CN102647918B - 用于淀粉加工的α-淀粉酶混合物及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及包含低pH、热稳定α-淀粉酶和地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的酶混合物。该混合物可以包含每5.0改进Wohlgemuth单位(MWU)的低pH、热稳定α-淀粉酶至少约1.0 Liquefon单位(LU)的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶。所述的酶混合物适合用于淀粉液化和糖化、乙醇产生和/或甜味剂产生等。本文还提供通过同时或顺次用低pH、热稳定α-淀粉酶和地衣芽孢杆菌α-淀粉酶液化淀粉来加工淀粉的方法。

Description

用于淀粉加工的α-淀粉酶混合物及其使用方法

优先权

本申请要求2009年8月7日提交的美国临时申请系列号61/232,276的优先权，该临时申请在此以其整体引用作为参考。

序列表

附上包含SEQ ID NO：1-6的序列表，并在此以其整体引用作为参考。

技术领域

本文描述加工淀粉的方法，其通过使低pH、热稳定的α-淀粉酶和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶与淀粉底物接触来液化淀粉。酶可以作为混合物加入或顺次加入。本文所述的酶混合物适合用于淀粉液化和糖化、乙醇产生和/或甜味剂产生等。还描述通过用低pH、热稳定的α-淀粉酶和地衣芽孢杆菌α-淀粉酶液化淀粉来加工淀粉的方法。

背景技术

来自谷粒、谷物和块茎的淀粉，例如玉米淀粉被广泛用于诸如糖浆和生物燃料的产物的工业制备。例如，高果糖玉米糖浆(HFCS)是加工形式的玉米葡萄糖浆，其具有高果糖含量和与蔗糖相当的甜度，使得HFCS可在软饮料和其他加工食物中用作糖替代物。HFCS生产目前代表了十亿美元的产业。类似地，从淀粉生产乙醇是快速增长的产业。

可以通过催化淀粉降解为葡萄糖的酶促方法从淀粉产生糖浆和生物燃料。此酶促方法通常涉及一系列酶催化的反应：

(1)液化：α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)首先催化可含有30-40％w/w干固体(ds)的淀粉悬液降解为麦芽葡聚糖(maltodextran)。α-淀粉酶是催化随机切割内部的α-1，4-D-糖苷键的内水解酶(endohydrolase)。因为通常在高温，例如90-100℃下进行液化，所以优选将热稳定的α-淀粉酶，如来自芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)的α-淀粉酶用于此步骤。目前用于此步骤的α-淀粉酶，例如来自地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)和嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)(AmyS)的α-淀粉酶不产生显著量的葡萄糖。相反，产生的液化产物(liquefact)具有低葡萄糖当量(DE)，包含麦芽糖和高聚合度(DPn)糖类。

(2)糖化：葡糖淀粉酶催化从非还原端液化后形成的麦芽糖糊精的α-1，4-糖苷键的水解，释放D-葡萄糖。糖化产生高葡萄糖糖浆。脱支酶，如支链淀粉酶可以辅助糖化。

(3)进一步加工：此方法中的分支点出现在产生富含葡萄糖的糖浆之后。如果最终希望的产物是生物燃料，那么酵母可将富含葡萄糖的糖浆发酵为乙醇。另一方面，如果最终希望的产物是富含果糖的糖浆，那么葡萄糖异构酶可催化富含葡萄糖的糖浆转化为果糖。

α-淀粉酶分离自多种细菌、真菌、植物和动物来源。许多工业上重要的α-淀粉酶分离自芽孢杆菌属物种，部分是由于芽孢杆菌属(Bacillus)普遍高的分泌淀粉酶进入生长培养基中的容量。此外，通过遗传工程获得了具有改变、同时也是更希望的特性的芽孢杆菌属α-淀粉酶变体。此外，存在对α-淀粉酶或其变体的混合物的需要，该混合物可以利用至少两种不同来源的α-淀粉酶的最佳特性。

α-淀粉酶(SEQ ID NO：2)(Verenium Corp.)是通过三种亲本酶的DNA改组获得的改造α-淀粉酶。见Richardson等，J.Biol.Chem.277：26501-26507(2002)；美国专利号7,323,336。α-淀粉酶的有利特性包含：较低剂量下有效的黏度降低、改善的热稳定性和宽的pH操作范围。但是，此α-淀粉酶的用途目前仅限于生物燃料应用，例如乙醇产生，因为它产生无效(ineffectual)葡萄糖浆，其不适合用于诸如甜味剂应用的下游应用。具体而言，糖化来自α-淀粉酶的淀粉液化产物产生指示不完全淀粉水解的碘阳性糖(IPS)。因此，如果可以通过使用α-淀粉酶的优化混合物来找到充分利用α-淀粉酶在淀粉加工中，尤其是在甜味剂应用中的优势的方式，那么这也可以代表对本领域的有用贡献。

发明概述

由于无效淀粉水解，通过低pH、热稳定α-淀粉酶，例如α-淀粉酶加工淀粉进行高葡萄糖糖浆产生不令人满意。本公开提供酶混合物，其包含低pH、热稳定α-淀粉酶，例如α-淀粉酶，及地衣芽孢杆菌α-淀粉酶。在用于淀粉加工时，该酶混合物消除了单独使用低pH、热稳定α-淀粉酶引起的碘阳性糖(IPS；蓝糖)。因此，该酶混合物产生适合用于诸如甜味剂产生的下游应用的糖化淀粉。

本文考虑用于加工淀粉的酶混合物包含低pH、热稳定α-淀粉酶，例如α-淀粉酶，及地衣芽孢杆菌α-淀粉酶。该低pH、热稳定α-淀粉酶具有与SEQ ID NO：2至少约80％、约85％、约90％、约95％、约98％或约99％同一的氨基酸序列。该酶混合物包含每5.0改进Wohlgemuth单位(Modified Wohlgemuth Unit，MWU)的低pH、热稳定α-淀粉酶至少约0.5、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5或约5.0Liquefon单位(LU)的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶。该酶混合物的至少一种α-淀粉酶可以是纯化的。可选地，该酶混合物可以进一步包含肌醇六磷酸酶。

一方面，所公开的是加工淀粉或谷粒的方法，其包括使酶混合物与淀粉接触，并液化淀粉来形成液化产物。另一方面，所公开的是通过使低pH、热稳定α-淀粉酶和地衣芽孢杆菌α-淀粉酶同时或顺次与淀粉接触，并液化淀粉形成液化产物来加工淀粉的方法。液化淀粉期间，按每克干固体淀粉(/g DS)每5.0改进Wohlgemuth单位(MWU)的低pH、热稳定α-淀粉酶约0.5、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5或约5.0Liquefon单位(LU)的量使用地衣芽孢杆菌α-淀粉酶。液化导致在约90分钟、约95分钟或约100分钟内，液化产物具有至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约16、至少约17、至少约18、至少约19，或至少约20的DE值。可以在约80℃至约95℃、约85℃至约95℃或约88℃至约92℃液化淀粉。可以在约pH 5.0至约pH 6.0、pH 5.2至约pH 5.8，或可选地在约pH 5.6液化淀粉。

该地衣芽孢杆菌α-淀粉酶具有与SEQ ID NO：4至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％同一的氨基酸序列。该地衣芽孢杆菌α-淀粉酶可以包含SEQID NO：6的氨基酸序列。该地衣芽孢杆菌α-淀粉酶可以由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成。该地衣芽孢杆菌α-淀粉酶可以是变体，与具有SEQ IDNO：4的氨基酸序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶相比，该变体具有一种或多种改变的特性。该改变的特性可以包含底物特异性、底物结合、底物切割模式、热稳定性、pH活性特性(pH activity profile)、pH稳定性特性(pHstability profile)、氧化稳定性、较低钙离子(Ca²⁺)水平下的稳定性、特异性活性、或其任意组合。所公开的酶混合物的低pH、热稳定α-淀粉酶可以包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。备选地，所公开的酶混合物的低pH、热稳定α-淀粉酶可以由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。

还考虑进一步包括糖化液化产物来产生糖浆的加工淀粉或谷粒的方法。该糖浆在糖化结束时可以包含至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％或至少约95％葡萄糖。该糖浆可以包含少于约1.5％、至少约1.0％或至少约0.5％v/v的沉淀。此外，糖化淀粉可以具有至少约67g/15分钟、至少约75g/15分钟、至少约80g/15分钟、至少约85g/15分钟或至少约90g/15分钟的过滤速率。

另一考虑的方面是进一步包括从糖浆产生高果糖糖浆的加工淀粉或谷粒的方法。可以通过使葡萄糖异构酶与糖浆接触来产生该高果糖糖浆。该葡萄糖异构酶可以固定在固相支持物上。

附图简述

图1显示用来自通过以下催化的液化产物样品的糖化淀粉底物进行的碘测试的结果：(1)50MWUds淀粉于pH 4.5；(2)50MWUds淀粉于pH 5.6；(3)25MWUds淀粉于pH 5.6；(4)10LUFRED(Danisco US Inc.，Genencor Division)/g ds淀粉于pH 5.8；和(5)添加5LUFRED/g ds淀粉的25MWUds淀粉于pH 5.6。

发明详述

提供低pH、热稳定α-淀粉酶和地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的酶混合物。该酶混合物包含每5.0改进Wohlgemuth单位(MWU)的低pH、热稳定α-淀粉酶约0.5、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5或约5.0Liquefon单位(LU)的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶。该酶混合物适合用于液化淀粉及淀粉加工的进一步的下游应用，例如甜味剂应用。还提供通过使低pH、热稳定α-淀粉酶和地衣芽孢杆菌α-淀粉酶与淀粉接触并液化淀粉形成液化产物来加工淀粉的方法。液化淀粉期间，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的量为每5.0改进Wohlgemuth单位(MWU)的低pH、热稳定α-淀粉酶约0.5、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5或约5.0Liquefon单位(LU)。

1.定义和缩写词

1.1.定义

如本文所使用，“淀粉”指包含植物复合多糖糖类的任意物质，其包含具有式(C₆H₁₀O₅)_x(其中X可以是任意数字)的直链淀粉和支链淀粉。具体而言，该术语指任意基于植物的物质，其包括但不限于谷粒、草、块茎和根，更具体而言是小麦、大麦、玉米、黑麦、燕麦、高粱(sorgum)、买罗高粱、稻、高粱(sorghum)、麸、木薯、粟、马铃薯、甘薯和木薯粉。

“α-淀粉酶”(即E.C.3.2.1.1)泛指催化α-1，4-糖苷键水解的酶。还已将这些酶描述为影响包含1，-α-连接D-葡萄糖单位的多糖中的1，4-α-D-糖苷键的外切水解或内切水解的那些酶。为了本公开的目的，“α-淀粉酶”指具有相对高的热稳定性，即在更高的温度，例如80℃以上具有持续活性的那些酶。因此，α-淀粉酶能够液化淀粉，其在高于80℃的温度进行。

“α-淀粉酶单位”(AAU)指按照美国专利号5,958,739中公开的方法测量的α-淀粉酶活性，该专利在此引用作为参考。一个AAU单位指在指定条件下每分钟水解10mg淀粉所需的酶量。α-淀粉酶活性测定使用对硝基苯麦芽七糖苷(PNP-G₇)作为非还原端糖经化学封闭的底物。PNP-G₇可以被内切淀粉酶，例如α-淀粉酶切割。切割后，α-葡糖苷酶和葡糖淀粉酶消化底物来释放自由PNP分子，该分子显示黄色，可以通过410nm下的可见光分光光度法测量。PNP释放的速率与α-淀粉酶活性成比例。针对标准对照计算给定样品的AAU。

如本文所使用，“Liquefon单位”(LU)指用碘溶液产生颜色变化所需的消化时间，显示淀粉底物在标准测定条件下糊精化的确定阶段。简言之，底物可以是含由5g/L可溶性Lintner淀粉的磷酸盐缓冲液pH 6.2(42.5g/L磷酸二氢钾、3.16g/L氢氧化钠)。将样品加至25mM氯化钙中，将活性测量为在30℃孵育产生阴性碘测试所耗费的时间。以按照以下公式计算的liquefon/克或mL(LU)记录活性：

$\mathrm{LU}/\mathrm{mLorLU}/g=\frac{570}{V\×t}\×D$

其中，LU＝Liquefon单位；V＝样品体积(5mL)；t＝糊精化时间(分钟)；D＝稀释因子＝稀释体积/所加入的酶的mL或g。

一个“改进Wohlgemuth单位”(MWU)指能够在标准反应条件下在30分钟内将1mg可溶性淀粉水解为特异性糊精的酶(例如)的量。还见》http://www.diversa.com/pdf/Fuelzyme-LF_Brochure.pdf.《上的Diversa Corp.，URL。

如本文所使用，酶“混合物”指包含至少两种酶，例如两种α-淀粉酶的混合物。

“支链淀粉酶”指能够催化水解α-1，6-糖苷键的淀粉分解内切酶。支链淀粉酶能够降解普鲁分支葡聚糖，认为鲁分支葡聚糖是通过α-1，6-糖苷键连接的麦芽三糖单位的链。支链淀粉酶也称为能够水解支链淀粉分子中的α-1，6-糖苷键的脱支酶(E.C.3.2.1.41；支链淀粉6-葡聚糖水解酶)。这些酶一般由芽孢杆菌属物种，例如Bacillus deramificans(美国专利号5,817,498)、嗜酸普鲁兰芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)(欧洲专利申请号82302001.1(公开号0063909))和Bacillus naganoensis(美国专利号5,055,403)分泌。具有支链淀粉酶活性的市售酶包含例如L-1000(Danisco US Inc.，Genencor Division)和(NovozymesA/S)。

如本文所使用，“碘阳性糖”(IPS)与“淀粉阳性糖”或“蓝糖”可互换使用，指包含液化和糖化后未水解的直链淀粉的糖化溶液。用碘测试糖化淀粉时，高DPn直链淀粉结合碘，并产生特征性蓝色。IPS是淀粉加工应用中，尤其是甜味剂应用中非常不希望的。具体而言，IPS指示差的液化，即不完全淀粉水解。IPS导致由澄清(fining out)引起的实际产量损失。IPS还堵塞或减慢过滤系统，并污染用于纯化的碳柱。IPS达到足够高的水平时，它可以渗漏穿过碳柱，并降低产生效率。此外，它可以产生保存后浑浊的终产物，这对终产物质量而言是不可接受的。

当用于提到细胞、核酸、蛋白质或载体时，术语“重组体”指已通过异源核酸或蛋白质的引入，或天然核酸或蛋白质的改变修饰该细胞、核酸、蛋白质或载体，或指该细胞衍生自经这样修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达不见于该细胞的天然(非重组体)形式内的基因，或表达否则将异常表达、低表达或完全不表达的天然基因。

术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。

本文使用氨基酸残基的常规单字母或三字母密码。

“信号序列”指与蛋白质N端部分连接的氨基酸序列，其便于蛋白质的成熟形式分泌至细胞外。信号序列的定义是功能性定义。胞外蛋白质的成熟形式缺乏信号序列，其在分泌过程中被切除。

“基因”指涉及产生多肽的DNA片段，并包含编码区之前和之后的区域以及单个编码片段(外显子)间的间插序列(内含子)。

术语“核酸”涵盖单链或双链的DNA、RNA及其化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用。

“载体”指设计用于将核酸引入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列，其中该载体的元件有效连接。载体包含克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒等。

如本文所使用，“表达载体”指包含DNA序列的DNA构建体，该DNA序列与能够影响该DNA在适宜的宿主中表达的适宜的控制序列有效连接。此类控制序列可以包含影响转录的启动子、控制转录的可选的操纵基因序列、编码mRNA上适宜的核糖体结合位点的序列、增强子及控制转录和翻译终止的序列。

“启动子”是涉及结合RNA聚合酶以起始基因转录的调控序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。

“处于转录控制下”是本领域公知的术语，其指多核苷酸序列(通常是DNA序列)的转录依赖于其与促成转录起始或促进转录的元件有效连接。

“处于翻译控制下”是本领域公知的术语，其指mRNA形成后发生的调节过程。

如本文所使用，在描述蛋白质和编码它们的基因时，用于基因的术语为斜体(例如编码amyL(地衣芽孢杆菌AA)的基因可以表示为用于蛋白质的术语一般不是斜体，且第一个字母一般大写(例如，由基因编码的蛋白质可以表示为AmyL或amyL)。

术语“衍生”涵盖术语“源自”、“获自”或“可获自”和“分离自”。

术语“有效连接”指并列，其中元件处于使它们在功能上相关的排列。例如，如果启动子控制编码序列的转录，那么它与该序列有效连接。

术语“选择标记”指能够在宿主中表达的基因，其允许容易地选择包含引入的核酸或载体的那些宿主。选择标记的实例包括但不限于抗微生物剂(例如潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢优势，如营养优势的基因。

与另一序列具有某百分比(例如约80％、约85％、约90％、约95％或约99％)的序列同一性的多核苷酸或多肽是指在比对时，该百分比的碱基或氨基酸残基在比较的两条序列中是相同的。可以用本领域已知的任意适宜的软件程序(例如CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY，Ausubel等编辑，1987，增刊30，7.7.18部分中所述的那些)测定此比对和百分比同源性或同一性。代表性程序包含Vector NTIAdvance^TM 9.0(Invitrogen Corp.Carlsbad，CA)、GCG Pileup、FASTA(Pearson等(1988)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 85：2444-2448)和BLAST(BLAST Manual，Altschul等，Nat’l Cent.Biotechnol.Inf.，Nat’l Lib.Med.(NCIB NLM NIH)，Bethesda，Md.；和Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)程序。另一典型比对程序是一般使用默认参数的ALIGNPlus(Scientific and Educational Software，PA)。使用的另一序列软件程序是在Sequence Software Package Version 6.0(Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，WI)中可得的TFASTA Data SearchingProgram。

术语“亲本”或“亲本序列”指天然或天然存在于宿主细胞中的序列。亲本序列包括但不限于地衣芽孢杆菌α-淀粉酶LAT的序列(SEQ ID NO：4)，其在此引用作为参考。

在最佳比对进行比较时，“变体”可以与多肽序列具有至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约88％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％序列同一性。

本文在多肽的背景中使用的术语“特性”或其语法等同形式指多肽的可以选择或检测的任意特征或属性。这些特性包括但不限于氧化稳定性、底物特异性、催化活性、热稳定性、pH活性特性、对蛋白水解降解的抗性、K_M、k_CAT、k_CAT/K_M比、蛋白质折叠、结合底物的能力和分泌能力。

“热稳定的”或“热稳定性”指酶在暴露于升高的温度后保持活性。通过其半衰期(t_1/2)来评价α-淀粉酶的热稳定性，在给定的温度下，酶活性在半衰期内丧失一半。通过测定酶在给定的温度下，尤其是在用于具体应用(例如液化)的温度下随时间保留的特异性α-淀粉酶活性来测量半衰期。

“宿主菌株”或“宿主细胞”指用于包含编码本公开的变体α-淀粉酶的多核苷酸的表达载体或DNA构建体的适宜宿主。具体而言，宿主菌株通常是细菌细胞。在典型实施方案中，“宿主细胞”指细胞和原生质体二者，该原生质体产生自微生物菌株，尤其是芽孢杆菌属物种的细胞。

术语“培养”指在适宜的条件下，在液体或固体培养基中培养微生物细胞群体。在一个实施方案中，培养指发酵性生物转化含有颗粒淀粉的淀粉底物为终产物(通常在容器或反应器中)。发酵是通过微生物酶促和厌氧降解有机物来产生更简单的有机化合物。虽然发酵发生于厌氧条件下，但此术语并非旨在仅限于严格的厌氧条件，因为在氧气存在下也发生发酵。

术语“酶促转化”通常指通过酶作用修饰底物。如本文所使用，该术语还指通过酶的作用修饰淀粉底物。衣帽间

如本文所使用，“波美度”指液体的比重。在20℃下，比重(s.g.)和波美度间的关系是：

对于比水重的液体：s.g.＝145÷(145-波美度)；和

对于比水轻的液体：s.g.＝145÷(波美度+130)。

对于淀粉悬液(例如浆液)和淀粉水解产物，波美度-干物质关系公开于Cleland J.等，“Baumé-Dry Substance Tables for Starch Suspensions，”Ind.Eng.Chem.anal.Ed.，15：334-36(1943)中。还见“Critical Data Tables，”Corn Refiners Association，Inc.(1991)。波美度在玉米湿磨工业中用于方法控制和水解产物商业销售二者。

如本文所使用，“糖化”指酶促转化淀粉为葡萄糖。

“糊化(作用)”指淀粉分子通过烹饪的增溶作用形成粘性悬液。

“液化”指淀粉转化中的阶段，其中水解糊化的淀粉来产生低分子量可溶性糊精。

术语“聚合度(DP)”指给定的糖中脱水吡喃葡萄糖单位的数目(n)。DP1的实例是单糖，如葡萄糖和果糖。DP2的实例是二糖类，如麦芽糖和蔗糖。DP＞3表示聚合物具有大于3的聚合度。

术语“葡萄糖当量”(DE)值指淀粉水解的程度。它反映转化为还原糖的总固体的百分比。较高的DE值意味着存在较多的糖和较少的糊精。沿淀粉加工的多个阶段，葡萄糖浆具有高于55的DE值称为高度转化；在33-55之间称为常规转化；低于20时水解产物为麦芽糖酶或麦芽糖糊精。

术语“终产物”或“希望的终产物”指通过酶转化自淀粉底物的任意碳源衍生的分子产物。

如本文所使用，术语“干固体含量(ds)”指以％干重表示的浆液中的总固体。

术语“浆液”指含有不可溶固体的水性混合物。

术语“残留淀粉”指发酵含有淀粉的底物后留在组合物中的剩余淀粉(可溶的或不可溶的)。

如本文所使用，“回收步骤”指醪液成分的回收，其可含有残留淀粉、酶和/或发酵含淀粉底物的微生物。

术语“醪液”指用来产生发酵产物，如乙醇的可发酵碳源(糖类)在水中的混合物。在一些实施方案中，术语“啤酒”和“醪液”可互换使用。

术语“釜馏物”指未发酵的固体和水的混合物，其是从发酵醪液去除醇后的残留物。

术语“干酒糟(DDG)”和“具有可溶物的干酒糟(DDGS)”指谷粒发酵的有用副产物。

如本文所使用，“产乙醇微生物”指具有将糖或寡糖转化为乙醇的能力的微生物。产乙醇微生物由于它们表达单独或一起将糖转化为乙醇的一种或多种酶的能力而是产乙醇的。

如本文所使用，“乙醇产生者”或“产乙醇微生物”指能够从己糖或戊糖产生乙醇的任意生物或细胞。通常，产乙醇细胞包含醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶。产乙醇微生物的实例包含真菌微生物，如酵母。用于乙醇产生的典型酵母包含酵母属(Saccharomyces)菌株，尤其是酿酒酵母(S.cerevisiae)。

提到多核苷酸或蛋白质时，术语“异源的”指并非天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质是商业上重要的工业蛋白质。该术语旨在涵盖由天然存在的基因、突变基因和/或合成基因编码的蛋白质。

提到多核苷酸或蛋白质时，术语“内源的”指天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。

如本文所使用，术语“回收的”、“分离的”和“分开的”指从至少一种其天然与之结合的成分移出的化合物、蛋白质、细胞、核酸或氨基酸。

如本文所使用，用来谈论细胞时，术语“转化的”、“稳定转化的”和“转基因的”指该细胞具有整合入其基因组或作为附加型质粒保持多代的非天然(例如异源的)核酸序列。

如本文所使用，“表达”指通过其来根据基因的核酸序列产生多肽的方法。该方法包括转录和翻译二者。

在将核酸序列插入细胞的背景中，术语“引入”指“转染”或“转化”或“转导”，且包括提到将核酸序列掺入真核或原核细胞，其中该核酸序列可以掺入该细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)、转化为自主复制子或瞬时表达(例如转染mRNA)。

如本文所使用，“比活性”指定义为在特定条件下每单位时间通过酶制剂转化为产物的底物摩尔数的酶单位。比活性表示为单位(U)/mg蛋白质。

术语“产量”指用本公开的方法产生的终产物或希望的终产物的量。在一些实施方案中，该产量大于用本领域已知的方法产生的产量。在一些实施方案中，该术语指终产物的体积，而在其他实施方案中，该术语指终产物的浓度。

如本文所使用，“接触”或“混合”指将相应的一种或多种酶置于足够接近相应的底物，以使该一种或多种酶能够将该底物转化为终产物。本领域技术人员将理解，将酶溶液与相应的底物混合可以影响接触或混合。

“ATCC”指位于Manassas，Va.20108的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。

“NRRL”指Agricultural Research Service Culture Collection，National Center for Agricultural Utilization Research(之前称为USDANorthern Regional Research Laboratory)，Peoria，IL。

除非上下文另有明确指明，否则“此”、“一个”和“该”包括复数形式。

如本文所使用，以它们的包含性含义使用“包含”及其同源词；即等同于术语“包括”及其对应的同源词。

1.2缩写词

除非另有说明，使用下列缩写词：

AA     α-淀粉酶

AAU    α-淀粉酶单位

AOS    α-烯属磺酸酯

AS     醇硫酸盐

BAA    细菌α-淀粉酶

cDNA   互补DNA

CMC    羧甲基纤维素

DDG    干酒糟

DDGS   具有可溶物的干酒糟

DE     葡萄糖当量

DNA    脱氧核糖核酸

DNS    3，5-二硝基水杨酸

DP3    具有3个亚单位的聚合度

DPn    具有n个亚单位的聚合度

DS、ds 干固体

DSC    差示扫描量热法

DTMPA  二乙基三胺五乙酸

EC     酶学委员会

EDTA   乙二胺四乙酸

EDTMPA 乙二胺四亚甲基磷酸

EO     环氧乙烷

FREDFRED(SEQ ID NO：6)(Danisco US Inc.，Genencor Division)

F&HC   织物和家居护理

g      克

gal    加仑

GAU    葡糖淀粉酶活性单位

HFCS   高果糖玉米糖浆

HFSS   高果糖淀粉基糖浆

IPS    碘阳性糖(淀粉阳性糖)

IPTG   异丙基-β-D-硫代半乳糖苷

LAS    线性烷基苯磺酸盐

LAT    地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO：4)

LU     Liquefon单位

MES    2-(N-吗啉基)乙磺酸

MW     分子量

MWU    改进Wohlgemuth单位s

nm     纳米

NOBS    壬酰基氧基苯磺酸盐

NTA     次氮基三乙酸

PCR     聚合酶链式反应

PEG     聚乙二醇

pI      等电点

PNP-G₇  对硝基苯麦芽七糖苷

ppm     百万分之几

PVA     聚乙烯醇

PVP     聚乙烯基吡咯烷酮

RAU     参考淀粉酶单位

RMS     均方根

RNA     核糖核酸

rpm     转/分钟

SAS     仲烷基磺酸盐

s.g.    比重

1X SSC  0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH 7.0

SSF     同时糖化和发酵

TAED    四乙酰乙二胺

TNBS    三硝基苯磺酸

w/v     重量/体积

w/w     重量/重量

wt      野生型

μL     微升

2.淀粉加工

2.1.淀粉底物和原料

本领域技术人员清楚地知道可以用来制备用于本文公开的方法的淀粉底物的可得的方法。例如，有用的淀粉底物可以获自块茎、根、茎、豆荚、谷物或整个谷粒。更具体而言，颗粒淀粉来自产生高淀粉量的植物。例如，颗粒淀粉可以获自玉米、玉米芯、小麦、大麦、黑麦、买罗高梁、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯。玉米包含约60-68％淀粉；大麦包含约55-65％淀粉；粟包含约75-80％淀粉；小麦包含约60-65％淀粉；精白米包含约70-72％淀粉。具体考虑的淀粉底物是玉米淀粉、小麦淀粉和大麦淀粉。来自谷粒的淀粉可以是研磨的或整个的，且包含玉米固体，如谷粒、麸和/或玉米芯。淀粉可以是高度精制的粗淀粉或来自淀粉精制法的原料。多种淀粉还是市售的。例如可从Cerestar、Sigma和Katayama Chemical Industry Co.(日本)获得玉米淀粉；可从Sigma获得小麦淀粉；可从Wako Pure Chemical Industry Co.(日本)获得甘薯淀粉；可从Nakaari Chemical Pharmaceutical Co.(日本)获得马铃薯淀粉。

2.2.碾磨

淀粉底物可以是来自碾磨过的整个谷粒的粗淀粉，其包含非淀粉级分如胚芽残留物和纤维。碾磨可以包括湿磨法或干磨法。在湿磨法中，将整个谷粒浸渍在水或稀酸中，以将该谷粒分开为它的组成部分，例如淀粉、蛋白质、胚芽、油、谷粒纤维。湿磨法有效分开胚芽和粗磨粉(meal，即淀粉颗粒和蛋白质)，尤其适合用于产生糖浆。在干磨法中，将整个谷粒研磨为细粉，并在不将谷粒分级分离为它的组成部分的情况下加工。因此，除淀粉外，干磨谷粒将包含显著量的非淀粉糖类化合物。大多数乙醇来自干磨法。备选地，待加工的淀粉可以具有高度精制的淀粉质量，例如至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99.5％纯。

2.3.糊化和液化

如本文所使用，名词或动词形式的术语“液化”指通过其将淀粉转化为较低黏度和较短链的糊精的过程。此过程涉及在加入α-淀粉酶的同时或之后糊化淀粉。可以可选地加入其它诱导液化的酶，例如肌醇六磷酸酶。

在一些实施方案中，按上文所述制备的淀粉底物是含水浆液。淀粉浆可以包含干固体重量百分比为约10-55％、约20-45％、约30-45％、约30-40％或约30-35％的淀粉。为了优化α-淀粉酶的稳定性和活性，可以调节浆液的pH至α-淀粉酶的最适pH。可以通过在随后的反应步骤中降低pH或通过从浆液去除钙来失活液化后保留在浆液中的α-淀粉酶。

可以将淀粉加α-淀粉酶的浆液连续泵过蒸汽加热到约85℃至约105℃的喷射蒸煮器。糊化在这些条件下非常快速地发生，酶活性与显著的剪切力组合开始水解淀粉底物。在喷射蒸煮器中的滞留期非常短。部分糊化的淀粉可以通过一系列维持在约85-105℃的支持管，并保持5分钟，以完成糊化过程。这些罐可以包含挡板来阻止回混。如本文所使用，术语“二次液化”指继初次液化之后，当浆液被允许冷却至室温时的液化步骤。此冷却步骤可以是30分钟至180分钟，例如90分钟至120分钟。经碾磨和液化的谷粒也称为醪液。

2.4.糖化

液化后，通过糖化进一步水解醪液来产生可以容易地用于下游应用的高葡萄糖糖浆。一般用稀硫酸调节液化淀粉的pH至pH 4.2至pH 4.5，然后在60℃孵育液化淀粉36至96小时。糖化期间，一般通过糖化酶(即葡糖淀粉酶和支链淀粉酶的混合物)的存在，通过酶达到水解。代表性糖化酶混合物是4060VHP(Danisco US Inc.，Genencor Division)和DX(Novozymes A/S)。通常，除糖化酶混合物外，还可以添加α-葡糖苷酶和/或酸性α-淀粉酶。

整个糖化步骤通常可以在24至96小时之间。在用于乙醇产生的一些实施方案中，组合糖化步骤和发酵步骤，并将该过程称为同时糖化和发酵(SSF)或同时糖化、酵母繁殖和发酵。在一些实施方案中，可以在液化步骤和随后的糖化/发酵步骤之间包括约1-4小时的预糖化步骤。

2.5.甜味剂产生

在来自淀粉加工的希望的终产物是高果糖淀粉基糖浆(HFSS)，例如高果糖玉米糖浆(HFCS)时，可以将来自糖化过程的葡萄糖浆转化为果糖。该转化通常由葡萄糖异构酶，例如(Danisco US Inc.，Genencor Division)和(Novozymes，A/S)催化。简言之，糖化过程后，将pH提高至约6-8的范围内的值，通常为约7.5，并通过离子交换去除钙。然后用例如固定在固相支持物上的葡萄糖异构酶，如IGI-HF(Danisco US Inc.，Genencor Division)将葡萄糖浆转化为高果糖糖浆。

3.α-淀粉酶

3.1.结构和功能

α-淀粉酶组成一组存在于微生物中及来自动物和植物的组织中的酶。它们能够水解糖原、淀粉、相关多糖和一些寡糖中的α-1，4-糖苷键。虽然所有α-淀粉酶都具有相同的催化功能，但它们的氨基酸序列非常不同。不同淀粉酶之间的序列同一性可以实质上不存在，例如降至25％以下。虽然存在显著的氨基酸序列变异，但α-淀粉酶具有已在测定来自不同物种的α-淀粉酶的三维结构后鉴定的共同的总体拓扑示意图。共有的三维结构显示三个结构域：(1)称为结构域A的“TIM”桶；(2)称为结构域B的长环区域，其插入结构域A内；和(3)称为结构域C的靠近C端的区域，其包含具有希腊钥匙(Greek-key)基序的特征性β-结构。见van der Maarel等，J.Biotechnol.94：137-55(2002)。

结构域A的TIM桶由沿肽主链交替的8个α-螺旋和8条平行β-链组成，即(β/α)8。已知以保守糖酵解酶丙糖磷酸异构酶命名的此结构是保守蛋白质折叠中共有的。结构域B是在β_A3和α_A3(结构域A中的第三β-链和α-螺旋)之间插入的环区。结构域A和结构域B都直接涉及α-淀粉酶的催化功能，因为三维结构显示，结构域A在活性部位侧翼，且结构域与来自一侧的活性部位重叠。此外，认为结构域A是催化结构域，因为活性部位的氨基酸残基定位在将β-链连接至邻近α-螺旋的环中。认为结构域B通过影响底物结合来决定酶的特异性。MacGregor等，Biochim.Biophys.Acta.1546：1-20(2001)。

3.2.α-淀粉酶

目前描述的酶混合物的成分之一是α-淀粉酶(SEQ IDNO：2)，或与α-淀粉酶具有约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％或约99.5％氨基酸序列同一性的α-淀粉酶。α-淀粉酶(SEQ ID NO：2)是产生自三亲本DNA改组的改造酶。见Richardson等，J.Biol.Chem.277：26501-26507(2002)；美国专利号7,323,336。编码亲本酶的DNA收集自栖息在深海热水流火山口的微生物。16S rRNA分析表明，该微生物隶属于热球菌属物种(Thermococcus sp.)或与热球菌属物种具有非常近的关系。已针对(1)其优越的液化和黏度降低能力及(2)其广的温度和pH操作范围表征了α-淀粉酶。见Sheridan C.，“It Came From Beneath TheSea，”Nat.Biotechnol.，23：1199-201(2005)。美国专利号7,202,057、7,273,740、7,323,336和7,407,677中公开了α-淀粉酶的DNA序列及其遗传操作，所有专利在此引用作为参考。类似地，以上获批美国专利中详细描述了α-淀粉酶或相关酶的产生和纯化。

但是，由于它产生无效葡萄糖浆，α-淀粉酶目前仅限于生物燃料的产生，例如乙醇产生。具体而言，糖化产生自α-淀粉酶的淀粉液化产物产生碘阳性糖(IPS)或蓝糖。见下文实施例。这种观察表明，该糖化淀粉不适合用于甜味剂应用，例如高葡萄糖糖浆或高果糖糖浆的产生。

3.3.地衣芽孢杆菌α-淀粉酶及其变体

目前描述的酶混合物的另一成分可以是来自地衣芽孢杆菌的Termamyl样α-淀粉酶。一方面，该地衣芽孢杆菌α-淀粉酶可以是野生型亲本酶，例如具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的α-淀粉酶。另一方面，该α-淀粉酶可以是该亲本酶的变体。变体α-淀粉酶可以包含野生型地衣芽孢杆菌α-淀粉酶氨基酸序列的一个或多个修饰。野生型地衣芽孢杆菌α-淀粉酶可以分离自任意天然存在的地衣芽孢杆菌菌株。为了本公开的目的，可以将氨基酸取代命名为例如M15T。“M15T”指用苏氨酸(T)残基取代15位甲硫氨酸(M)残基，其中通过本领域公知的单字母缩写词命名氨基酸。

尤其有用的来自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶是可从Danisco US Inc.，Genencor Division购得的FRED(SEQ ID NO：6)。在本文中可以将此α-淀粉酶称为“FRED”(SEQ ID NO：6)。

野生型地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的蛋白质改造产生了可以具有改良特性的变体α-淀粉酶。一方面，可以随机修饰变体酶的一个或多个氨基酸残基，宿主细胞表达变体后，通过随后对变体性能特征的分析来确定该修饰的影响。另一方面，用具有与野生型地衣芽孢杆菌α-淀粉酶非常相似的结构的“模式”α-淀粉酶作为指导，可以系统地产生对变体氨基酸序列的修饰，使得可以预测该修饰的影响。

若用模式α-淀粉酶指导变体α-淀粉酶氨基酸改变的设计，则不必精确地知道该模式α-淀粉酶的哪些残基促成该酶的性能。相反，将变体α-淀粉酶中的一个或多个氨基酸，甚至整个组的氨基酸修饰为模式α-淀粉酶的一个或多个对应氨基酸。这种情况下，“对应”氨基酸不是通过常规的一级氨基酸序列的比对确定，而是通过两种酶多肽主链的三维结构比对确定。从而变体中待修饰的氨基酸可以选择为例如酶表面的带电荷残基、活性部位残基或促成模式酶独特的特定二级结构元件的残基。还可以以修饰不会破坏两种酶间保守的三维结构，尤其是保守的二级结构元件(例如α-螺旋、β-折叠、转角)为基础来选择待修饰的残基。

例如，已知改变带电荷氨基酸在酶表面的分布一般可以改变其酶特性。见例如Russell等，“Rational modification of enzyme catalysis byengineering surface charge，”Nature 328：496-500(1987)。同样可以修饰地衣芽孢杆菌α-淀粉酶表面的一个或多个残基来改变变体α-淀粉酶的酶特性，其中可以通过模式α-淀粉酶表面电荷分布来指导修饰的选择。为了此目的，通过至少部分暴露于溶剂的氨基酸的带电荷侧链带来“表面电荷”。

可以将变体α-淀粉酶的残基分类为属于本文称为结构域A、B和C的三个结构域之一。为了本公开的目的，结构域A从残基2延伸至残基105和从残基208延伸至残基396；结构域B从残基106延伸至残基207；结构域C从残基397延伸至蛋白质的C端。还可以将氨基酸分类为活性部位残基。活性部位残基至少位于49、52、163、167、170、172、187、188、190、238、262、264、293、297和332-334位。按地衣芽孢杆菌α-淀粉酶序列(SEQ ID NO：4)中所示编号残基“位”。

在变体α-淀粉酶中，一个或多个氨基酸可修饰为模式α-淀粉酶中的对应氨基酸。修饰可以按结构域分组(cluster)，和/或其可以按带电荷和存在于酶表面的氨基酸分组。备选地或此外，可以对一个或多个活性部位残基进行修饰。通过这种方式，有可能产生多重氨基酸修饰，其中修饰对变体α-淀粉酶的性能特征具有可预测的影响。例如，变体一个或多个结构域中的每一个表面带电荷残基可以改变为模式α-淀粉酶的对应残基。在另一个实施方案中，变体可以有残基插入或缺失(例如可以插入或缺失环)，以使变体的多肽主链更类似于模式α-淀粉酶的结构。因此，只要变体保持α-淀粉酶活性，变体可以包含1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70，或这些范围之间的任意整数值个氨基酸取代、缺失或插入。变体的表面电荷也可以以任意数目改变。例如，酶表面带正电荷的氨基酸残基的数目可以减少1、2、3、4、5、6、7或8个。预期这类氨基酸取代可改变变体的等电点(pI)等。如下文所述，变体的其他特征可以不同于野生型酶。

另一方面，变体α-淀粉酶与来自地衣芽孢杆菌的Termamyl样α-淀粉酶可以具有约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。另一方面，变体α-淀粉酶与地衣芽孢杆菌α-淀粉酶LAT(SEQ ID NO：4)可以具有约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。考虑的变体公开于WO 95/35382、WO 96/23874、WO 97/41213和WO 99/19467中，所有专利在此引用作为参考。

还在另一方面，混合物可以包含每5.0改进Wohlgemuth单位(MWU)的低pH、热稳定α-淀粉酶至少约0.5、至少约1.0、至少约1.1、至少约1.2、至少约1.3、至少约1.4、至少约1.5、至少约1.6、至少约1.7、至少约1.8、至少约1.9、至少约2.0、至少约2.5、至少约3.0、至少约3.5、至少约4.0、至少约4.5或至少约5.0Liquefon单位(LU)的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶。

另一方面，变体α-淀粉酶与Termamyl样α-淀粉酶可以具有约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性。

在一些实施方案中，与亲本酶，例如具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的α-淀粉酶的那些相比，变体地衣芽孢杆菌α-淀粉酶可以显示一种或多种改变的特性。该改变的特性可以有利地使得变体α-淀粉酶能够在液化中有效地表现。类似地，该改变的特性可以导致变体与其亲本相比改进的性能。这些特性可以包含底物特异性、底物结合、底物切割模式、热稳定性、pH/活性谱、pH/稳定性谱、氧化稳定性、较低钙离子(Ca²⁺)水平下的稳定性和/或比活性。可以用于本公开的代表性α-淀粉酶变体包括但不限于2008年9月11日公开的US 2008/0220476、2008年7月3日公开的US2008/0160573、2008年6月26日公开的US 2008/0153733、2008年4月10日公开的US 2008/0083406、2008年11月3日提交的U.S.S.N.12/263,804和2008年11月3日提交的U.S.S.N.12/263,886中所述的那些，所有专利在此引用作为参考。

可以按照美国专利号5,958,739中公开的方法进行少量修改来测定α-淀粉酶活性。简言之，该测定用对硝基苯麦芽七糖苷(PNP-G₇)作为非还原端糖经化学封闭的底物。PNP-G₇可以被内切淀粉酶(例如α-淀粉酶)切割。切割后，α-葡糖苷酶和葡糖淀粉酶消化底物释放自由PNP分子，该分子显示黄色，可以通过410nm下的可见光分光光度法测量。PNP释放的速率与α-淀粉酶活性成比例。针对标准对照计算样品的α-淀粉酶活性。

可以通过核酸和多肽序列、通过其上述三维结构和/或通过其比活性来表征酶变体。α-淀粉酶变体的其他特征包含底物特异性、半衰期、较低钙离子(Ca²⁺)水平下的稳定性、pH范围、氧化稳定性和热稳定性。一方面，α-淀粉酶变体可以具有更高的比活性，比活性可用本领域技术人员已知的标准测定来评价。另一方面，变体显示其他改良的性能特征，如改良的在高温(即70-120℃)和/或极端pH(即约pH 4.0至约pH 6.0或约pH 8.0至约pH 11.0)和/或低于约60ppm的钙浓度下的稳定性。

改变的底物特异性可以包含改变的底物结合和/或改变的底物切割模式。改变的底物结合可以指提高或降低的与给定底物结合的能力。改变的底物切割模式可以指与亲本酶相比提高或降低的切割效率。

改变的Ca²⁺稳定性指酶在Ca²⁺耗尽下的稳定性已被改变，即提高或降低。重要的突变包含改变Ca²⁺稳定性和需要的那些，尤其是在高pH(即pH 8.0至10.5)下具有降低的Ca²⁺依赖性的那些。

改变的pH谱指酶在不同pH值下的性能已被改变。改变的pH谱可以包含改变的pH活性特性，其指在给定的pH范围下提高或降低的比活性。此外，改变的pH谱还可以包含改变的pH稳定性特性，其指在给定的pH范围下提高或降低的稳定性。

另一方面，为了用于清洁组合物，重要的突变表现出改变的比活性，特别是在从约10℃至约60℃、尤其是约20℃至约50℃和更尤其是约30℃至约40℃的温度下改变的比活性。

与亲本α-淀粉酶相比，α-淀粉酶变体也可以具有改变的氧化稳定性，特别是更高的氧化稳定性。例如，提高的氧化稳定性在洗涤剂组合物中有利，而降低的氧化稳定性可以在淀粉液化用组合物中有利。

变体α-淀粉酶可以比野生型α-淀粉酶更热稳定。这类α-淀粉酶变体对用于烘焙或需要升高温度的其他过程有利。例如，热稳定的α-淀粉酶变体可在约55℃至约80℃或更高的温度降解淀粉。热稳定的α-淀粉酶变体可以在暴露于高达约95℃的温度后保留其活性。

本文所述的α-淀粉酶变体多肽也可以具有使其尤其是在至少约55℃至约95℃或更高的升高的温度下，尤其是在约80℃下的半衰期相对于亲本酶延长至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约200％或更多的突变。在一个实施方案中，α-淀粉酶变体可以在约80℃或更高温度加热约1-10分钟。

α-淀粉酶变体可以具有外特异性(exo-specificity)，例如通过本文所述外特异性指数测量的外特异性。α-淀粉酶变体包含这样的变体，通常当在相同条件下测量时，这些变体与其所衍生自的亲本酶或多肽相比具有更高或提高的外特异性。因此，例如，与其亲本多肽相比，α-淀粉酶变体多肽可以具有约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约150％、约200％、约500％、约1000％、约5000％、约10,000％或更高的外特异性指数。

一方面，由核酸编码的α-淀粉酶变体多肽具有与亲本序列相同的pH稳定性。另一方面，变体包含赋予更大pH稳定性范围、或将pH范围迁移至对酶的终端商业目的而言希望的范围的突变。例如，在一个实施方案中，变体可以在约pH 5.0至约pH 10.5降解淀粉。α-淀粉酶变体多肽与相同条件下的亲本多肽相比可以具有更长的半衰期或更高的活性(取决于测定)，或者α-淀粉酶变体可以具有与亲本多肽相同的活性。α-淀粉酶变体多肽与相同pH条件下的其亲本多肽相比也可以具有约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更长的半衰期。备选地，或此外，酶变体与相同pH条件下的亲本多肽相比可以具有更高的比活性。

另一方面，提供与编码本文所示的任意α-淀粉酶变体的核酸互补的核酸。此外，还提供能够与该互补物杂交的核酸。在另一实施方案中，用于本文所述方法和组合物的序列是合成序列。其包括但不限于用在宿主生物(如甲基营养酵母毕赤酵母属(Pichia)和汉逊酵母属(Hansenula))中表达的最佳密码子选择产生的序列。

4.地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的产生和纯化

可以使用通常包含编码适宜的启动子、操纵基因、核糖体结合位点、翻译起始信号和(通常)阻遏基因或多种激活物基因的调控序列的表达载体，以酶的形式表达通过本文所述方法或通过本领域已知的任意备选方法产生的编码酶变体的DNA序列。

4.1.载体

携带编码α-淀粉酶变体的DNA序列的重组表达载体可以是任意可方便地进行重组DNA操作的载体，且载体的选择通常将取决于其待引入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制与染色体复制无关，例如质粒、噬菌体或染色体外元件、微染色体或人工染色体。备选地，载体可以是在被引入到宿主细胞中时整合到宿主细胞基因组中并与其所整合入的一条或多条染色体一起复制的载体。也可以通过使用可扩增构建体来扩增该整合的基因，以在染色体中产生该基因的多个拷贝，该可扩增构建体可以由抗生素选择或其它选择压力(例如必需调控基因)驱动，或者由必需代谢途径基因的互补作用驱动。

表达载体通常包含克隆载体的成分，例如允许载体在所选择的宿主生物中自主复制的元件和用于选择目的的一个或多个表型上可检测的标记。表达载体一般包含编码启动子、操纵基因、核糖体结合位点、翻译起始信号和(通常)阻抑基因或一个或多个激活基因的调控核苷酸序列。一方面，所用的所有信号序列将物质靶向至细胞培养基，以更容易地收集和纯化酶。用来连接分别编码α-淀粉酶变体、启动子、终止子和其他元件的DNA构建体，并将它们插入包含复制必需信息的适宜载体的操作为本领域技术人员公知(见例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，1989和第3版，2001)。

在载体中，DNA序列应与适宜的启动子序列有效连接。启动子可以是任何在所选宿主细胞中显示转录活性的DNA序列，并且可衍生自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。用于指导编码α-淀粉酶变体的DNA序列转录(尤其在细菌宿主中)的适宜启动子的实例是大肠杆菌(E.coli)lac操纵子的启动子；天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因dagA或celA启动子；地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子；嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子；解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(amyQ)的启动子；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)xylA和xylB基因的启动子等。对于真菌宿主中的转录，有用的启动子的实例是源自编码米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白水解酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶或构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶的基因的那些启动子。当在诸如大肠杆菌的细菌物种中表达编码α-淀粉酶变体多肽的基因时，可以例如从噬菌体启动子(包括T7启动子和λ噬菌体启动子)选择适宜的启动子。用于在酵母物种中表达的适宜启动子的实例包括但不限于酿酒酵母的Gal 1和Gal 10启动子及巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的AOX1或AOX2启动子。对于在里氏木霉(Trichoderma reesei)中表达，还可以使用CBHII启动子。

表达载体也可以包含与编码α-淀粉酶变体的DNA序列有效连接的适宜的转录终止子以及(在真核生物中)多聚腺苷酸化序列。终止序列和多聚腺苷酸化序列可适宜地与启动子源自相同的来源。载体还可包含使载体能够在所讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。此类序列的实例是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1、pICatH和pIJ702的复制起点。

载体也可包含选择标记，例如其产物能在宿主细胞中弥补缺陷的基因，例如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性)的基因。此外，载体可包含曲霉属(Aspergillus)选择标记，如amdS、argB、niaD和xxsC，赋予潮霉素抗性的标记，或者可通过如本领域已知的共转化实现选择。参见例如WO 91/17243。

4.2.变体表达和宿主生物

虽然细胞内表达或固态发酵在一些方面可以是有利的，例如当使用某些细菌或真菌作为宿主细胞时，但变体表达于细胞外且进入培养基一般是有利的。一般而言，本文述及的芽孢杆菌属α-淀粉酶包含允许所表达的蛋白酶分泌到培养基中的信号序列。如果期望，这种信号序列可由不同的信号序列代替，这可以通过编码相应信号序列的DNA序列的替代而方便地实现。信号序列一般被表征为具有三个结构域，即，N-端结构域、H-结构域和C-端结构域，且长度范围在18至35个残基。

成熟蛋白质最初可以是以融合蛋白或前蛋白质的形式产生自另一种芽孢杆菌属物种或产生自与亲本序列相同的物种。为了在地衣芽孢杆菌中分泌蛋白质，常使用地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的信号肽；但是，也可取代为来自其他芽孢杆菌属物种α-淀粉酶的信号蛋白质。

有利地，将含有DNA构建体或表达载体的分离的细胞用作重组产生α-淀粉酶变体的宿主细胞。可用编码变体的DNA构建体，方便地通过将该DNA构建体(以一个或多个拷贝)整合到宿主染色体中而转化细胞。通常认为这种整合是有利的，因为DNA序列更可能稳定地维持在细胞中。可以按照常规方法，例如通过同源或异源重组，进行DNA构建体向宿主染色体的整合。备选地，可以用上述有关不同类型宿主细胞的表达载体转化细胞。

适宜的细菌宿主生物的实例是革兰氏阳性菌物种，如芽孢杆菌科(Bacillaceae)，包含枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)；链霉菌属物种(Streptomyces sp.)，如鼠灰链霉菌(S.murinus)；乳酸细菌物种，包含乳球菌属物种(Lactococcus sp.)，如乳酸乳球菌(L.lactis)；乳杆菌属物种(Lactobacillus sp.)，包含罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)；明串珠菌属物种(Leuconostoc sp.)；片球菌属物种(Pediococcus sp.)；和链球菌属物种(Streptococcus sp.)。备选地，可选择隶属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(包含大肠杆菌)或假单胞菌科(Pseudomonadaceae)的革兰氏阴性菌物种作为宿主生物。

适宜的酵母宿主生物可选自生物技术相关的酵母物种，例如，但不限于毕赤酵母属物种(Pichia sp.)、汉逊酵母属物种(Hansenula sp.)、克鲁维酵母属物种(Kluyveromyces sp.)、耶氏酵母属物种(Yarrowinia sp.)、酵母属物种(Saccharomyces sp.)(包含酿酒酵母)或隶属于裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的物种(如粟酒裂殖酵母(S.pombe))。甲基营养酵母物种巴斯德毕赤酵母的菌株可用作宿主生物。备选地，宿主生物可以是汉逊酵母属物种。丝状真菌中适宜的宿主生物包括曲霉属的物种，例如黑曲霉、米曲霉、塔宾曲霉(A.tubigensis)、泡盛曲霉(A.awamori)或构巢曲霉。备选地，镰孢霉属物种(Fusarium sp.)(例如尖镰孢(Fusariumoxysporum))或根毛霉属物种(Rhizomucor sp.)(如米黑根毛霉)菌株可用作宿主生物。其他适宜的酵母包含嗜热丝孢菌属物种(Thermomyces sp.)和毛霉属物种(Mucor sp.)。真菌细胞可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化、接着再生细胞壁的方法以本领域已知的方式进行转化。转化曲霉属宿主细胞的适宜操作例如描述于欧洲专利号238023中。

还在另一方面，提供产生α-淀粉酶变体的方法，该方法包括在有利于变体产生的条件下培养上述宿主细胞，并从该细胞和/或培养基回收变体。用于培养细胞的培养基可以是适于生长所讨论的宿主细胞和获得α-淀粉酶变体表达的任意常规培养基。适宜的培养基和培养基组分可获自商品供应商或可根据公开的配方(例如按美国典型培养物保藏中心(ATCC)的目录中所述)制备。示例性培养基包括但不限于用于例如在三千升(3,000L)搅拌釜发酵罐中进行补料分批发酵的那些培养基，其用于下文提供的实施例中。所用培养基将是最适于所培养的宿主细胞的培养基，例如下文讨论的培养基用于培养地衣芽孢杆菌。该情况下生长培养基可以包含玉米浆固体和大豆粉作为有机化合物的来源，连同无机盐作为钠、钾、磷酸、镁和硫酸的来源，以及微量元素。通常，糖类来源如葡萄糖也是起始培养基的部分。一旦培养物自身已经建立并开始生长，即可以如本领域已知的那样向罐中定量供应糖类来维持培养物。定期从发酵罐中取样，以便利用例如比色测定法来测量酶滴度。根据测量结果，当酶产生速率停止增加时终止发酵过程。

可通过公知的方法方便地从培养基中回收分泌自宿主细胞的α-淀粉酶变体，其包括通过离心或过滤从培养基中分离细胞，通过诸如硫酸铵的盐沉淀培养基中的蛋白质组分，随后使用诸如离子交换层析、亲和层析等的层析方法。

可在允许α-淀粉酶变体蛋白质表达的适宜条件下培养宿主细胞。蛋白质的表达可以是组成型的，从而它们可以连续产生，或可以是诱导型的，从而需要刺激来起始表达。在诱导型表达的情况下，可以在需要时通过例如向培养基中加入诱导物(例如地塞米松、IPTG或Sepharose)来起始蛋白质产生。也可以在体外无细胞体系，如TnT^TM(Promega)兔网织红细胞体系中重组产生多肽。

也可以在有氧条件下，于对宿主适宜的培养基中培养表达α-淀粉酶变体的宿主。可以提供振荡，或搅拌和通气的组合，在对该宿主适宜的温度，例如约30℃至约75℃下进行产生，这取决于宿主和产生所希望的α-淀粉酶变体的需要。可以培养约12至约100小时或更长(以及其间的任何小时值)或更尤其是约24至约72小时。通常，培养基(culture broth)pH在约5.5至约8.0，这也取决于宿主细胞相对于α-淀粉酶变体的产生所需的培养条件。

4.3.α-淀粉酶的纯化

发酵、分离和浓缩技术为本领域已知，可以用常规方法来制备包含浓缩α-淀粉酶变体的溶液。发酵后，获得发酵液，并通过常规分离技术去除微生物细胞和多种悬浮固体(包含残留的发酵原料)，以获得淀粉酶溶液。通常使用过滤、离心、微量过滤、转鼓真空过滤、随后超滤、提取或层析等。

希望浓缩包含α-淀粉酶的溶液来优化回收，因为使用未浓缩的溶液需增加孵育时间来收集含有纯化的α-淀粉酶变体的沉淀物。用常规技术浓缩溶液至获得期望的酶水平。可通过上文讨论的任意技术实现含酶变体的溶液的浓缩。在一个实施方案中，使用旋转真空蒸发和/或超滤。备选地，可使用超滤。

为了纯化的目的，“沉淀剂”指对以固体形式从浓缩酶变体溶液沉淀α-淀粉酶变体有效的化合物，无论其是什么性质，即晶体、非晶体或二者的混合物。可以使用例如金属卤化物沉淀剂进行沉淀。金属卤化物沉淀剂包含：碱金属氯化物、碱金属溴化物和这些金属卤化物中两种或更多种的混合物。金属卤化物可以选自氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾和这些金属卤化物中两种或更多种的混合物。适宜的金属卤化物包含氯化钠和氯化钾，尤其是氯化钾，其还可用作防腐剂。

以有效沉淀α-淀粉酶变体的量使用金属卤化物沉淀剂。在常规试验后，本领域普通技术人员可以显而易见地至少选择出能够有效地引起酶变体沉淀的金属卤化物的有效量和最佳量，以及用于实现最大回收的沉淀条件，包括孵育时间、pH、温度和α-淀粉酶变体的浓度。

通常，向浓缩酶变体溶液中加入至少约5％w/v(重量/体积)至约25％w/v的金属卤化物，且通常是至少约8％w/v。通常，向浓缩酶变体溶液中加入不超过约25％w/v的金属卤化物，且通常不超过约20％w/v。金属卤化物沉淀剂的最适浓度将取决于具体的α-淀粉酶变体的性质以及其在浓缩α-淀粉酶变体溶液中的浓度等。

实现酶沉淀的另一备选方法是使用有机化合物，其可以添加到浓缩酶变体溶液中。有机化合物沉淀剂可包含：4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸的碱金属盐、4-羟基苯甲酸的烷基酯、以及这些有机化合物中两种或更多种的混合物。有机化合物沉淀剂的添加可以在金属卤化物沉淀剂的添加之前、与其同时或在其后发生，并且两种沉淀剂(有机化合物和金属卤化物)的添加都可顺次进行或同时进行。进一步的描述见例如美国专利号5,281,526(Danisco US Inc.，Genencor Division)。

通常，有机化合物沉淀剂选自4-羟基苯甲酸的碱金属盐(如钠盐或钾盐)，以及4-羟基苯甲酸的线性或分支的烷基酯(其中烷基含有1-12个碳原子)，以及这些有机化合物中两种或更多种的混合物。有机化合物沉淀剂可以是例如4-羟基苯甲酸的线性或分支的烷基酯(其中烷基含有1-10个碳原子)，以及这些有机化合物中两种或更多种的混合物。适宜的有机化合物包含4-羟基苯甲酸的线性烷基酯(其中烷基含有1-6个碳原子)，以及这些有机化合物中两种或更多种的混合物。也可以使用4-羟基苯甲酸的甲基酯、4-羟基苯甲酸的丙基酯、4-羟基苯甲酸的丁基酯、4-羟基苯甲酸的乙基酯以及这些有机化合物中两种或更多种的混合物。其他有机化合物还包括但不限于4-羟基苯甲酸甲酯(甲基PARABEN)、4-羟基苯甲酸丙酯(丙基PARABEN)，它们也是淀粉酶防腐剂。

就pH、温度、α-淀粉酶变体浓度、沉淀剂浓度和孵育时间而论，有机化合物沉淀剂的添加提供了沉淀条件的高度灵活性的优势。

可以以有效提高金属卤化物沉淀剂引起的酶变体沉淀的量使用有机化合物沉淀剂。基于本公开，在常规试验后，本领域普通技术人员将可以显而易见地至少选择出有机化合物沉淀剂的有效量和最佳量，以及用于实现最大回收的沉淀条件，包括孵育时间、pH、温度和酶变体浓度。

通常，向浓缩酶变体溶液中加入至少约0.01％w/v的有机化合物沉淀剂，且通常是至少约0.02％w/v。通常，向浓缩酶变体溶液中加入不超过约0.3％w/v的有机化合物沉淀剂，且通常不超过约0.2％w/v。

可以调节含有金属卤化物沉淀剂和(一方面)有机化合物沉淀剂的浓缩酶变体溶液的pH，该pH必然地将取决于待纯化的酶变体。通常，将pH调节至淀粉酶等电点(pI)附近的水平。例如，可以在低于pI约2.5个pH单位至高于pI约2.5个pH单位的范围内调节pH。为了说明的目的，当α-淀粉酶变体衍生自地衣芽孢杆菌时，通常调节浓缩酶变体溶液至约5.5和9.7之间的pH，尤其是调节至约6.5和9.0之间的pH。若变体的pI不同于野生型的pI，则可以相应地调节pH。

获得纯化的酶变体沉淀物所需的孵育时间取决于具体酶变体的性质、酶浓度、以及具体的沉淀剂(一种或多种)及其浓度。通常，有效沉淀酶变体的时间为约1至约30小时；通常不超过约25小时。在有机化合物沉淀剂存在下，孵育时间还可以减至小于约10小时，且在大多数情况下甚至是约6小时。

通常，孵育期间的温度为约4℃至约50℃。通常，在约10℃至约45℃，且尤其是约20℃至约40℃的温度进行该过程。用于诱导沉淀的最佳温度根据溶液条件和酶变体或所用沉淀剂(一种或多种)而变化。

可以通过搅拌包含酶变体、添加的金属卤化物和添加的有机化合物的溶液，来改善纯化的酶变体沉淀物的总回收率以及该方法的实施效率。在添加金属卤化物和有机化合物期间，以及在随后的孵育期均可以进行搅拌步骤。适宜的搅拌方法包括机械搅拌或振荡、强有力的通风或任意类似的技术。

孵育期后，然后通过常规分离技术，如过滤、离心、微量过滤、旋转真空过滤、超滤、压滤、交叉膜微量过滤(cross membrane microfiltration)、交叉流膜微量过滤(cross flow membrane microfiltration)等从解离的色素和其他杂质分离并收集纯化的酶变体。所使用的一种方法可以是交叉膜微量过滤。可以通过用水洗涤沉淀物来获得对纯化的酶变体沉淀物的进一步纯化。例如，可以用含有金属卤化物沉淀剂的水来洗涤纯化的酶变体沉淀物，例如用含有金属卤化物和有机化合物沉淀剂的水。

培养期间，热稳定淀粉酶胞外累积在培养基中。为了分离和纯化希望的α-淀粉酶变体，离心或过滤培养基以除去细胞，且可以将产生的无细胞液体用于进行酶的纯化。在一个实施方案中，使用约70％饱和度的硫酸铵对无细胞液进行盐析；然后将该70％饱和度沉淀的级分溶解在缓冲液中并施加到诸如Sephadex G-100柱的柱中，并洗脱以回收酶变体活性级分。为了进一步纯化，可以使用诸如离子交换层析的常规方法。

纯化的酶变体可用于通常利用酶变体的所有应用中。例如，它们可以用于衣物洗涤剂和除斑剂，用于食品工业，用于淀粉加工和烘焙，及作为消化助剂用于药物组合物。可以将它们制成液体(溶液，浆液)或固体(颗粒，粉末)的终产物。

备选地，可以回收酶产物，并向培养基中加入絮凝剂，以通过过滤或离心除去细胞和细胞碎片，而无需进一步纯化酶。

5.用于淀粉加工的其他酶

5.1.葡糖淀粉酶

考虑用于淀粉酶加工(尤其是糖化期间)的另一酶是葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)。葡糖淀粉酶通常衍生自微生物或植物。例如，葡糖淀粉酶可以是真菌或细菌来源。

示例性真菌葡糖淀粉酶有曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等，EMBO J.3(5)：1097-1102(1984))或其变体，如WO92/00381和WO 00/04136中所公开的；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO84/02921)；米曲霉葡糖淀粉酶(Hata等，Agric.Biol.Chem.，55(4)：941-949(1991))或其变体或片段。其他考虑的曲霉属葡糖淀粉酶变体包括增强热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等，Prot.Eng.9：499-505(1996))；D257E和D293E/Q(Chen等，Prot.Eng.8：575-582(1995))；N182(Chen等，Biochem.J.301：275-281(1994))；二硫键，A246C(Fierobe等，Biochemistry，35：8698-8704(1996))；在A435和S436位引入Pro残基(Li等，Protein Eng.10：1199-1204(1997))。

示例性真菌葡糖淀粉酶还可以包含美国专利号7,413,879(Danisco USInc.，Genencor Division)中公开的里氏木霉葡糖淀粉酶及其同源物。这些葡糖淀粉酶包括里氏木霉葡糖淀粉酶(SEQ ID NO：4)、淡黄肉座菌美国变种(Hypocrea citrina var.americana)葡糖淀粉酶(SEQ ID NO：6)、酒红肉座菌(Hypocrea vinosa)葡糖淀粉酶(SEQ ID NO：8)、木霉属物种(Trichoderma sp.)葡糖淀粉酶(SEQ ID NO：10)、胶质肉座菌(Hypocreagelatinosa)葡糖淀粉酶(SEQ ID NO：12)、Hypocrea orientalis葡糖淀粉酶(SEQ ID NO：14)、Trichoderma konilangbra葡糖淀粉酶(SEQ ID NO：16)、木霉属物种葡糖淀粉酶(SEQ ID NO：29)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)葡糖淀粉酶(SEQ ID NO：31)、长梗木霉(Trichodermalongibrachiatum)葡糖淀粉酶(SEQ ID NO：33)、棘孢木霉(Trichodermaasperellum)葡糖淀粉酶(SEQ ID NO：35)和Trichoderma strictipilis葡糖淀粉酶(SEQ ID NO：37)。

其他考虑的葡糖淀粉酶包括踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是来源于埃默森踝节菌(T.emersonii)(WO 99/28448)、T.leycettanus(美国专利号RE 32,153)、杜邦踝节菌(T.duponti)或嗜热踝节菌(T.thermophilus)(美国专利号4,587,215)。考虑的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)，特别是C.thermoamylolyticum(EP 135138)和C.thermohydrosulfuricum(WO 86/01831)的葡糖淀粉酶。

适宜的葡糖淀粉酶包括来源于米曲霉的葡糖淀粉酶，例如与WO00/04136中的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％或甚至约90％同一性的葡糖淀粉酶。适宜的葡糖淀粉酶还可以包括来源于里氏木霉的葡糖淀粉酶，如与WO 08/045489(Danisco US Inc.，Genencor Division)中的SEQ IDNO：1或3所示的氨基酸序列具有约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％或甚至约90％同一性的葡糖淀粉酶。具有改变的特性的里氏木霉葡糖淀粉酶变体，如2008年11月20日提交的WO 08/045489和U.S.S.N.12/292,563(Danisco US Inc.，Genencor Division)中公开的那些可以尤其有用。

同样适宜的是市售葡糖淀粉酶，如Fuel、Plus和Ultra(Novozymes A/S，丹麦)；480、480Ethanol、GC 147、和(Danisco US Inc.，Genencor Division)。可以按0.02-2.0AGU/g ds或0.1-1.0AGU/g ds，例如0.2AGU/g ds的量加入葡糖淀粉酶。

5.2.支链淀粉酶

支链淀粉酶(E.C.3.2.1.41)是表征为其水解例如支链淀粉和普鲁分支葡聚糖中的α-1，6-糖苷键的能力的脱支酶。支链淀粉酶已用于多种工业应用，尤其是用于食品和饮料工业。支链淀粉酶是淀粉脱支酶，且在淀粉水解产物脱支(用于调理生面团)、β-极限糊精脱支(用于啤酒和麦芽酒的酿造)及从含淀粉物质(如玉米、马铃薯、小麦、木薯和稻)产生糖浆中有效。

可以用美国专利号5,736,375中所述的还原糖法测量支链淀粉酶活性，该专利在此引用作为参考。还见Nelson N.，“A Photometric Adaptation ofthe Somogyi Method for the Determination of Glucose，”J.Biol.Chem.153：375-80(1944)；Somogyi M.，“A New Reagent for the Determination ofSugars，”J.Biol.Chem.160：61-68(1945)。

代表性支链淀粉酶包括来自芽孢杆菌属的那些，尤其是美国专利号4,560,651中公开的来自Bacillus amyloderamificans的支链淀粉酶、WO01/051620中公开为SEQ ID NO：2的支链淀粉酶、WO 01/051620中公开为SEQ ID NO：4的来自Bacillus deramificans的支链淀粉酶和WO01/051620中公开为SEQ ID NO：6的来自嗜酸普鲁兰芽孢杆菌的支链淀粉酶，所有专利在此引用作为参考。还见Kelly等，“Molecular Geneticanalysis of the Pullulanase B Gene of Bacillus acidopullulyticus，”FEMSMicrobiol.Lett.115：97-106(1994)。

此外，支链淀粉酶可以是天然存在的支链淀粉酶的变体。美国专利号5,736,375和7,399,623中描述了Bacillus deramificans支链淀粉酶的产生，两个专利都在此引用作为参考。

适宜的市售支链淀粉酶包括PROMOZYME D、PROMOZYMETMD2(Novozymes A/S)、OPTIMAX L-300(Danisco US Inc.，GenencorDivision)、KLEISTASE PL45和KLEISTASE PLF(Amano Enzyme Inc.，日本)。

5.3.葡萄糖异构酶

市售葡萄糖异构酶实际上是木糖异构酶(D-木糖乙酮醇异构酶，EC5.3.1.5)，其是催化D-木糖异构化为D-木酮糖的胞内酶。但是，该酶的实际意义源于木糖异构酶可以用D-木糖或D-葡萄糖作为底物的事实。该酶的商业用途主要是用于高果糖糖浆产生。见Kaneko等，Biosci.Biotechnol.Biochem.64：940-947(2000)。目前，市售葡萄糖异构酶主要来自米苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)、凝结芽孢杆菌或链霉属物种。考虑的异构酶包括商品IT(Novozymes A/S)；IGI SA、IGI HF、IGI VHF、SGI和IGI MAX(Danisco US Inc.，Genencor Division)。

5.4.肌醇六磷酸酶

肌醇六磷酸酶对本公开有用，因为它们能够在孵育和液化步骤限定的条件下水解肌醇六磷酸。在一些实施方案中，肌醇六磷酸酶能够从肌醇六磷酸(inositol hexaphosphate)(肌醇六磷酸(phytic acid))释放至少一个无机磷酸。可根据其对肌醇六磷酸分子上起始水解作用的磷酸酯基团的具体位置的偏好来分组肌醇六磷酸酶(例如分为3-肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.8)或分为6-肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.26))。肌醇六磷酸酶的典型实例是肌醇-六磷酸-3-磷酸水解酶。

肌醇六磷酸酶可以获自微生物，如真菌生物和/或细菌生物。这些微生物中的一些包括例如曲霉属(例如黑曲霉、土曲霉(A.terreus)、无花果曲霉(A.ficum)和烟曲霉(A.fumigatus))、毁丝霉属(Myceliophthora)(嗜热毁丝霉(M.thermophila))、踝节菌属(嗜热踝节菌)、木霉属物种(里氏木霉)和嗜热丝孢菌属(WO 99/49740)。肌醇六磷酸酶还可获自青霉属(Penicillium)物种，例如P.hordei(ATCC号22053)、桧状青霉(P.piceum)(ATCC号10519)或短密青霉(P.brevi-compactum)(ATCC号48944)。见例如美国专利号6,475,762。此外，肌醇六磷酸酶可获自芽孢杆菌属(例如枯草芽孢杆菌)、假单胞菌属(Pseudomonas)、枹蕈属(Peniophora)、大肠杆菌、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、Enterbacter和Buttiauxella(见WO2006/043178)。

可获得市售肌醇六磷酸酶，如NATUPHOS(BASF)、RONOZYME P(Novozymes A/S)和FINASE(AB Enzymes)。Engelen等，J.of AOAC Int.，77：760-764(1994)发表了测定微生物肌醇六磷酸酶活性的方法和肌醇六磷酸酶单位的定义。肌醇六磷酸酶可以是天然存在的肌醇六磷酸酶、其变体或片段。

在一个实施方案中，肌醇六磷酸酶是衍生自细菌Buttiauxiella spp.的肌醇六磷酸酶。Buttiauxiella spp.包含B.agrestis、B.brennerae、B.ferragutiase、B.gaviniae、B.izardii、B.noackiae和B.warmboldiae。Buttiauxella物种的菌株可获自DSMZ，德国生物材料保藏中心(GermanNational Resource Center for Biological Material，Inhoffenstrabe 7B，38124Braunschweig，德国)。以保藏号NCIMB 41248保藏的Buttiauxiellasp.菌株P1-29是尤其有用的菌株实例，可从其获得肌醇六磷酸酶，并按照本公开使用。在一些实施方案中，肌醇六磷酸酶是WO 06/043178中公开的BP-野生型、其变体(如BP-11)，或2008年9月11日公开的US2008/0220498中公开的变体。例如，WO 06/043178的表1中公开了BP-野生型及其变体，其中编号参考已公开的PCT申请的SEQ ID NO：3。

5.5.β-淀粉酶

另一方面考虑额外使用β-淀粉酶。β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)是外切产麦芽糖淀粉酶，其催化水解直链淀粉、支链淀粉和相关葡萄糖聚合物中的1，4-α-糖苷键，从而释放麦芽糖。已从多种植物和微生物分离了β-淀粉酶(Fogarty等，Progress in Industrial Microbiology，15卷，112-115页，1979)。这些β-淀粉酶的特征在于具有40℃至65℃范围内的最适温度，以及约4.5至约7.0范围内的最适pH。考虑的β-淀粉酶包括但不限于来自大麦的β-淀粉酶BBA 1500、DBA、OPTIMALT^TMME、OPTIMALT^TM BBA(Danisco US Inc，Genencor Division)；和Novozym^TM WBA(Novozymes A/S)。

实施例

以下实施例不解释为限制，而是使用所公开的方法的示例性手段。

材料和方法

商品(批号90BA031A1M1；活性134，603MWU/g)由Verenium Corporation，4955Directors Place，San Diego，CA 92121的产品经理Brian A.Steer博士提供，电话：858-526-5264，传真：858-526-5764。

FRED和4060VHP

FRED和4060VHP来自Danisco US Inc.，Genencor Division(批号1077061001；活性17662AAU/g)。

用于96孔微量滴定板中蛋白质含量测定的Bradford测定

用Bradford QuickStart^TM Dye Reagent(Bio-Rad，California)测定样品上清中的蛋白质浓度。通过过滤来自在微量滴定板(MTP)中培养的培养物的培养基来获得样品。培养物在37℃、280转/分钟振荡和湿润通气下培养3天。将10μL培养物滤液样品与200μL Bradford QuickStart^TM DyeReagent在第二MTP的孔内组合。充分混合后，将MTP于室温下孵育至少10分钟。去除气泡，并在595nm测量OD(光密度)。为了测定蛋白质浓度，从样品读数扣除背景读数(来自未接种的孔)。

沉淀测试

除葡萄糖聚合物外，所有淀粉(尤其是基于谷粒的淀粉)都包含在水解期间释放的诸如细纤维、蛋白质、脂肪和灰分的微量成分。淀粉蒸煮参数和诸如蒸汽喷射蒸煮器的操作设备对此物质的量具有一定承载量。小量淀粉-脂质复合体及(在正确条件下)部分糊化的淀粉颗粒和/或整个淀粉颗粒可以通过液化系统。由于液化系统中的不完全水解，测试这些成分的最可靠的位置是在完全糖化之后。从碾磨部分接收经良好洗涤的淀粉的运行良好的液化系统应通过此方法测试出＜1.5％沉淀。存在始终如一地传递＜1％的系统。操作历史已显示，高于2.5％的沉淀水平将导致下游过滤困难，从而导致预包被介质和/或微型过滤器的耗费。

本文描述的此方法可以用于葡萄糖＞90％的所有葡萄糖底物。这还可以用于麦芽糖溶液和液化的低DE产物。由于最终的糖化干物质＞5％引起的黏度和浮力问题，应在测试前稀释已知大于此的溶液。

将糖化糖浆的样品在60℃水浴中保持10-30分钟以使其恒温。但是，该孵育应不长于1小时。必要时，在测试前调节DS值至35％±0.5％。在磁力搅拌器上混合样品，用注射器转移至离心管。将样品于2,500转/分钟(1,350×g)离心10分钟。在离心管底可见沉淀(如果存在)。

过滤测试

此测试基于在受控温度和真空下通过受控深度的助滤剂(硅藻土)的过滤速率。此测试可以在糖化后鉴定液化酶和液化方法中的差异。此测试适合用于模拟工业旋转真空预包被过滤系统。它可以用于测定和显示多种液化和糖化的酶和方法。此外，滤液提供了清澈的物质用于进一步评价，如用碘反应测定可溶性淀粉。

将柱套维持在60℃。插入两个滤纸盘并拧入接头，直至紧贴O形环密封圈。去皮重的250ml真空瓶就位后，堵住出口向柱中加入100ml水。打开真空泵，直至达到23-24英寸的稳定真空。打开管出口，并开始计时。100ml耗时约1分10秒至1分30秒滤过该系统。如果不是这样，那么检查滤纸，保证它们紧密。滤纸抽干后，夹住出口管。泵在从出口管除去夹子后运行。用去皮重的250ml滤瓶替换真空瓶。将约2.0克助滤剂与100克测试溶液混合在250ml烧杯中。在磁性平板上搅拌样品，同时用注射器按目标量取出样品。可以将上皿天平用于此步骤。保持颗粒悬浮，用漏斗辅助将全部量快速转移至柱。打开出口管夹子，开始计时。收集至溶液到达滤床顶部，并记录时间。可以用多次测试的滤液量来判断液化或糖化中的操作差异。备选地，可以按重量或体积/平方米滤床来计算速率。

例如，15分钟内收集了60克滤液。将滤床表面积计算为πr²，在此情况下为3.141593×0.75×0.75＝1.767cm²(柱具有0.75cm的内部半径)。此外，60克滤液等同于52ml样品，该样品具有35％DS和1.151g/mL的密度。因此，过滤速率为52ml/1.767cm²/15分钟＝1.96ml/cm²/分钟。

碘测试

对于糖化溶液测试，用10ml DI水稀释0.2ml糖化溶液。将稀释的糖化溶液煮沸10分钟，然后在冰浴中冷却。向冷却的糖化溶液样品中加入0.5ml碘溶液(0.02M)。

对于滤液测试，用10ml DI水稀释按实施例1.3.中所述获得的0.5ml滤液。将稀释的滤液煮沸10分钟，并在冰浴中冷却。向冷却的滤液样品中加入0.5ml碘溶液(0.02M)。

测量葡萄糖浆组成的HPLC法

通过HPLC系统(Beckman System Gold 32Karat Fullerton，CA)测量了糖化产物的组成。该系统(维持在50℃)配有Rezex 8u8％H单糖柱和折射率(RI)检测器(ERC-7515A，Anspec Company，Inc.)。按0.6ml/分钟的流速用稀硫酸(0.01N)作为移动相。将20μl4.0％的反应混合物溶液注射在柱上。获取45分钟内的洗脱图。从之前运行的标准品测定糖的分布和每种糖的量。

实施例1.和FRED的比较。

在金属桶中过夜搅拌，制备含有10ppm Ca²⁺和100ppm二氧化硫(SO₂)的38％DS精制淀粉(Cargill，Minneapolis，MN)浆。用碳酸钠溶液(20％w/v)调节浆液pH至pH 4.5、5.6和5.8。浆液波美度(度)约为22.3。用不同酶剂量的和指定的pH进行了3组液化，用FRED进行了1组液化。按以下进行液化：(1)50MWU/gds的于pH 4.5；(2)50MWU/g ds的于pH 5.6；(3)25MWU/g ds的于pH 5.6；和(4)10LU/g ds的FRED于pH 5.8。

将添加了一种或多种酶的浆液按0.5g/分钟、6分钟滞留期输送通过中试工厂喷射蒸煮器(Hydro-thermal Corporation，Waukesha，WI)，并在约108-110℃蒸煮进行初次液化。二次液化在95℃进行120分钟。在二次液化期间的多个时间点测量了DE和折射率(RI)(表1A)。

表1A.和FRED的DE发展。

表1A中的数据显示二次液化期间的DE发展。50MWU/g ds剂量的在pH 4.5和5.6液化都能在60分钟内产生10DE。而25MWU/g ds的甚至在132分钟时也未能产生10DE。此结果显示，倍增剂量几乎使二次液化中的DE发展速率加倍，因为与25MWU相比，50MWU在一半的时间内达到10DE。FRED的二次液化在103分钟内产生10.57DE，其是FRED在所使用的条件下的标准DE发展速率。

将液化产物的pH调节至pH 4.2，DS调节至34％。按0.16GAU/g ds加入糖化酶混合物4060VHP。糖化在60℃进行48-64小时。在多个时间点取样，并通过HPLC法测定了反应产物的组成(表1B)。

表1B.使用来自不同液化酶组合的液化淀粉的高果糖糖浆组成。

糖化后，针对(1)碘测试(材料和方法)、(2)沉淀测试(材料和方法)和(3)过滤测试(材料和方法)测试了葡萄糖浆。值总结在表1C中。

表1C.来自和FRED液化产物的糖溶液的蓝糖、沉淀、过滤和葡萄糖结果。

由于淀粉在液化系统中的不完全水解，在糖化结束时观察到的高葡萄糖水平并非必然表明该糖化淀粉适合用于甜味剂应用。最可靠的方法之一是通过碘测试测量碘阳性糖(IPS；蓝糖)。针对滤液和沉淀二者对糖化淀粉进行碘测试。碘能够结合液化/糖化期间逃脱水解的任何直链淀粉，并产生蓝色，其称为碘阳性糖。IPS是甜味剂应用中非常不希望的。对糖化淀粉的沉淀和滤液都进行了碘测试。

另外，还在糖化后进行了沉淀测试。不完全水解的淀粉可以与脂质、蛋白质和/或细纤维络合形成葡萄糖浆中的沉淀。对甜味剂应用而言，高水平的沉淀是不希望的，因为沉淀可以实质上降低过滤速率，需要加入高水平的助滤剂，导致更高的成本和处理问题。这还将减少工厂容量。从碾磨部分接收经良好洗涤的淀粉的运行良好的液化系统通常产生少于1.5％v/v的沉淀。

用来自的液化产物获得的高葡萄糖糖浆显示碘阳性糖(IPS)。当用碘染色时，沉淀和滤液变蓝色/绿色(图1)，表明糖化获自的液化产物后仍存在直链淀粉(DP＞46-54)。因此，对甜味剂应用而言，该液化产物是不可接受的。用来自的液化产物获得的高果糖糖浆还显示高水平的沉淀。对产生HFCS(高果糖玉米糖浆)而言，两个结果都是不希望的。

获自使用FRED液化产物的高葡萄糖糖浆的沉淀或滤液在用碘染色时未显示蓝色，而变黄(图1)，且显示较低水平(＜1.5％)的沉淀，其在HFCS的产生中是理想的。

此外，评价糖化淀粉的另一可靠的方法是过滤测试，其类似于沉淀测试。沉淀量不利地影响过滤速率。过滤测试结果与在沉淀测试中观察到的结果一致。见表1C。来自多种液化产物的糖化淀粉显示11至33.5g/15分钟的低过滤速率。而对于来自FRED液化产物的糖化淀粉，过滤速率提高至67g/15分钟，其是液化产物的速率的两倍。

为了充分实现此低pH、热稳定酶在甜味剂应用中的潜能，测试组合了和地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的混合物，以克服甜味剂产生中与相关的蓝糖或IPS问题，并阐述于以下实施例中。

实施例2.淀粉液化中的和FRED混合物

通过过夜搅拌制备了含有38％DS精制淀粉(Cargill，Minneapolis，NM)、10ppm Ca²⁺和100ppm二氧化硫(SO₂)的水性浆液。用碳酸钠溶液(20％w/v)调节浆液的pH。浆液波美度(度)约为22.3。用添加了5LU/g dsFRED的25MWU/g ds在pH 5.6下进行了单组液化。将添加了一种或多种酶的浆液按0.5g/分钟、6分钟滞留期输送通过大喷射器，并在约108-110℃蒸煮进行初次液化。二次液化在95℃进行120分钟。在二次液化期间的多个时间点测量了DE和折射率(RI)。表2A反映了在二次液化的多个时间测定的两组液化的DE值。结果显示，在pH 5.6， FRED 25/5混合物能够达到对甜味剂应用中的淀粉液化而言可接受DE发展，即90-100分钟内达到至少10的DE值。此处同时显示的数据表明， FRED 25/5混合物在pH 5.6下液化期间的DE发展与工业标准一致。

表2A.pH 5.6和5.3下 FRED混合物的DE发展。

随后，在糖化中测试了产生的液化产物在甜味剂应用中的适合性。将液化产物调节至pH 4.2和34％DS。按0.16GAU/g ds加入糖化酶4060VHP。糖化在60℃进行48-64小时。在多个时间点取样，并通过HPLC法测定了反应产物的组成(表2B)。如表2B中所示，对于FRED 25/5混合物的液化产物，葡萄糖产生在48小时内达到约95％。该葡萄糖产生水平类似于实施例1中从液化产物达到的水平。

表2B.使用来自不同液化酶组合的液化淀粉的高葡萄糖糖浆组成。

通过(1)碘测试、(2)沉淀测试和(3)过滤测试(如之前所讨论)进一步评价糖化淀粉，这些测试全都用来评价将糖化淀粉(葡萄糖浆)转化为高果糖糖浆(HFCS或HFSS)的潜能。

针对滤液和沉淀二者对糖化淀粉(葡萄糖浆)进行了碘测试。见图1。当用碘染色时，来自最初用FRED 25/5混合物液化的糖化淀粉的沉淀变黄。此结果表明糖化后缺乏直链淀粉复合体。对甜味剂应用而言，对应的液化产物具有可接受的质量。对滤液进行碘测试时，样品显示黄色，产生与沉淀碘测试中类似的结果。对获自FRED混合物的糖化淀粉进行了沉淀测试，结果显示在表2C中。来自FRED 25/5混合物液化产物的糖化淀粉仅显示0.5％沉淀，其良好地处于1.5％的工业阈值以下，对工业使用而言令人满意。

过滤结果也与沉淀测试中观察到的结果一致。见表2C。来自FRED混合物液化产物的糖化淀粉显示过滤速率提高至83g/15分钟，这是之前实施例1中源自的速率的2.5倍以上。

表2C.来自FRED混合物的糖化溶液的蓝糖、沉淀、过滤和葡萄糖结果。

实施例3.

在金属桶中过夜搅拌，制备了含有38％DS精制淀粉(Cargill，Minneapolis，MN)、含有10ppm Ca²⁺和100ppm二氧化硫(SO₂)的淀粉浆。用碳酸钠溶液(20％w/v)调节浆液pH至pH 5.6。浆液波美度(度)约为22.3。进行了4组液化，其包含恒定剂量的和不同剂量的FRED。按以下进行液化：

(1)25MWU/g的和5LU/g的FRED；

(2)25MWU/g的和2.5LU/g的FRED；

(3)25MWU/g的和1LU/g的FRED；和

(4)25MWU/g的

将添加了一种或多种酶的浆液按0.5g/分钟、6分钟滞留期输送通过中试工厂喷射蒸煮器(Hydro-thermal Corporation，Waukesha，WI)，并在约108-110℃蒸煮进行初次液化。二次液化在95℃进行120分钟。在二次液化期间的多个时间点测量了DE和折射率(RI)。

表3A中的数据显示二次液化期间的DE发展。DE进展在整个酶剂量范围内如预期的那样，液化1最高，随后分别是液化2、液化3和液化4。

表3A.和FRED的DE发展。

所有处理的糖化性能相似，葡萄糖水平在48小时内达到～94-95％(表3B)。

表3B.使用来自不同液化酶组合的液化淀粉的高葡萄糖糖浆组成。

通过(1)碘测试、(2)沉淀测试和(3)过滤测试(如之前所讨论)进一步评价糖化淀粉，所有测试都用来评价将糖化淀粉(葡萄糖浆)转化为高果糖糖浆(HFCS或HFSS)的潜能。

当用碘染色时，只有来自液化1(25MWU/g的和5LU/g的FRED的混合物)的糖化溶液是碘阴性，而所有其他三种处理都是蓝色/绿色。将管静置24小时，发现结果仍类似。

来自糖化溶液的沉淀测试的结果显示，25MWU/g的和5LU/g的FRED的混合物具有最低(＜3％)的沉淀。不含FRED的25MWU/g的沉淀最高，为15％。较高的沉淀是不可接受的，因为它可以在甜味剂应用中堵塞过滤和降低输出。

表3C.来自和FRED液化产物的糖化溶液的蓝糖、沉淀、过滤和葡萄糖结果。

序列表

SEQ ID NO：1：Fuelzyme LF(AF504065；美国专利号7,273,740的SEQ ID NO：1)的DNA序列

   1 ATGGCCAAGT ACTCCGAGCT GGAAAAGGGC GGGGTCATAA TGCAGGCGTT

  51 CTACTGGGAC GTGCCTTCAG GAGGAATATG GTGGGACACA ATACGGCAGA

 101 AGATACCGGA GTGGTACGAT GCCGGAATCT CCGCAATATG GATTCCCCCG

 151 GCGAGCAAGG GCATGGGCGG CGCCTATTCG ATGGGCTACG ACCCCTACGA

 201 CTTCTTTGAC CTCGGTGAGT ACGACCAGAA GGGAACGGTA GAGACGCGCT

 251 TTGGCTCCAA GCAGGAGCTC GTGAACATGA TAAACACCGC CCACGCCTAT

 301 GGCATGAAGG TAATAGCCGA TATAGTCATC AACCACCGCG CCGGCGGTGA

 351 CCTGGAGTGG AACCCCTTCG TGAACGACTA TACCTGGACC GACTTCTCAA

 401 AGGTCGCGTC GGGTAAATAC ACGGCCAACT ACCTCGACTT CCACCCGAAC

 451 GAGCTCCATG CGGGCGATTC CGGAACATTT GGAGGCTATC CCGACATATG

 501 CCACGACAAG AGCTGGGACC AGTACTGGCT CTGGGCCAGC CAGGAGAGCT

 551 ACGCGGCATA TCTCAGGAGC ATCGGCATCG ATGCCTGGCG CTTCGACTAC

 601 GTCAAGGGCT ATGCTCCCTG GGTCGTCAAG GACTGGCTGA ACTGGTGGGG

 650 AGGCTGGGCG GTTGGAGAGT ACTGGGACAC CAACGTCGAC GCTGTTCTCA

 701 ACTGGGCATA CTCGAGCGGT GCCAAGGTCT TTGACTTCGC CCTCTACTAC

 751 AAGATGGATG AGGCCTTTGA CAACAAAAAC ATTCCAGCGC TCGTCTCTGC

 801 CCTTCAGAAC GGCCAGACTG TTGTCTCCCG CGACCCGTTC AAGGCCGTAA

 851 CCTTTGTAGC AAACCACGAC ACCGATATAA TCTGGAACAA GTATCCAGCC

 901 TACGCGTTCA TCCTCACCTA CGAGGGCCAG CCGACAATAT TCTACCGCGA

 951 CTACGAGGAG TGGCTCAACA AGGATAAGCT CAAGAACCTC ATCTGGATAC

1001 ATGAGAACCT CGCCGGAGGA AGCACCGACA TAGTCTACTA CGATAACGAT

1051 GAACTCATCT TCGTCAGGAA CGGCTACGGG GACAAGCCGG GGCTTATAAC

1101 CTACATCAAC CTAGGCTCGA GCAAGGCCGG AAGGTGGGTT TATGTGCCGA

1151 AGTTCGCGGG CGCGTGCATC CACGAGTATA CTGGTAACCT CGGAGGCTGG

1201 GTAGACAAGT ACGTCTACTC AAGCGGCTGG GTCTATCTCG AAGCTCCAGC

1251 TTACGACCCT GCCAACGGGC AGTATGGCTA CTCCGTGTGG AGCTACTGCG

1301 GGGTGGGCTG A

SEQ ID NO：2：α-淀粉酶、Ultra-Thin或Fuelzyme-LF(AAM48115；美国专利号7,273,740的SEQ ID NO：2)的合成构建体

 1  MAKYSELEKG GVIMQAFYWD VPSGGIWWDT IRQKIPEWYD AGISAIWIPP

 51 ASKGMGGAYS MGYDPYDFFD LGEYDQKGTV ETRFGSKQEL VNMINTAHAY

101 GMKVIADIVI NHRAGGDLEW NPFVNDYTWT DFSKVASGKY TANYLDFHPN

151 ELHAGDSGTF GGYPDICHDK SWDQYWLWAS QESYAAYLRS IGIDAWRFDY

201 VKGYAPWVVK DWLNWWGGWA VGEYWDTNVD AVLNWAYSSG AKVFDFALYY

251 KMDEAFDNKN IPALVSALQN GQTVVSRDPF KAVTFVANHD TDIIWNKYPA

301 YAFILTYEGQ PTIFYRDYEE WLNKDKLKNL IWIHENLAGG STDIVYYDND

351 ELIFVRNGYG DKPGLITYIN LGSSKAGRWV YVPKFAGACI HEYTGNLGGW

401 VDKYVYSSGW VYLEAPAYDP ANGQYGYSVW SYCGVG

SEQ ID NO：3：野生型LATDNA(2008年11月3日提交的U.S.S.N.12/263,804的SEQ ID NO：3)

atgaaacaac aaaaacggct ttacgcccga ttgctgacgc tgttatttgc

gctcatcttc ttgctgcctc attctgcagc ttcagcagca aatcttaatg

ggacgctgat gcagtatttt gaatggtaca tgcccaatga cggccaacat

tggaagcgtt tgcaaaacga ctcggcatat ttggctgaac acggtattac

tgccgtctgg attcccccgg catataaggg aacgagccaa gcggatgtgg

gctacggtgc ttacgacctt tatgatttag gggagtttca tcaaaaaggg

acggttcgga caaagtacgg cacaaaagga gagctgcaat ctgcgatcaa

aagtcttcat tcccgcgaca ttaacgttta cggggatgtg gtcatcaacc

acaaaggcgg cgctgatgcg accgaagatg taaccgcggt tgaagtcgat

cccgctgacc gcaaccgcgt aatttcagga gaacacctaa ttaaagcctg

gacacatttt cattttccgg ggcgcggcag cacatacagc gattttaaat

ggcattggta ccattttgac ggaaccgatt gggacgagtc ccgaaagctg

aaccgcatct ataagtttca aggaaaggct tgggattggg aagtttccaa

tgaaaacggc aactatgatt atttgatgta tgccgacatc gattatgacc

atcctgatgt cgcagcagaa attaagagat ggggcacttg gtatgccaat

gaactgcaat tggacggttt ccgtcttgat gctgtcaaac acattaaatt

ttcttttttg cgggattggg ttaatcatgt cagggaaaaa acggggaagg

aaatgtttac ggtagctgaa tattggcaga atgacttggg cgcgctggaa

aactatttga acaaaacaaa ttttaatcat tcagtgtttg acgtgccgct

tcattatcag ttccatgctg catcgacaca gggaggcggc tatgatatga

ggaaattgct gaacggtacg gtcgtttcca agcatccgtt gaaatcggtt

acatttgtcg ataaccatga tacacagccg gggcaatcgc ttgagtcgac

tgtccaaaca tggtttaagc cgcttgctta cgcttttatt ctcacaaggg

aatctggata ccctcaggtt ttctacgggg atatgtacgg gacgaaagga

gactcccagc gcgaaattcc tgccttgaaa cacaaaattg aaccgatctt

aaaagcgaga aaacagtatg cgtacggagc acagcatgat tatttcgacc

accatgacat tgtcggctgg acaagggaag gcgacagctc ggttgcaaat

tcaggtttgg cggcattaat aacagacgga cccggtgggg caaagcgaat

gtatgtcggc cggcaaaacg ccggtgagac atggcatgac attaccggaa

accgttcgga gccggttgtc atcaattcgg aaggctgggg agagtttcac

gtaaacggcg ggtcggtttc aatttatgtt  caaaga

SEQ ID NO：4：野生型LAT多肽(2008年11月3日提交的U.S.S.N.12/263,804的SEQ ID NO：4)

ANLNGTLMQY FEWYMPNDGQ HWKRLQNDSA YLAEHGITAV WIPPAYKGTS

QADVGYGAYD LYDLGEFHQK GTVRTKYGTK GELQSAIKSL HSRDINVYGD

VVINHKGGAD ATEDVTAVEV DPADRNRVIS GEHLIKAWTH FHFPGRGSTY

SDFKWHWYHF DGTDWDESRK LNRIYKFQGK AWDWEVSNEN GNYDYLMYAD

IDYDHPDVAA EIKRWGTWYA NELQLDGFRL DAVKHIKFSF LRDWVNHVRE

KTGKEMFTVA EYWQNDLGAL ENYLNKTNFN HSVFDVPLHY QFHAASTQGG

GYDMRKLLNG TVVSKHPLKS VTFVDNHDTQ PGQSLESTVQ TWFKPLAYAF

ILTRESGYPQ VFYGDMYGTK GDSQREIPAL KHKIEPILKA RKQYAYGAQH

DYFDHHDIVG WTREGDSSVA NSGLAALITD GPGGAKRMYV GRQNAGETWH

DITGNRSEPV VINSEGWGEF HVNGGSVSIY VQR

SEQ ID NO：5：FRED的DNA序列AGCTTGAAGAAGTGAAGAAGCAGAGAGGCTATTGAATAAATGAGTAGAAAGCGCCATATCGGCGCTTTTCTTTTGGAAGAAAATATAGGGAAAATGGTACTTGTTAAAAATTCGGAATATTTATACAACATCATATGTTTCACATTGAAAGGGGAGGAGAATCATGAAACAACAAAAACGGCTTTACGCCCGATTGCTGACGCTGTTATTTGCGCTCATCTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGCAGCGGCGGCAAATCTTAATGGGACGCTGATGCAGTATTTTGAATGGTACATGCCCAATGACGGCCAACATTGGAAGCGTTTGCAAAACGACTCGGCATATTTGGCTGAACACGGTATTACTGCCGTCTGGATTCCCCCGGCATATAAGGGAACGAGCCAAGCGGATGTGGGCTACGGTGCTTACGACCTTTATGATTTAGGGGAGTTTCATCAAAAAGGGACGGTTCGGACAAAGTACGGCACAAAAGGAGAGCTGCAATCTGCGATCAAAAGTCTTCATTCCCGCGACATTAACGTTTACGGGGATGTGGTCATCAACCACAAAGGCGGCGCTGATGCGACCGAAGATGTAACCGCGGTTGAAGTCGATCCCGCTGACCGCAACCGCGTAATTTCAGGAGAACACCTAATTAAAGCCTGGACACATTTTCATTTTCCGGGGCGCGGCAGCACATACAGCGATTTTAAATGGCATTGGTACCATTTTGACGGAACCGATTGGGACGAGTCCCGAAAGCTGAACCGCATCTATAAGTTTCAAGGAAAGGCTTGGGATTGGGAAGTTTCCAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGATGTATGCCGACATCGATTATGACCATCCTGATGTCGCAGCAGAAATTAAGAGATGGGGCACTTGGTATGCCAATGAACTGCAATTGGACGGTTTCCGTCTTGATGCTGTCAAACACATTAAATTTTCTTTTTTGCGGGATTGGGTTAATCATGTCAGGGAAAAAACGGGGAAGGAAATGTTTACGGTAGCTGAATATTGGCAGAATGACTTGGGCGCGCTGGAAAACTATTTGAACAAAACAAATTTTAATCATTCAGTGTTTGACGTGCCGCTTCATTATCAGTTCCATGCTGCATCGACACAGGGAGGCGGCTATGATATGAGGAAATTGCTGAACGGTACGGTCGTTTCCAAGCATCCGTTGAAATCGGTTACATTTGTCGATAACCATGATACACAGCCGGGGCAATCGCTTGAGTCGACTGTCCAAACATGGTTTAAGCCGCTTGCTTACGCTTTTATTCTCACAAGGGAATCTGGATACCCTCAGGTTTTCTACGGGGATATGTACGGGACGAAAGGAGACTCCCAGCGCGAAATTCCTGCCTTGAAACACAAAATTGAACCGATCTTAAAAGCGAGAAAACAGTATGCGTACGGAGCACAGCATGATTATTTCGACCACCATGACATTGTCGGCTGGACAAGGGAAGGCGACAGCTCGGTTGCAAATTCAGGTTTGGCGGCATTAATAACAGACGGACCCGGTGGGGCAAAGCGAATGTATGTCGGCCGGCAAAACGCCGGTGAGACATGGCATGACATTACCGGAAACCGTTCGGAGCCGGTTGTCATCAATTCGGAAGGCTGGGGAGAGTTTCACGTAAACGGCGGGTCGGTTTCAATTTATGTTCAAAGATAGAAGAGCAGAGAGGACGGATTTCCTGAAGGAAATCCGTTTTTTTATTTTGCCCGTCTTATAAATTTCTTTGATTACATTTTATAATTAATTTTAACAAAGTGTCATCAGCCCTCAGGAAGGACTTGCTGACAGTTTGAATCGCATAGGTAAGGCGGGGATGAAATGGCAACGTTATCTGATGTAGCAAAGAAAGCAAATGTGTCGAAAATGACGGTATCGCGGGTGATCAATCATCCTGAGACTGTGACGGATGAATTGAAAAAGCT

SEQ ID NO：6：α-淀粉酶氨基酸序列

  1 MKQQKRLYAR LLTLLFALIF LLPHSAAAAA NLNGTLMQYF EWYTPNDGQH

 51 WKRLQNDSAY LAEHGITAVW IPPAYKGTSQ ADVGYGAYDL YDLGEFHQKG

101 TVRTKYGTKG ELQSAIKSLH SRDINVYGDV VINHKGGADA TEDVTAVEVD

151 PADRNRVISG EYLIKAWTHF HFPGRGSTYS DFKWHWYHFD GTDWDESRKL

201 NRIYKFQGKA WDWEVSSENG NYDYLMYADI DYDHPDVVAE IKRWGTWYAN

251 ELQLDGFRLD AVKHIKFSFL RDWVNHVREK TGKEMFTVAE YWQNDLGALE

301 NYLNKTNFNH SVFDVPLHYQ FHAASTQGGG YDMRKLLNGT VVSKHPLKSV

351 TFVDNHDTQP GQSLESTVQT WFKPLAYAFI LTRESGYPQV FYGDMYGTKG

401 DSQREIPALK HKIEPILKAR KQYAYGAQHD YFDHHDIVGW TREGDSSVAN

451 SGLAALITDG PGGAKRMYVG RQNAGETWHD ITGNRSEPVV INSEGWGEFH

501 VNGGSVSIYV QR

Claims (30)

1.用于加工淀粉的酶混合物，其包含低pH且热稳定α-淀粉酶和地衣芽孢杆菌α-淀粉酶，其中所述低pH、热稳定α-淀粉酶的氨基酸序列是SEQID NO:2的氨基酸序列；

所述地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列是SEQ ID NO:6的氨基酸序列；

且其中所述酶混合物包含每5.0改进Wohlgemuth单位(MWU)的所述低pH、热稳定α-淀粉酶，1.0Liquefon单位(LU)的所述地衣芽孢杆菌α-淀粉酶。

2.权利要求1的酶混合物，其中每克干固体(/g DS)淀粉使用每5.0改进Wohlgemuth单位(MWU)的所述低pH、热稳定α-淀粉酶，1.0Liquefon单位(LU)的所述地衣芽孢杆菌α-淀粉酶。

3.权利要求1的酶混合物，其中至少一种α-淀粉酶是纯化的。

4.权利要求1的酶混合物，其进一步包含肌醇六磷酸酶。

5.加工淀粉的方法，其包括使权利要求1的酶混合物与淀粉接触，并液化所述淀粉来形成液化产物。

6.权利要求5的方法，其中液化所述淀粉在80℃至95℃进行。

7.权利要求5的方法，其中液化所述淀粉在pH 5.0至pH 6.0进行。

8.权利要求5的方法，其中所述液化产物在90-100分钟内具有至少10的DE值。

9.权利要求5的方法，其进一步包括糖化所述液化产物来产生糖浆。

10.权利要求9的方法，其中所述糖浆包含至少90％葡萄糖。

11.权利要求9的方法，其中所述糖浆包含少于1.5％v/v的沉淀。

12.权利要求9的方法，其中所述糖浆具有至少67g/15分钟的过滤速率。

13.权利要求9的方法，其进一步包括从所述糖浆产生高果糖糖浆。

14.权利要求13的方法，其中通过使葡萄糖异构酶与所述糖浆接触来产生所述高果糖糖浆。

15.权利要求14的方法，其中所述葡萄糖异构酶固定在固相支持物上。

16.权利要求5的方法，其中所述淀粉是谷粒的淀粉。

17.加工淀粉的方法，其包括使低pH、热稳定α-淀粉酶和地衣芽孢杆菌α-淀粉酶与淀粉接触，并液化所述淀粉来形成液化产物，其中所述低pH、热稳定α-淀粉酶的氨基酸序列是SEQ ID NO:2的氨基酸序列；

所述地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列是SEQ ID NO:6的氨基酸序列；

其中每克干固体(/g DS)淀粉使用每5.0改进Wohlgemuth单位(MWU)的所述低pH、热稳定α-淀粉酶，1.0Liquefon单位(LU)的所述地衣芽孢杆菌α-淀粉酶，且其中所述液化产物在90-100分钟内具有至少10的DE值。

18.权利要求17的方法，其中使所述低pH、热稳定α-淀粉酶与所述淀粉接触，和使所述地衣芽孢杆菌α-淀粉酶与所述淀粉接触同时或顺次发生。

19.权利要求17的方法，其中至少一种α-淀粉酶是纯化的。

20.权利要求17的方法，其进一步包括使肌醇六磷酸酶与所述淀粉接触。

21.权利要求17的方法，其中液化所述淀粉在80℃至95℃进行。

22.权利要求17的方法，其中液化所述淀粉在pH 5.0至pH 6.0进行。

23.权利要求17的方法，其进一步包括糖化所述液化产物来产生糖浆。

24.权利要求23的方法，其中所述糖浆包含至少90％葡萄糖。

25.权利要求23的方法，其中所述糖浆包含少于1.5％v/v的沉淀。

26.权利要求23的方法，其中所述糖浆具有至少67g/15分钟的过滤速率。

27.权利要求23的方法，其进一步包括从所述糖浆产生高果糖糖浆。

28.权利要求27的方法，其中通过使葡萄糖异构酶与所述糖浆接触来产生所述高果糖糖浆。

29.权利要求28的方法，其中所述葡萄糖异构酶固定在固相支持物上。

30.权利要求17的方法，其中所述淀粉是谷粒的淀粉。