JP2007532117A - αアミラーゼ変異体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】
本発明は、配列番号3に示すアミノ酸配列のR179及びG180の位置で欠失を持つ前駆体バチルス ステアロテルモフィルスαアミラーゼ変異体を提供する。本αアミラーゼ変異体は高温で安定性が向上する等の改変された機能特性を持つ。
【選択図】図7
Description
本明細書で参照された全ての特許及び刊行物は、それらの特許及び刊行物に開示された全ての配列を含み、参照により明示的に本明細書に組み入れられる。他に断らない限り、本明細書で用いる全ての技術及び科学用語は、本発明の属する分野の当業者により通常理解される意味と同じ意味を持つ(例えば、Singleton 他, Dictionary of Microbiology 及び Molecular Biology, 第2版, John Wiley and Sons, New York [1994]; 及びHale and Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY [1991]を参照。これらの双方共、当業者に本明細書で用いられる多くの用語について一般的な辞書を提供する)。本明細書に記載されている方法及び材料に類似する又は同等な方法及び材料は何れも,本発明の実施又は本発明を試験するために用いることができるが、本明細書においては、好ましい方法及び材料について記載されている。数値範囲はその範囲を規定する数値を含む。本明細書及び請求の範囲で用いられる様に、単数形の冠詞「a」、「an」及び「the」は、文意より明らかに異なる場合を除き、複数をも含む。したがって、例えば、単数形の「宿主細胞」(host cell)はその複数の場合を含む。
適当なアミラーゼのソース
αアミラーゼ前駆体はαアミラーゼを生産することの可能などの様なソースを用いても良い。αアミラーゼの適当なソースは、糸状菌、細菌、植物又は動物を含む原核生物又は真核生物である。好ましくは、αアミラーゼ前駆体はバチルス(Bacillus)に由来するのが良く、より好ましくは、バチルス リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス アミロリケファシエンス(Bacillus amylloliquefaciens)、又はバチルス ステアロテルモフィルス (Bacillus stearothermophilus)が良く、より好ましくは、αアミラーゼ前駆体はバチルス ステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、又はゲオバチルス ステアロテルモフィルス(Geobacillus stearothermophilus)(配列番号3)に由来するのが良い。
Phe178 (F178)- Iso181 (I181 )- Gly182 (G182) - Lys183 (K183)を含む。
本発明は、例えば、配列番号4のアミノ酸を持つアミラーゼの様な、前駆体バチルス(Bacillus)又はゲオバチルス(Geobacillus)αアミラーゼのR179* 及び/又はG180*に対応する欠失を導入した変異種αアミラーゼを提供する。
本発明は、本発明のαアミラーゼ変異体を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子(DNA)も提供する。本発明の更なる実施の形態においては、本発明は、本発明のαアミラーゼをコードするDNA、及びその様なDNAを含む配列ベクターを含む。ある実施の形態においては、形質転換DNAは新たに入ってくる配列を含む。例えば、ベクターに挿入される様な形質転換DNAが閉鎖環を作るように末端が閉じていても良い。ある実施の形態においては、DNA配列は配列番号1の核酸配列とa %核酸の同一性を持つ(図1)。他の実施の形態においては、DNA配列は、配列番号1の配列と少なくとも75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%核酸配列が同一である。DNA構築体は、適当な宿主細胞でそのDNAを発現させることのできる適当な制御配列に動作可能にリンクされているDNA配列を含むこともある。核酸は組み換えにより、又は例えば、インビトロでPCRにより作られる様に、合成して作ることも出来る。その様な制御配列は、転写をするプロモータ、その様な転写を制御する任意選択的オペレータ配列、適当なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の終了を制御する配列を含むこともある。DNA配列は、これらの配列を適当な発現ベクターにおいて、発現制御配列に動作可能にリンクし、及び発現ベクターを用いて周知の技術により適当な宿主を形質転換させ、発現されることもある。出願人は、例えば、バチルス(Bacillus)形質転換細胞のための好ましい発現制御配列は、宿主細胞がバチルス サブチリス (Bacillus subtilis)である場合は、バチルス サブチリス (Bacillus subtilis)に由来するaprEシグナルペプチドであることを見出した。出願人は又、宿主細胞がバチルス リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)である場合には、バチルス リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)形質転換細胞のための好ましい発現制御配列は、バチルス リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)由来のLATシグナルペプチドであることを見出した。
同様に、本発明は、宿主細胞に形質転換された発現システムに組み入れられたDNAを発現させることによりαアミラーゼ変異体を作り出す方法を含む。本発明のDNA配列を発現させるために、広範囲の種類の宿主/発現ベクターの組合せを用いることができる。多くの原核生物及び真核生物発現ベクターが市販されている。適当な発現ベクターを選択することは、当業者の通常の知識の範囲にある。ベクターはプラスミド、ファージ粒子、又は単純に遺伝子の挿入の可能なもの(potential genomic insert)であっても良い。適当な宿主細胞に転換されると、ベクターは複製し、宿主ゲノムから独立に機能し、ある場合にはゲノム自身に一体化することもある。プラスミドは現在では、最も普通に用いられるベクターの形であるため、本明細書においては、プラスミドとベクターは時には相互交換的に用いられる。しかし、本発明においては、同等な機能を持ち、且つその技術分野で知られている、又は知られるであろう他の形の発現ベクターをも含むものである。有用な発現ベクターは、例えば、この目的にとり有用な種々の知られているプラスミド、ファージの様な染色体の、非染色体の、及び合成DNA配列の部分を含む。更に、広い範囲の発現制御配列であればどの様なものでも一般にこれらのベクターとして用いられる。
バチルス種を形質転換する方法は種々知られている。事実、プラスミド構築及びプラスミドを大腸菌に形質転換するバチルス種の染色体の変換方法は良く知られている。殆どの方法において、プラスミドは結局大腸菌から分離されそしてバチルスに形質転換される。しかし、大腸菌の様な介在微小生物を用いることは本質的なことではなく、ある好ましい実施の形態においては、DNA構築体はプロトプラスト、又は適切な細胞形質転換を経て有能なバチルス宿主に直接形質転換される。本発明のαアミラーゼ変異種の発現及び精製は、その様なプロセスを実施するための良く知られた方法により実行される。
本発明のαアミラーゼ変異体は澱粉の液状化状態において、洗濯用洗剤の成分、自動皿洗い機用洗剤、塗装面清浄用製品、パン焼きを含む食品加工、湯通し剤(desize agent)を含む繊維加工、又はαアミラーゼ活性が有用である他の用途に用いることができる。
実施例1
バチルス リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)でのαアミラーゼ変異体の発現
αアミラーゼ変異体、ゲオバチルス ステアロテルモフィルス(Geobacillus stearothermophilus)αアミラーゼの変異体は、バチルス リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)において、バチルス リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)αアミラーゼ(LAT)のシグナルペプチドにより融合タンパク質として発現された(図6a 及び6bを参照)。遺伝子融合は、pCPCoriプラスミド(Enzyme BioSystems, Beloit, Wisconsin, USAから入手)から得られるαアミラーゼ変異体の成熟鎖をコードする配列をPCR増幅することにより作られ、ベクターpHPLTにクローンされた。PCR反応は、供給者の指示に従い(アニール温度55℃)High Fidelity Platinum Taq Polymerase (Invitrogen)を用いて典型的な熱サイクル器(themocycler)で30サイクルによる方法で実施された。pHPLTはLAT プロモータ (PLAT)、LATシグナル ペプチド(preLAT) をコードする配列、それに続くクローンのためのPstl及び Hpal制限部位を含む。αアミラーゼ変異体(VAA) はHigh Fidelity Platinum Taq Polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA1 USA)により、供給者の指示に従い、及び以下のプライマを用い、融合PCR(EBS2遺伝子の内部Pstl部位を除くために必要)によりPstl−Hpal断片として作られた:
αアミラーゼ活性の決定のためのアッセイ
溶解可能基質のアッセイ: 比率アッセイ(rate assay)がMegazyme (Aust.) Pty. Ltd製の評価項目キット(end-point assay kit)に基づき作られた。ガラス瓶に入った基質(p−ニトロフェニル マルトヘプタオシド(p-nitrophenyl maltoheptaoside, BPNPG7)が10mlの殺菌水に溶解され、続いて1:4のアッセイ緩衝液(50mM マレイン酸塩緩衝液, pH 6.7, 5mM 塩化カルシウム, 0.002% Tween20)により希釈された。アッセイは25℃のキュベットで、10μlのアミラーゼを790μlの基質に加えて実施された。加水分解率は410nmでの吸光度の変化率として、75秒遅れで測定された。アッセイは0.2吸光度単位/分の比率まで線形であった。
熱安定性検討の為の追加的αアミラーゼ変異体の準備及び試験
実施例1に記載のR179/G180に欠失を持つバチルス ステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)αアミラーゼ変異体が作られた。変異体の熱不活性率は以下の手順で測定される。アミラーゼ原液が20mM酢酸アンモニア、4 mM CaCl2 pH 6.5に大量に透析注入される。各サンプルは4℃で保存される。安定度を測定するために、この原液は50mM酢酸アンモニア、5mM CaCl2、0.02% Tween 20 pH 4.8に50倍以上に希釈され、最終濃度を30から50μg/mlとする。6つの100μlアリコートをエッペンドルフ試験管に入れ、83℃の温浴又は高温区画に置く。エッペンドルフ試験管は30秒から5分の一定の間隔で取り出され、不活性を停止するために氷上に置かれる。残留活性が、実施例2に記載の様に可溶性基質を用いてアッセイされる。培養時間に対する活性の自然対数がプロットされ、直線の傾きから不活性定数が得られた。結果を示す。
スラリーのDEを決定するSchrool 法 (Fehling's Assay)
試薬液
フェーリング液 A 及びB (VWR, Brisane, CA Catalogue # VW3316-2; VW3317-1 )
ヨウ化カリウム(30% w/v)溶液が、150gKIを450ml蒸留水に溶解し準備された。1.5ml 1NのNaOHが追加された。この溶液は500ml 容量測定フラスコに移され、蒸留水によって規定の水準にまで合わされた。
チオ硫酸ナトリウム(VWR, International, BrisbaneCA, Catalogue # EM-SX0810-11 ) (0.1 N)、標準化されたもの:
アッセイ手続き
ヒータが完全に、加熱準備され、50mlの水を3分で沸騰するように調整された。
平均DE進行の決定
実施例1に記載の様に生産されたαアミラーゼ[EBS2]はGenencor international (Palo Alto, CA)により提供された。380gのコーン澱粉(Archer Daniels Midland 106-B Pearl Corn Starch, Decatur, IL, USA)が1000mlの水で懸濁され、スラリーのpHは5.5pHに調整された。スラリーは澱粉を水和させるため一夜(12時間)攪拌され、pHが安定するまで6.0N H2SO4により調整された。20ppm Ca2+, 100 ppm SO2 及びαアミラーゼ変異体が2A-10 単位/グラム、又は0.28kg/MT乾燥固体量加えられ、106.5℃のジェット調理器に5分通され、冷却され、そして95℃の温浴で120分培養された。溶解された固体(DS)は、30℃でAbbe屈折計(Model 10450, American Optical Corporation - Scientific Instrument Division, Buffalo, New York, USA) を用い、Corn Refiners Association (Washington, D. C.)の Critical Data Tablesを使用して、約35dsと確認された。サンプルは30分間隔で引き出され、DEがSchrool Fehlings滴下法で測定された(実施例3aを参照)。結果を図11に示す。
スラリー粘度の進行
αアミラーゼ変異体は実施例1に記載の様に生産された。810gの挽いたコーンが、Viscoklick VK12コントローラを持つIKA EUROSTAR Labortechnik Power control - visc P7 粘度計中に水ジャケットを備えた、ガラスジャー機器内に、2リットル水の内30%の薄い残留物(thin stillage)を含む、2リットル水中に懸濁された。 スラリーのpHは6.0 Nの H2SO4でpH5.5に調整された。スラリーは室温で30分攪拌され、スラリーの温度は60℃に上げられ、そして1分1℃の割りで85℃まで上げられた。
LC/MS分析
実施例1で発現させたゲオバチルス ステアロテルモフィルス(Geobacillus stearothermophilus)αアミラーゼがLC/MSにより分析された。全ての液体のサンプルは10%TCAにより沈殿させ、続いて20mM DTT により 50℃で15-20分間還元された。アルキル化反応は又55mMヨードアセトアミドにより実施された。室温、暗室でアルキル化反応を45分行わせた。タンパク質分解は25mM重炭酸アンモニウム中で、種々のプロテアーゼを用いて37℃で4時間培養することで実施した(酵素と基質の比は1:20)。
Claims (18)
- αアミラーゼ前駆体の変異体であり、前記αアミラーゼ前駆体が配列番号3に示すアミノ酸配列を持つバチルス ステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)αアミラーゼ、配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも90%同一の配列であるαアミラーゼ、配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも90%同一の配列であるαアミラーゼ、及び配列番号4のアミノ酸配列と同一の配列であるαアミラーゼよりなる群から選択され、前記変異体がR179及びG180の一以上の位置で欠失を含む前記αアミラーゼ前駆体の変異体。
- 前記αアミラーゼ前駆体が、配列番号3に示すアミノ酸配列を持つバチルス ステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)αアミラーゼである請求項1に記載のαアミラーゼ変異体。
- 前記αアミラーゼ前駆体が、配列番号3に示すアミノ酸配列と少なくとも90%同一の配列を持つαアミラーゼである請求項1に記載のαアミラーゼ変異体。
- 前記αアミラーゼ前駆体が、配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも90%同一の配列を持つαアミラーゼである請求項1に記載のαアミラーゼ変異体。
- 前記αアミラーゼ前駆体が、配列番号4のアミノ酸配列を持つαアミラーゼである請求項1に記載のαアミラーゼ変異体。
- 配列番号16のアミノ酸配列を持つαアミラーゼ、及び配列番号16のアミノ酸配列と少なくとも97%同一の配列であるαアミラーゼよりなる群から選択されるαアミラーゼ変異体。
- 前記αアミラーゼ変異体が配列番号16のアミノ酸配列を持つ請求項6に記載のαアミラーゼ変異体。
- 前記αアミラーゼ変異体が配列番号16のアミノ酸配列と少なくとも97%同一の配列である請求項6に記載のαアミラーゼ変異体。
- 請求項1に記載のαアミラーゼ変異体をコードするDNA。
- 請求項9に記載のDNAを含む発現ベクター。
- 請求項10に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
- 前記宿主細胞がバチルス(Bacillus)種である請求項11に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞がバチルス サブチリス(Bacillus subtilis)及びバチルス リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)の群れから選択される請求項12に記載の宿主細胞。
- 請求項1に記載のαアミラーゼ変異体を含む洗浄剤組成物。
- 請求項1に記載のαアミラーゼ変異体を含む澱粉液状化組成物。
- 澱粉スラリーを請求項1に記載のαアミラーゼ変異体に接触させるステップ、前記スラリーの温度を60℃から80℃の間に上げるステップ、及びスラリーの粘度を200.0Ncm未満に維持するステップを含む澱粉液状化方法。
- 澱粉スラリーを請求項1に記載のαアミラーゼ変異体に接触させるステップ、前記スラリーの温度を85℃から100℃の間に上げるステップ、第二の液状化の開始から60分以内に平均DE進行を少なくとも8.00にするステップを含む澱粉液状化方法。
- 澱粉分解活性を持つαアミラーゼ変異体を生産する方法であり、a) 宿主細胞を請求項10に記載の発現ベクターにより安定的に形質転換し、
b) 前記宿主細胞が澱粉分解活性を持つ酵素を生産するのに適した条件の下で、形質転換された宿主細胞を培養し、及び
c) 前記αアミラーゼ変異体を回収する
ことを含む前記方法。
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