（ＡＴＣＣ１９４２０）及びテラバクター・ツメスセンス（ＩＦＯ１２９６０）を含むリゾビウム属、アルスロバクター属、ブレビバクテリウム属、フラボバクテリウム属、ミクロコッカス属、クルトバクテリウム属、マイコバクテリウム属、テラバクター属の微生物が挙げられ、これら微生物の菌体からはこの発明のＤＮＡを含む遺伝子が得られる。すなわち、斯かる微生物を栄養培地に植菌し、好気的条件下で約１乃至３日間培養後、培養物から菌体を採取し、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素や超音波で処理することにより、当該ＤＮＡを含む遺伝子を菌体外に溶出させる。このとき、細胞壁溶解酵素にプロテアーゼなどの蛋白質加水分解酵素を併用したり、菌体を超音波処理する際、ＳＤＳなどの界面活性剤を共存させたり凍結融解してもよい。斯くして得られる処理物に、例えば、フェノール抽出、アルコール沈澱、遠心分離、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理などの斯界における通常一般の方法を適用すれば目的のＤＮＡが得られる。一方、ＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、配列表における配列番号３又は４に示す塩基配列に基づいて化学合成するか、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを適宜宿主に導入して得られる形質転換体を培養し、培養物から菌体を分離し、その菌体から当該ＤＮＡを含むプラスミドを採取すればよい。
【００７３】
斯かるＤＮＡは、通常、組換えＤＮＡの形態で宿主に導入される。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなり、ＤＮＡが入手できれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。斯かるベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７などのプラスミドベクターやλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、ρ１１、φ１、φ１０５などのファージベクターが挙げられ、このうち、この発明のＤＮＡを大腸菌で発現させるにはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、λｇｔ・λＣ及びλｇｔ・λＢが好適であり、一方、枯草菌で発現させるにはｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１及びφ１０５が好適である。ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７は、組換えＤＮＡを２種以上の宿主内で増殖させる場合に有用である。
【００７４】
ＤＮＡを斯かるベクターに挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、先ず、ＤＮＡを含む遺伝子と自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。遺伝子及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＩＩ型の制限酵素、詳細には、Ｓａｕ ３ＡＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｂａｍ ＨＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉなどを使用すれば、ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するのが容易となる。ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するには、必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培養することにより無限に複製可能である。
【００７５】
このようにして得られる組換えＤＮＡは、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母を始めとする適宜の宿主微生物に導入することができる。宿主が大腸菌の場合には、宿主を組換えＤＮＡとカルシウムイオンの存在下で培養すればよく、一方、宿主が枯草菌の場合には、コンピテントセル法やプロトプラスト法を適用すればよい。形質転換体をクローニングするには、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖を含む栄養培地で培養し、該澱粉糖より末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成するものを選択すればよい。
【００７６】
斯くして得られる形質転換体は、栄養培地で培養すると、菌体内外に当該酵素を産生する。栄養培地には、通常、炭素源、窒素源、ミネラル、さらには、必要に応じて、アミノ酸やビタミンなどの微量栄養素を補足した通常一般の液体培地が使用され、個々の炭素源としては、例えば、澱粉、澱粉加水分解物、グルコース、果糖、蔗糖などの糖質が、また、窒素源としては、例えば、アンモニア若しくはアンモニウム塩、尿素、硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンスティープリカー、肉エキスなどの含窒素無機乃至有機物が挙げられる。形質転換体を斯かる栄養培地に植菌し、栄養培地を温度２５乃至６５℃、ｐＨ２乃至８に保ちつつ、通気撹拌などによる好気的条件下で約１乃至６日間培養すれば、当該酵素を含む培養物が得られる。この培養物は酵素剤としてそのまま使用可能ではあるが、通常は使用に先立ち、必要に応じて、超音波や細胞壁溶解酵素により菌体を破砕した後、濾過、遠心分離などにより酵素を菌体又は菌体破砕物から分離し、精製する。精製には酵素を精製するための通常一般の方法が採用でき、例えば、菌体又は菌体破砕物を除去した培養物に濃縮、塩析、透析、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの１種若しくは２種以上を適宜組合せて適用すればよい。
【００７７】
前述のとおり、この発明による組換え型酵素は、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成するという、従来の酵素に見られない顕著な性質を有する。生成した非還元性糖質は温和で上品な甘味に加えて適度の粘度と保湿性を有し、そして、何よりも、分子中に還元性基を有しないので、着色や変質の懸念なく飲食物を甘味付けできるという大きな利点がある。当該組換え型酵素のこの性質を利用することにより、従来、還元性故に敬遠されがちであった種々の澱粉糖を、還元性を有しないか還元性が顕著に低下した、扱い易い、有用な糖質に変換できることとなる。
【００７８】
斯かる変換方法につきさらに説明すると、この発明による組換え型酵素の基質には、通常、澱粉、又はアミロペクチン、アミロースなどの澱粉質を酸及び／又はアミラーゼによって部分的に加水分解して得られる還元性澱粉加水分解物が用いられる。斯かる澱粉加水分解物は斯界における通常一般の方法により得ることができ、通常、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースなどのグルコース重合度３以上のマルトオリゴ糖の１種若しくは２種以上を含んでなる。アミラーゼ研究会編『ハンドブック・オブ・アミレーシーズ・アンド・リレイテッド・エンザイムズ』、１９８８年、パーガモン・プレス発行に記載されているα−アミラーゼ、マルトテトラオース生成アミラーゼ、マルトペンタオース生成アミラーゼ及びマルトヘキサオース生成アミラーゼは、この発明で使用する還元性澱粉糖の調製に特に有用であり、これらアミラーゼのいずれかを使用することにより、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖を豊富に含む澱粉糖混合物が容易且つ効率的に得られる。なお、このとき、必要に応じて、プルラナーゼやイソアミラーゼなどの澱粉枝切酵素を併用すれば、当該組換え型酵素の基質となり得る還元性澱粉糖の収量を上げることができる。
【００７９】
この発明による変換方法においては、通常、基質として上記したような還元性澱粉糖の１種又は２種以上を含む水溶液にこの発明による組換え型酵素を共存せしめ、水溶液を所定の温度、ｐＨに保ちつつ、所望量の非還元性糖質が生成するまで反応させる。反応は０．１％（ｗ／ｗ）程度の基質濃度下でも進行するが、この発明による変換方法を大規模に実施する場合には、より高濃度の２％（ｗ／ｗ）以上、望ましくは、５乃至５０％（ｗ／ｗ）とするのがよい。反応時の温度とｐＨは組換え型酵素が失活することなく基質に効率的に作用するレベルに設定され、温度は５５℃付近まで、望ましくは、約４０乃至５５℃に、また、ｐＨは５乃至１０、望ましくは、約６乃至８の範囲に設定される。組換え型酵素の量と反応時間は、反応の進行具合に依って適宜に設定する。斯かる反応によりグルコース重合度３以上の還元性澱粉糖の還元力は顕著に低下し、マルトペンタオースの場合、還元力はもとの約７％程度にまで低下する。
【００８０】
この発明の変換方法により得られた反応物はそのまま使用可能であるが、通常、使用に先立ち精製する。すなわち、濾過・遠心分離などにより反応物から不溶物を除去し、活性炭により脱色した後、イオン交換樹脂により脱塩・精製し、濃縮してシロップ状物とする。用途に依っては、このシロップ状物を真空乾燥、噴霧乾燥などにより固状物としてもよい。実質的に非還元性糖質のみからなる製品を得るには、上記シロップ状物にイオン交換樹脂、活性炭、シリカゲルなどによる糖質を分離するための種々のクロマトグラフィー、アルコール、アセトンなどによる分別沈澱、膜濾過、酵母による発酵、アルカリによる還元性糖質の分解除去などの１種若しくは２種以上を適用する。大量の反応物を処理するには、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報や特開昭５８−７２５９８号公報に開示されている強酸性カチオン交換樹脂を使用する固定床方式、移動床方式又は擬似移動床方式のイオン交換クロマトグラフィーが有用であり、これらの方法によるときには、非還元性糖質の含量が高い製品を大量且つ効率的に得ることができる。
【００８１】
斯くして得られる非還元性糖質は、糖質甘味剤の還元性を嫌う種々の物品に広範な用途を有し、例えば、食品、化粧品、医薬品の甘味剤、呈味改善剤、品質改善剤、安定剤、賦形剤として極めて有用である。加えて、当該非還元性糖質は、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、あるいは、特開平７−２１３２８３号公報（特願平５−３４０３４３号明細書）に開示されているトレハロース遊離酵素を作用させると、ほぼ定量的にトレハロースを与えることから、従来、大量入手が難しかったトレハロースを製造するための中間体としても有用である。
【００８２】
以下、２〜３の実施例により、この発明による組換え型酵素の製造方法と還元性澱粉糖の変換方法を具体的に説明する。
【００８３】
【実施例Ａ−１ 組換え型酵素の製造】
５００ｍｌ容三角フラスコにマルトース２．０％（ｗ／ｖ）、ペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸水素二ナトリウム０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸二水素カリウム０．１％（ｗ／ｖ）を含む液体培地（ｐＨ７．０）を１００ｍｌずつとり、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加えた後、１２０℃で２０分間オートクレーブして加熱滅菌した。冷却後、三角フラスコ内の液体培地に実験例３−２の方法で得た形質転換体ＢＭＴ７を植菌し、回転振盪下、２７℃で２４時間種培養した。別途、上記と同組成の液体培地を１８ｌとり、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加え、１２０℃で２０分間加熱滅菌し、冷却後、上記で得た種培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、３７℃で２４時間通気撹拌培養した。培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去後、上清中の酵素活性を測定したところ、培養物１ｌ当たりに換算して、約３，０００単位の酵素が産生していた。この上清を実験例１−１の方法により精製したところ、比活性約２００単位／ｍｇ蛋白質の組換え型酵素を１ｍｌ当たり約１３５単位含む水溶液が約５０ｍｌ得られた。
【００８４】
【実施例Ａ−２ 組換え型酵素の製造】
実験例５−２の方法により得た形質転換体ＢＱＴ１３を実施例Ａ−１と同様に培養し、培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去後、上清中の酵素活性を測定したところ、培養物１ｌ当たりに換算して、約２，４５０単位の酵素が産生していた。この上清を実施例１−１の方法により精製したところ、比活性約２００単位／ｍｇ蛋白質の組換え型酵素を１ｍｌ当たり約１２０単位含む水溶液が約４５ｍｌ得られた。
【００８５】
【実施例Ｂ−１ 組換え型酵素による澱粉加水分解物の変換】
馬鈴薯澱粉を濃度６％（ｗ／ｗ）になるよう水中に懸濁し、１２０℃で１０分間オートクレーブして糊化した。糊化液を５０℃に急冷し、ｐＨを約４．５に調整後、林原生物化学研究所製イソアミラーゼ剤を澱粉固形分１ｇ当たり２，５００単位加え、５０℃で２０時間反応させた。反応物をｐＨ６．０に調整し、１２０℃で１０分間オートクレーブして酵素を失活させた後、４５℃に急冷し、ノボ・ノルディスク・インダストリー製α−アミラーゼ剤『ターマミル６０Ｌ』を澱粉固形分１ｇ当たり１５０単位加え、４５℃で２４時間反応させてマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースなどのグルコース重合度３以上の還元性澱粉糖を含む反応物を得た。この反応物を１２０℃で２０分間オートクレーブして酵素を失活させ、４５℃まで急冷後、実施例Ａ−１で得た組換え型酵素を澱粉糖固形分１ｇ当たり１単位加え、４５℃で９６時間反応させた。反応物を９６℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、濾過後、常法にしたがって濾液を活性炭により脱色し、イオン交換樹脂により脱塩・精製し、濃縮して濃度約７０％（ｗ／ｗ）のシロップ状物を澱粉固形分当たり約９１％の収率で得た。
【００８６】
実験例２−１の方法によりこのシロップ状物を分析したところ、ＤＥ値は１８．７、主成分として、固形分当たりα−グルコシルトレハロースを８．４％、α−マルトシルトレハロースを５．６％、α−マルトリオシルトレハロースを３７．９％含み、前記還元性糖質の殆どが対応する非還元性糖質に変換されていた。温和で上品な甘味に加えて適度の粘性と保湿性を有する本品は、食品、化粧品、医薬品の甘味剤、呈味改善剤、品質改善剤、安定剤、賦形剤として有用である。また、本品は非還元性糖質の含量が高いので、トレハロースを製造するための中間体としても有用である。
【００８７】
【実施例Ｂ−２ 組換え型酵素による澱粉加水分解物の変換】
トウモロコシ澱粉を３３％（ｗ／ｗ）になるよう水中に懸濁し、炭酸カルシウムを０．１％（ｗ／ｗ）加えた。懸濁液にノボ・ノルディスク・インダストリー製α−アミラーゼ剤『ターマミル６０Ｌ』を澱粉固形分当たり０．２％加え、９５℃で１５分間反応させて澱粉を液化した。液化物を１２０℃で１０分間オートクレーブして酵素を失活させ、５５℃に急冷後、特開昭６３−２４０７８４号公報に開示されているシュードモナス・スツッツェリ由来のマルトテトラオース生成アミラーゼを澱粉固形分１ｇ当たり５単位加え、５５℃で６時間反応させた。その後、反応物に上田化学製α−アミラーゼ剤『α−アミラーゼ２Ａ』を澱粉固形分１ｇ当たり３０単位加え、６５℃で４時間反応させてマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースなどのグルコース重合度３以上の還元性澱粉糖を固形分当たり約５０％含む反応物を得た。この反応物を１２０℃で１０分間オートクレーブして酵素を失活させ、４５℃に急冷後、ｐＨ６．５に調整し、実施例Ａ−１の方法で得た組換え型酵素を澱粉糖固形分１ｇ当たり２単位加え、４５℃で６４時間反応させた。反応物を９５℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、濾過後、常法にしたがって活性炭により脱色し、イオン交換樹脂により脱塩・精製し、濃縮して濃度約７０％（ｗ／ｗ）のシロップ状物を澱粉固形分当たり約９０％の収量で得た。
【００８８】
実験例２−１の方法によりこのシロップ状物を分析したところ、ＤＥ値は１０．５、主成分として、固形分当たりα−グルコシルトレハロースを３．８％、α−マルトシルトレハロースを４３．８％、α−マルトリオシルトレハロースを１．２％含み、前記還元性澱粉糖の殆どが対応する非還元性糖質に変換されていた。温和で上品な甘味に加えて適度の粘性と保湿性を有する本品は、食品、化粧品、医薬品の甘味剤、呈味改善剤、品質改善剤、安定剤、賦形剤として有用である。また、本品は非還元性糖質の含量が高いので、トレハロースを製造するための中間体としても有用である。
【００８９】
【実施例Ｂ−３ 組換え型酵素によるマルトペンタオースの変換】
林原生物化学研究所製高純度マルトペンタオースを２０％（ｗ／ｗ）になるよう水中に溶解し、ｐＨ６．５に調整後、実施例Ａ−１の方法で得た組換え型酵素をマルトペンタオース１ｇ当たり１単位加え、４５℃で４８時間反応させた。反応物を９５℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、濾過し、濃縮後、実験例２−１の方法により分析したところ、マルトペンタオースの約９２％がα−マルトトリオシルトレハロースに変換されていた。
【００９０】
別途、内径５．４ｃｍ、長さ５ｍのジャケット付きステンレス製カラム４本に東京有機化学工業製強酸性カチオン交換樹脂『ＸＴ−１０１６（Ｎａ＋型）』を 均一に充填し、カラムを直列に連結して全長を２０ｍとした。カラム内温度を５５℃に保ちつつ上記反応物を樹脂に対して約５％（ｖ／ｖ）の割合で負荷し、次いで、カラムに５５℃の温水をＳＶ０．１３の流速で通液して糖質成分を溶出させた。溶出液の糖組成を分析し、当該非還元性糖質の含量が高い画分を採取し、これを濃縮し、真空乾燥し、破砕して固状物を固形分当たり約５５％の収量で得た。
【００９１】
実験例２−１の方法により分析したところ、この固状物のＤＥ値は約０．２未満であり、固形分当たりα−マルトトリオシルトレハロースを９９．０％含んでいた。吸湿性低く、極めて低い還元性とかすかな甘味を有する本品は、食品、化粧品、医薬品の甘味剤、呈味改善剤、品質改善剤、安定剤、賦形剤として有用である。また、本品は非還元性糖質の含量が高いので、トレハロースを製造するための中間体としても有用である。
【００９２】
【実施例Ｂ−４ 組換え型酵素による澱粉加水分解物の変換】
松谷化学工業製澱粉加水分解物『パインデックス＃４』を４０％（ｗ／ｗ）となるよう水中に溶解し、溶液を４５℃、ｐＨ６．５に調整後、実施例Ａ−１の方法で得た組換え型酵素を澱粉加水分解物１ｇ当たり１単位加えて９６時間反応させ、末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を含む反応物を得た。次いで、この反応物を１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、濃度約２０％（ｗ／ｗ）まで濃縮し、５５℃に冷却後、ｐＨ４．５に調整してナガセ生化学工業製グルコアミラーゼ剤『グルコチーム』を糖質固形分１ｇ当たり１０単位加え、４０時間反応させた。反応物を１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、濾過後、常法にしたがって活性炭により脱色し、イオン交換樹脂により脱塩・精製し、濃縮してトレハロースを固形分当たり約２９．７％含む濃度約６０％（ｗ／ｗ）のシロップ状物を得た。
【００９３】
このシロップ状物を強酸性カチオン交換樹脂としてオルガノ製『ＣＧ６０００（Ｎａ＋型）』を使用した以外実施例Ｂ−３と同様に分画し、トレハロースを固形分当たり約９０％含む画分を採取した。この画分を濃度約７５％（ｗ／ｗ）に濃縮後、助晶罐にとり、種晶としてトレハロース含水結晶を糖質固形分当たり約２％加え、緩やかに撹拌しながら助晶して結晶化度約４５％のマスキットを得た。このマスキットを約１５０ｋｇ／ｃｍ２の圧力下、噴霧乾燥塔の上部に設けた 噴霧ノズルより噴霧乾燥塔下方に向かって噴霧する一方、約８５℃の温風を噴霧乾燥塔の上部から下方に向かって送風しつつ、噴霧乾燥塔の底部に設けたベルトコンベア上に蓄積した結晶性粉状物を噴霧乾燥塔外に徐々に搬出した。その後、粉状物を熟成塔に移し、約４０℃の温風を送風しながら１０時間熟成して結晶化と乾燥を完了した。
【００９４】
吸湿性なく、温和で上品な甘味を有する本品は、食品、化粧品、医薬品、飼料の甘味剤、呈味改善剤、品質改善剤、安定剤、賦形剤として有用である。
【００９５】
【実施例Ｂ−５ 組換え型酵素による澱粉加水分解物の変換】
タピオカ澱粉を３４％（ｗ／ｗ）になるように水中に懸濁し、炭酸カルシウムを０．１％（ｗ／ｗ）加えた。懸濁液にノボ・ノルディスク・インダストリー製α−アミラーゼ剤『ターマミル６０Ｌ』を澱粉固形分当たり０．２％加え、９５℃で１５分間反応させて澱粉を液化した。液化物を１２０℃で１０分間オートクレーブして酵素を失活させ、５５℃に急冷し、ｐＨ５．２に調整後、上田化学製α−アミラーゼ剤『α−アミラーゼ２Ａ』と林原生物化学研究所製イソアミラーゼ剤を澱粉固形分１ｇ当たりそれぞれ１０単位又は５００単位加え、５５℃で２０時間反応させてマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースなどのグルコース重合度３以上の還元性澱粉糖を固形分当たり約６０％含むＤＥ約２９の反応物を得た。この反応物を１２０℃で１０分間オートクレーブして酵素を失活させ、４５℃に急冷し、ｐＨ６．５に調整後、実施例Ａ−２の方法で得た組換え型酵素を澱粉糖固形分１ｇ当たり２単位加え、４５℃で６４時間反応させた。反応物を９５℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、濾過後、常法にしたがって活性炭により脱色し、イオン交換樹脂により脱塩・精製し、濃縮して濃度約７０％（ｗ／ｗ）のシロップ状物を澱粉固形分当たり約９０％の収量で得た。
【００９６】
実験例２−１の方法によりこのシロップ状物を分析したところ、ＤＥ値は１５．８、主成分として、固形分当たりα−グルコシルトレハロースを５．８％、α−マルトシルトレハロースを８．５％、α−マルトトリオシルトレハロースを１３．１％、α−マルトテトラオシルトレハロースを１８．９％、α−マルトペンタオシルトレハロースを３．６％含み、前記還元性澱粉糖の殆どが対応する非還元性糖質に変換されていた。温和で上品な甘味に加えて適度の粘性と保湿性を有する本品は、食品、化粧品、医薬品の甘味剤、呈味改善剤、品質改善剤、安定剤、賦形剤として有用である。本品は非還元性糖質の含量が高いので、トレハロースを製造するための中間体としても有用である。
【００９７】
【実施例Ｂ−６ 組換え型酵素による澱粉加水分解部の変換】
実施例Ｂ−２と同様に液化トウモロコシ澱粉にマルトテトラオース生成アミラーゼとα−アミラーゼを逐次反応させ、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースなどのグルコース重合度３以上の還元性澱粉糖を固形分当たり約５０％含む反応物を得た。この反応物を１２０℃で１０分間オートクレーブして酵素を失活させ、４５℃に急冷後、ｐＨ６．５に調整し、実施例Ａ−２の方法で得た組換え型酵素を澱粉糖固形分１ｇ当たり２単位加え、４５℃で６４時間反応させた。反応物を９５℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、濾過後、常法にしたがって活性炭により脱色し、イオン交換樹脂により脱塩・精製し、濃縮して濃度約７０％（ｗ／ｗ）のシロップ状物を澱粉固形分当たり約９０％の収量で得た。
【００９８】
実験例２−１の方法によりこのシロップ状物を分析したところ、ＤＥ値は１０．３、主成分として、固形分当たりα−グルコシルトレハロースを３．６％、α−マルトシルトレハロースを４４．０％、α−マルトリオシルトレハロースを１．０％含み、前記還元性澱粉糖の殆どが対応する非還元性糖質に変換されていた。温和で上品な甘味に加えて適度の粘性と保湿性を有する本品は、食品、化粧品、医薬品の甘味剤、呈味改善剤、品質改善剤、安定剤、賦形剤として有用である。また、本品は非還元性糖質の含量が高いので、トレハロースを製造するための中間体としても有用である。
【００９９】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明は、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する、従来未知の全く新規な酵素の発見に基づくものである。この発明は、組換えＤＮＡ技術により斯かる酵素を大規模且つ効率的に生産する道を拓くものである。この発明による組換え型酵素を使用する変換方法により、還元性澱粉糖は効率的に対応する非還元性糖質に変換され、その生成した非還元性糖質は温和で上品な甘味に加えて適度の粘性と保湿性を有し、しかも、分子中に還元性基を有しないので、着色や変質の懸念なく飲食物を甘味付けできる実益がある。加えて、この発明による組換え型酵素は全アミノ酸配列までが明らかにされた酵素であり、飲食物等への配合使用を前提とするトレハロースや末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質の製造に安心して使用し得るものである。
【０１００】
この発明は斯くも顕著な作用効果を奏する意義のある発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な発明であると言える。
【０１０１】
【配列表】
【０１０２】
【０１０３】
【０１０４】
【０１０５】
【０１０６】
【０１０７】
【０１０８】
【０１０９】
【０１１０】
【０１１１】
【０１１２】
【図面の簡単な説明】
【図１】酵素Ｍ−１１の至適温度を示す図である。
【図２】酵素Ｑ３６の至適温度を示す図である。
【図３】酵素Ｍ−１１の至適ｐＨを示す図である。
【図４】酵素Ｑ３６の至適ｐＨを示す図である。
【図５】酵素Ｍ−１１の熱安定性を示す図である。
【図６】酵素Ｑ３６の熱安定性を示す図である。
【図７】酵素Ｍ−１１のｐＨ安定性を示す図である。
【図８】酵素Ｑ３６のｐＨ安定性を示す図である。
【図９】この発明による組換えＤＮＡであるｐＢＭＴ７の制限酵素地図である。なお、図中、太線表示部は、酵素をコードするＤＮＡを示す。
【図１０】この発明による組換えＤＮＡであるｐＢＱＴ１３の制限酵素地図である。なお、図中、太線表示部は、酵素をコードするＤＮＡを示す。
【産業上の利用分野】
この発明は、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する新規な組換え型酵素とその製造方法並びに用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
トレハロースは、グルコース２分子が還元性基同士結合した二糖類であり、天然には細菌、真菌、藻類、昆虫などに微量存在する。トレハロースは分子中に還元性基を持たないので、アミノ酸類の存在下で加熱しても褐変反応を起こすことがなく、着色や変質の懸念なく飲食物を甘味付けできる利点がある。しかしながら、従来の製造方法では所望量を入手するのが難しく、実際に飲食物の甘味付けに使われることは殆ど無かった。
【０００３】
これまでの製造方法は、微生物の菌体を利用する方法と、糖質に複合酵素系を作用させる方法とに大別される。前者の方法は、特開昭５０−１５４４８５号公報などにも見られるように、細菌、酵母などの微生物を栄養培地で増殖させ、培養物中の菌体からトレハロースを採取するものである。一方、後者の方法は、特開昭５８−２１６６９５号公報などにも見られるように、基質にマルトースを使用し、これにマルトース・フォスフォリラーゼとトレハロース・フォスフォリラーゼからなる複合酵素系を作用させ、生成したトレハロースを系外に取出すものである。前者の方法は、微生物そのものの増殖は比較的容易なものの、トレハロースを菌体から採取するのに一連の繁雑な工程を要し、しかも、菌体に含まれるトレハロースが１５％（ｗ／ｗ）と僅少であるという問題があった。後者の方法は、トレハロースそのものの分離は比較的容易なものの、反応自体が２種類の酵素による平衡反応であり、しかも、その平衡が常時グルコース燐酸側に傾いていることから、基質を高濃度にして反応させ、トレハロースの収量を上げることが原理的に難しかった。
【０００４】
斯かる状況に鑑み、本発明者が、澱粉糖からトレハロース構造を有する糖質を生成する酵素につき鋭意検索したところ、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１やアルスロバクター・スピーシーズＱ３６などの微生物が、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成するという、従来未知の全く新規な酵素を産生することが判明した。この知見とあい前後して、この非還元性糖質は、同じくリゾビウム・スピーシーズＭ−１１やアルスロバクター・スピーシーズＱ３６が産生する別の酵素により、ほぼ定量的にトレハロースとグルコース及び／又はマルトオリゴ糖に加水分解されることが判明した。これら酵素を併用することにより、澱粉を原料に所望量のトレハロースが比較的容易に得られることとなり、トレハロースに係わる前記課題は悉く解決されていくものと期待される。しかしながら、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１もアルスロバクター・スピーシーズＱ３６も当該酵素の産生能が充分でなく、トレハロースや末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を大規模に製造しようとすると、微生物を大量に培養しなければならないという問題がある。
【０００５】
一方、昨今の組換えＤＮＡ技術の進歩には目覚しいものがある。今日では、全アミノ酸配列が解明されていない酵素であっても、これをコードする遺伝子を単離し、その塩基配列を解明できれば、その酵素をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを作製し、これを微生物や動植物の細胞に導入して得られる形質転換体を培養することにより、比較的容易に所望量の酵素が取得できるようになった。斯かる状況に鑑み、両酵素をコードする遺伝子を突き止め、その塩基配列を解明するのが急務となっている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
この発明の目的は、組換えＤＮＡ技術を応用して斯かる酵素を創製することにある。
【０００７】
この発明の別の目的は、その創製された酵素の製造方法を提供することにある。
【０００８】
この発明のさらに別の目的は、その創製された酵素を使用する還元性澱粉糖の変換方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この発明は、前記第一の課題を、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する組換え型酵素により解決するものである。
【００１０】
この発明は、前記第二の課題を、その組換え型酵素を産生する形質転換体を培養し、培養物から組換え型酵素を採取する組換え型酵素の製造方法により解決するものである。
【００１１】
この発明は、前記第三の課題を、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖に組換え型酵素を作用させて該澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成させる工程を含んでなる還元性澱粉糖の変換方法により解決するものである。
【００１２】
【作用】
この発明による組換え型酵素は、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖に作用して末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する。
【００１３】
この発明の製造方法にしたがって形質転換体を培養すれば、所望量の組換え型酵素が比較的容易に得られる。
【００１４】
この発明の変換方法により、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖は、末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質に変換される。
【００１５】
この発明は、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する、従来未知の全く新規な酵素の発見に基づくものである。斯かる酵素はリゾビウム・スピーシーズＭ−１１やアルスロバクター・スピーシーズＱ３６の培養物から得ることができ（以下、それぞれ「酵素Ｍ−１１」又は「酵素Ｑ３６」と云う。）、本発明者がカラムクロマトグラフィーを中心とする種々の精製方法を組合せてこの酵素を単離し、その性質・性状を調べたところ、その本質はポリペプチドであり、次のような理化学的性質を有することが判明した。
（１） 作用
グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する。
（２） 分子量
約７６，０００乃至８７，０００ダルトン（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
（３） 等電点
約３．６乃至４．６（等電点電気泳動）
（４） 至適温度
ｐＨ７．０で６０分間インキュベートすると、３５乃至４０℃付近に至適温度を示す。
（５） 至適ｐＨ
４０℃で６０分間インキュベートすると、ｐＨ６．４乃至７．２付近に至適ｐＨを示す。
（６） 熱安定性
ｐＨ７．０で６０分間インキュベートすると、３５乃至４０℃付近まで安定である。
（７） ｐＨ安定性
２５℃で１６時間インキュベートすると、ｐＨ５．５乃至１１．０付近まで安定である。
【００１６】
次に、これら理化学的性質を解明すべく行なった実験について説明する。
【００１７】
【実験例１ 精製酵素の調製】
【００１８】
【実験例１−１ 酵素Ｍ−１１の精製】
５００ｍｌ容三角フラスコにマルトース２．０％（ｗ／ｖ）、ペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸水素二ナトリウム０．１％（ｗ／ｖ）及び燐酸二水素カリウム０．１％（ｗ／ｖ）を含む液体培地（ｐＨ７．０）を１００ｍｌずつとり、１２０℃で２０分間オートクレーブして滅菌した。冷却後、三角フラスコ内の液体培地にリゾビウム・スピーシーズＭ−１１を植菌し、回転振盪下、２７℃で２４時間種培養した。別途、３０ｌ容ジャーファーメンタに上記と同組成の液体培地を２０ｌとり、滅菌後、上記で得た種培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、液体培地をｐＨ６乃至８に保ちつつ、３０℃で２４時間通気撹拌培養した。
【００１９】
次に、上記で得た培養物約１８ｌを超高圧菌体破砕装置にとり、菌体を破砕後、遠心分離により採取した上清約１６ｌに硫酸アンモニウムを２０％飽和になるように加え、４℃で１時間静置後、遠心分離により沈澱部を除去した。得られた上清に６０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加え、４℃で２４時間静置後、沈澱部を遠心分離により採取し、最少量の１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して２４時間透析後、遠心分離により不溶物を除去した。得られた上清を予め１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化させておいた東ソー製イオン交換クロマトグラフィー用カラム『ＤＥＡＥ−トヨパール』に負荷し、０Ｍから０．５Ｍに上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液した。溶出液より酵素を含む画分を採取し、２Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して１０時間透析後、遠心分離により不溶物を除去した。その後、上清を予め２Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化させておいた東ソー製疎水クロマトグラフィー用カラム『ブチルトヨパール』に負荷し、２Ｍから０Ｍに低下する硫酸アンモニウムの濃度勾配下、カラムに５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液した。溶出液から酵素を含む画分を採取し、予め５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化させておいた東ソー製ゲル濾過カラムクロマトグラフィー用カラム『トヨパールＨＷ−５５』に負荷し、カラムに５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液し、溶出液から酵素を含む画分を採取した。このようにして精製した酵素Ｍ−１１の比活性は約１９５単位／ｍｇ蛋白質であり、収量は培養物１ｌ当たり約２２０単位であった。
【００２０】
なお、この発明を通じて、酵素の活性は次の方法により測定した活性値（単位）で表示する。すなわち、マルトペンタオースを１．２５％（ｗ／ｖ）含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を４ｍｌとり、これに酵素液を１ｍｌ加え、４０℃で６０分間インキュベートして反応させた後、反応液を１００℃で１０分間加熱して反応を停止させる。反応液を蒸留水で１０倍希釈した後、ソモギ・ネルソン法により還元力を測定する。当該酵素の１単位とは、上記条件下において、１分間にマルトペンタオース１μｍｏｌに相当する還元力を低下させる酵素の量と定義する。
【００２１】
【実験例１−２ 酵素Ｑ３６の精製】
実験例１−１と同様にアルスロバクター・スピーシーズＱ３６を培養し、培養物を処理したところ、比活性約２００単位／ｍｇ蛋白質の精製酵素Ｑ３６が、培養物１ｌ当たり、約２９５単位の収量で得られた。
【００２２】
【実験例２ 酵素の理化学的性質】
【００２３】
【実験例２−１ 作用】
基質としてグルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース又はマルトヘプタオースを２０％（ｗ／ｖ）含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に実験例１で得た精製酵素Ｍ−１１又は精製酵素Ｑ３６を基質１ｇ当たり２単位加え、４０℃で４８時間反応させた。常法により反応物を脱塩した後、和光純薬製高速液体クロマトグラフィー用カラム『ＷＢ−Ｔ−３３０』に負荷し、溶出液の糖濃度を東ソー製示差屈折計『ＲＩ−８０１２型』でモニターしながら、室温下にてカラムに蒸留水を０．５ｍｌ／分の流速で通液することにより、反応物に含まれる糖質を分離した。表１及び表２に、それぞれ、酵素Ｍ−１１または酵素Ｑ３６を加えた場合の反応物の糖組成を示す。 なお、表中の糖質Ｐ１乃至Ｐ５は、反応により生成した糖質をグルコース重合度の小さい順に命名したものである。
【００２４】
【表１】
【表２】
表１及び表２の結果から明らかなように、酵素Ｍ−１１及び酵素Ｑ３６は、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース及びマルトヘプタオースなどのグルコース重合度が３以上の還元性澱粉糖からは新たな糖質を生成するけれども、グルコース重合度が３を下回るグルコースやマルトースからは新たな糖質を生成しない。また、反応により生成した糖質はそれぞれ糖質Ｐ１乃至Ｐ５のみであり、糖質Ｐ２乃至Ｐ５の含量は固形分当たり８５％以上と著しく高かった。
【００２７】
次に、糖質Ｐ１乃至Ｐ５を分離すべく、東京有機化学工業製強酸性カチオン交換樹脂『ＸＴ−１０１６（Ｎａ＋型）』を内径２．０ｃｍ、長さ１ｍのジャケット付きステンレス製カラム３本に充填し、これらカラムを直列に連結した。そして、カラム内の温度を５５℃に保ちつつ、カラムに糖質Ｐ１乃至Ｐ５のいずれかを含む前記反応物を別々に負荷した後、カラムに５５℃の蒸留水をＳＶ０．１３の流速で通液した。溶出液の糖組成を調べ、糖質Ｐ１乃至Ｐ５のいずれかを固形分で９７％以上含む画分を採取し、真空乾燥により粉末化した。このようにして精製した糖質Ｐ１乃至Ｐ５の還元力をソモギ・ネルソン法により調べたところ、いずれの糖質にも実質的な還元力は認められなかった。
【００２８】
さらに、糖質Ｐ１乃至Ｐ５を同定すべく、これら糖質のいずれかを５０ｍｇとり、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）１ｍｌに溶解後、グルコアミラーゼを１単位加え、４０℃で６時間インキュベートした。表１及び表２に示す反応物の糖組成を高速液体クロマトグラフィーにより分析したところ、それぞれ表３及び表４に示すように、全ての反応物からグルコースとトレハロースが検出された。同様にして、糖質Ｐ１乃至Ｐ５にβ−アミラーゼを作用させたところ、糖質Ｐ１及びＰ２がβ−アミラーゼの作用を受けなかったのに対して、糖質Ｐ３は１分子のマルトースと糖質Ｐ１を、糖質Ｐ４は１分子のマルトースと糖質Ｐ２を、また、糖質Ｐ５は２分子のマルトースと糖質Ｐ１を与えた。
【００２９】
【表３】
【表４】
表３及び表４の結果は、糖質Ｐ１乃至Ｐ５が１分子のトレハロースと１乃至５分子のグルコースにより構成されることを強く示唆している。また、グルコアミラーゼがマルトオリゴ糖におけるα−１，４結合及びα−１，６結合に特異的に切断することと、β−アミラーゼがマルトオリゴ糖におけるα−１，４結合をその末端よりマルトース単位で切断することから、糖質Ｐ１乃至Ｐ５は、グルコース又はグルコース重合度が２乃至５のマルトオリゴ糖の末端にトレハロース残基が１個結合した構造を有していると推定される。
【００３２】
以上の結果を総合的に判断すると、糖質Ｐ１乃至Ｐ５は、それぞれ、α−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース又はα−マルトペンタオシルトレハロースと同定され、このことは、当該酵素にグルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する作用のあることを裏付けている。
【００３３】
【実験例２−２ 分子量】
ユー・ケー・レムリが『ネーチャー』、第２２７巻、第６８０〜６８５頁（１９７０年）に報告している方法に準じて精製酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動したところ、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、分子量約７６，０００乃至８７，０００ダルトンに相当する位置に単一バンドが観察された。なお、このときの分子量マーカは、ミオシン（２００，０００ダルトン）、β−ガラクトシダーゼ（１１６，２５０ダルトン）、フォスフォリラーゼＢ（９７，４００ダルトン）、血清アルブミン（６６，２００ダルトン）及びオボアルブミン（４５，０００ダルトン）であった。
【００３４】
【実験例２−３ 等電点】
等電点電気泳動法により測定したところ、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、約３．６乃至４．６に等電点を示した。
【００３５】
【実験例２−４ 至適温度】
常法により、５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で６０分間インキュベートする条件で試験したところ、図１又は図２に示すように、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、３５乃至４０℃付近に至適温度を示した。
【００３６】
【実験例２−５ 至適ｐＨ】
常法により、ｐＨの相違する５０ｍＭ酢酸緩衝液、燐酸緩衝液又は炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液中、４０℃で６０分間インキュベートする条件で試験したところ、図３又は図４に示すように、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、ｐＨ６．４乃至７．２付近に至適ｐＨを示した。
【００３７】
【実験例２−６ 熱安定性】
常法により、５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で６０分間インキュベートする条件で試験したところ、図５又は図６に示すように、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、３５乃至４０℃付近まで安定であった。
【００３８】
【実験例２−７ ｐＨ安定性】
常法により、ｐＨの相違する５０ｍＭ酢酸緩衝液、燐酸緩衝液又は炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液中、２５℃で１６時間インキュベートする条件で試験したところ、図７又は図８に示すように、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、ｐＨ５．５乃至１１．０付近まで安定であった。
【００３９】
【実験例２−８ Ｎ末端アミノ酸配列】
常法により、アプライッド・バイオシステム製気相プロテイン・シーケンサ『４７０Ａ型』を使用して分析したところ、酵素Ｍ−１１は、Ｎ末端に配列表における配列番号７に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００４０】
同様に分析したところ、酵素Ｑ３６は、Ｎ末端に配列表における配列番号８に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００４１】
【実験例２−９ 部分アミノ酸配列】
実験例１−１で得た精製酵素Ｍ−１１を適量とり、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して４℃で１８時間透析後、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて酵素濃度を約１ｍｇ／ｍｌとした。この溶液を約１ｍｌとり、リジルエンドペプチダーゼを１０μｇ加え、３０℃で２２時間インキュベートして酵素を部分加水分解した。加水分解物を、予め１６％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸により平衡化させておいた資生堂製逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム『カプセルパックＣ１８』に負荷し、次いで、１６％（ｖ／ｖ）から６４％（ｖ／ｖ）に上昇するアセトニトリルの濃度勾配下、カラムに０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を０．９ｍｌ／分の流速で通液した。そして、通液開始から約２８分後又は約４０分後に溶出したペプチド断片（以下、それぞれ「ペプチド断片Ａ」又は「ペプチド断片Ｂ」と云う。）を含む画分を別々に採取し、真空乾燥後、５０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸に溶解した。以後、実験例２−８と同様に分析したところ、ペプチド断片Ａ及びＢは、配列表における配列番号９及び１０に示すアミノ酸配列を有していることが判明した
【００４２】
別途、実験例１−２で得た精製酵素Ｑ３６を上記と同様にして部分加水分解し、予め２４％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸により平衡化させておいた日本ミリポア・リミテッド製逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム『マイクロボンダパックＣ１８』に負荷し、２４％（ｖ／ｖ）から４４％（ｖ／ｖ）に上昇する水性アセトニトリルの濃度勾配下、カラムに０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を０．９ｍｌ／分の流速で通液した。そして、通液開始から約２２分後又は約４０分後に溶出したペプチド断片（以下、それぞれ「ペプチド断片Ｃ」又は「ペプチド断片Ｄ」と云う。）を含む画分を採取し、真空乾燥後、５０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸に溶解した。以後、上記と同様に分析したところ、ペプチド断片Ｃ及びＤは、配列表における配列番号１１及び１２に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００４３】
以上のような理化学的性質を有する酵素は未だ知られておらず、新規物質であると判断される。なお、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１は岡山県岡山市の土壌から分離され、平成４年１２月２４日以降、茨城県つくば市東１丁目１番３号にある通商産業省、工業技術院、生命工学工業技術研究所、特許微生物寄託センターに寄託番号『ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３０』で寄託されている。一方、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６は岡山県総社市の土壌から分離されたものであり、平成５年６月３日以降、同センターに寄託番号『ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１６』で寄託されている。同じ出願人による特願平５−３４９２１６号明細書には、酵素の性質・性状とともに、両微生物の菌学的性質が詳細に開示されている。
【００４４】
そこで、本発明者が、実験例２−９で明らかにした酵素Ｍ−１１の部分アミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブに使用し、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１の染色体ＤＮＡを鋭意検索した結果、配列表における配列番号３に示す塩基配列を有する２，３１６塩基対からなるＤＮＡ断片が得られた。そして、その塩基配列を解読したところ、酵素Ｍ−１１は７７２個のアミノ酸からなる配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００４５】
一方、酵素Ｑ３６の部分アミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブにし、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６の染色体ＤＮＡを同様に検索したところ、配列表における配列番号４に示す塩基配列を有する２，３２５塩基対からなるＤＮＡ断片が得られた。この塩基配列を解読したところ、酵素Ｑ３６は７７５個のアミノ酸からなり、配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００４６】
配列表における配列番号１乃至４に示す塩基配列及びアミノ酸配列を解明するに到った一連の工程を要約すると、次のようになる。
（１） 供与体微生物の培養物から当該酵素を分離し、高度に精製した。精製酵素をプロテアーゼにより部分加水分解後、加水分解物から２種類のペプチド断片を単離し、そのアミノ酸配列を決定した。
（２） 別途、供与体微生物の菌体より染色体ＤＮＡを分離し、精製後、制限酵素により部分的に切断して約３，０００乃至７，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。ＤＮＡリガーゼにより、このＤＮＡ断片を予め制限酵素で切断しておいたプラスミドベクターに連結し、組換えＤＮＡを作製した。
（３） 大腸菌に組換えＤＮＡを導入して形質転換体を作製し、前記部分アミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブとするコロニーハイブリダイゼーションにより当該酵素をコードするＤＮＡを含む形質転換体を選択した。
（４） 形質転換体から組換えＤＮＡを採取し、プライマーとともにアニーリング後、ＤＮＡポリメラーゼを作用させてプライマーを伸長し、得られた相補鎖ＤＮＡをジデオキシ・チェーン・ターミネータ法により分析して塩基配列を決定した。そして、その塩基配列から推定されるアミノ酸配列と前記部分アミノ酸配列とを比較し、その塩基配列が当該酵素をコードしていることを確認した。
【００４７】
次の実験例３乃至６では、上記の工程（２）乃至（４）を具体的に説明するが、これら実施例で用いる手法自体は斯界において公知のものであり、例えば、ジェー・サムブルック等『モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル』、第２版、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス発行などにも詳述されている。
【００４８】
【実験例３ リゾビウム・スピーシーズＭ−１１に由来するＤＮＡを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製】
【００４９】
【実験例３−１ 染色体ＤＮＡの調製】
リゾビウム・スピーシーズＭ−１１をバクト・ニュートリエント・ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、２７℃で２４時間回転振盪培養した。遠心分離により培養物から菌体を分離し、ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に浮遊させ、リゾチームを０．０５％（ｗ／ｖ）加えた後、３７℃で３０分間インキュベートした。処理物を−８０℃で１時間凍結後、ＴＳＳ緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて６０℃に加温し、ＴＥＳ緩衝液／フェノール混液を加え、氷冷後、遠心分離により上清を採取した。この上清に２倍容の冷エタノールを加え、沈澱した粗染色体ＤＮＡを採取し、ＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解後、リボヌクレアーゼとプロテアーゼをそれぞれ７．５μｇ又は１２５μｇ加え、３７℃で１時間インキュベートして反応させた。その後、反応物にクロロフォルム／イソアミルアルコール混液を加えて染色体ＤＮＡを抽出し、冷エタノールを加え、生成した染色体ＤＮＡを含む沈澱を採取した。このようにして得た精製染色体ＤＮＡを濃度約１ｍｇ／ｍｌになるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、溶液を−８０℃で凍結した。
【００５０】
【実験例３−２ 組換えＤＮＡ ｐＢＭＴ７と形質転換体ＢＭＴ７の調製】実験例３−１で得た精製染色体ＤＮＡ溶液を約１ｍｌとり、これに制限酵素Ｓａｕ ３ＡＩを約３５単位加え、３７℃で約２０分間反応させて染色体ＤＮＡを部分切断した後、蔗糖密度勾配超遠心法により約３，０００乃至７，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。別途、プラスミドベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）を１μｇとり、常法により制限酵素Ｂａｍ ＨＩを作用させて完全に切断した後、上記で得たＤＮＡ断片１０μｇとＴ４ ＤＮＡリガーゼを２単位加え、４℃で一夜静置することによりＤＮＡ断片をベクター断片に連結した。そして、得られた組換えＤＮＡに東洋紡績製コンピテントセル『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ』を３０μｌ加え、氷冷下に３０分間静置後、４２℃に加温し、ＳＯＣブロスを加えて３７℃で１時間インキュベートすることにより、組換えＤＮＡを大腸菌に導入した。
【００５１】
次に、上記で得た形質転換体を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド５０μｇ／ｍｌを含む寒天平板培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で１８時間培養後、培地上にナイロン膜を載置し、培地上に形成された約４，４００個のコロニーをナイロン膜に固定した。別途、常法により、配列表における配列番号９に示すアミノ酸配列における第１７乃至２１番目のＰｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓで表される配列に基づき５′−ＣＣＮＧＡＲＴＧＧＧＡＲＡＡ−３′で表される塩基配列のプローブ１を化学合成し、同位体３２Ｐで標識後、前記ナイロン膜上に固定した形質転換体のコロニーにハイブリダイズさせ、顕著な会合が認められた９種類の形質転換体を選択した。
【００５２】
常法により、これら９種類の形質転換体から組換えＤＮＡを採取し、配列表における配列番号１０に示すアミノ酸配列における第１６乃至２０番目のＴｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ａｓｐで表される配列に基づき化学合成した５′−ＡＣＮＧＡＲＴＴＹＴＧＧＧＡ−３′で表される塩基配列のプローブ２をイー・エム・サザーン『ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー』、第９８巻、第５０３〜５１７頁（１９７５年）に記載されている方法に準じてハイブリダイズさせ、プローブ２と顕著な会合を示した組換えＤＮＡを選択した。以上のようにして選択した組換えＤＮＡと形質転換体を、それぞれ、『ｐＢＭＴ７』又は『ＢＭＴ７』と命名した。
【００５３】
上記で得た形質転換体ＢＭＴ７をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常一般のアルカリ法により組換えＤＮＡを菌体外に溶出させた。処理物を常法により精製し、分析したところ、組換えＤＮＡ ｐＢＭＴ７は約９，３００塩基対からなり、図９に示す制限酵素地図で表される構造を有していた。図９に示すように、酵素Ｍ−１１をコードする２，３１６塩基対からなるＤＮＡは、制限酵素Ｐｓｔ Ｉによる切断部位付近の下流に位置していることが判明した。
【００５４】
【実験例３−３ 形質転換体による酵素の産生】
マルトース２．０％（ｗ／ｖ）、ペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸水素二ナトリウム０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸二水素カリウム０．１％（ｗ／ｖ）を含む液体培地をｐＨ７．０に調整し、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加え、１２０℃で２０分間加熱滅菌し、冷却後、実験例３−２で得た形質転換体ＢＭＴ７を植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去後、上清中の酵素活性を測定したところ、培養物１ｌ当たりに換算して、約３，０００単位の酵素が産生していた。
【００５５】
別途、対照として、大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株及びリゾビウム・スピーシーズＭ−１１をアンピシリン無含有の同じ液体培地に植菌し、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１の場合、培養温度を３０℃に設定した以外は上記と同様に培養・処理した。処理物の活性を測定したところ、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１による酵素の産生は培養物１ｌ当たり約１，５００単位と、形質転換体ＢＭＴ７と比較して有意に低いものであった。なお、宿主に使用した大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株は、当該酵素を全く産生しなかった。
【００５６】
その後、形質転換体ＢＭＴ７が産生した酵素を実験例１−１と同様に精製し、その性質・性状を調べたところ、組換え型酵素はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量値約７６，０００乃至８７，０００ダルトンを、また、等電点電気泳動で約３．６乃至４．６に等電点を示すなど、実験例２で得られた酵素Ｍ−１１のものと同様の理化学的性質を有することが判明した。このことは、組換えＤＮＡ技術によっても当該酵素を製造でき、且つ、酵素の生産性も有意に向上することを示唆している。
【００５７】
【実験例４ リゾビウム・スピーシーズＭ−１１に由来する相補鎖ＤＮＡの調製とその塩基配列、アミノ酸配列の決定】
実験例３−２で得た組換えＤＮＡ ｐＢＭＴ７を、常法に従って、各種制限酵素で分解し、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）にサブクローニングして、塩基配列決定用ＤＮＡとした。これら塩基配列決定用ＤＮＡを２μｇとり、これに２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加えて変性させた後、適量の冷エタノールを加え、生成したテンプレートＤＮＡを含む沈澱を採取し、真空乾燥した。このテンプレートＤＮＡに化学合成した５′−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３′で表される塩基配列のプライマー１を５０ｐｍｏｌ／ｍｌと、２０ｍＭ塩化マグネシウムと５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を１０μｌ加え、６５℃で２分間インキュベートしてアニーリングした後、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰをそれぞれ７．５μＭ含む水溶液を２μｌと、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（２ｍＣｉ／ｍｌ）を０．５μｌと、０．１Ｍジチオスレイトールを１μｌと、１．５単位／ｍｌのＴ７ ＤＮＡポリメラーゼを２μｌ加え、２５℃で５分間インキュベートすることによりプライマー１を５′末端から３′末端に向かって伸長させ、相補鎖ＤＮＡを生成させた。
【００５８】
次に、上記で得た相補鎖ＤＮＡを含む反応物を四等分し、それぞれにｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ及びｄｄＴＴＰのいずれかを８μＭと８０μＭ ｄＮＴＰを含む５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液を２．５μｌ加え、３７℃で５分間インキュベートして反応させ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）ブロムフェノールブルー及び０．０５％（ｗ／ｖ）キシレンシアノールを含む９５％（ｖ／ｖ）水性ホルムアミド溶液を４μｌ加えて反応を停止させた。反応物を沸騰水浴中で３分間加熱後、６％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル上にとり、約２，０００Ｖの定電圧を印加しながら電気泳動してＤＮＡ断片を分離し、次いで、常法によりゲルを固定し、乾燥させた後、オートラジオグラフィーした。
【００５９】
ラジオグラム上に分離したＤＮＡ断片を解析した結果、相補鎖ＤＮＡは配列表における配列番号５に示す２，９３６塩基対からなる塩基配列を含んでいることが判明した。この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は配列表における配列番号５に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と配列表における配列番号７、９又は１０に示す酵素Ｍ−１１のＮ末端アミノ酸配列、部分アミノ酸配列を比較したところ、配列番号７のＮ末端アミノ酸配列は配列表における配列番号５における第１乃至２０番目の配列に、また、配列番号９又は１０の部分アミノ酸配列は配列表における配列番号５における第４８６乃至５０６番目又は第６０６乃至６２６番目の配列に一致した。これは、酵素Ｍ−１１が配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有するものであり、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１においては、酵素Ｍ−１１が配列表における配列番号３に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示している。
【００６０】
【実験例５ アルスロバクター・スピーシーズＱ３６に由来するＤＮＡを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製】
【００６１】
【実験例５−１ 染色体ＤＮＡの調製】
実験例３−１と同様にしてアルスロバクター・スピーシーズＱ３６から染色体ＤＮＡを分離・精製し、濃度約１ｍｇ／ｍｌになるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、−８０℃で凍結した。
【００６２】
【実験例５−２ 組換えＤＮＡ ｐＢＱＴ１３と形質転換体ＢＱＴ１３の調製】
実験例５−１で得た精製染色体ＤＮＡ溶液を実験例３−２と同様に部分切断した後、蔗糖密度勾配超遠心法により約３，０００乃至６，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。その後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用し、このＤＮＡ断片を実験例３−２と同様に制限酵素Ｂａｍ ＨＩによるベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）の消化物に連結し、得られた組換えＤＮＡを大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株に導入した。得られた形質転換体を実験例３−２と同様に５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシドを含む寒天平板培地で培養し、生成した約４，５００個のコロニーをナイロン膜上に固定する一方、配列表における配列番号１２に示すアミノ酸配列における第１１乃至１６番目のＰｈｅ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ａｓｐで表される配列に基づき５′−ＴＴＹＧＡＹＧＴＮＧＡＹＴＧＧＧＡ−３′で表される塩基配列のプローブ３を化学合成し、同位体３２Ｐで標識後、前記ナイロン膜上に固定した形質転換体のコロニーにハイブリダイズさせ、顕著な会合が認められた８種類の形質転換体を選択した。
【００６３】
実験例３−２と同様にして、これら８種類の形質転換体から組換えＤＮＡを採取し、配列表における配列番号１１に示すアミノ酸配列における第１６乃至２０番目のＴｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ａｓｐで表される配列に基づき化学合成した５′−ＡＣＮＧＡＲＴＴＹＴＧＧＧＡ−３′で表される塩基配列のプローブ４をハイブリダイズさせ、顕著な会合を示した組換えＤＮＡを選択した。以上のようにして選択した組換えＤＮＡと形質転換体を、それぞれ、『ｐＢＱＴ１３』又は『ＢＱＴ１３』と命名した。
【００６４】
その後、この形質転換体ＢＱＴ１３をアンピシリンを含むＬ−ブロス培地で実験例３−２と同様に培養し、培養物より採取した菌体から組換えＤＮＡを溶出させ、精製し、分析したところ、組換えＤＮＡ ｐＢＱＴ１３は約７，２００塩基対からなり、図１０に示す制限酵素地図で表される構造を有していた。図１０に示すように、酵素Ｑ３６をコードする２，３２５塩基対からなるＤＮＡは、制限酵素Ｘｍｎ Ｉによる切断部位付近の下流に位置していることが判明した。
【００６５】
【実験例５−３ 形質転換体ＢＱＴ１３による酵素の産生】
マルトース２．０％（ｗ／ｖ）、ペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸水素二ナトリウム０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸二水素カリウム０．１％（ｗ／ｖ）を含む液体培地をｐＨ７．０に調整し、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加え、１２０℃で２０分間加熱滅菌し、冷却後、実験例５−２で得た形質転換体ＢＱＴ１３を植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去後、上清中の酵素活性を測定したところ、培養物１ｌ当たりに換算して、約２，４５０単位の酵素が産生していた。
【００６６】
別途、対照として、大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株及びアルスロバクター・スピーシーズＱ３６をアンピシリン無含有の同じ組成の液体培地に植菌し、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６の場合、培養温度を３０℃に設定した以外は上記と同様に培養・処理した。処理物の活性を測定したところ、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６による酵素の産生は培養物１ｌ当たり約１，２００単位と、形質転換体ＢＱＴ１３と比較して有意に低いものであった。なお、宿主に使用した大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株は、当該酵素を産生しなかった。
【００６７】
その後、形質転換体ＢＱＴ１３が産生した酵素を実験例１−１と同様に精製し、その性質・性状を調べたところ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量約７６，０００乃至８７，０００ダルトンを、また、等電点電気泳動で約３．６乃至４．６に等電点を示すなど、実験例２で得られた酵素Ｑ３６のものと同様の理化学的性質を有することが判明した。このことは、組換えＤＮＡ技術によっても当該酵素を製造でき、且つ、酵素の生産性も有意に向上することを示唆している。
【００６８】
【実験例６ アルスロバクター・スピーシーズＱ３６に由来する相補鎖ＤＮＡの調製とその塩基配列、アミノ酸配列の決定】
実験例５−２で得た組換えＤＮＡ ｐＢＱＴ１３を実験例４と同様に処理してテンプレートＤＮＡとし、これをプライマー１とともにアニーリング後、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼを作用させてプライマー１を５′末端から３′末端に向かって伸長させ、相補鎖ＤＮＡを生成させた。実験例４と同様に、この相補鎖ＤＮＡにジデオキシ・チェーン・ターミネータ法を適用し、ラジオグラム上に分離したＤＮＡ断片を解析した結果、相補鎖ＤＮＡは配列表における配列番号６に示す３，０７３塩基対からなる塩基配列を含んでいることが判明した。この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は配列表における配列番号６に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と配列表における配列番号８、１１又は１２に示すＮ末端アミノ酸配列、部分アミノ酸配列を比較したところ、配列番号８のＮ末端アミノ酸配列は配列表における配列番号６における第１乃至２０番目の配列に、また、配列番号１１又は１２の部分アミノ酸配列は配列表における配列番号６における第６０６乃至６２５番目又は第１１０乃至１２９番目の配列に一致した。これは、酵素Ｑ３６が配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列を有するものであり、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６においては、酵素Ｑ３６が配列表における配列番号４に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示している。
【００６９】
以上説明したように、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する酵素は、本発明者が長年に亙る研究の一成果として見出されたものであり、従来公知の酵素には見られない独特の理化学的性質を具備している。この発明は、組換えＤＮＡ技術を応用することにより、この酵素を創製しようというものである。以下、実施例等を参照しながら、この発明の組換え型酵素とその製造方法並びに用途につき、具体的に説明する。
【００７０】
この発明でいう組換え型酵素とは、組換えＤＮＡ技術により創製され、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する酵素全般を意味する。この発明の組換え型酵素は、通常、解明されたアミノ酸配列を有しており、その一例として、例えば、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列かそれに相同的なアミノ酸配列が挙げられる。配列表における配列番号１又は２のアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有する変異体は、所期の酵素作用を実質的に変えることなく、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列における構成アミノ酸の１個又は２個以上を他のアミノ酸で置換することにより得ることができる。なお、同じＤＮＡであっても、それを導入する宿主や、そのＤＮＡを含む形質転換体の培養に使用する栄養培地の成分・組成、培養温度・ｐＨなどに依っては、宿主内酵素によるＤＮＡ発現後の修飾などにより、所期の酵素反応は保持しているものの、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列におけるＮ末端付近のアミノ酸が１個又は２個以上欠失したり、Ｎ末端に１個又は２個以上のアミノ酸が新たに付加した変異体の産生することがある。斯かる変異体も、それがグルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成するかぎり、当然、この発明の組換え型酵素に包含される。
【００７１】
この発明による組換え型酵素は、特定のＤＮＡを含む形質転換体の培養物から採取することができる。この発明で使用する形質転換体は、例えば、配列表における配列番号３又は４に示す塩基配列かそれに相同的な塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列のＤＮＡを適宜宿主に導入することにより得ることができる。なお、上記塩基配列は、遺伝子コードの縮重を利用して、コードするアミノ酸配列を変えることなく、塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置き換えてもよい。また、ＤＮＡが宿主中で実際に当該酵素の産生を発現するために、当該酵素又はその相同変異体をコードする塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で適宜置換し得ることはいうまでもない。
【００７２】
この発明で使用するＤＮＡは、それが前述のような配列を有するかぎり、それが天然に由来するものか人為的に合成されたものであるかは問わない。天然の給源としては、例えば、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３０）、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１６）、ブレビバクテリウム・ヘロボルム（ＡＴＣＣ１１８２２）、フラボバクテリウム・アクアチレ（ＩＦＯ３７７２）、ミクロコッカス・ルテウス（ＩＦＯ３０６４）、ミクロコッカス・ロゼウス（ＡＴＣＣ１８６）、クルトバクテリウム・シトレウム（ＩＦＯ１５２３１）、マイコバクテリウム・スメグマチス（ＡＴＣＣ１９４２０）及びテラバクター・ツメスセンス（ＩＦＯ１２９６０）を含むリゾビウム属、アルスロバクター属、ブレビバクテリウム属、フラボバクテリウム属、ミクロコッカス属、クルトバクテリウム属、マイコバクテリウム属、テラバクター属の微生物が挙げられ、これら微生物の菌体からはこの発明のＤＮＡを含む遺伝子が得られる。すなわち、斯かる微生物を栄養培地に植菌し、好気的条件下で約１乃至３日間培養後、培養物から菌体を採取し、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素や超音波で処理することにより、当該ＤＮＡを含む遺伝子を菌体外に溶出させる。このとき、細胞壁溶解酵素にプロテアーゼなどの蛋白質加水分解酵素を併用したり、菌体を超音波処理する際、ＳＤＳなどの界面活性剤を共存させたり凍結融解してもよい。斯くして得られる処理物に、例えば、フェノール抽出、アルコール沈澱、遠心分離、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理などの斯界における通常一般の方法を適用すれば目的のＤＮＡが得られる。一方、ＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、配列表における配列番号３又は４に示す塩基配列に基づいて化学合成するか、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを適宜宿主に導入して得られる形質転換体を培養し、培養物から菌体を分離し、その菌体から当該ＤＮＡを含むプラスミドを採取すればよい。
【００７３】
斯かるＤＮＡは、通常、組換えＤＮＡの形態で宿主に導入される。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなり、ＤＮＡが入手できれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。斯かるベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７などのプラスミドベクターやλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、ρ１１、φ１、φ１０５などのファージベクターが挙げられ、このうち、この発明のＤＮＡを大腸菌で発現させるにはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、λｇｔ・λＣ及びλｇｔ・λＢが好適であり、一方、枯草菌で発現させるにはｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１及びφ１０５が好適である。ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７は、組換えＤＮＡを２種以上の宿主内で増殖させる場合に有用である。
【００７４】
ＤＮＡを斯かるベクターに挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、先ず、ＤＮＡを含む遺伝子と自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。遺伝子及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＩＩ型の制限酵素、詳細には、Ｓａｕ ３ＡＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｂａｍ ＨＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉなどを使用すれば、ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するのが容易となる。ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するには、必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培養することにより無限に複製可能である。
【００７５】
このようにして得られる組換えＤＮＡは、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母を始めとする適宜の宿主微生物に導入することができる。宿主が大腸菌の場合には、宿主を組換えＤＮＡとカルシウムイオンの存在下で培養すればよく、一方、宿主が枯草菌の場合には、コンピテントセル法やプロトプラスト法を適用すればよい。形質転換体をクローニングするには、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖を含む栄養培地で培養し、該澱粉糖より末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成するものを選択すればよい。
【００７６】
斯くして得られる形質転換体は、栄養培地で培養すると、菌体内外に当該酵素を産生する。栄養培地には、通常、炭素源、窒素源、ミネラル、さらには、必要に応じて、アミノ酸やビタミンなどの微量栄養素を補足した通常一般の液体培地が使用され、個々の炭素源としては、例えば、澱粉、澱粉加水分解物、グルコース、果糖、蔗糖などの糖質が、また、窒素源としては、例えば、アンモニア若しくはアンモニウム塩、尿素、硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンスティープリカー、肉エキスなどの含窒素無機乃至有機物が挙げられる。形質転換体を斯かる栄養培地に植菌し、栄養培地を温度２５乃至６５℃、ｐＨ２乃至８に保ちつつ、通気撹拌などによる好気的条件下で約１乃至６日間培養すれば、当該酵素を含む培養物が得られる。この培養物は酵素剤としてそのまま使用可能ではあるが、通常は使用に先立ち、必要に応じて、超音波や細胞壁溶解酵素により菌体を破砕した後、濾過、遠心分離などにより酵素を菌体又は菌体破砕物から分離し、精製する。精製には酵素を精製するための通常一般の方法が採用でき、例えば、菌体又は菌体破砕物を除去した培養物に濃縮、塩析、透析、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの１種若しくは２種以上を適宜組合せて適用すればよい。
【００７７】
前述のとおり、この発明による組換え型酵素は、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成するという、従来の酵素に見られない顕著な性質を有する。生成した非還元性糖質は温和で上品な甘味に加えて適度の粘度と保湿性を有し、そして、何よりも、分子中に還元性基を有しないので、着色や変質の懸念なく飲食物を甘味付けできるという大きな利点がある。当該組換え型酵素のこの性質を利用することにより、従来、還元性故に敬遠されがちであった種々の澱粉糖を、還元性を有しないか還元性が顕著に低下した、扱い易い、有用な糖質に変換できることとなる。
【００７８】
斯かる変換方法につきさらに説明すると、この発明による組換え型酵素の基質には、通常、澱粉、又はアミロペクチン、アミロースなどの澱粉質を酸及び／又はアミラーゼによって部分的に加水分解して得られる還元性澱粉加水分解物が用いられる。斯かる澱粉加水分解物は斯界における通常一般の方法により得ることができ、通常、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースなどのグルコース重合度３以上のマルトオリゴ糖の１種若しくは２種以上を含んでなる。アミラーゼ研究会編『ハンドブック・オブ・アミレーシーズ・アンド・リレイテッド・エンザイムズ』、１９８８年、パーガモン・プレス発行に記載されているα−アミラーゼ、マルトテトラオース生成アミラーゼ、マルトペンタオース生成アミラーゼ及びマルトヘキサオース生成アミラーゼは、この発明で使用する還元性澱粉糖の調製に特に有用であり、これらアミラーゼのいずれかを使用することにより、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖を豊富に含む澱粉糖混合物が容易且つ効率的に得られる。なお、このとき、必要に応じて、プルラナーゼやイソアミラーゼなどの澱粉枝切酵素を併用すれば、当該組換え型酵素の基質となり得る還元性澱粉糖の収量を上げることができる。
【００７９】
この発明による変換方法においては、通常、基質として上記したような還元性澱粉糖の１種又は２種以上を含む水溶液にこの発明による組換え型酵素を共存せしめ、水溶液を所定の温度、ｐＨに保ちつつ、所望量の非還元性糖質が生成するまで反応させる。反応は０．１％（ｗ／ｗ）程度の基質濃度下でも進行するが、この発明による変換方法を大規模に実施する場合には、より高濃度の２％（ｗ／ｗ）以上、望ましくは、５乃至５０％（ｗ／ｗ）とするのがよい。反応時の温度とｐＨは組換え型酵素が失活することなく基質に効率的に作用するレベルに設定され、温度は５５℃付近まで、望ましくは、約４０乃至５５℃に、また、ｐＨは５乃至１０、望ましくは、約６乃至８の範囲に設定される。組換え型酵素の量と反応時間は、反応の進行具合に依って適宜に設定する。斯かる反応によりグルコース重合度３以上の還元性澱粉糖の還元力は顕著に低下し、マルトペンタオースの場合、還元力はもとの約７％程度にまで低下する。
【００８０】
この発明の変換方法により得られた反応物はそのまま使用可能であるが、通常、使用に先立ち精製する。すなわち、濾過・遠心分離などにより反応物から不溶物を除去し、活性炭により脱色した後、イオン交換樹脂により脱塩・精製し、濃縮してシロップ状物とする。用途に依っては、このシロップ状物を真空乾燥、噴霧乾燥などにより固状物としてもよい。実質的に非還元性糖質のみからなる製品を得るには、上記シロップ状物にイオン交換樹脂、活性炭、シリカゲルなどによる糖質を分離するための種々のクロマトグラフィー、アルコール、アセトンなどによる分別沈澱、膜濾過、酵母による発酵、アルカリによる還元性糖質の分解除去などの１種若しくは２種以上を適用する。大量の反応物を処理するには、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報や特開昭５８−７２５９８号公報に開示されている強酸性カチオン交換樹脂を使用する固定床方式、移動床方式又は擬似移動床方式のイオン交換クロマトグラフィーが有用であり、これらの方法によるときには、非還元性糖質の含量が高い製品を大量且つ効率的に得ることができる。
【００８１】
斯くして得られる非還元性糖質は、糖質甘味剤の還元性を嫌う種々の物品に広範な用途を有し、例えば、食品、化粧品、医薬品の甘味剤、呈味改善剤、品質改善剤、安定剤、賦形剤として極めて有用である。加えて、当該非還元性糖質は、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、あるいは、特開平７−２１３２８３号公報（特願平５−３４０３４３号明細書）に開示されているトレハロース遊離酵素を作用させると、ほぼ定量的にトレハロースを与えることから、従来、大量入手が難しかったトレハロースを製造するための中間体としても有用である。
【００８２】
以下、２〜３の実施例により、この発明による組換え型酵素の製造方法と還元性澱粉糖の変換方法を具体的に説明する。
【００８３】
【実施例Ａ−１ 組換え型酵素の製造】
５００ｍｌ容三角フラスコにマルトース２．０％（ｗ／ｖ）、ペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸水素二ナトリウム０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸二水素カリウム０．１％（ｗ／ｖ）を含む液体培地（ｐＨ７．０）を１００ｍｌずつとり、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加えた後、１２０℃で２０分間オートクレーブして加熱滅菌した。冷却後、三角フラスコ内の液体培地に実験例３−２の方法で得た形質転換体ＢＭＴ７を植菌し、回転振盪下、２７℃で２４時間種培養した。別途、上記と同組成の液体培地を１８ｌとり、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加え、１２０℃で２０分間加熱滅菌し、冷却後、上記で得た種培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、３７℃で２４時間通気撹拌培養した。培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去後、上清中の酵素活性を測定したところ、培養物１ｌ当たりに換算して、約３，０００単位の酵素が産生していた。この上清を実験例１−１の方法により精製したところ、比活性約２００単位／ｍｇ蛋白質の組換え型酵素を１ｍｌ当たり約１３５単位含む水溶液が約５０ｍｌ得られた。
【００８４】
【実施例Ａ−２ 組換え型酵素の製造】
実験例５−２の方法により得た形質転換体ＢＱＴ１３を実施例Ａ−１と同様に培養し、培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去後、上清中の酵素活性を測定したところ、培養物１ｌ当たりに換算して、約２，４５０単位の酵素が産生していた。この上清を実施例１−１の方法により精製したところ、比活性約２００単位／ｍｇ蛋白質の組換え型酵素を１ｍｌ当たり約１２０単位含む水溶液が約４５ｍｌ得られた。
【００８５】
【実施例Ｂ−１ 組換え型酵素による澱粉加水分解物の変換】
馬鈴薯澱粉を濃度６％（ｗ／ｗ）になるよう水中に懸濁し、１２０℃で１０分間オートクレーブして糊化した。糊化液を５０℃に急冷し、ｐＨを約４．５に調整後、林原生物化学研究所製イソアミラーゼ剤を澱粉固形分１ｇ当たり２，５００単位加え、５０℃で２０時間反応させた。反応物をｐＨ６．０に調整し、１２０℃で１０分間オートクレーブして酵素を失活させた後、４５℃に急冷し、ノボ・ノルディスク・インダストリー製α−アミラーゼ剤『ターマミル６０Ｌ』を澱粉固形分１ｇ当たり１５０単位加え、４５℃で２４時間反応させてマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースなどのグルコース重合度３以上の還元性澱粉糖を含む反応物を得た。この反応物を１２０℃で２０分間オートクレーブして酵素を失活させ、４５℃まで急冷後、実施例Ａ−１で得た組換え型酵素を澱粉糖固形分１ｇ当たり１単位加え、４５℃で９６時間反応させた。反応物を９６℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、濾過後、常法にしたがって濾液を活性炭により脱色し、イオン交換樹脂により脱塩・精製し、濃縮して濃度約７０％（ｗ／ｗ）のシロップ状物を澱粉固形分当たり約９１％の収率で得た。
【００８６】
実験例２−１の方法によりこのシロップ状物を分析したところ、ＤＥ値は１８．７、主成分として、固形分当たりα−グルコシルトレハロースを８．４％、α−マルトシルトレハロースを５．６％、α−マルトリオシルトレハロースを３７．９％含み、前記還元性糖質の殆どが対応する非還元性糖質に変換されていた。温和で上品な甘味に加えて適度の粘性と保湿性を有する本品は、食品、化粧品、医薬品の甘味剤、呈味改善剤、品質改善剤、安定剤、賦形剤として有用である。また、本品は非還元性糖質の含量が高いので、トレハロースを製造するための中間体としても有用である。
【００８７】
【実施例Ｂ−２ 組換え型酵素による澱粉加水分解物の変換】
トウモロコシ澱粉を３３％（ｗ／ｗ）になるよう水中に懸濁し、炭酸カルシウムを０．１％（ｗ／ｗ）加えた。懸濁液にノボ・ノルディスク・インダストリー製α−アミラーゼ剤『ターマミル６０Ｌ』を澱粉固形分当たり０．２％加え、９５℃で１５分間反応させて澱粉を液化した。液化物を１２０℃で１０分間オートクレーブして酵素を失活させ、５５℃に急冷後、特開昭６３−２４０７８４号公報に開示されているシュードモナス・スツッツェリ由来のマルトテトラオース生成アミラーゼを澱粉固形分１ｇ当たり５単位加え、５５℃で６時間反応させた。その後、反応物に上田化学製α−アミラーゼ剤『α−アミラーゼ２Ａ』を澱粉固形分１ｇ当たり３０単位加え、６５℃で４時間反応させてマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースなどのグルコース重合度３以上の還元性澱粉糖を固形分当たり約５０％含む反応物を得た。この反応物を１２０℃で１０分間オートクレーブして酵素を失活させ、４５℃に急冷後、ｐＨ６．５に調整し、実施例Ａ−１の方法で得た組換え型酵素を澱粉糖固形分１ｇ当たり２単位加え、４５℃で６４時間反応させた。反応物を９５℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、濾過後、常法にしたがって活性炭により脱色し、イオン交換樹脂により脱塩・精製し、濃縮して濃度約７０％（ｗ／ｗ）のシロップ状物を澱粉固形分当たり約９０％の収量で得た。
【００８８】
実験例２−１の方法によりこのシロップ状物を分析したところ、ＤＥ値は１０．５、主成分として、固形分当たりα−グルコシルトレハロースを３．８％、α−マルトシルトレハロースを４３．８％、α−マルトリオシルトレハロースを１．２％含み、前記還元性澱粉糖の殆どが対応する非還元性糖質に変換されていた。温和で上品な甘味に加えて適度の粘性と保湿性を有する本品は、食品、化粧品、医薬品の甘味剤、呈味改善剤、品質改善剤、安定剤、賦形剤として有用である。また、本品は非還元性糖質の含量が高いので、トレハロースを製造するための中間体としても有用である。
【００８９】
【実施例Ｂ−３ 組換え型酵素によるマルトペンタオースの変換】
林原生物化学研究所製高純度マルトペンタオースを２０％（ｗ／ｗ）になるよう水中に溶解し、ｐＨ６．５に調整後、実施例Ａ−１の方法で得た組換え型酵素をマルトペンタオース１ｇ当たり１単位加え、４５℃で４８時間反応させた。反応物を９５℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、濾過し、濃縮後、実験例２−１の方法により分析したところ、マルトペンタオースの約９２％がα−マルトトリオシルトレハロースに変換されていた。
【００９０】
別途、内径５．４ｃｍ、長さ５ｍのジャケット付きステンレス製カラム４本に東京有機化学工業製強酸性カチオン交換樹脂『ＸＴ−１０１６（Ｎａ＋型）』を 均一に充填し、カラムを直列に連結して全長を２０ｍとした。カラム内温度を５５℃に保ちつつ上記反応物を樹脂に対して約５％（ｖ／ｖ）の割合で負荷し、次いで、カラムに５５℃の温水をＳＶ０．１３の流速で通液して糖質成分を溶出させた。溶出液の糖組成を分析し、当該非還元性糖質の含量が高い画分を採取し、これを濃縮し、真空乾燥し、破砕して固状物を固形分当たり約５５％の収量で得た。
【００９１】
実験例２−１の方法により分析したところ、この固状物のＤＥ値は約０．２未満であり、固形分当たりα−マルトトリオシルトレハロースを９９．０％含んでいた。吸湿性低く、極めて低い還元性とかすかな甘味を有する本品は、食品、化粧品、医薬品の甘味剤、呈味改善剤、品質改善剤、安定剤、賦形剤として有用である。また、本品は非還元性糖質の含量が高いので、トレハロースを製造するための中間体としても有用である。
【００９２】
【実施例Ｂ−４ 組換え型酵素による澱粉加水分解物の変換】
松谷化学工業製澱粉加水分解物『パインデックス＃４』を４０％（ｗ／ｗ）となるよう水中に溶解し、溶液を４５℃、ｐＨ６．５に調整後、実施例Ａ−１の方法で得た組換え型酵素を澱粉加水分解物１ｇ当たり１単位加えて９６時間反応させ、末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を含む反応物を得た。次いで、この反応物を１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、濃度約２０％（ｗ／ｗ）まで濃縮し、５５℃に冷却後、ｐＨ４．５に調整してナガセ生化学工業製グルコアミラーゼ剤『グルコチーム』を糖質固形分１ｇ当たり１０単位加え、４０時間反応させた。反応物を１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、濾過後、常法にしたがって活性炭により脱色し、イオン交換樹脂により脱塩・精製し、濃縮してトレハロースを固形分当たり約２９．７％含む濃度約６０％（ｗ／ｗ）のシロップ状物を得た。
【００９３】
このシロップ状物を強酸性カチオン交換樹脂としてオルガノ製『ＣＧ６０００（Ｎａ＋型）』を使用した以外実施例Ｂ−３と同様に分画し、トレハロースを固形分当たり約９０％含む画分を採取した。この画分を濃度約７５％（ｗ／ｗ）に濃縮後、助晶罐にとり、種晶としてトレハロース含水結晶を糖質固形分当たり約２％加え、緩やかに撹拌しながら助晶して結晶化度約４５％のマスキットを得た。このマスキットを約１５０ｋｇ／ｃｍ２の圧力下、噴霧乾燥塔の上部に設けた 噴霧ノズルより噴霧乾燥塔下方に向かって噴霧する一方、約８５℃の温風を噴霧乾燥塔の上部から下方に向かって送風しつつ、噴霧乾燥塔の底部に設けたベルトコンベア上に蓄積した結晶性粉状物を噴霧乾燥塔外に徐々に搬出した。その後、粉状物を熟成塔に移し、約４０℃の温風を送風しながら１０時間熟成して結晶化と乾燥を完了した。
【００９４】
吸湿性なく、温和で上品な甘味を有する本品は、食品、化粧品、医薬品、飼料の甘味剤、呈味改善剤、品質改善剤、安定剤、賦形剤として有用である。
【００９５】
【実施例Ｂ−５ 組換え型酵素による澱粉加水分解物の変換】
タピオカ澱粉を３４％（ｗ／ｗ）になるように水中に懸濁し、炭酸カルシウムを０．１％（ｗ／ｗ）加えた。懸濁液にノボ・ノルディスク・インダストリー製α−アミラーゼ剤『ターマミル６０Ｌ』を澱粉固形分当たり０．２％加え、９５℃で１５分間反応させて澱粉を液化した。液化物を１２０℃で１０分間オートクレーブして酵素を失活させ、５５℃に急冷し、ｐＨ５．２に調整後、上田化学製α−アミラーゼ剤『α−アミラーゼ２Ａ』と林原生物化学研究所製イソアミラーゼ剤を澱粉固形分１ｇ当たりそれぞれ１０単位又は５００単位加え、５５℃で２０時間反応させてマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースなどのグルコース重合度３以上の還元性澱粉糖を固形分当たり約６０％含むＤＥ約２９の反応物を得た。この反応物を１２０℃で１０分間オートクレーブして酵素を失活させ、４５℃に急冷し、ｐＨ６．５に調整後、実施例Ａ−２の方法で得た組換え型酵素を澱粉糖固形分１ｇ当たり２単位加え、４５℃で６４時間反応させた。反応物を９５℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、濾過後、常法にしたがって活性炭により脱色し、イオン交換樹脂により脱塩・精製し、濃縮して濃度約７０％（ｗ／ｗ）のシロップ状物を澱粉固形分当たり約９０％の収量で得た。
【００９６】
実験例２−１の方法によりこのシロップ状物を分析したところ、ＤＥ値は１５．８、主成分として、固形分当たりα−グルコシルトレハロースを５．８％、α−マルトシルトレハロースを８．５％、α−マルトトリオシルトレハロースを１３．１％、α−マルトテトラオシルトレハロースを１８．９％、α−マルトペンタオシルトレハロースを３．６％含み、前記還元性澱粉糖の殆どが対応する非還元性糖質に変換されていた。温和で上品な甘味に加えて適度の粘性と保湿性を有する本品は、食品、化粧品、医薬品の甘味剤、呈味改善剤、品質改善剤、安定剤、賦形剤として有用である。本品は非還元性糖質の含量が高いので、トレハロースを製造するための中間体としても有用である。
【００９７】
【実施例Ｂ−６ 組換え型酵素による澱粉加水分解部の変換】
実施例Ｂ−２と同様に液化トウモロコシ澱粉にマルトテトラオース生成アミラーゼとα−アミラーゼを逐次反応させ、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースなどのグルコース重合度３以上の還元性澱粉糖を固形分当たり約５０％含む反応物を得た。この反応物を１２０℃で１０分間オートクレーブして酵素を失活させ、４５℃に急冷後、ｐＨ６．５に調整し、実施例Ａ−２の方法で得た組換え型酵素を澱粉糖固形分１ｇ当たり２単位加え、４５℃で６４時間反応させた。反応物を９５℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、濾過後、常法にしたがって活性炭により脱色し、イオン交換樹脂により脱塩・精製し、濃縮して濃度約７０％（ｗ／ｗ）のシロップ状物を澱粉固形分当たり約９０％の収量で得た。
【００９８】
実験例２−１の方法によりこのシロップ状物を分析したところ、ＤＥ値は１０．３、主成分として、固形分当たりα−グルコシルトレハロースを３．６％、α−マルトシルトレハロースを４４．０％、α−マルトリオシルトレハロースを１．０％含み、前記還元性澱粉糖の殆どが対応する非還元性糖質に変換されていた。温和で上品な甘味に加えて適度の粘性と保湿性を有する本品は、食品、化粧品、医薬品の甘味剤、呈味改善剤、品質改善剤、安定剤、賦形剤として有用である。また、本品は非還元性糖質の含量が高いので、トレハロースを製造するための中間体としても有用である。
【００９９】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明は、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する、従来未知の全く新規な酵素の発見に基づくものである。この発明は、組換えＤＮＡ技術により斯かる酵素を大規模且つ効率的に生産する道を拓くものである。この発明による組換え型酵素を使用する変換方法により、還元性澱粉糖は効率的に対応する非還元性糖質に変換され、その生成した非還元性糖質は温和で上品な甘味に加えて適度の粘性と保湿性を有し、しかも、分子中に還元性基を有しないので、着色や変質の懸念なく飲食物を甘味付けできる実益がある。加えて、この発明による組換え型酵素は全アミノ酸配列までが明らかにされた酵素であり、飲食物等への配合使用を前提とするトレハロースや末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質の製造に安心して使用し得るものである。
【０１００】
この発明は斯くも顕著な作用効果を奏する意義のある発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な発明であると言える。
【０１０１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】酵素Ｍ−１１の至適温度を示す図である。
【図２】酵素Ｑ３６の至適温度を示す図である。
【図３】酵素Ｍ−１１の至適ｐＨを示す図である。
【図４】酵素Ｑ３６の至適ｐＨを示す図である。
【図５】酵素Ｍ−１１の熱安定性を示す図である。
【図６】酵素Ｑ３６の熱安定性を示す図である。
【図７】酵素Ｍ−１１のｐＨ安定性を示す図である。
【図８】酵素Ｑ３６のｐＨ安定性を示す図である。
【図９】この発明による組換えＤＮＡであるｐＢＭＴ７の制限酵素地図である。なお、図中、太線表示部は、酵素をコードするＤＮＡを示す。
【図１０】この発明による組換えＤＮＡであるｐＢＱＴ１３の制限酵素地図である。なお、図中、太線表示部は、酵素をコードするＤＮＡを示す。
Claims (25)
- グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成し、かつ、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列か、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配列において、１個又は２個以上のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加したアミノ酸配列を有する組換え酵素をコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含む組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体を培養し、培養物から組換え型酵素を採取する組換え型酵素の製造方法。
- ＤＮＡが、配列表における配列番号３又は４に示す塩基配列か、配列表における配列番号３又は４の塩基配列において、コードする酵素の酵素活性を実質的に変えることなく、１個又は２個以上の塩基が置換、欠失、若しくは付加した塩基配列、又はそれらに相補的な塩基配列を有する請求項１に記載の組換え型酵素の製造方法。
- ＤＮＡが配列表における配列番号５又は６に示す塩基配列を有する請求項１又は２に記載の組換え型酵素の製造方法。
- ＤＮＡがリゾビウム属又はアルスロバクター属の微生物に由来する請求項１乃至３のいずれかに記載の組換え型酵素の製造方法。
- 宿主が大腸菌である請求項１乃至４のいずれかに記載の組換え型酵素の製造方法。
- 自律複製可能なベクターがプラスミドベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）である請求項１乃至５のいずれかに記載の組換え型酵素の製造方法。
- 形質転換体を炭素源及び窒素源を含むｐＨ２乃至８の液体培地に植菌し、温度２５乃至６５℃で１乃至６日間培養する請求項１乃至６のいずれかに記載の組換え型酵素の製造方法。
- 培養物中の組換え型酵素を遠心分離、濾過、濃縮、塩析、透析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動及び／又は等電点電気泳動により採取する請求項１乃至７のいずれかに記載の組換え型酵素の製造方法。
- グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖に請求項１乃至８のいずれかに記載の組換え型酵素の製造方法によって得られる組換え型酵素を作用させて該澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成させる工程を含んでなる還元性澱粉糖の変換方法。
- 還元性澱粉糖が澱粉又は澱粉質を酸及び／又はアミラーゼにより加水分解して得られたものである請求項９に記載の還元性澱粉糖の変換方法。
- 還元性澱粉糖がマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース及び／又はマルトヘプタオースである請求項９又は１０に記載の還元性澱粉糖の変換方法。
- 還元性澱粉糖の濃度が５０％（ｗ／ｗ）以下の水溶液中に組換え型酵素を共存せしめ、温度４０乃至５５℃、ｐＨ５乃至１０で作用させる請求項９乃至１１のいずれかに記載の還元性澱粉糖の変換方法。
- 非還元性糖質が、α−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース又はα−マルトペンタオシルトレハロースである請求項９乃至１２のいずれかに記載の還元性澱粉糖の変換方法。
- グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖に請求項１乃至８のいずれかに記載の組換え型酵素の製造方法によって得られる組換え型酵素を作用させて、該澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成させる工程を含んでなる非還元性糖質の製造方法。
- 還元性澱粉糖が澱粉又は澱粉質を酸及び／又はアミラーゼにより加水分解して得られたものである請求項１４に記載の非還元性糖質の製造方法。
- 還元性澱粉糖がマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース及び／又はマルトヘプタオースである請求項１４又は１５に記載の非還元性糖質の製造方法。
- 還元性澱粉糖の濃度が５０％（ｗ／ｗ）以下の水溶液中に組換え型酵素を共存せしめ、温度４０乃至５５℃、ｐＨ５乃至１０で作用させることを特徴とする請求項１４乃至１６のいずれかに記載の非還元性糖質の製造方法。
- 非還元性糖質が、α−グルコシルトレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース又はα−マルトペンタオシルトレハロースである請求項１４乃至１７のいずれかに記載の非還元性糖質の製造方法。
- 請求項１乃至８のいずれかに記載の組換え型酵素の製造方法によって得られる組換え型酵素と、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ又はトレハロース遊離酵素とを組み合わせて用いることを特徴とするトレハロースの製造方法。
- グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ又はトレハロース遊離酵素を、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質に作用させることを特徴とする請求項１９に記載のトレハロースの製造方法。
- 澱粉質又は還元性澱粉糖を用いることを特徴とする請求項１９又は２０に記載のトレハロースの製造方法。
- 還元性澱粉糖が、酸及び／又は酵素によって加水分解して得られるものである請求項２１に記載のトレハロースの製造方法。
- 酵素が、澱粉枝切酵素であることを特徴とする請求項２２に記載のトレハロースの製造方法。
- 澱粉枝切酵素が、プルラナーゼ又はイソアミラーゼであることを特徴とする請求項２３に記載のトレハロースの製造方法。
- 還元性澱粉糖が、グルコース重合度３以上のマルトオリゴ糖の１種又は２種以上からなることを特徴とする請求項２１又は２２に記載のトレハロースの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05825895A JP3557272B2 (ja) | 1994-02-23 | 1995-02-23 | 組換え型酵素とその製造方法並びに用途 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4794094 | 1994-02-23 | ||
| JP6-47940 | 1994-02-23 | ||
| JP9070594 | 1994-04-06 | ||
| JP6-90705 | 1994-04-06 | ||
| JP05825895A JP3557272B2 (ja) | 1994-02-23 | 1995-02-23 | 組換え型酵素とその製造方法並びに用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07322883A JPH07322883A (ja) | 1995-12-12 |
| JP3557272B2 true JP3557272B2 (ja) | 2004-08-25 |
Family
ID=27293136
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP05825895A Expired - Lifetime JP3557272B2 (ja) | 1994-02-23 | 1995-02-23 | 組換え型酵素とその製造方法並びに用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3557272B2 (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4295840B2 (ja) * | 1997-12-09 | 2009-07-15 | 株式会社林原生物化学研究所 | 血行改善剤 |
| JP3958884B2 (ja) | 1998-09-11 | 2007-08-15 | 株式会社林原生物化学研究所 | 非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素ならびに該酵素を用いる糖質の製造方法 |
| JP2000262252A (ja) | 1999-01-11 | 2000-09-26 | Aoba Kasei Kk | タンパク質変性抑制剤、冷凍変性が抑制された擂潰食肉およびその製造方法ならびに練り製品の製造方法 |
| JP4652540B2 (ja) | 2000-03-02 | 2011-03-16 | 株式会社林原生物化学研究所 | 体臭抑制剤とその用途 |
| CA2355814C (en) | 2000-09-14 | 2010-06-29 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Pharmaceutical composition for ophthalmic use |
| JP4754066B2 (ja) | 2000-12-22 | 2011-08-24 | 株式会社林原生物化学研究所 | 抗関節障害剤 |
| JP2004168785A (ja) * | 2004-02-03 | 2004-06-17 | Hayashibara Biochem Lab Inc | 化粧料 |
| CN107446007A (zh) | 2011-09-21 | 2017-12-08 | 株式会社林原 | 含有α,α‑海藻糖二水合物晶体的粉末的制备方法 |
-
1995
- 1995-02-23 JP JP05825895A patent/JP3557272B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07322883A (ja) | 1995-12-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3557289B2 (ja) | 非還元性糖質からトレハロースを遊離する組換え型耐熱性酵素 | |
| JP3557288B2 (ja) | 還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する組換え型耐熱性酵素 | |
| KR100374449B1 (ko) | 효소를인코우드하는디엔에이(dna),재조합디엔에이(dna)와효소,형질전환체및이들의제조방법과용도 | |
| JP3810457B2 (ja) | マルトースをトレハロースに変換する組換え型耐熱性酵素 | |
| US5871993A (en) | DNA encoding enzyme, recombinant DNA and enzyme, transformant, and their preparations and uses | |
| JP3559609B2 (ja) | 組換え型酵素とその製造方法並びに用途 | |
| JP3557272B2 (ja) | 組換え型酵素とその製造方法並びに用途 | |
| JP3650632B2 (ja) | マルトースをトレハロースに変換する組換え型酵素 | |
| JP3557271B2 (ja) | 酵素をコードするｄｎａとそれを含む組換えｄｎａ並びに形質転換体 | |
| JP3557276B2 (ja) | 酵素をコードするｄｎａとそれを含む組換えｄｎａ並びに形質転換体 | |
| US5763228A (en) | Recombinant enzyme for converting maltose into trehalose from pimelobacter sp. | |
| CA2159551C (en) | Recombinant thermostable enzyme for converting maltose into trehalose |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A132 Effective date: 20040330 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040413 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20040511 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20040517 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110521 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120521 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130521 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130521 Year of fee payment: 9 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |