JP3810457B2 - マルトースをトレハロースに変換する組換え型耐熱性酵素 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、マルトースをトレハロースに変換する新規な組換え型耐熱性酵素に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
トレハロースは、グルコース２分子が還元性基同士が結合した二糖類であり、天然には細菌、真菌、藻類、昆虫などに微量存在する。トレハロースは分子中に還元性基を持たないので、アミノ酸類の存在下で加熱しても褐変反応を起こすことがなく、着色や変質の懸念なく飲食物を甘味付けできる利点がある。しかしながら、従来の方法では所望量を入手するのが難しく、実際に飲食物の甘味付けに使われることは殆どなかった。
【０００３】
これまでの製造方法は、主として微生物の菌体を利用する方法と、糖質に複合酵素系を作用させる方法とに大別される。前者の方法は、特開昭５０−１５４４８５号公報などにも見られるように、細菌、酵母などの微生物を栄養培地で増殖させ、主として菌体からトレハロースを採取するものである。一方、後者の方法は、特開昭５８−２１６６９５号公報などにもみられるように、基質にマルトースを使用し、これにマルトース・フォスフォリラーゼとトレハロース・フォスフォリラーゼからなる複合酵素系を作用させ、生成したトレハロースを系外に取出すものである。前者の方法は、微生物そのものの増殖は比較的容易なものの、菌体に含まれるトレハロースが高々１５％（ｗ／ｗ）と僅少であるという問題があった。後者の方法は、トレハロースそのものの分離は比較的容易なものの、反応自体が２種類の酵素による平衡反応であり、しかも、その平衡が常時グルコース燐酸側に傾いていることから、基質を高濃度にして反応させ、トレハロースの収量を上げるのが原理的に難しかった。
【０００４】
斯かる状況に鑑み、本発明者らがマルトースを直接トレハロースに変換する酵素につき鋭意検索したところ、ピメロバクター属やシュードモナス属に属するある種の微生物がマルトースに作用してトレハロースを生成するという、従来未知の全く新規な酵素を産生することを見出し、特願平５−１９９９７１号明細書に開示した。このことは、大量且つ廉価に入手し得るマルトースを原料にトレハロースが製造できることを意味しており、斯かる酵素を利用することにより、トレハロースに係わる前記課題は悉く解決されるものと期待される。
【０００５】
ところが、上記微生物が産生する酵素は、いずれも２０乃至４０℃付近に至適温度を有しており、実際にトレハロースの製造に使用するには熱安定性にやや難点のあることが判明した。すなわち、斯界においては、澱粉や澱粉質を糖化するには、一般に、５５℃を越える温度で反応させるのが望ましいとされており、これは、５５℃以下で糖化すると雑菌汚染が顕著となり、反応物のｐＨが低下して酵素が失活したり、これにより、大量の基質が未反応のまま残存したりすることによる。敢えて熱安定性に劣る酵素で糖化しようとすると、ｐＨの推移に多大の注意を払わなければならず、万一、ｐＨが顕著に低下した場合には、反応物にアルカリ等を加えて可及的速やかにｐＨを上昇させるなどの対策を講じなければならない。
【０００６】
このようなことから、本発明者らが、斯かる作用ある耐熱性酵素につき引続き検索したところ、サーマス・アクアティカス（ＡＴＣＣ３３９２３）を始めとするサーマス属の微生物が産生する酵素は、５５℃を上回る温度で反応させても、実質的に失活することなく、マルトースを効率的にトレハロースに変換することを見出した。しかしながら、これら微生物は酵素の産生能が充分でなく、トレハロースを大規模に製造しようとすると、微生物を大量に培養しなければならないという問題がある。
【０００７】
一方、昨今の組換えＤＮＡ技術の進歩には目覚ましいものがある。今日では、全アミノ酸配列が解明されていない酵素であっても、これをコードする遺伝子を単離し、その塩基配列を解明できれば、その酵素をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを作製し、これを微生物や動植物の細胞に導入して得られる形質転換体を培養することにより、比較的容易に所望量の酵素が取得できるようになった。斯かる状況に鑑み、上記耐熱性酵素をコードする遺伝子を突止め、その塩基配列を解明するのが急務となっている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
この発明の目的は、組換えＤＮＡ技術を応用することにより、マルトースに作用してトレハロースを生成する耐熱性酵素を創製することにある。
【０００９】
この発明の別の目的は、その創製された組換え型酵素をコードするＤＮＡを提供することにある。
【００１０】
この発明のさらに別の目的は、斯かるＤＮＡを含む複製可能な組換えＤＮＡを提供することにある。
【００１１】
この発明のさらに別の目的は、斯かる組換えＤＮＡを導入した形質転換体を提供することにある。
【００１２】
この発明のさらに別の目的は、斯かる形質転換体を利用する、組換え型耐熱性酵素の製造方法を提供することにある。
【００１３】
この発明のさらに別の目的は、組換え型耐熱性酵素により、マルトースをトレハロースに変換する方法を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
この発明は、前記第一の課題を、マルトースをトレハロースに変換する作用を有し、５５℃を越える温度で反応させても、実質的に失活しない組換え型酵素により解決するものである。
【００１５】
この発明は、前記第二の課題を、斯かる組換え型酵素をコードするＤＮＡにより解決するものである。
【００１６】
この発明は、前記第三の課題を、上記組換え型酵素をコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡにより解決するものである。
【００１７】
この発明は、前記第四の課題を、上記組換え型酵素をコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体により解決するものである。
【００１８】
この発明は、前記第五の課題を、上記組換え型酵素をコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体を培養し、培養物から組換え型酵素を採取してなる組換え型酵素の製造方法により解決するものである。
【００１９】
この発明は、前記第六の課題を、マルトースに上記組換え型酵素を作用させてトレハロースを生成させる工程を含んでなるマルトースの酵素的変換方法により解決するものである。
【００２０】
【発明の実施の形態】
この発明の組換え型酵素は、５５℃を越える温度で反応させても、実質的に失活することなく、マルトースに作用してトレハロースを生成する。
【００２１】
この発明のＤＮＡは、自律複製可能な適宜ベクターに挿入して複製可能な組換えＤＮＡとし、これを、通常、当該組換え型酵素を産生しないけれども、容易に増殖させることのできる適宜宿主に導入して形質転換体とすることにより、当該組換え型酵素の産生を発現する。
【００２２】
この発明の組換えＤＮＡは、通常、当該組換え型酵素を産生しないけれども、容易に増殖させることのできる適宜宿主に導入して形質転換体とすることにより、当該組換え型酵素の産生を発現する。
【００２３】
この発明の形質転換体は、培養すると、当該組換え型酵素を産生する。
【００２４】
斯かる形質転換体をこの発明の製造方法にしたがって培養すれば、所望量の当該組換え型酵素が容易に得られる。
【００２５】
この発明の酵素的変換方法により、マルトースはトレハロースとグルコース及び／又はマルトオリゴ糖からなる糖組成物に変換される。
【００２６】
この発明は、マルトースをトレハロースに変換する、従来未知の全く新規な耐熱性酵素の発見に基づくものである。斯かる酵素はサーマス・アクアティカス（ＡＴＣＣ３３９２３）の培養物から得ることができ、本発明者らがカラムクロマトグラフィーを中心とする種々の方法を組合せてこの酵素を単離し、その性質・性状を調べたところ、その本質はポリペプチドであり、次のような理化学的性質を有することが判明した。
（１） 作用
マルトースに作用してトレハロースを生成する。
トレハロースに作用してマルトースを生成する。
（２） 分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定すると、分子量約１００，０００乃至１１０，０００ダルトンを示す。（３） 等電点
等電点電気泳動法により測定すると、約３．８乃至４．８に等電点を示す。
（４） 至適温度
ｐＨ７．０で６０分間反応させると、６５℃付近に至適温度を示す。
（５） 至適ｐＨ
６０℃で６０分間反応させると、ｐＨ６．０乃至６．７付近に至適ｐＨを示す。
（６） 熱安定性
ｐＨ７．０で６０分間インキュベートすると、８０℃付近まで安定である。
（７） ｐＨ安定性
６０℃で６０分間インキュベートすると、ｐＨ５．５乃至９．５付近まで安定である。
【００２７】
次に、サーマス・アクアティカス（ＡＴＣＣ３３９２３）が産生する耐熱性酵素の理化学的性質を解明すべく行った実験について説明する。
【００２８】
【実験例１ 精製酵素の調製】
【００２９】
【実験例１−１ 酵素の産生】
５００ｍｌ容フラスコに０．５％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．０７％（ｗ／ｖ）硝酸ナトリウム、０．０１％（ｗ／ｖ）燐酸水素二ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム７水塩、０．０１％（ｗ／ｖ）塩化カルシウム及び水からなる液体培地（ｐＨ７．５）を１００ｍｌずつとり、１２０℃で２０分間オートクレーブして滅菌し、冷却後、サーマス・アクアティカス（ＡＴＣＣ３３９２３）を接種し、６０℃、２００ｒｐｍで２４時間回転振盪培養して種培養液を得た。３０ｌ容ジャーファーメンタに上記と同一組成の新鮮な液体培地を２０ｌずつとり、同様に滅菌し、６０℃まで冷却後、上記で得た種培養液を１％（ｖ／ｖ）ずつ植菌し、培地のｐＨを６．０乃至８．０に保ちつつ、６０℃で２０時間通気攪拌培養した。
【００３０】
培養終了後、培養物の酵素活性を測定したところ、約０．３５単位／ｍｌの酵素が産生していた。培養物の一部をとり、遠心分離して上清を回収し、酵素活性を測定したところ、約０．０２単位／ｍｌの酵素活性が認められた。さらに、分離した菌体に５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えてもとの培養物と同液量にした後、酵素活性を測定したところ、約０．３３単位／ｍｌの酵素活性が認められた。
【００３１】
なお、この発明を通じて、酵素の活性は次の方法により測定した活性値（単位）で表示する。すなわち、マルトースを２０％（ｗ／ｖ）含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を１ｍｌとり、適宜希釈した酵素液を１ｍｌ加え、６０℃で６０分間インキュベートして反応させた後、１００℃で１０分間加熱して反応を停止させる。５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．５）で反応物を１１倍希釈し、その希釈した反応物を０．４ｍｌとり、これにトレハラーゼを１単位／ｍｌ含む溶液を０．１ｍｌ加え、４５℃で１２０分間インキュベートした後、反応物中のグルコース量をグルコースオキシダーゼ法で定量する。同時に、１００℃で１０分間加熱して失活させた酵素液とトレハラーゼ液を用いる系を設け、上記と同様に処置して対照とする。このようにして求めたグルコース量から反応により生成したトレハロースの量を推定する。当該酵素の１単位とは、上記条件下において、１分間に１μｍｏｌのトレハロースを生成する酵素量と定義する。
【００３２】
【実験例１−２ 酵素の精製】
実験例１−１で調製した培養物を遠心分離し、得られた菌体（湿重量約０．２８ｋｇ）を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に浮遊させ、常法により破砕後、遠心分離して粗酵素液約１．８ｌを得た。この粗酵素液に硫酸アンモニウムを７０％飽和になるように加え、４℃で一夜静置して塩析した後、遠心分離して上清を採取した。この上清を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、新鮮な同一緩衝液に対して２４時間透析した。
【００３３】
透析内液を遠心分離して採取した上清（１，５６０ｍｌ）を予め１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化させておいた東ソー製イオン交換クロマトグラフィー用ゲル『ＤＥＡＥ−トヨパール６５０』５３０ｍｌのカラムに負荷し、０Ｍから０．４Ｍに上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液した。溶出液より酵素活性ある画分を採取し、１Ｍ硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して１０時間透析後、遠心分離して上清を採取した。この上清を予め１Ｍ硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化させておいた東ソー製疎水クロマトグラフィー用ゲル『ブチルトヨパール６５０』３８０ｍｌのカラムに負荷し、１Ｍから０Ｍに下降する硫酸アンモニウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液した。
【００３４】
硫酸アンモニウム濃度０．２Ｍ付近で溶出した酵素活性ある画分を採取し、０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して１６時間透析し、遠心分離により不溶物を除去した後、予め０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化させておいた東ソー製ゲル濾過クロマトグラフィー用ゲル『トヨパールＨＷ−５５Ｓ』３８０ｍｌのカラムに負荷し、カラムに１Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液した。その後、溶出液から酵素活性ある画分を採取し、予め１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化させておいたファルマシア製イオン交換クロマトグラフィー用カラム『モノＱ ＨＲ５／５』に負荷し、０．１Ｍから０．３５Ｍに上昇する塩化ナトリウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液し、溶出液より酵素活性ある画分を採取した。このようにして精製した酵素の比活性は約１３５単位／ｍｇ蛋白質であり、収量は培養物１ｌ当たり約３３０単位であった。
【００３５】
常法により、この精製酵素を７．５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル上でゲル電気泳動したところ、ゲル上には酵素活性を伴なう実質的に単一のバンドが観察され、精製酵素が極めて高純度であることが窺われた。
【００３６】
【実験例２ 酵素の理化学的性質】
【００３７】
【実験例２−１ 作用】
基質としてマルトース又はトレハロースを５％（ｗ／ｗ）含む水溶液に実験例１−２で調製した精製酵素を基質固形分１グラム当たり２単位加え、６０℃、ｐＨ７．０で２４時間反応させた。反応物の糖組成を調べるべく、反応物を真空乾燥し、ピリジンに溶解し、常法によりトリメチルシリル化後、ガスクロマトグラフィーに供した。ガスクロマトグラフ装置は島津製作所製『ＧＣ−１６Ａ』を、カラムはステンレス製円筒管（内径３ｍｍ、長さ２ｍ）に充填したジー・エル・サイエンス製『２％シリコンＯＶ−１７／クロモゾルブＷ』を、検出器は水素炎イオン方式のものを、そして、キャリアーガスに窒素ガス（流量４０ｍｌ／分）を使用し、カラムオーブン温度を１６０乃至３２０℃（昇温速度７．５℃／分）に設定した。表１に反応物の糖組成を示す。
【００３８】
【表１】

【００３９】
表１に見られるように、精製酵素は、マルトースを基質にすると、トレハロース及びグルコースをそれぞれ約７０％又は約４％生成し、一方、トレハロースを基質にすると、マルトース及びグルコースをそれぞれ約２１％又は約３％生成した。これらの事実は、精製酵素にマルトース及びトレハロースをそれぞれトレハロース又はマルトースに変換する作用のあること、さらには、僅かながら、マルトース分子中のα−１，４結合やトレハロース分子中のα，α−１，１結合を加水分解作用のあることを示唆している。斯かる酵素作用は未だ報告されておらず、全く新規な作用機序を辿るものと推定される。
【００４０】
【実験例２−２ 分子量】
ユー・ケー・レムリが『ネイチャー』、第２２７巻、第６８０乃至６８５頁（１９７０年）に報告している方法に準じてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動したところ、精製酵素は、分子量約１００，０００乃至１１０，０００ダルトンに相当する位置に酵素活性を伴なう実質的に単一なバンドを示した。なお、このときの分子量マーカーは、ミオシン（２００，０００ダルトン）、β−ガラクトシダーゼ（１１６，２５０ダルトン）、フォスフォリラーゼＢ（９７，４００ダルトン）、血清アルブミン（６６，２００ダルトン）及びオボアルブミン（４５，０００ダルトン）であった。
【００４１】
【実験例２−３ 等電点】
常法にしたがって、ファルマシア製ポリアクリルアミドゲル『アンフォライン』を２％（ｗ／ｖ）使用する等電点電気泳動に供したところ、精製酵素は約３．８乃至４．８に等電点を示した。
【００４２】
【実験例２−４ 至適温度】
常法により、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で６０分間反応させる条件で試験したところ、図１に示すように、精製酵素は６５℃付近に至適温度を示した。
【００４３】
【実験例２−５ 至適ｐＨ】
常法により、ｐＨの相違する１０ｍＭ酢酸緩衝液、燐酸緩衝液又は炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液中、６０℃で６０分間反応させる条件で試験したところ、図２に示すように、精製酵素はｐＨ６．０乃至６．７付近に至適ｐＨを示した。
【００４４】
【実験例２−６ 熱安定性】
常法により、５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で６０分間インキュベートする条件で試験したところ、図３に示すように、精製酵素は８０℃付近まで安定であった。
【００４５】
【実験例２−７ ｐＨ安定性】
常法により、ｐＨの相違する５０ｍＭ酢酸緩衝液、燐酸緩衝液又は炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液中、６０℃で６０分間インキュベートする条件で試験したところ、図４に示すように、精製酵素はｐＨ５．５乃至９．５付近まで安定であった。
【００４６】
【実験例２−８ Ｎ末端アミノ酸配列】
常法により、パーキン・エルマー製気相プロテイン・シーケンサ『４７０Ａ型』を使用して分析したところ、精製酵素はＮ末端に配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有していた。
【００４７】
【実験例２−９ 部分アミノ酸配列】
実験例１−２で調製した精製酵素を適量とり、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して４℃で１８時間透析後、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて酵素濃度を約１ｍｇ／ｍｌとした。１００℃で５分間加熱して変性させた後、溶液を約１ｍｌとり、リジルエンドペプチダーゼを４０μｇ加え、３０℃で４４時間インキュベートして酵素を部分加水分解した。加水分解物を予め０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸により平衡化させておいた日本ミリポア・リミテッド製高速液体クロマトグラフィー用カラム『マイクロボンダスフェアーＣ１８』に負荷し、０％（ｖ／ｖ）から７０％（ｖ／ｖ）に上昇する水性アセトニトリルの濃度勾配下、カラムに０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を１．０ｍｌ／分の流速で通液した。
【００４８】
通液開始から約５８乃至６０分後に溶出したペプチド断片を含む画分を採取し、真空乾燥後、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．５ｍｌに溶解し、ＴＰＣＫ処理したトリプシンを５μｇ加え、３７℃で１６時間インキュベートして加水分解した。凍結により反応を停止させた後、加水分解物を予め１５％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸により平衡化させておいた日本ミリポア・リミテッド製高速液体クロマトグラフィー用カラム『マイクロボンダスフェアーＣ１８』に負荷し、１５％（ｖ／ｖ）から５５％（ｖ／ｖ）に上昇する水性アセトニトリルの濃度勾配下、カラムに０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を１．０ｍｌ／分の流速で通液した。そして、通液開始から約４２分後に溶出したペプチド断片を含む画分を採取し、真空乾燥後、５０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸に溶解した。以後、実験例２−８と同様に分析したところ、ペプチド断片は配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列を有していた。
【００４９】
以上のような理化学的性質を有する酵素は未だ知られておらず、新規物質であると判断される。
【００５０】
そこで、本発明者が、実験例２−８及び実験例２−９で明らかにした部分アミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブにし、サーマス・アクアティカス（ＡＴＣＣ３３９２３）の染色体ＤＮＡを鋭意検索したところ、配列表における配列番号４に示す塩基配列を含む、約３，６００塩基対からなるＤＮＡ断片が得られた。そして、その塩基配列を解読したところ、同微生物が産生する耐熱性酵素は９６３個のアミノ酸からなる、配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。
【００５１】
配列表における配列番号３及び４に示すアミノ酸配列及び塩基配列を解明するに到った一連の工程を要約すると、次のようになる。
（１） 供与体微生物の培養物から耐熱性酵素を単離し、高度に精製後、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。一方、その精製酵素をプロテアーゼにより部分加水分解し、加水分解物よりペプチド断片を単離し、そのアミノ酸配列を決定した。
（２） 別途、供与体微生物の菌体より染色体ＤＮＡを分離し、精製後、制限酵素により部分消化し、消化物から約４，０００乃至８，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。ＤＮＡリガーゼにより、このＤＮＡ断片を予め制限酵素で切断しておいたプラスミドベクターに連結し、組換えＤＮＡを作製した。
（３） 大腸菌にこの組換えＤＮＡを導入して形質転換体を作製し、前記部分アミノ酸配列に基づき化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブとするコロニーハイブリダイゼーションにより耐熱性酵素をコードするＤＮＡを含む形質転換体を選択した。
（４） 形質転換体から組換えＤＮＡを採取し、プライマーとともにアニーリング後、ＤＮＡポリメラーゼを作用させてプライマーを伸長し、得られた相補鎖ＤＮＡをジオキシ・チェーン・ターミネータ法により分析して塩基配列を決定した。そして、その塩基配列から推定されるアミノ酸配列と前記部分アミノ酸配列とを比較し、その塩基配列が耐熱性酵素をコードしていることを確認した。
【００５２】
次の実験例３及び４では、上記の工程（２）乃至（４）を具体的に説明するが、これら実験例で用いる手法自体は斯界において公知であり、例えば、ジェー・サムブルック等『モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル』、第２版、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行などにも詳述されている。
【００５３】
【実験例３ 耐熱性酵素をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製】
【００５４】
【実験例３−１ 染色体ＤＮＡの調製】
ニュートリエント・ブロス培地（ｐＨ７．０）にサーマス・アクアティカス（ＡＴＣＣ３３９２３）を接種し、常法により６０℃で２４時間回転振盪培養した。遠心分離により培養物から採取した菌体をＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に浮遊させ、リゾチームを０．０５％（ｗ／ｖ）加えた後、３７℃で３０分間インキュベートした。処理物を−８０℃で１時間凍結し、ＴＳＳ緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて６０℃に加温し、ＴＥＳ緩衝液／フェノール混液を加え、氷冷後、遠心分離により上清を採取した。この上清に２倍容の冷エタノールを加え、沈澱した粗染色体ＤＮＡを採取し、ＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解後、リボヌクレアーゼとプロテアーゼをそれぞれ７．５μｇ又は１２５μｇ加え、３７℃で１時間インキュベートして反応させた。反応物にクロロホルム／イソアミルアルコール混液を加えて染色体ＤＮＡを抽出し、冷エタノールを加え、生成した染色体ＤＮＡを含む沈澱を採取した。このようにして得た精製染色体ＤＮＡを濃度約１ｍｇ／ｍｌになるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、溶液を−８０℃で凍結した。
【００５５】
【実験例３−２ 組換えＤＮＡ ｐＢＴＭ２２と形質転換体ＢＴＭ２２の作製】
実験例３−１で調製した精製染色体ＤＮＡ溶液を１ｍｌとり、これに制限酵素Ｓａｕ ３ＡＩを約１０単位加え、３７℃で２０分間反応させて染色体ＤＮＡを部分切断した後、蔗糖密度勾配超遠心法により約４，０００乃至８，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。別途、ストラタジーン・クローニング・システムズ製プラスミドベクター『Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）』を１μｇとり、常法により制限酵素Ｂａｍ ＨＩを作用させて完全に切断した後、上記で得たＤＮＡ断片１０μｇとＴ４ ＤＮＡリガーゼを２単位加え、４℃で一夜静置することによりＤＮＡ断片に連結した。得られた組換えＤＮＡにストラタジーン・クローニング・システムズ製コンピテントセル『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ』を３０μｌ加え、氷冷下で３０分間静置後、４２℃に加温し、ＳＯＣブロスを加え、振盪下、３７℃で１時間インキュベートして組換えＤＮＡを大腸菌に導入した。
【００５６】
このようにして得た形質転換体を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシドを５０μｇ／ｍｌ含む寒天平板培地（ｐＨ７．０）に接種し、３７℃で１８時間培養後、培地上に形成された約６，０００個のコロニーをナイロン膜上に固定した。別途、常法により、配列表における配列番号１に示す部分アミノ酸配列のＴｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｌで表わされる配列に基づき５´−ＴＧＧＴＡＹＡＡＲＧＡＹＧＣＮＧＴ−３´で表わされる塩基配列のプローブ１を化学合成し、同位体³²Ｐで標識後、前記ナイロン膜上に固定した形質転換株のコロニーにハイブリダイズさせ、顕著な会合を示した５種類の形質転換体を選択した。
【００５７】
常法により、これら５種類の形質転換体から組換えＤＮＡを採取する一方、配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列のＡｓｎ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕで表わされる配列に基づき化学合成した５´−ＡＡＹＡＴＧＴＧＧＣＣＮＧＡＲＧＡ−３´で表わされる塩基配列のプローブ２を同位体³²Ｐで標識後、イー・エム・サザーン『ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー』、第９８巻、第５０３乃至５１７頁（１９７５年）に記載されている方法に準じて上記組換えＤＮＡにハイブリダイズさせ、顕著な会合を示した組換えＤＮＡを選択した。このようにして得た組換えＤＮＡ及び形質転換体を、それぞれ、『ｐＢＴＭ２２』、『ＢＴＭ２２』と命名した。
【００５８】
形質転換体ＢＴＭ２２をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に接種し、３７℃で２４時間回転振盪培養し、培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常のアルカリ法により組換えＤＮＡを菌体外に溶出させた。処理物を常法により精製し、分析したところ、組換えＤＮＡｐＢＴＭ２２は約１０，３００塩基対からなり、図５に示すように、耐熱性酵素をコードする約２，９００塩基対からなるＤＮＡを含む断片は、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩによる切断部位の下流に連結されていた。
【００５９】
【実験例３−３ 形質転換体ＢＴＭ２２による組換え型酵素の産生】
５００ｍｌ容フラスコに２．０％（ｗ／ｖ）グルコース、０．５％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．１％（ｗ／ｖ）燐酸水素二カリウム、０．０６％（ｗ／ｖ）燐酸二水素ナトリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム７水塩、０．５％（ｗ／ｖ）炭酸カルシウム及び水からなる液体培地（ｐＨ７．０）を１００ｍｌずつとり、１１５℃で３０分間オートクレーブして滅菌し、冷却後、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加えた。この液体培地に実験例３−２で調製した形質転換体ＢＴＭ２２を接種し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。培養物を常法により超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去した後、上清中の酵素活性を測定したところ、培養物１ｌ当たり約８００単位の組換え型酵素が産生していた。
【００６０】
対照として、大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株又はサーマス・アクアティカス（ＡＴＣＣ３３９２３）をアンピシリン無含有の上記と同一組成の液体培地を使用し、サーマス・アクアティカス（ＡＴＣＣ３３９２３）の場合、培養温度を６５℃に設定した以外は上記と同様に培養・処理した。処理物の酵素活性を測定したところ、サーマス・アクアティカス（ＡＴＣＣ３３９２３）による耐熱性酵素の産生は培養物１ｌ当たり約３５０単位と、形質転換体ＢＴＭ２２と比較して有意に低いものであった。なお、宿主に使用した大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株は、耐熱性酵素を全く産生しなかった。
【００６１】
その後、形質転換体ＢＴＭ２２が産生した組換え型酵素を実験例１及び２の方法により精製し、その性質・性状を調べたところ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量約１００，０００乃至１１０，０００ダルトンと等電点電気泳動で約３．８乃至４．８に等電点を示すとともに、水溶液（ｐＨ７．０）中、８０℃で６０分間インキュベートしても実質的に失活しないなど、供与体微生物であるサーマス・アクアティカス（ＡＴＣＣ３３９２３）が産生する耐熱性酵素とほぼ同じ理化学的性質を有していた。このことは、組換えＤＮＡ技術によっても耐熱性酵素を製造でき、且つ、その生産性も有意に向上することを示唆している。
【００６２】
【実験例４ 相補鎖ＤＮＡの調製並びにその塩基配列及びアミノ酸配列の決定】
実験例３−２で調製した組換えＤＮＡ ｐＢＴＭ２２を２μｇとり、これに２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加えて変性させた後、適量の冷エタノールを加え、生成したテンプレートＤＮＡを含む沈澱を採取し、真空乾燥した。このテンプレートＤＮＡに化学合成した５´−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３´で表わされる塩基配列のプライマーを５０ｐｍｏｌ／ｍｌと、２０ｍＭ塩化マグネシウムと塩化ナトリウムを含む４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を１０μｌ加え、６５℃で２分間インキュベートしてアニーリングした後、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰをそれぞれ７．５μＭ含む水溶液を２μｌと、［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰ（２ｍＣｉ／ｍｌ）を０．５μｌと、０．１Ｍジチオスレイトールを１μｌと、１．５単位／ｍｌのＴ７ ＤＮＡポリメラーゼを２μｌ加え、２５℃で５分間インキュベートすることによりプライマーを５´末端から３´末端に向かって伸長させ、相補鎖ＤＮＡを生成させた。
【００６３】
次に、上記で得た相補鎖ＤＮＡを含む反応物を四等分し、それぞれにｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ及びｄｄＴＴＰのいずれかを８μＭと８０μＭ ｄＮＴＰを含む５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液を２．５μｌ加え、３７℃で５分間インキュベートして反応させ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）ブロムフェノールブルー及び０．０５％（ｗ／ｖ）キシレンシアノールを含む９８％（ｖ／ｖ）水性ホルムアミド溶液を４μｌ加えて反応を停止させた。反応物を沸騰水中で３分間加熱後、６％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル上にとり、約２，０００Ｖの定電圧を印加しながら電気泳動してＤＮＡ断片を分離し、次いで、常法によりゲルを固定し、乾燥させた後、オートラジオグラフィーした。
【００６４】
ラジオグラム上に分離したＤＮＡ断片を解析した結果、相補鎖ＤＮＡは配列表における配列番号５に示す約３，６００塩基対からなる塩基配列を含んでいることが判明した。この塩基配列から推定されるアミノ酸配列はその配列番号５に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と配列表における配列番号１及び２に示す部分アミノ酸配列を比較したところ、配列番号１のアミノ酸配列は配列番号５における第１乃至２０番目の配列に、また、配列番号２のアミノ酸配列は配列番号５における第２３６乃至２５０番目の配列に一致した。これは、この発明の組換え型酵素が配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を有することあり、サーマス・アクアティカス（ＡＴＣＣ３３９２３）由来のＤＮＡにおいては、そのアミノ酸配列が配列表における配列番号４に示す塩基配列によりコードされていることを示している。
【００６５】
以上説明したように、マルトースをトレハロースに変換し、トレハロースをマルトースに変換する耐熱性酵素は、本発明者の長年に亙る研究の一成果として見出されたものであり、従来公知の酵素には見られない独特の理化学的性質を具備している。この発明は、組換えＤＮＡ技術を応用することにより、この耐熱性酵素を創製しようというものである。以下、実施例等を参照しながら、この発明の組換え型酵素とその製造方法、用途につき、具体的に説明する。
【００６６】
この発明でいう組換え型酵素とは、組換えＤＮＡ技術により創製され、マルトースをトレハロースに変換し、トレハロースをマルトースに変換する酵素全般を意味する。この発明の組換え型酵素は、通常、解明されたアミノ酸配列を有しており、その一例として、例えば、配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列又はそれに相同的なアミノ酸配列が挙げられる。配列番号３に示すアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有する変異体は、所期の性質を実質的に変えることなく、配列番号３のアミノ酸配列における構成アミノ酸の１個又は２個以上を他のアミノ酸で置換することにより得ることができる。なお、同じＤＮＡであっても、それを導入する宿主や、そのＤＮＡを含む形質転換体の培養に使用する栄養培地の成分・組成や培養温度・ｐＨなどに依っては、宿主内酵素によるＤＮＡ発現後の修飾などにより、所期の性質は保持しているものの、配列番号３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端及び／又はＣ末端付近のアミノ酸が１個又は２個以上が欠失したり、Ｎ末端に１個又は２個以上のアミノ酸が新たに付加した変異体の産生することがある。斯かる変異体も、それが所期の性質を具備しているかぎり、当然、この発明の組換え型酵素に包含される。
【００６７】
この発明による組換え型酵素は、特定のＤＮＡを含む形質転換体の培養物から採取することができる。この発明で使用する形質転換体は、例えば、配列表における配列番号４に示す塩基配列若しくはそれに相同的な塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列のＤＮＡを適宜宿主に導入することにより得ることができる。なお、斯かる塩基配列は、遺伝子コードの縮重を利用して、コードするアミノ酸配列を変えることなく、塩基の１個又は２個以上を他の塩基に置換えてもよい。また、ＤＮＡが宿主中で実際に当該組換え型酵素の産生を発現するために、当該組換え型酵素又はその相同変異体をコードする塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で適宜置換し得ることは言うまでもない。
【００６８】
この発明で使用するＤＮＡは、それが前述のような配列を有するかぎり、それが天然に由来するものか人為的に合成されたものであるかは問わない。天然の給源としては、例えば、サーマス・アクアティカス（ＡＴＣＣ３３９２３）を含むサーマス属の微生物が挙げられる。これら微生物の菌体からは、例えば、配列表における配列番号５に示す塩基配列のＤＮＡを含む遺伝子が得られる。すなわち、斯かる微生物を栄養培地に接種し、好気的条件下で約１日乃至３日間培養後、培養物から菌体を採取し、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素や超音波で処理することにより当該ＤＮＡを含む遺伝子を菌体外に溶出させる。このとき、細胞壁溶解酵素にプロテアーゼなどの蛋白質加水分解酵素を併用したり、菌体を超音波処理する際、ＳＤＳなどの界面活性剤を共存させたり凍結融解してもよい。斯くして得られる処理物に、例えば、フェノール抽出、アルコール沈澱、遠心分離、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理などの斯界における通常一般の方法を適用すれば目的のＤＮＡが得られる。一方、ＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、配列表における配列番号４に示す塩基配列に基づいて化学合成するか、配列番号３に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを適宜宿主に導入して得られる形質転換体を培養し、培養物から菌体を採取し、その菌体から当該ＤＮＡを含むプラスミドを採取すればよい。
【００６９】
斯かるＤＮＡは、通常、組換えＤＮＡの形態で宿主に導入される。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなり、ＤＮＡが入手できれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。斯かるベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７などのプラスミドベクターやλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、ρ１１、φ１、φ１０５などのファージベクターが挙げられる。このうち、この発明のＤＮＡを大腸菌で発現させるにはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３、λｇｔ・λＣ及びλｇｔ・λＢが好適であり、一方、枯草菌で発現させるにはｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１及びφ１０５が好適である。ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７は、組換えＤＮＡを２種類以上の宿主内で複製させる場合に有用である。
【００７０】
ＤＮＡを斯かるベクターに挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、先ず、ＤＮＡを含む遺伝子と自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。遺伝子及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＩＩ型の制限酵素、詳細には、Ｓａｕ ３ＡＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｂａｍ ＨＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩなどを使用すれば、ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するのが容易となる。ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するには、必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培養することにより無限に複製可能である。
【００７１】
このようにして得られる複製可能な組換えＤＮＡは、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母を始めとする適宜の宿主微生物に導入することができる。宿主が大腸菌の場合には、宿主を組換えＤＮＡとカルシウムイオンの存在下で培養すればよく、一方、宿主が枯草菌の場合には、コンピテントセル法やプロトプラスト法を適用すればよい。形質転換体をクローニングするには、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、マルトース又はトレハロースを含む栄養培地で培養し、それぞれ、トレハロース又はマルトースを生成するものを選択すればよい。
【００７２】
斯くして得られる形質転換体は、栄養培地で培養すると、菌体内外に当該組換え型酵素を産生する。栄養培地には、通常、炭素源、窒素源、ミネラル、さらには、必要に応じて、アミノ酸やビタミンなどの微量栄養素を補足した通常一般の液体培地が使用され、個々の炭素源としては、例えば、澱粉、澱粉加水分解物、グルコース、果糖、蔗糖、トレハロースなどの糖源が、また、窒素源としては、例えば、アンモニア乃至アンモニア塩、尿素、硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンスティープリカー、肉エキスなどの含窒素無機乃至有機物が挙げられる。形質転換体を斯かる栄養培地に接種し、栄養培地を温度２０乃至５０℃、ｐＨ２乃至９に保ちつつ、通気撹拌などによる好気的条件下で約１乃至６日間培養すれば、当該組換え型酵素を含む培養物が得られる。この培養物は酵素剤としてそのまま使用可能ではあるが、通常は使用に先立ち、必要に応じて、超音波や細胞溶解酵素により菌体を破砕した後、瀘過、遠心分離などにより酵素を菌体又は菌体破砕物から分離し、精製する。精製には酵素を精製するための通常の方法が採用でき、例えば、菌体又は菌体破砕物を除去した培養物に濃縮、塩析、透析、分別沈澱、ゲル瀘過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの１種又は２種以上を適宜組合わせて適用すればよい。
【００７３】
前述のとおり、この発明による組換え型酵素は、５５℃を越える温度で反応させても、実質的に失活することなく、マルトース及びトレハロースを、それぞれ、トレハロース又はマルトースに変換するという、従来の酵素には見られない独特の作用を有する。トレハロースはまろやかで上品な甘味を有し、そして、何よりも、分子中に還元性基を有しないので、着色や変質の懸念なく飲食物を甘味付けできるという大きな利点がある。当該組換え型酵素のこの性質を利用することにより、従来、還元性故に敬遠されがちであったマルトースを、還元性を有さず、扱い易く、付加価値の高いトレハロースに変換できることとなる。
【００７４】
斯かる変換方法につきさらに説明すると、この発明によるマルトースの酵素的変換方法でいうマルトースとは、通常、マルトースを含んでなる糖組成物を意味し、この発明の組換え型酵素が作用してトレハロースを生成し得るかぎり、その原料、製造方法は問わない。大量のトレハロースを効率的に製造するには、マルトース含量の高い糖組成物を使用するのが望ましく、通常、固形分当たり約７０％以上、望ましくは、約８０％以上のものが使用される。斯かる糖組成物は斯界における通常一般の方法により得ることができ、例えば、特公昭５６−１１４３７号公報や特公昭５６−１７０７８号公報に開示されている、糊化澱粉又は液化澱粉にβ−アミラーゼを作用させ、生成したマルトースを分別沈澱や透析手段により分離する方法や、特公昭４７−１３０８９号公報や特公昭５４−３９３８号公報に開示されている、糊化澱粉又は液化澱粉にβ−アミラーゼとイソアミラーゼやプルラナーゼなどの澱粉枝切酵素を作用させる方法を採用することができる。
【００７５】
この発明による酵素的変換方法においては、マルトースを含む水性媒体にこの発明の組換え型酵素の有効量を共存せしめ、水性媒体を所定の温度、ｐＨに保ちつつ、所望量のトレハロースが生成するまで反応させる。反応は０．１％（ｗ／ｗ）程度の低基質濃度下でも進行するけれども、この発明の変換方法を大規模に実施する場合には、より高濃度の約２％（ｗ／ｗ）以上、望ましくは、約５乃至５０％（ｗ／ｗ）とするのがよい。反応時の温度とｐＨは組換え型酵素が失活することなくマルトースに効率的に作用するレベルに設定され、温度は５５℃を越え、８５℃を越えないレベル、望ましくは、約５６乃至６３℃に、また、ｐＨは約５乃至１０、望ましくは、約６乃至７の範囲に設定される。組換え型酵素の量と反応時間は、反応の進行具合に依って適宜に設定する。この発明の組換え型酵素は、反応温度が高くなればなるほど高活性となるが、反応温度が高くなりすぎるとグルコースの遊離が顕著となり、結果的に最終製品におけるトレハロース含量を低下させることとなる。このようなことから、上記温度範囲をもって最良とした。この発明の酵素的変換方法により、マルトースは効率的にトレハロースに変換され、変換率は、使用する糖組成物のマルトース含量にも依るが、通常、約５０％以上に達する。
【００７６】
この発明の変換方法により得られた反応物はそのまま使用可能ではあるが、通常、使用に先立ち精製する。すなわち、瀘過、遠心分離などにより反応物から不溶物を除去し、活性炭により脱色した後、イオン交換樹脂により脱塩・精製し、濃縮してシロップ状物とする。用途に依っては、このシロップ状物を真空乾燥、噴霧乾燥などにより固状物としてもよい。実質的にトレハロースのみからなる製品を得るには、上記シロップ状物にイオン交換樹脂、活性炭、シリカゲルなどによる糖質を分離するための種々のクロマトグラフィー、酵母による発酵、アルカリによる還元性糖質の分解除去などの１種又は２種以上を適用する。大量の反応物を処理するには、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報や特開昭５８−７２５９８号公報に開示されている強酸性カチオン交換樹脂を使用する固定床方式、移動床方式又は疑似移動床方式のイオン交換クロマトグラフィーが有用であり、これらの方法によるときには、従来、大量入手が難しかったトレハロース含量が高い製品を大量且つ効率的に得ることができる。
【００７７】
斯くして得られるトレハロース及びトレハロースを含む糖組成物は、糖質甘味剤の還元性を嫌う種々の物品に広範な用途を有し、例えば、飲食物、化粧品、医薬品を始めとする組成物一般の甘味剤、呈味改善剤、品質改善剤、安定剤、賦形剤として極めて有用である。
【００７８】
以下、２〜３の実施例により、この発明による組換え型酵素の製造方法とマルトースの酵素的変換方法を具体的に説明する。
【００７９】
【実施例Ａ−１ 組換え型耐熱性酵素の製造】
５００ｍｌ容三角フラスコに２．０％（ｗ／ｖ）グルコース、０．５％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．１％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．１％（ｗ／ｖ）燐酸水素二カリウム、０．０６％（ｗ／ｖ）燐酸二水素ナトリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム７水塩、０．５％（ｗ／ｖ）炭酸カルシウム及び水からなる液体培地（ｐＨ７．２）を１００ｍｌずつとり、１１５℃で３０分間オートクレーブして滅菌し、冷却し、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加えた後、実験例１−２で調製した形質転換体ＢＴＭ２２を接種し、回転振盪下、３７℃で２４時間種培養した。次に、３０ｌ容ジャーファーメンタに上記と同一組成の新鮮な液体培地を１８ｌずつとり、同様に滅菌後、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加え、上記で得た種培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、液体培地をｐＨ６乃至８に保ちつつ、３７℃で２４時間通気撹拌培養した。培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物を除去後、上清中の酵素活性を測定したところ、培養物１ｌ当たりに換算して約８００単位の組換え型酵素が産生していた。この上清を実験例１−１の方法により精製したところ、比活性約１３５単位／ｍｇ蛋白質の組換え型酵素を約１５２単位／ｍｌ含む水溶液が約５ｍｌ得られた。
【００８０】
【実施例Ａ−２ 組換え型耐熱性酵素の製造】
【００８１】
【実施例Ａ−２（ａ） 形質転換体ＢＴＭ２３の作製】
実験例３−２の方法により得た組換えＤＮＡ ｐＢＴＭ２２を制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断し、配列表の配列番号４に示す塩基配列における第１０７乃至２，８８９までの塩基配列を含む約８，１００塩基対のＤＮＡ断片を得た。
【００８２】
別途、常法により化学合成した５´−ＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＴＴＴＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＣＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＡＣＣ−３´、５´−ＣＣＣＴＣＴＧＧＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＣＧＧＴＧＡＴＣＴＡＣＣＡＧＣＴＣＣＡＣ−３´、５´−ＧＴＣＣＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＴＧＡＣＧＣＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＧＧＣＴＡＣＧＧ−３´、５´−ＧＧＡＣＴＴＴＧＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＧＣＧＧＡ−３´、５´−ＡＧＣＴＴＣＣＧＣＣＴＣＡＧＧＣＣＣＴＣＡＡＡＧＴＣＣＣＣＧＴＡＧＣＣＧＴＣＧＴＴＧＴＴＧ−３´、５´−ＧＣＧＴＣＡＡＡＧＡＡＧＧＡＧＣＧＧＡＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＧＡＴＣＡＣＣ−３´、５´−ＧＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＣＣＡＧＡＧＧＧＧＧＴＣＣＡＴＧＧＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣ−３´及び５´−ＴＧＡＴＴＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡ−３´で表わされる塩基配列を有する８種類のオリゴヌクレオチドを適量混合し、１００℃、６５℃、３７℃及び２０℃でそれぞれ２０分間インキュベートしてアニールさせた。得られた配列表の配列番号６に示す塩基配列と配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列における第１乃至３６番目までのアミノ酸配列を変えることなく配列表の配列番号４に示す塩基配列における第１番目の「グアニン」が「アデニン」に置き換わった第１乃至１１０番目までの塩基配列からなる両端が４塩基の５´末端突出である１４１塩基対の二本鎖ＤＮＡに上記ＤＮＡ断片を加え、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下、４℃で一晩静置して連結させることにより、配列表の配列番号６に示す塩基配列と配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列における第１乃至９６３番目までの「グアニン」が「アデニン」に置き換わった第１乃至２，８８９番目までの塩基配列を含む第一の組換えＤＮＡを得た。
【００８３】
次に、実験例３−２の方法により得た組換えＤＮＡ ｐＢＴＭ２２を制限酵素Ｂａｍ ＨＩにより切断し、得られた配列表の配列番号４に示す塩基配列における第１，００８乃至２，８８９番目までの塩基配列を含む約２，４００塩基対のＤＮＡ断片に予め制限酵素Ｂａｍ ＨＩにより切断しておいた宝酒造製ファージベクター『Ｍ１３ｔｖ１９ ＲＦ ＤＮＡ』を上記と同様にして連結させて第二の組換えＤＮＡを得た。
【００８４】
別途、配列表の配列番号５に示す塩基配列における第３，４４８番目の「チミン」が「グアニン」に置き換わった第３，４３８乃至３，４５８番目までの塩基配列である５´−ＣＧＧＴＡＧＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＣＧＧＧ−３´で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを、常法により化学合成した。この合成オリゴヌクレオチドと、宝酒造製部位特異的変異システム『Ｍｕｔａｎ−Ｇ』とを用いて、第二の組換えＤＮＡに含まれる配列表の配列番号５に示す塩基配列における第３３７乃至９６３番目までのアミノ酸配列を変えることなく配列表の配列番号５に示す塩基配列における第３，４４８番目の「チミン」が「グアニン」に置き換わった配列表の配列番号４に示す塩基配列における第１，００８乃至２，８８９番目までの塩基配列を含む第三の組換えＤＮＡを得た。なお、部位特異的変異操作は、宝酒造製部位特異的変異システム『Ｍｕｔａｎ−Ｇ』に添付されていた説明書に従って行った。
【００８５】
次に、第一の組換えＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ ＲＩ及びＢｇｌ ＩＩにより切断して得られた配列表の配列番号４に示す第１番目の「グアニン」が「アデニン」に置き換わった第１乃至１，３５８番目までの塩基配列を含んでなる約１，３９０塩基対のＤＮＡ断片及び第三の組換えＤＮＡを制限酵素Ｂｇｌ ＩＩ及びＰｓｔ Ｉにより切断して得られた配列表の配列番号４に示す第１，３５９乃至２，８８９番目までの塩基配列を含んでなる約１，５５０塩基対のＤＮＡ断片を、予め制限酵素Ｅｃｏ ＲＩ及びＰｓｔ Ｉにより切断しておいたファルマシア製プラスミドベクター『ｐＫＫ２２３−３』にＴ４ ＤＮＡリガーゼにより連結させ、配列表の配列番号４に示す塩基配列を含むこの発明による組換えＤＮＡ ｐＢＴＭ２３を得た。
【００８６】
斯くして得られた組換えＤＮＡ ｐＢＴＭ２３を、ジェイ・サムブルック等『モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル』、第２版、第１．７４乃至１．８１頁、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行に記載されている方法に準じて予めコンピテントセル化した大腸菌ＬＥ３９２（ＡＴＣＣ３３５７２）に実験例３−２の方法に準じて導入し、当該酵素をコードするＤＮＡを含むこの発明による形質転換体ＢＴＭ２３を得た。実験例３−２の方法により形質転換体ＢＴＭ２３を培養し、培養物から菌体を採取し、溶出させた組換えＤＮＡを精製し、分析したところ、組換えＤＮＡ ｐＢＴＭ２３は約７，５００塩基対からなり、図６に示すように、当該酵素をコードする２，８８９塩基対を含むＤＮＡ断片を制限酵素Ｎｃｏ Ｉによる切断部位の下流に連結していた。
【００８７】
【実施例Ａ−２（ｂ） 形質転換体による組換え型耐熱性酵素の製造】
形質転換体ＢＴＭ２３を１％（ｗ／ｖ）マルトース、３％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、１％（ｗ／ｖ）『アサヒミーストＰ１Ｇ』（アサヒビール食品製）、０．１％（ｗ／ｖ）燐酸二水素ナトリウム二水塩、２００μｇ／ｍｌアンピシリンナトリウム及び水からなる液体培地（ｐＨ７．０）を用いた以外は実施例Ａ−１と同様にして培養した。培養物に卵白由来リゾチーム（生化学工業製）及び界面活性剤トリトンＸ−１００をそれぞれ０．１ｍｇ／ｍｌ及び１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように加え、３７℃で１６時間攪拌して菌体から組換え型耐熱性酵素を抽出した後、６０℃で１時間保温して大腸菌由来の夾雑酵素を失活させ、遠心分離により不純物を除去後、上清中の酵素活性を測定したところ、培養物１ｌ当たり約１２０，０００単位の組換え型耐熱性酵素が産生していた。この上清を実験例１の方法により精製したところ、比活性約１３５単位／ｍｇ蛋白質の組換え型耐熱性酵素を１ｍｌ当たり約１，４００単位含む水溶液が、約１７７ｍｌ得られた。
【００８８】
実験例２の方法によりこの精製酵素の性質、性状を調べたところ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量１００，０００乃至１１０，０００ダルトン、等電点電気泳動で約３．８乃至４．８に等電点を示すと共に、水溶液（ｐＨ７．０）中、８０℃で６０分間インキュベートしても実質的に失活しないなど、供与体微生物であるサーマス・アクアティカス（ＡＴＣＣ３３９２３）が産生する耐熱性酵素とほぼ同じ理化学的性質を有していた。
【００８９】
【実施例Ｂ−１ 組換え型酵素によるトレハロースシロップ状物の製造】
馬鈴薯澱粉を濃度１０％（ｗ／ｗ）になるように水中に懸濁し、懸濁液をｐＨ５．５に調整後、ナガセ生化学工業製α−アミラーゼ剤『スピターゼＨＳ』を澱粉固形分１グラム当たり２単位加え、９５℃で加熱して澱粉を糊化・液化した。液化液を１２０℃で２０分間オートクレーブして酵素を失活させ、５０℃に急冷後、ｐＨを５．０に調整し、澱粉固形分１グラム当たり、林原生物化学研究所製イソアミラーゼ剤を５００単位、ナガセ生化学工業製β−アミラーゼ剤を２０単位加え、５０℃で２４時間反応させて、固形分当たり、マルトースを約９２％含む糖液を得た。糖液を１００℃で２０分間加熱して酵素を失活させ、６０℃に冷却後、ｐＨを６．５に調整し、実施例Ａ−１の方法により得た組換え型酵素を澱粉固形分１グラム当たり１単位加え、９６時間反応させた。反応物を１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、瀘過後、常法にしたがって活性炭により脱色し、イオン交換樹脂により脱塩・精製し、濃縮して、濃度約７０％（ｗ／ｗ）のシロップ状物を原料澱粉固形分当たり約９５％の収率で得た。
【００９０】
トレハロースを固形分当たり約６８％含有する本品は、還元力がＤＥ１８．４と低く、しかも、温和な甘味や適度の粘度・保湿性を有していることから、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、賦形剤などとして飲食物、化粧品、医薬品を始めとする各種組成物に有利に配合使用できる。
【００９１】
【実施例Ｂ−２ 組換え型酵素によるトレハロース粉状物の製造】
実施例Ｂ−１の方法により得た反応物をｐＨ５．０に調整し、ナガセ生化学工業製グルコアミラーゼ剤『グルコチーム』を澱粉固形分１グラム当たり１０単位加え、５０℃で２４時間反応させた。新たに得られた反応物を加熱して酵素を失活させ、常法により脱色し、脱塩・精製した後、トレハロースの含量を高めるべく、東京有機化学工業製ナトリウム型カチオン交換樹脂『ＸＴ−１０１６』（架橋度４％）を用いるイオン交換カラムクロマトグラフィーに供した。すなわち、水に懸濁したイオン交換樹脂を内径５．４ｃｍのジャケット付きステンレス製円筒管４本に充填した後、円筒管を直列に連結して全カラム長を２０ｍとした。カラム内温度を６０℃に維持しつつ、上記反応物をカラムに対して約５％（ｖ／ｖ）負荷し、次に、６０℃の温水をＳＶ０．１５で通液して分画し、トレハロース含量の高い画分を採取した。この画分を常法により濃縮し、精製し、真空乾燥し、破砕して、トレハロース粉状物を原料固形分当たり約５０％の収率で得た。
【００９２】
トレハロースを固形分当たり約９７％含有する本品は、還元力が極めて低く、甘味もまろやかであることから、甘味剤、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして飲食物、化粧品、医薬品を始めとする各種組成物に有利に配合使用できる。
【００９３】
【実施例Ｂ−３ 組換え型酵素による結晶性トレハロース粉状物の製造】
実施例Ｂ−２の方法により得たトレハロース含量の高い画分を、常法にしたがって活性炭により脱色し、イオン交換樹脂により脱塩し、濃度約７０％（ｗ／ｗ）まで濃縮後、助晶機にとり、撹拌しつつ徐冷して晶出率約４５％のマスキットを得た。次に、約８５℃の温風を噴霧乾燥塔上部から下方に向かって送風しつつ、マスキットを噴霧乾燥塔上部に設けたノズルより約１５０ｋｇ／ｃｍ²の加圧 下で噴霧乾燥塔の下方に向かって噴霧する一方、噴霧乾燥塔底部に設けた金網コンベア上に捕集した結晶性粉末を、コンベア下部より約４５℃の温風を送風しつつ、噴霧乾燥塔外に徐々に搬出した。その後、結晶性粉末を熟成塔に充填し、温風気流中で１０時間熟成し、結晶化と乾燥を完了した。このようにして、トレハロース含水結晶の粉末を原料固形分当たり約９０％の収率で得た。
【００９４】
本品は実質的に吸湿性を示さず、取扱いも容易であり、甘味剤、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして飲食物、化粧品、医薬品を始めとする各種組成物に有利に配合使用できる。
【００９５】
【実施例Ｂ−４ 組換え型酵素による無水結晶性トレハロース粉状物の製造】
実施例Ｂ−２の方法により得たトレハロース含量の高い画分を実施例Ｂ−３と同様にして精製した後、蒸発釜にとり、減圧下で煮詰めて水分含量約３．０％（ｗ／ｗ）のシロップ状物とした。このシロップ状物を助晶機に移し、種晶として無水結晶トレハロースを固形分当たり約１％（ｗ／ｗ）加え、撹拌下、１２０℃で助晶後、アルミ製バットに取出した。この状態のまま、１００℃で６時間熟成して得られたブロック状物を切削機で粉砕し、流動乾燥して、水分含量約０．３％（ｗ／ｗ）の無水結晶トレハロース粉状物を原料固形分当たり約８５％の収率で得た。
【００９６】
強力な脱水作用を有する本品は、飲食物、化粧品、医薬品又はその製造原料若しくは中間加工物の脱水剤として、さらには、上品な甘味を有する白色粉末甘味剤として飲食物、化粧品、医薬品を始めとする各種組成物に有利に配合使用できる。
【００９７】
【実施例Ｂ−５ 組換え型酵素によるトレハロース粉状物の製造】
『マルトース ＨＨＨ』（林原生物化学研究所製高純度マルトース）を濃度４０％（ｗ／ｗ）になるように水に溶解し、５７℃にした後、ｐＨを６．５に調製し、実施例Ａ−２の方法により得た組換え型酵素をマルトース固形分１グラム当たり２単位加え、４８時間反応させた。反応物を１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、冷却し、濾過後、常法に従って活性炭により脱色し、イオン交換樹脂により脱塩・精製し、濃縮し、真空乾燥し、粉砕して、トレハロースを固形分当たり約７３％含有する粉状物を、原料マルトース固形分当たり約９０％の収率で得た。
【００９８】
本品の還元力はＤＥ１９と低く、この値はマルトースの約３０％であるにもかかわらず、本品の粘度はマルトースとほぼ同じであり、しかも、穏和な甘味や適度の保湿性を有していることから、甘味剤、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして飲食物、化粧品、医薬品を始めとする各種組成物に有利に配合使用できる。
【００９９】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明は、マルトース及びトレハロースに作用して、それぞれ、トレハロース又はマルトースを生成する、従来未知の全く新規な耐熱性酵素の発見に基づくものである。この発明は、組換えＤＮＡ技術により、斯かる酵素を大規模且つ効率的に生産する道を拓くものである。この発明の組換え型酵素を使用する変換方法によるときには、雑菌汚染を懸念することなく、マルトースをトレハロースとグルコース及び／又はマルトオリゴ糖からなる糖組成物に変換することができる。トレハロースはまろやかで上品な甘味を有し、しかも、分子中に還元性基を有しないので、着色や変質の懸念なく飲食物一般を甘味付けできる実益がある。くわえて、この発明の組換え型酵素はアミノ酸配列まで明らかにされた酵素であり、飲食物や医薬品等への配合使用を前提とするトレハロースの製造に安心して使用し得るものである。
【０１００】
この発明は斯くも顕著な作用効果を奏する意義のある発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な発明であると云える。
【０１０１】
【配列表】

【０１０２】

【０１０３】

【０１０４】

【０１０５】

【０１０６】

【図面の簡単な説明】
【図１】サーマス・アクアティカス（ＡＴＣＣ３３９２３）が産生する耐熱性酵素の至適温度を示す図である。
【図２】サーマス・アクアティカス（ＡＴＣＣ３３９２３）が産生する耐熱性酵素の至適ｐＨを示す図である。
【図３】サーマス・アクアティカス（ＡＴＣＣ３３９２３）が産生する耐熱性酵素の熱安定性を示す図である。
【図４】サーマス・アクアティカス（ＡＴＣＣ３３９２３）が産生する耐熱性酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図５】この発明による組換えＤＮＡであるｐＢＴＭ２２の制限酵素地図である。
【図６】この発明による組換えＤＮＡであるｐＢＴＭ２３の制限酵素地図である。

Claims (15)

1. 配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列におけるアミノ酸の１個又は２個以上が他のアミノ酸に置換、欠失及び／又は付加したアミノ酸配列を有し、下記の理化学的性質を有する組換え型酵素。
   （１） 作用
   マルトースに作用してトレハロースを生成する。トレハロースに作用してマルトースを生成する。
   （２） 分子量
   ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定すると、分子量約１００，０００乃至１１０，０００ダルトンを示す。
   （３） 等電点
   等電点電気泳動法により測定すると、約３．８乃至４．８に等電点を示す。
   （４） 至適温度
   ｐＨ７．０で６０分間反応させると、６５℃付近に至適温度を示す。
   （５） 至適ｐＨ
   ６０℃で６０分間反応させると、６．０乃至６．７付近に至適ｐＨを示す。
   （６） 熱安定性
   ｐＨ７．０で６０分間インキュベートすると、８０℃付近まで安定である。
   （７） ｐＨ安定性
   ６０℃で６０分間インキュベートすると、ｐＨ５．５乃至９．５付近まで安定である。
2. マルトースをトレハロースに変換する作用を有し、配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を有する酵素か、又は、請求項１記載の組換え型酵素をコードするＤＮＡ。
3. ＤＮＡが、配列表における配列番号４に示す塩基配列か、配列表における配列番号４に示す塩基配列における塩基の１個又は２個以上が置換、欠失及び／又は付加した塩基配列、又はそれらに相補的な塩基配列を有する請求項２に記載のＤＮＡ。
4. 遺伝子コードの縮重に基づき、配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列を変えることなく、配列表の配列番号４に示す塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換した請求項２又は３に記載のＤＮＡ。
5. 配列表における配列番号５に示す塩基配列を有する請求項２乃至４のいずれかに記載のＤＮＡ。
6. サーマス属の微生物に由来する請求項２乃至５のいずれかに記載のＤＮＡ。
7. 請求項２乃至６のいずれかに記載のＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡ。
8. 自律複製可能なベクターがプラスミドベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）又はｐＫＫ２２３−３である請求項７に記載の複製可能な組換えＤＮＡ。
9. 請求項７又は８に記載の複製可能な組換えＤＮＡを適宜の宿主に導入してなる形質転換体。
10. 宿主が大腸菌である請求項９に記載の形質転換体。
11. 請求項９又は１０に記載の形質転換体を培養し、培養物から組換え型酵素を採取する組換え型酵素の製造方法。
12. 培養物中の組換え型酵素を遠心分離、濾過、濃縮、塩析、透析、分別沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動及び／又は等電点電気泳動により採取する請求項１１に記載の組換え型酵素の製造方法。
13. マルトースに請求項１に記載の組換え型酵素を作用させてトレハロースを生成させる工程を含んでなるマルトースの酵素的変換方法。
14. マルトース含量が５０％（ｗ／ｗ）までの水性媒体に有効量の組換え型酵素を共存せしめ、ｐＨ５乃至１０、５５℃を越える温度で反応させる請求項１３に記載のマルトースの酵素的変換方法。
15. 反応物が、固形分当たり、トレハロースを約５０％以上含む請求項１３又は１４に記載のマルトースの酵素的変換方法。

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