KR100322793B1 - 산화안정성알파-아밀라아제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 천연 또는 재조합형 알파 - 아밀라아제의 DNA 배열로부터 유도된 신규한 알파-아밀라아제 돌연변이종에 관한다. 일반적으로 돌연변이 알파-아밀라아제는 천연 또는 재조합형 알파 - 아밀라아제를 암호화하는 전구 DNA 배열을 체외 수식시켜 전구 알파-아밀라아제의 아미노산 배열내 하나이상의 산화가능한 아미노산 잔기들의 치환 (대체) 또는 삭제를 생성시킴으로써 얻어진다. 이러한 돌연변이 알파-아밀라아제는 전구체와 비교할때 개선된 산화안정성 및/또는 개선된 pH 성능 프로파일 및/또는 개선된 열안정성을 갖고 있다. 또한, 본 발명은 돌연변이 아밀라아제를 사용하는 방법뿐 아니라 돌연변이 아밀라아제로 구성되는 세제 및 전분액화 조성물에도 관한다.

Description

산화 안정성 알파 - 아밀라아제
관련 출원
본 출원은 1993 년 2 월 11 일자 제출된 USSN 제 08/016,395 호의 일부 계속 출원이다.
발명의 분야
본 발명은 알파 - 아밀라아제 전구체의 하나이상의 아미노산 잔기 (들), 특히 혹종의 산화가능한 아미노산 잔기가 상위한 아미노산으로 치환된 천연에서 발견되지 않는 아미노산 배열을 갖는 신규한 알파 - 아밀라아제 돌연변이종에 관한다. 본 발명의 돌연변이 효소는 개선된 산화 안정성, 개선된 pH 성능 프로파일, 개선된 특이 활성 및/또는 개선된 온도 안정성을 포함한 (그러나 이에 한정되지는 않고) 개선된 안정성/활성 프로파일을 나타낸다.
발명의 배경
알파 - 아밀라아제 (알파 - 1, 4 - 글루칸 - 4 - 글루카노하이드롤라아제, EC3.3.1.1) 는 전분의 내부 알파 - 1, 4 - 글루코사이드 결합을 상당히 랜덤하게 가수분해시켜 저분자량의 말토 - 덱스트린으로 만든다. 알파-아밀라아제는 전분가공의 개시단계 (액화) 에 ; 알콜제조에 : 세제 매트릭스내 세정제로서 : 및 전분 호발용의 직물산업에 사용되는 상업적으로 유용한 것으로 간주된다. 알파-아밀라아제는 바실러스 (Bacillus) 및 아스퍼질러스 (Aspergillus)를 포함한 다양한 미생물에 의해 만들어지며, 가장 상업적인 아밀라아제는 비. 리케니포미스 (B. licheniformis ), 비. 아밀로리퀴페이션스 ( B. amyloliquefaciens ), 비. 서브틸리스 (B. subtilis ), 또는 비. 스테아로써모필러스 (B. stearothermophilus)와 같은 미생물 자원으로부터 얻어진다. 최근의 시판용으로 바람직한 효소는 중성 및 약얄카리성 pH 에서 열 안정성 및 성능을 나타내는 비. 리케니포미스에서 얻어진 효소이다.
이전에는 아밀라아제의 촉매활성에 잔기들이 중요한 잔기 및/또는 다양한 아밀라아제의 활성부위내 어떤 아미노산의 수식(modification)이 미치는 영향을 조사하기 위하여 재조합형 DNA 기술을 이용하여 연구해왔다 [ Vihinen, M, 등 (1990) J. Bichem. 107 : 267 - 272 : Holm, L. 등 (1990) Protein Engineering 3 : 181 - 1919 : Takase, K. 등 (1992) Biochemica et Biophysica Acta, 1120 : 281 - 288 ; Mastui, I. 등(1992) Febs Letters Vol.310, No,3, pp216 - 218 ] : 어떤 잔기들은 열안정성에 중요하며 ( Suzuki, Y. 등 (1989) J. Biol, Chem, 264 : 18933 - 18938 ) : 한 연구 그룹은 기타 유사한 바실러스 아밀라아제와 비교할 때 (열적으로 안정하다고 알려진) 비. 리케니포미스 아밀라아제내 다양한 히스티딘 잔기가 치환된 것과 과량의 히스티딘을 가지고 있는 것을 근거로 하여, 상기와 같은 방법으로 비. 리케니포미스 아밀라아제의 다양한 히스티딘 위치에 돌연변이를 도입하여 히스티딘 치환이 효소의 열안정에 영향을주는 것을 제시하였다( Declerck, N. 등 (1990) J. Biol. Chem. 265 : 15481 - 15488 ; FR 2 665 178 - Al ; Joyet, P. 등 (1992)Bio/Technology 10 : 1579 - 1583 ).
알파 - 아밀라아제는 과산화수소 및 기타 산화제에 의해 본원의 실시예들에서 기술된 바와같이 pH 4 - 10.5 에서 불활성화되는 것으로 알려져 있다. 상업적으로, 알파-아밀라아제 효소는 상업적 용도에 따라 높은 pH 조건 및 낮은 pH 조건 모두와 같은 극적으로 다른 조건하에서 사용할수 있다. 예를들면, 알파-아밀리아제는 바람직하게는 낮은 pH (5.5 미만의 pH)에서 수행되는 공정인 전분의 액화에 사용할수 있을 것이다. 다른한편, 아밀라아제는 알카리성 조건으로 훨씬 많이 사용되는 표백제 또는 과산과 같은 산화제를 함유하고 시판되는 식기 세정용 또는 세탁용 세제에 사용될 수 있을 것이다.
다양한 조건하에서 아밀라아제 효소의 안정성 또는 활성 프로파일을 개선시키기 위하여 메티오닌, 트립토판, 티로신, 히스티딘 또는 시스테인과 같은 산화가능한 아미노산을 선택적으로 대체, 치환 또는 삭제시키면, 전구체와 비교할때 형질전환된 효소의 개선된 프로파일이 얻어짐을 발견하였다. 현재 시판되는 아밀라아제는 다양한 조건하에서 용인 (안정) 될수 없으므로 개선된 안정성 및/또는 활성 프로파일을 갖는 아밀라아제에 대한 필요성이 있어왔다. 야생형 또는 전구체 효소와 비교할때 적당한 효소적 활성을 유지하면서 상기와 같은 개선된 안정성 (산화력, 열 또는 pH 성능 프로파일)이 얻어질 수 있다. 상기 돌연변이 유전자를 도입시킴으로써 얻게된 특징은 열안정성을 유지하면서 산화 안정성을 변화시킬수 있으며 그 역도 립될 것이다. 부가적으로, 알파-아밀라아제 전구체 배열내 산화가능한 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나 하나이상의 산화가능한 아미노산 (들) 을 삭제시키면 전구 알파 - 아밀라아제에 최적이라 사료되어지는 pH 이외에서도 효소적 활성이 개선될 것이다. 즉, 본 발명의 돌연변이중 효소는 또한 pH 성능 프로파일이 개선되는데 이는 효소의 향상된 산화안정성에 기인하는 것일 것이다.
발명의 개요
본 발명은 하나이상의 산화가능한 아미노산을 삭제 또는 치환 (대체)시켜 전구 알파 -아밀라아제에서 유도되고, 알파 -아밀라아제를 암호화하는 돌연변이된 DNA 배열의 발현 생성물인 신규한 알파-아밀라아제 돌연변이종에 관한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서 돌연변이는 전구 알파-아밀라아제내 하나이상의 메티오닌 잔기(들)을 다른 아미노산으로 치환시켜 일어난다. 본 발명의 다른 구체예에서 돌연변이종은 전구 알파 -아밀라아제내 하나이상의 트립토판 잔기의 단독 치환 또는 하나이상의 메티오닌 잔기의 치환과 조합하여 구성된다. 일반적으로 이러한 돌연변이종 알파 -아밀라아제는 전구 아미노산 배열내 하나이상의 아미노산 잔기의 치환 또는 삭제를 암호화하기 위하여 천연 또는 재조합형 알파 - 아밀라아제를 암호화하는 전구 DNA 배열을 시험관내(in vitro)에서 수식시켜 얻는다.
바람직하게는 아미노산 배열내 하나이상의 아미노산의 치환 또는 삭제는 상기 배열내 하나이상의 메티오닌, 트립토판, 시스테인, 히스티딘 또는 티로신 잔기들의 치환 또는 삭제에 기인하고, 가장 바람직하게는 변하는 잔기는 메티오닌 잔기이다. 산화가능한 아미노산 잔기들은 기타 20개의 천연 아미노산중 어느 하나로 대체된다. 목적하는 효과가 전구체의 산화 안정성을 개선시키는 것이라면, 아미노산 잔기는 산화되지 않는 아미노산 (알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파트산, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 이소류신, 류신, 라이신, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 또는 발린과 같은)또는 다른 산화가능한 아미노산 (시스테인, 메티오닌, 트립토판, 티로신 또는 히스티딘과 같은 아미노산 : 가장 쉽게 산화되는 것부터 순서대로 열거함) 으로 치환시켜야 할 것이다. 이와 유사하게, 목적하는 효과가 열안정성을 개선시키는 것이라면, 기타 20개의 천연 아미노산중 어느 하나로 치환시켜야 할 것이다(즉, 메타오닌 대신 시스테인을 치환시킬 것이다).
바람직한 돌연변이 유전자는 비. 리케니포미스 알파-아밀라아제내에서 발견되는 (+8, +15, +197, +256, +304, +366 및 +438) 혹종의 메티오닌 잔기와 등가의 메티오닌 잔기의 치환체로 구성된다. 가장 바람직하게는 치환되는 메티오닌은 비. 리케니포미스 알파-아밀라아제내 +197 또는 +15 위치와 등가 위치의 메티오닌이다. +197 위치에 메티오닌을 치환시킬 바람직한 치환체 아미노산은 알라닌 (A), 이소류신(I), 트레오닌 (T)또는 시스테인 (C)이다. +15 위치의 바람직한 치환체 아미노산은 류신 (L), 트레오닌 (T), 아스파라긴 (N), 아스파테이트 (D), 세린 (S), 발린 (V) 및. 이소류신 (I) 이며 기술되지 않은 다른 치환체 아미노산들 역시 유용할 것이다. 본 발명의 두개의 특히 바람직한 돌연변이 유전자는 M197T 및 M15L 이다.
본 발명의 다른 구체예는 비. 리케니포미스 알파-아밀라아제에서 발견되는 혹중의 트립토판 잔기와 등가의 트립토판 잔기의 치환체로 구성되는 돌연변이 유전자에 관한다 (제 2 도 참조 하시오). 바람직하게는 치환될 트립토판은 비. 리케니포미스 알파 - 아밀라아제내 +138 과 등가위치에 있다. 트립토판 잔기에서의 돌연변이중 (치환)은 다른 산화가능한 아미노산 잔기들에서의 돌연변이 유전자와 결합되어 또는 단독으로 일어날 것이다. 특히, 최소한 하나의 메티오닌과 조합하여 최소한 하나의 트립토판에서의 치환에 의해 형질전환시키는 것이 유리하다(예를들면, 이중 돌연변이 유전자 +138/+l97).
본 발명의 알파-아밀라아제 돌연변이종은 일반적으로 과산화수소 및, 표백제 또는 과산과 같은 다른 산화제, 또는 더 구체적으로 클로라민 - T와 같은 더 온화한 산화제의 존재하에 개선된 산화 안정성을 나타낸다. 산화 안정성이 향상된 돌연변이종 효소는 세제 제품에 사용된 아밀라아제는 표백제, 과붕산화물, 과탄산화물 또는 과산과의 상용성 및 저장수명을 증대시키는데 유용할 것이다. 유사하게는, 감소된 산화안정성은 효소활성을 신속하고 효율적으로 소멸시키는것이 요구되는 산업 공정에 유용할 것이다. 본 발명의 돌연변이중 효소는 또한 pH 성능 프로파일이 증대되었음을 예증하는데 이로써 M15L 과 같은 돌연변이는 낮은 pH의 전분액화에 대하여 안정성을 나타내며 M197T와 같은 돌연변이는 높은 pH의 세제 제품조건에서 안정성을 나타냄을 알 수 있다. 본 발명의 돌연변이종은 또한 개선된 열적 안정성을 가질수 있으며 이로써 돌연변이종은 고온 또는 저온에서 향상된 안정성을 나타낼 것이다. 전구체와 비교할때 돌연변이종의 효소적 특성(들) 내에 어떠한 변화 (증대되든 감소되든) 가 일어나더라도 돌연변이종 알파 - 아밀라아제의 목적하는 최종 용도에 따라 유용할 것이라고 사료되어 진다.
전분 가공 및 세정 용도외에, 본 발명의 변종 아밀라아제는 공지된 아밀라아제가 사용되는 어떠한 용도에도 사용가능하며, 예를들면 변종 아밀라아제는 직물가공, 식품가공등에 사용할수 있다. 구체적으로, 산화에 의해 쉽게 불활성화되는M197C와 같은 변종 효소는 예를들면 냉동 식품가공 용도에서와 같은 공정의 말기에 아밀라아제 활성을 완전히 제거시키고자할 경우의 공정에 유용할 것이다.
본 발명의 바람직한 알파-아밀라아제 돌연변이종은 비. 리케니포미스, 비. 아밀로리퀴페이션스, 및 비. 스테아로써모필러스와 같은 바실러스 변종에서 유도되고 가장 바람직하게는 바실러스 리케니포미스에서 얻은 것이다.
본 발명의 다른 양상에서는 비. 리케니포미스에의해 통상적으로 생성되는 알파 - 아밀라아제의 신규 형태를 제공한다. A4 형이라 명명된 상기 신규 형태는 분비되는 아밀라아제의 N -종결부위에 부가적인 4개의 알라닌 잔기를 갖는다 (제 4b 도). A4형의 돌연변이종 또는 유도체란 본 발명이 예를들면 하나이상의 산화가능한 아미노산 (들) 의 돌연변이 유전자 (치환, 대체 또는 삭제) 와 같은 하나이상의 부가적인 돌연변이종들을 함유하는 A4 형 알파 - 아밀라아제로 구성됨을 의미한다.
본 발명의 조성물 구체예에서, 본원의 알파 -아밀라아제로 구성되는 세제 조성물, 액체, 겔 또는 과립을 제공한다. 특히 바람직하기로는 엔도글리코시다제 셀룰라아제, 프로테아제, 리파아제 또는 기타 아밀라아제 효소와 같은 다른 효소와 결합되거나 또는 단독의 +197위치의 돌연변이종으로 구성되는 세제 조성물이다. 부가적으로, 본 발명의 조성물은 하나이상의 부위 -지향적 돌연변이종을 갖는 알파 - 아밀라아제 돌연변이종을 포함할 것임을 주지해야 할 것이다.
본 발명의 또다른 조성물 구체예에서 본 발명은 전분 가공, 특히 전분의 액화에 유용한 조성물을 제공한다. 본 발명의 전분 액화 조성물은 바람직하게는 M15 위치에서 치환 또는 삭제가 일어난 알파 - 아밀라아제 돌연변이종으로 구성된다.부가적으로, 이러한 조성물은 예를들면 산화제, 칼슘, 이온등을 포함한 당업자에 공지된 부가적 성분들을 포함할 수 있을 것임을 주지해야 할것이다.
본 발명의 공정면에서, 본 발명은 전분, 특히 습식 또는 건식 분쇄공정으로부터 얻어진 과립 전분 슬러리를 액화시키는 방법을 제공한다. 일반적으로, 전분 분해 공정의 제 1 단계에서 전분 슬러리를 비교적 고온(최대 약 110℃)에서 가열시켜 젤라틴화시킨다. 전분 슬러리를 젤라틴시킨후 알파-아밀라아제를 사용하여 액화시키고 덱스트린화시킨다. 이러한 액화 조건은 본원에 참고용으로 합체된 공동 양도된 미합중국 특허출원 제 07/785,624호 및 제 07/785,623호 및 미합중국 특허 제 5,180,669 호에 기술되어 있다. 전분을 액화시키는 본 발명 방법은 전분 슬러리에 단독 또는 산화제와 같이 부가적인 부형제와 결합하여 본 발명의 알파-아밀라아제를 유효량 가하는 단계, 및 적당한 시간동안 및 온도에서 슬러리를 반응시켜 전분을 액화시키는 단계로 구성된다.
본 발명의 또다른 양상은 본 발명의 돌연변이종 알파 -아밀라아제 (A4 형 및 이의 돌연변이종을 포함하여)를 암호화하는 DNA를 암호화하는 발현 벡터 및 이러한 발현 벡터에 의해 형질변환된 숙주세포로 구성된다.
도면의 간단한 설명
제 1 도는 비. 리케니포미스 (NCIB8061)에서 얻은 알파-아밀라아제에 대한 유전자의 DNA배열 (배열식별번호 31)및 Gray, G. 등 (1986) J. Bacter, 166 : 635 - 643 에 기술된 추론된 번역 생성물을 나타낸다.
제 2 도는 비. 리케니포미스 (NCIB8061) 에서 얻은 성숙 알파 -아밀라아제효소의 아미노산 배열 (배열식별번호 32) 을 나타낸다.
제 3 도는 바실러스 알파-아밀라아제의 일차 구조 배열을 보여준다. 비. 리케니포미스 아밀라아제 ( Am - Lich ) (배열식별번호 33) 는 Gray, G. 등이 (1986) J. Bact. 166 : 635 - 643 에서 기술하고 있다 : 비. 아밀로리퀘페이션스 아밀라아제(Am - Amylo) (배열식별번호 34) 는 Takkinen, K 등이 (1983) J. Biol. Chem, 258 : 1007 - 1013 에서 기술하고 있다 ; 비. 스테아로써모필러스 (Am - Stearo) (배열식별번호 35)는 Ihara, H. 등이 (1985) J. Biochem. 98 : 95 - 103 에서 기술하고 있다.
제 4a 도는 성숙 알파 - 아밀라아제 변종 M197T 의 아미노산 배열 (배열식별번호 36) 을 나타낸다.
제 4b 도는 비. 리케니포미스 NCIB8061에서 얻은 A4 형 알파-아밀라아제의 아미노산 배열 (배열식별번호 37) 을 나타낸다. N - 종결부위에서 번호를 매기는데 4 개의 부가 알라닌에서 시작한다.
제 5 도는 플라스미드 pA4BL을 나타내며 BLAA는 비. 리케니포미스 알파 - 아밀라아제 유전자, PstI - SstI를 의미하고 : AmpR은 pBR322에서 얻은 항-암피실린 유전자를 뜻하며 ; CAT는 pC194 에서 얻은 항 - 클로르암페니콜 유전자를 나타낸다.
제 6 도는 pA4BL내 비. 리케니포미스 (배열식별번호 40), 비. 서브틸리스 (배열식별번호 39), 비. 리케니포미스 (배열식별번호 38) 및 pBLapr in 비. 리케니포미스(배열식별번호 41) 에 대한 시그널 배열 - 성숙 단백질 접합점을 나타낸다.
제 7a 도는 pH 5.0, 25℃에서 0.88 M 의 H2O2로 특종의 알파-아밀라아제 (Spezyme AA20 및 M197L (A4 형)) 를 불활성시키는 방법을 나타낸다.
제 7b 도는 pH 10.0, 25℃에서 0.88M의 H2O2로 혹종의 알파-아밀라아제 (Spezyme AA20 및 M197T) 를 불활성시키는 방법을 보여준다.
제 7c 도는 pH 5.0, 25℃ 에서 0.88M의 H2O2로 특종의 알파-아밀라아제(Spezyme AA20, M15L) 를 불활성시키는 방법을 나타낸다.
제 8 도는 M197X 카세트 돌연변이 유전자의 생성을 보여주는 도식을 나타낸다.
제 9 도는 M197X 변종의 발현을 보여준다.
제 10 도는 5 분동안 95℃ 에서 5mM의 CaCl2pH 5.0 에서 M197X 변종의 열안정성을 나타낸다.
제 11a 도 및 제 11b 도는 자동 식기 세정용 세제내에서 혹종의 아밀라아제를 불활성시키는 방법을 나타낸다. 제 11a 도는 전분의 존재 또는 부재하에 65℃ 에서 CascadeTM(시판되는 식기 세정제)내 혹종의 아밀라아제의 안정성을 보여준다. 제 11b 도는 전분의 존재 또는 부재하에 65℃ 에서 SumlightTM(시판되는 식기 세정제) 내 혹종의 아밀라아제의 안정성을 보여준다.
제 12 도는 M15X 카세트 돌연변이 유전자의 생성을 보여주는 도식이다.
제 13 도는 M15X 변종의 발현을 나타낸다.
제 14 도는 가용성 전분상의 M15X 변종의 특이 활성을 나타낸다.
제 15 도는 90℃, pH 5.0, 5 mM의 CaCl2, 5분동안 M15X변종의 열안정성을 나타낸다.
제 16 도는 전분 및 가용성 기질상에서의 특이활성, 및 비. 리케니포미스 야생형의 활성 (%) 의 함수로서 pH 5.5, 젯 액화에서의 M15 변종의 성능을 보여준다.
제 17 도는 변종 M197A (1.7 mg/ml)및 M197L (1.7 mg/ml)에 비하여 pH 8.0에서 클로라인 - T 로 비. 리케니포미스 알파 - 아밀라아제 (0.65 mg/ml 에서 AA20) 를 불활성시키는 방법을 나타낸다.
제 18 도는 변종 M197A (4.3 mg/ml) 및 M197L (0.53 mg/ml) 에 비하여 pH 4.0 에서 클로라민 - T 로 비. 리케니포미스 알파-아밀라아제 (0.22 mg/ml 에서 AA20)를 불활성시키는 방법을 나타낸다.
제 19 도는 이중변종 M197T/W138F (0.64 mg/ml) 및 M197T/W138Y (0.60 mg/ml) 에 비하여 pH 5.0 에서 클로라민 - T 와 비. 리케니포미스 알파 - 아밀라아제 (0.75 mg/ml에서 AA20) 의 반응을 보여준다.
발명의 상세한 설명
전분액화에 사용되는 아밀라아제는 전분 슬러리내에 일부 활성이 존재하여 어떠한 형태의 불활성화가 일어난다(본원의 참고자료로 합체된 공동 소유의 미합중국 특허출원 제 07/785,624 호 및 07/785,623 호와 1993 년 1 월 19 일 공고된 미합중국 특허 제 5,180,669호를 참고하시오). 표백제 또는 과산함유 세제내에서와 같은 산화제의 존재하에 아밀라아제를 사용하면 아밀라아제가 부분적으로 또는 완전히 불활성될 것이다. 따라서, 본 발명은 아밀라아제의 산화 감수성 변화에 집중하고 있다. 본 발명의 돌연변이종 효소는 또한 낮거나 높은 pH에서 향상된 효소의 산화안정성에 기인하여 pH프로파일 및/또는 열안정성이 개선되게 될 것이다.
본원에 사용된 알파 - 아밀라아제는 천연 아밀라아제 및 재조합형 아밀라아제를 포함한다. 본 발명에서 바람직한 아밀라아제는 전기한 비. 리케니포미스에서 유도된 A4 형 알파 - 아밀라아제를 포함한 리케니포미스 또한 비. 스테아로써모필러스에서 유도된 알파-아밀라아제 및 아스퍼길러스 (Aspergillus ) 에서 유도된 균류 알파 - 아밀라아제 (즉, 에이. 오리자 (A. oryzae ) 및 에이. 니거 (A. niger)로서) 이다.
재조합형 알파-아밀라아제란 천연 알파-아밀라아제를 암호화하는 DNA 배열이 수식되어 알파-아밀라아제 배열내 하나이상의 아미노산의 치환, 삽입 또는 삭제를 암호화하는 돌연변이 유전자 DNA 배열을 생성시키는 알파 - 아밀라아제를 뜻한다. 적당한 수식방법에 대하여는 본원의 참고용으로 합체된 공동소유의 미합중국 특허 제 4,760,025 및 제 5,185,258 호에 기술되어 있다.
식물, 포유류 및 세균에 걸쳐, 지금까지 배열된 거의 모든 엔도-아밀라아제 사이에서 상동성을 발견할수 있었다 ( Nakajima, R.T. 등 (1986) Appl. Microbiol. Biotechnol, 23 : 355 - 360 : Rogers, J.C. (1985) Biochem. Biophys. Res. Commun 128 : 410 - 476 ). 혹종의 바실러스 아밀라아제내에서 특히 높은 상동성을 지닌 4개의 영역이 있으며, 제 3도에 도시된 바와같이 밑줄그은 부분이 고 상동성 영역을 나타낸다. 더우기, 배열 얼라인먼트는 바실러스 엔도-아밀라아제들간의 관계를 매핑하는데 사용되어 왔다( Feng, D. F. 및 Doolittle, R. F. (1987) J. Molec. Evel 35 : 351 - 360 ), 비. 스테아로써모필러스 및 비. 리케니포미스 아밀라아제간의 상대적인 배열 상동성은 Holm, L, 등 (1990) [ Protein Engineering 3 (3) pp 181 - 191] 이 측정한 바와같이, 비. 스테아로써모필러스 및 비. 리케니포미스 아밀라아제간의 배열 상동성은 약 66% 이다. 상기 H01m, L.등에 따르면 비. 리케니포미스 및 비. 아밀로리퀴페이션스 아밀라아제간의 배열 상동성은 약 81% 이다. 배열 상동성이 중요하긴 하지만, 아밀라아제 또는 다른 효소들을 비교함에 있어 구조적 상동성 또한 중요하다는 것을 일반적으로 인지하여야 한다. 예를들면, 균류 아밀라아제와 세균성 (바실러스) 아밀라아제간의 구조적 상동성이 제안되어왔으며 따라서 균류 아밀라아제는 본 발명 영역에 포함된다.
알파 - 아밀라아제 돌연변이종은 전구 알파-아밀라아제의 아미노산 배열에서 유도된 아미노산 배열을 갖는다. 전구 알파-아밀라아제는 천연 알파-아밀라아제 및 재조합형 알파-아밀라아제 (정의한 바와같이 )를 포함한다. 알파-아밀라아제 돌연변이 유전자의 아미노산 배열은 하나이상의 전구 아미노산 배열을 치환, 삭제 또는 삽입시킴으로써 전구 알파-아밀라아제로부터 유도된다. 이러한 수식은 본질적으로 전구 알파 - 아밀라아제의 조작이라기보다 전구 알파 - 아밀라아제의 아미노산 배열을 암호화하는 전구 DNA 배열의 수식이다. 전구 DNA 배열의 상기 조작에 적당한 방법은 공유 미합중국 특허 제 4,760,025호 및 제 5,185,258호 및 본원에 기술된 방법들을 포함한다.
바실러스 리케니포미스 알파 - 아밀라아제의 M 197, M 15 및 W 138 위치에해당하는 특이 잔기는 본원에서 모든 메티오닌, 히스티딘, 트립토판, 시스테인 및 티로신 위치에서와 같이 치환 또는 삭제용으로 동정되어진다. 아미노산의 위치번호( 즉, +107 ) 는 제 2도에 도시된 성숙 바실러스 리케니포미스 알파 - 아밀라아제에 할당된 번호를 일컫는다. 그러나, 본 발명은 이러한 특정의 성숙 알파-아밀라아제 ( 비. 리케니포미스 )의 돌연변이에 한정되지않고 비. 리케니포미스 알파 - 아밀라아제내 특정의 동정된 잔기와 등가의 위치에 존재하는 아미노산 잔기를 함유하는 전구 알파-아밀라아제까지 포함한다. 특이 잔기 또는 비. 리케니포미스 알파-아밀라아제 내 특정잔기의 일부와 상동(즉, 1 차 또는 3 차 구조내 위치에 해당하는 )또는 상사(즉, 화학적 또는 구조적으로 결합, 반응 또는 상호 작용하는 동일 또는 유사한 관능량을 갖는 ) 일 경우에 전구 알파 - 아밀라아제의 잔기 (아미노산 ) 는 비. 리케니포미스 알파 - 아밀라아제의 잔기와 동일하다.
1 차 구조와 상동을 이루기위하여, 전구 알파 - 아밀라아제의 아미노산 배열을 직접적으로 비. 리케니포미스 알파 - 아밀라아제 1 차 배열과, 특히 제 3도에 나타낸바와같이 배열이 공지된 모든 알파-아밀라아제에 대하여 불변하다고 알려진 일련의 잔기들과 비교한다. 3차 구조에의해 등가의 잔기들을 측정할 수 있다 : 결정구조에 의해 돼지 췌장의 알파-아밀라아제 ( Buisson, G.등(1987) EMBO J. 6 = 3909 - 3916 ) ; 아스퍼길러스 오리자 (Aspergillus oryzae) 에서 얻은 타카 - 아밀라아제 에이 ( Ma 3uura, Y등 (1984) J, Biochem. ( Tokyo ) 95 : 697 - 702 ) ; 및 에이. 니거 ( A. niger ) 에서 얻은 산 알파 -아밀라아제 ( Boel, E. 등 (1990) Biochemistry 29 : 6244 - 6249 ) 가 보고 되었으며 앞의 두 구조는 유사하다. 글루카나아제 및 ( MacGregor, E. A. ＆ Svensson, B. (1989) Biochem. J. 259 : 145 - 152 ) 타카-아밀라아제 에이의 구조에 모델링한 비. 스테아로써모필러스 효소에 대한 구조간 공통적인 슈퍼-2차-구조가 예상되기는 하지만( Holm, L. 등 (1990) Protein Engineering 3 : 181 - 191 ), 바실러스 알파 -아밀라아제에 대한 구조는 밝혀지지 않았다. 제 3 도에 도시된 4 개의 고도로 보존된 영역은 리케니포미스 번호매기기로 His 105 : Arg 229 : Asp 231 : His 235 : Glu 261 및 Asp 328 을 포함하여, 활성부위의 일부라 사료되는 많은 잔기들을 함유한다. ( Matsuura, Y. 등 (1984) J. Biochem. (Tokyo) 95 : 697-702 : Buisson, G.등. (1987) EMBO J. 6 3909 -3916 Vihinen, M. 등 (1990) J. Biochem. 107 : 267 - 272 )
본원에 사용된 발현 벡터는 적당한 숙주내에서 DNA를 발현시킬수 있는 적당한 조절 배열과 조종가능하게 결합된 DNA 배열을 함유하는 DNA 구성체를 뜻한다. 상기의 조절 배열은 전사를 수행하는 촉진 유전자, 이러한 전사를 조절하는 임의의 작동 유전자 배열, 적당한 mRNA 리보좀 - 결합부위를 암호화하는 배열, 및 전사 및 번역의 종결을 조절하는 배열을 포함할 것이다. 바람직한 촉진 유전자는 비. 서브틸리스 aprE 촉진유전자이다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 단순히 잠재적인 게놈 삽입물일 것이다. 일단 적당한 숙주로 형질 전환되면 벡터는 복제되고 숙주 게놈과 별도로 작용하거나, 또는 몇몇 경우에 게놈 그 자체로 집적될 것이다. 본 명세서에서, 플라스미드가 본원에서 벡터의 가장 범용되는 형태인 것과 같이 플라스미드 및 벡터는 때때로 같은 의미로 사용된다. 그러나, 본 발명은 등가의 작용을 하고 또 업계에 공지된 다른 형태의 발현 벡터도 포함하고 있다.
본 발명에 유용한 숙주 종 ( 또는 세포 )은 일반적으로 원핵생물 또는 진 생물 숙주이고 알파 - 아밀라아제가 발현될 수 있는 혹종의 형질 전환가능한 미생물을 포함한다. 구체적으로, 바실러스 균주과 같이, 동종 또는 알파-아밀라아제가 유도되는 유전자의 숙주 균주이 적당하다. 바람직하게는 알파-아밀라아제 음성 바실러스 숙주 ( 유전자가 삭제된 ) 및/또는 바실러스 서브틸리스 균주 BG 2473( △amyE, △apr, △npr )과 같은 알파-아밀라아제 및 프로테아제가 제거된 바실러스 균주를 사용한다. 숙주 세포는 재조합형 DNA 기술을 이용하여 구축된 벡터로써 형질전환되거나 트랜스펙션된다. 이러한 형질전환된 숙주 세포는 알파 아밀라아제 또는 이의 변종 ( 돌연변이종 ) 을 암호화하는 벡터를 복제하거나 또는 목적하는 알파 - 아밀라아제를 발현시킬 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 돌연변이종은 발효시 배양 배지로 분비된다. aprE 시그널 펩타이드와 같은 혹종의 적당한 시그널 배열을 사용하여 분비시킬 수 있다.
본 발명의 많은 알파-아밀라아제 돌연변이종은 다양한 세제 조성물, 특히 혹종의 식기 세정 조성물, 특별히 공지된 산화제를 함유하는 세정 조성물 조제에 유용하다. 본 발명의 알파-아밀라아제 돌연변이종은 pH 6.5 - 12.0 의 공지된 분말형, 액체 또는 겔형 세제로 제조될 수 있다. 적당한 과립형 조성물은 본원에 참고용으로 합체된 공유 미합중국 특허출원 제 07/429,881 호, 제 07/533,721 호 및; 제07/957,973호에 기술된 바와같이 제조될 수 있을 것이다. 이러한 세제 세정 조성물은 또한 공지된 프로테아제, 리파아제, 셀룰라아제, 엔도글리코시다아제 또는 다른 아밀라아제와 같은 기타의 효소, 증진재, 안정화제, 또는 업계의 당업자들에게공지된 기타의 부형제를 함유할 수 있다. 상기 효소는 공-과립으로 또는 배합된 혼합물로 또는 업계에 공지된 특종의 기타 방식으로 존재할 수 있다. 더우기, 다중 돌연변이종이 세정 또는 기타 용도에 유용할 수 있음을 본 발명에 의해 예견할 수 있다. 예를들면, +15 및 +197 위치에서 변이가 있는 돌연변이 종 효소는 세정 제품에 유용한 개선된 성능을 나타내거나 또는 +197 및 +138 위치의 변이를 포함하는 다중 돌연변이종은 향상된 성능을 나타낼 것이다.
전기한 바와같이, 본 발명의 알파-아밀라아제는 또한 전분의 액화에 유용한 것이다. 전분 액화, 구체적으로 과립 전분 슬러리 액화는 일반적으로 중성에 가까운 pH 및 고온에서 수행된다. 공유 미합중국 출원 제 07/788,624 호 및 제 07/785,623호 및 미합중국 특허 제 5,180,669 호에서 기술한 바와같이, 또한 몇 종류의 산화제 또는 불활성화제가 일반적인 액화 공정에 존재하는데 이는 효소활성에 영향을 미치는 것이 명백하므로 상기 관련 특허 출원에서는 산화방지제를 공정에 가하여 효소를 보호한다.
바람직한 액화공정의 조건 (즉, 저 pH, 고온 및 잠재적인 산화조건 )에 기준하여, 공유 미합중국 출원 제 07/788,624호 및 제 07/785,623호 및 미합중국 특허 제 5,180,669호에서 기술된 바와같이, 액화 공정용으로 사용되는 본 발명의 바람직한 돌연변이종은 개선된 pH성능 프로파일 (즉, 낮은 pH 프로파일, 6 미만의, 바람직하게는 5.5 미만의 pH ) 및/또는 개선된 열안정성 ( 즉, 고온, 약 90 - 110℃ ), 및/또는 개선된 산화 안정성 ( 즉, 향상된 산화 안정성 ) 을 나타내는 돌연변이종들로 구성된다.
따라서, 본 발명에 의해 제공되는 전분을 액화시키는 개선된 방법은 유효량의 본 발명의 알파 - 아밀라아제 돌연변이종을 약 4 - 6 의 pH 에서 습식 또는 건식 분쇄공정에서 얻은 과립형 전분 슬러리에 가하는 단계 ; 임의로 유효량의 산화제 또는 기타 부형제를 상기 슬러리에 가하는 단계 ; 및 적당한 시간동안 적당한 온도에서 슬러리를 반응시켜 전분을 액화시키는 단계로 구성된다.
다음에 주어진 실시예는 본원 특허청구의 범위를 제한하려는 의도로 기재된 것은 아니며, 본원에 사용된 약어, 특히 아미노산에 대한 세글자 또는 한글자로 나타낸 표기는 Dale, J. W., Molecular Genetics of Bacteria, John Wiley ＆ Sons, (1989) Appendix B 에 기술된 것이다.
실 시 예 1
비. 리케니포미스 알파 - 아밀라아제내 메티오닌 잔기 치환
스코틀랜드, 애버딘에 소재하는 National Collection of Industrial Bacteria 에서 얻은 비. 리케니포미스 NCIB 8061 로부터 알파-아밀라아제 유전자 (제 1 도)를 클론하였다 ( Gray, G.등 (1986)의 J. Bacterilolgy 166 : 635 - 643 ) 단일 배열의 마지막 3 개의 잔기를 암호화하는 1.72 kb Pstl - SstI 단편 (완전히 성숙 단백질 및 종결 암호부위 ) 을 M13MP18로 서브클론시켰다. 비. 아밀로리퀴페이션스 서브틸리스 전사 종결 암호를 함유하도록 고안된 하기 형태의 올리고누클레오타이드 카세트 [ Wells 등 (1983) Nucleic Acid Research 11 : 7911 - 7925 ]를 사용하여 BclI 및 SstI 부위 사이에 합성 종결암호를 가하였다.
실질적으로 Zoller, M. 등 (1983) Meth. Enzymol, 100 : 68 - 500 의 지침서를 이용하여 올리고누클레오타이드에 의한 부위 -지향적 돌연변이를 유발시켰다 : 요약하자면, 비. 리케니포미스 알파-아밀라아제에 발견되는 7개의 각각의 메티오닌 대신에 치환시키기 위하여 표 1 에 나타낸 올리고누클레오타이드, 5'- 포스포릴화한 올리고누클레오타이드 프라이머를 사용하여 M13 - 일본쇄 DNA 주형상에 목적하는 돌연변이 유전자를 도입시켰다. 각각의 돌연변이유발 올리고뉴클레오타이드는 돌연변이가 연결된 것을 스크리닝하기 위한 제한 엔도뉴클리아제 위치를 역시 도입한다.
표 1
굵은 글씨는 올리고누클레오타이드에 의해 도입된 염기 변화를 나타낸다.
메티오닌 (M)이 +8 위치에서 알라닌 (A)으로 변했을 경우, 코돈 변화는 M8A 형태로 나타내었다.
밑줄은 올리고누클레오타이드에 의해 도입된 제한 엔도누클레아제 부위를 나타낸다.
헤테로 이중사슬을 사용하여 이. 콜라이 ( E. coli ) mutL 세포들 ( Kramer 등. (1984) Cell 38 : 897 ) 을 트랜스픽션시키고, 플라크 정제후 RF1 의 제한 분석법으로 클론을 분석하였다. 디데옥시서열 ( Samger등(1977) Proc, Natl. Acad. Sci. U.S.A, 74 : 5463 - 5467 ) 및 이, 콜리 벡터 플라스미드 pA4BL로 서브클론된 각각에 대한 PstI - SstI 단편에 의해 양성임을 확인하였다.
플라스미드 pA4BL
본 발명에 참고자료로 합체된 미합중국 출원 제 860,468 호 ( Power 등 ) 에기술된 방법에 따르면, 활동하지않는 PstI 부위를 pS168 - 1 ( Stahl, M, L. 및 Ferrari, E. (1984) J. Bacter. 158 : 411 - 418 ) 에서 얻은 aprE 유전자의 코돈 +1 첫번째 아미노산 다음의 시그널 분리 부위 )에 도입시켰다. 그다음 aprE 촉진 유전자 및 시그널 펩타이드 영역을 Hind III - PstI 단편으로서 pJH101 플라스미드 (Rerrari, F A. 등(1983) J. Bacter. 154 : 1513 - 1515 )로부터 클론되어 pUC18 - 유도된 플라스미드 JM102 ( Ferrari, E. 및 Hoch, J. A (1989) Bacilus, ed. C. R. Harwood, Plenum Pub., ppo 57 - 72 ) 로 서브클론시켰다. 비. 리케니포미스 알파 - 아밀라아제에서 얻은 PstI - SstI 를 가하면 제 6도에 나타낸 바와같이 aprE 시그널 펩타이드-아밀라아제 접합점이 결과되는 pA4BL (제5도)이 얻어진다.
비. 서브틸리스로의 형질 변환
pA4BL은 이. 콜리내에서 복제가능하고 비. 서브틸리스 염색체로 삽입 가능한 플라스미드이다. 다른 변종들을 함유한 플라스미드는 비. 서브틸리스로 형질 변환되고 ( Anagnostopoulos, C. 및 Spizizen. J. ( 19617 J. Bacter. 81 : 741 - 746 ) Campbell - 형 메카니즘 ( Young, M (1984) J. Gen. Microbiol. 130 : 1613 - 1621 ) 에 의해 aprE 유전자위치에서 염색체로 삽입된다. 바실러스 서브틸리스 사슬 BG2473은 아밀라아제 ( △amyE ) 및 두개의 프로테아제 ( △apr, △npr )가 삭제된 I168의 유도체 였다 (본원의 참고용으로 합체된 Stahl, M. L, 및 Ferrari, E,, J. Bactem. 158 : 411 - 418 및 미합중국 특허 제 5,264,366호 ). sacU32 (Hy) ( Henner, D. J.등 (1988) J. Bacter. 170 : 296 - 300 )로 형질 변환시킨후, 돌연변이 유전자를 PBS - 1 매개된 형질도입에 의해 도입시켰다 ( Hoch, J. A. (1983)154 : 1513 - 1515 )
비. 서브틸릭스 내 pA4BL에서 발현된 아밀라아제의 N - 종결부위를 분석하면 이는 분비된 아밀라아제 단백질 ( A4 형 )의 N -종결부위에서 4개이상의 알라닌을 갖도록 처리된 것으로 나타난다. 이러한 여분의 잔기는 A4 형의 열안정성 활성에 중요하고 유해한 영향을 미치지 않고 몇몇 용도에서는 성능을 개선시켜 줄 것이다. 계속되는 실험에서 정확하게 프로세싱된 형태의 리케니포미스 아밀라아제 및 변종 M197을 매우 유사한 구조로부터 제조되어졌다 ( 제 6도 참조 ) 구체적으로, A4 구조의 5' 말단을 pA4BL에서 얻어진 EcoRI - SstlII 단편상에서 M13MB20( 뵈링거 만하임 ) 으로 서브클론시킨 다음 하기와 같이 돌연변이 유발성 올리고누클레오타이드에 대한 암호사슬 주형을 얻었다 :
상기 프라이머는 여분의 4개의 N - 종결부위 알라닌에 대한 코돈이 제거되었는데, 정확한 형태는 PstI 부위의 부재에 의해 확증되었다. EcoRI - SstII 단편을 다시 pA4BL 벡터 (제 5 도) 로 서브클론시켰더니 플라스미드 pBLapr이 얻어졌다. 그다음 M197T 치환이 SstII - SstI 단편상에서 pA4BL ( M197T ) 로부터 상보적인 pBLapr 벡터로 이동되어 플라스미드 pBLapr (M197T )이 얻어질수 있었다. 비. 서브틸리스내 pBLapr 로부터 발현된 아밀라아제의 N -종결부위를 분석하였더니 이는 비. 리케니포미스 알파-아밀라아제에서 발견되는 동일한 N -종결 부위에 의해 처리되었음을 보여주었다.
실 시 예 2: 메티오닌변종의 산화 감수성
SpeqymeAA20 (Genencor International. Inc. 제품) 과같은 비. 리케니포미스 알파 - 아밀라아제는 과산화수소의 존재하에 재빨리 불활성된다 (제 7 도). 다양한 메티오닌 변종은 비. 서브틸리스의 진탕 -플라스크 배양균내에 발현되며 이 정제되지않은 상청액을 암모늄 설페이트 컷으로 정제시켰다. 아밀라아제는 20 % 포화 암모늄 설페이트 상청액으로부터 암모늄 설페이트의 포화율을 70% 까지 상승시켰더니 침전되었고, 침전된 것을 재현탁하였다. 이 변종을 pH 5.0, 25℃, 0.88 M의 과산화수소에 노출시켰다. 비. 리케니포미스 알파-아밀라아제내 6개의 메티오닌 위치의 변종은 과산화물에 의해 여전히 산화가 일어나고 있는 반면 +197 ( M197L ) 위치에서의 치환은 과산화물 산화에 저항을 나타내었다 (제 7 도 참조). 그러나 하기에서 더 상세하게 기술한 연속적인 분석 결과는 변종이 pH 5.0, 25℃에서 산화되기 쉽지만, 다른 조건하에서는 (즉, 액화조건 ) 개선된/향상된 특성들을 나타냄을 보여주었다.
실 시 예 3: 197 위치에서 모든 가능한 변종의 구축
제 8 도에서 간략하게 도시한 바와같이 모든 M197변종 ( M197X ) 은 카세트 돌연변이 유발에 의하여 A4 형 내에 생성되었다 ;
1) 하기 돌연변이 유발성 올리고누클레오타이드를 사용하여 부위 지향적 돌연변이유발 ( M13 에서의 프라이머 확장을 통하여 ) 시켜 M197A를 제조하였다 :
또한 ClaI 부위 ( 코돈 201 - 202 ) 를 대체하기 위하여 EcoRV 부위 ( 코돈 200 - 201 ) 를 삽입시켰다.
2) 그다음 프라이머 LAAM12 ( 표 II ) 를 사용하여 코돈 186 - 188 에 걸쳐 다른 불활성 제한 부위 ( BstBI ) 를 도입시켰다.
3) 이렇게 얻어진 M197A ( BstBI+, EcoRV+ ) 변종을 플라스미드 pA4BL로 서브클론 ( PstI - SstI 단편 ) 시킨다음 이렇게 얻어진 플라스미드를 BstBI 및 EsoRV 로 가수분해 시키고 아가로스겔로부터 전기용리시켜 큰 단편-함유 벡터를 분리시켰다.
4) 합성 프라이머들 LAAM 14 - 30 ( 표 II )을 각각 충분히 상보적인 공통 프라이머 LAAM 13 (표 II )과 어닐시켰다. 이렇게 얻어진 카세트들은 +197위치에 잔류하는 모든 천연 아미노산에 대하여 암호화하고, 개별적으로 상기에서 제조한 벡터 단편으로 리게이션 ( ligation ) 시켰다.
표 II
카세트들은 리게이션될때 EcoRV 부위를 파괴하도록 고안되었으므로 이. 콜라이(E. coli)형질 전환체로부터 얻어진 플라스미드를 이러한 단일 부위 손실에 대하여 스크린시켰다. 이외에, 카세트의 공통 기본사슬은 프레임 - 시프트를 함유하고 NsiI 부위를 암호화하므로 이 사슬에서 유도된 형질 전환체는 단일 NsiI 부위의 존재에 대하여 스크린시킴으로써 제거시킬 수 있으며 혹종의 경우라도 활성 아밀라아제의 발현을 유도하는 것으로는 예견되지 않는다.
제한분석에 의한 양성 ( positive ) 임을 시퀀싱시켜 확증하였고 진탕 - 플라스크 배양내에서 발현시키기 위하여 비. 서브틸리스내에서 형질전환시켰다 (제 9 도). 그다음 가용성 기질 측정방법들을 이용하여 얻은 데이타가 하기 표 III 에 주어지있다.
가용성 기질 측정법: Megazyme ( Aust. ) pty. Ltd. 에 의해 공급되는 종말점 분석 키트에 기초하여 속도를 측정하였다 : 기질 ( P - 니트로페닐 말토헵타오사이드, BPNPG7 )이 든 각각의 바이얼을 10 ml 의 살균수에 용해시킨 다음 측정 버퍼 ( 50 mM의 말레에이트 버퍼, pH 6.7, 5 mM의 칼슘 클로라이드, 0,002 % Tween 20 )내 1 - 4 배까지 희석시켰다. 25℃ 큐벳내 790㎕의 기질에 10 ㎕의 아밀라아제를 가하여 측정하였다. 가수분해속도는 75 초 경과시킨 후 410 nm에서의 흡수율 변화 속도로서 측정하였다. 측정은 최대 분당 0.4 흡수단위의 속도로 선형이었다.
아밀라아제 단백질 농도는 소의 혈청 알부민 포준물질을 사용한 Bradford, M. (1976) Anal, Biochem. 72 : 248 의 방법에 기초하여 표준 Bio - Rad 측정법 ( Bio - Rad Laboratories ) 을 이용하여 측정하였다.
전분 가수분해 측정법: SpezymeRAA20 의 알파 - 아밀라아제 활성을 측정하는 표준방법을 이용하였다. 이 방법은 본원의 참고용으로 합체된 미합중국 제 07/785,624호의 실시예 1 에 상세하게 기술되어 있다. 천연 전분은 아이오다인과 결합하여 청색을 띠나 더 작은 덱스트린 분자로 가수분해되면 청색을 띠지 않는다. 기질은 pH 6.2 의 포스페이트 버퍼 ( 42.5 gm/l 의 포타슘 디하이드로젼 포스페이트, 3.16 g/l 의 소듐 하이드록사이드 ) 내 가용성 Lintner 전분 5 gm/l 이다. 샘플을 25 mM의 칼슘 클로라이드에 가하고 35℃ 에서 보온시킬때 아이오다인 테스트에 음성을 나타내는데 소요되는 시간으로 활성을 측정하였다. 활성은 다음식에 따라 계산된 ml 또는 g 당 액화로 기록하였다 :
표 III
실 시 예 4
변종 M15L의 특성화
앞의 실시예에서 제조한 변종 M15L은 증대된 아밀라아제 활성이 나타나지 않았으며 ( 표 III ) 과산화수소에 의해 불화성되었다 (제 7 도). 그러나, 이는 하기 표 IV 에서 주어진 바와같이, 특히 낮은 pH에서 전분의 분사 액화에 대하여 상당히 증대된 성능을 나타낸다.
전분 액화는 일반적으로 말단 역압밸브와 혼합 챔버 뒤 2.5 ℓ의 지연 코일이 장착된 Hydroheater M 103 - M 스팀 젯을 사용하여 수행하였다. 전분은 Moyno펌프로 젯으로 공급되고 스팀은 150 psi 스팀라인에 의해 공급되는데 90 - 100 psi 까지 감소시켰다. 온도 프로브는 Hydroheater 젯 바로 뒤, 역압밸브 바로 앞에 장치하였다.
전분 슬러리는 콘 습식 분쇄기로부터 얻는데 2 일이내에 사용하였다. 전분을 목적하는 고형분 농도까지 탈염수로 희석시키고 전분의 pH는 2 % 의 NaOH 또는 포화 Na2CO3로 조절하였다. 일반적인 액화 조건은 다음과 같다 ;
알파 - 아밀라아제 건조상태를 기준하여 전분의 g 당 12 - 14 LU 전분을 분당 약 350 ml 젯에 도입하였다. 젯의 온도는 105 - 107℃로 유지시켰다. 전분의 샘플을 젯쿠커에서 95℃ 두번째 액화단계로 이동시켜 90분 동안 정치시켰다.
Standard Analytical Methods of the Member Companies of the Corn Refiners Association, Inc., Sixth Ed. 에 기술된 방법에 따라, 샘플의 덱스트로스 당량 ( DE )을 측정하고 생전분의 존재에 대하여 테스트함으로써 두번째의 액화단계 후 전분의 액화도를 즉시 측정하였다. 상기에서 주어진 조건 및 pH 6.0에서 일반적으로 처리할 경우 전분은 DE가 약 10 이고 생전분이 없는 액화 전분이 얻어질 것이다. 본 발명의 돌연변이종을 사용한 전분 액화 테스트의 결과를 하기 표 IV에 나타내었다.
표 IV
실 시 예 5
M15X 변종의 구축
일반적으로 상기 실시예 3 에서 기술한 공정을 따라, 제 12도에서 간략하게 도시된 바와 같이 카세트 돌연변이 유발에 의해 천연 비. 리케니포미스내에 M15 ( M15X ) 에서의 모든 변종을 생성시켰다.
1) 돌연변이 유발 카세트의 삽입을 용이하게 하기위해서 부위 지향적 돌연변이 유발 ( M13에서 프라이머의 증대를 통하여 )을 이용하여 M15 코돈에 접하는 단일 제한 부위를 도입시켰다. 구체적으로, 하기에 나타낸 두개의 올리고누클레오타이드를 사용하여 코돈 11 - 13 에 BstBI 부위 및 코돈 18 - 20 에 MscI 부위를 도입시켰다.
2) 돌연변이 유발된 아밀라아제 ( BstBI+ MscI)에서 얻어진 SfiI - SstII 단편을 서브클론시켜 M15X 카세트 돌연변유발에 대한 벡터를 플라스미드 pBLapr로 구축하였다. 이렇게 얻어진 플라스미드를 BstBI 및 MscI 로 가수분해시키고 폴리아크릴아미드 겔로부터 전기 용리시켜 큰 벡터 단편을 분리시켰다.
3) M197X 변종으로 돌연변이유발 카세트가 얻어졌다. 각각 코돈 15 에서 치환을 암호화하는 합성 올리고머를 공통 기본 프라이머로 어닐시켰다. 카세트를 벡터로 적당하게 리게이션시킬때, MssI을 이 부위의 손실에 의해 양성 형질 전환체의 스크린을 가능하게한다. 기본 프라이머는 SnaBI 부위에 대하여 스크린시켜 제거시켜야할 기본 사슬로부터 유도된 형질 전환체를 고려한다면 단일 SnaBI 부위를 함유한다. 이 프라이머는 또한 공통 기본 사슬로부터 유도된 돌연변이 유전자에 대한 아밀라아제 발현을 또한 제거하는 프레임 시프트를 함유한다.
합성 카세트는 하기 표 V 에 나타냈고 일반적인 카세트 돌연변이 유발 방법에 대하여는 제 12도에 예시하였다.
표 V
밑줄은 아미노산 위치 15 에서의 코돈 변화를 의미한다.
새로운 제한 부위의 도입을 막기위하여 몇몇 경우에 보존적 치환이 일어났다.
실 시 예 6
M15X 변종에 의한 탁상 액화
탁상 액화 시스템을 이용한 pH 5.5 에서의 액화에서 Spezyme AA20 ( Genencor International, Inc. 제품 )과 비교하여, 실시예 5에 따라 제조된 M15에 대한 치환체를 갖는 11개의 알파-아밀라아제 변종의 활성을 측정하였다. 탁상 규모의 액화시스템은 전방 말단으로부터 대략 12 인치에 7인치 길이의 정적 혼합 요소와 후방 말단에 30 psi 역압 밸브가 장착된 스테인리스 스틸 코일 ( 직경 0.25인치, 부피 대략 350 ml )로 이루어진다. 양단을 제외한 코일은 배쓰가 약 105 - 106℃ 로 유지되도록 열평형학적으로 조절되는 히팅 요소가 장착된 글리세롤 - 물 배쓰에 함침시켰다.
약 70 ml/분로 피스톤이 작동되어 계량되는 펌프를 사용하여, 교반시킴으로써 현탁액내에 유지되는, 효소를 함유하는 전분 슬러리를 반응물로 도입시켰다. 코일 말단에서 전분을 회수하여 두번째 홀드 ( 95℃, 90분동안 ) 로 이동시켰다. 두번째 홀드에서 경과시킨후 즉시, 실시예 4에서 기술한 바와같이 액화된 전분의 DE를 측정하였다. 그 결과를 제 16도에 나타내었다.
실 시 예 7
M197X 변종의 특성화
제 9 도에서 볼수 있다시피, M107X ( A4형 ) 변종에 의해 발현된 아밀라아제활성 (가용성 기질 측정법으로 측정된 )은 광범위하다. 2 부피의 에탄올로 침전시킨다음 재현탁시킴으로써 아밀라아제를 상청액으로부터 부분적으로 정제시켰다. 그 다음 5 mM 의 칼슘 클로라이드 존재하에 pH 5.0, 10 mM의 아세테이트 버퍼내 95℃에서 5분동안 가열시켜 열안정성 (제 10도) 에 대하여 스크린 하였다 ; A4 야생형을 보온후 자신의 활성의 28 %를 보유하였다. M197W 및 M197P에 대하여는 우리는 상청액으로부터 활성 단백질을 회수할 수 없었다. 시퀀싱 시킬때, M197H 변종은 두번째 돌연변이 유전자 N190K 를 함유하고 있음을 발견하였다. M197L은 별도의 실험으로 검사하였는데 열적으로 가장 덜 안정한 변종들 중 하나였다.
아밀라아제 활성의 발현과 열안정성 간에는 폭넓은 상관관계가 있는 것으로 보여진다. 리케니포미스 아밀라아제는 열안정성을 보유하거나 강화시키는 형태로 197 위치에 축적될 수 있는 잔기로 제한된다 : 이러한 조건하에서 시스테인 및 트레오닌은 최대의 열안정성으로 바람직한 반면 알라닌 및 이소류신은 중간적인 안정성을 지닌다. 그러나, +197 위치에서의 기타의 치환은 감소된 열안정성을 얻게하며 이는 다른 용도에 유용할 것이다. 부가적으로, +197에서의 상위한 치환은 개선된 pH성능 프로파일 또는 개선된 산화 안정성과 같은 다른 유익한 특성을 가질 것이다. 예를들면, M197C 변종은 공기 중 산화로 재빨리 불활성되나 열 안정성은 높은 것으로 알려겼다. 역으로, M197L 변종과 비교하면 M197T 및 M197A 는 pH 5 - 10에서 과산화물에 의한 불활성화에 내성을 지니면서 (제 7 도) 고도의 열안정성 (제 10 도) 및 고도의 활성 ( 표 III ) 을 보유한다.
실 시 예 8
세제 조제물내에서의 안정성 및 성능
M197T ( A4 형 ), M197T 및 M197A 의 안정성을 자동식기세정제 ( ADD ) 매트릭스내에서 측정하였다. 2 ppm의 SavinaseTM( ADD 에 통용되는 형태의 프로테아제, Novo industries의 제품 )를 두개의 시판되는 표백제 -함유 ADD에 가하였다 : CascadeTM( Procter 및 Gamble, Ltd. 제품 ) 및 SunlightTM( Unilever 사 제품 ) 아밀라아제 변종들과 TermamylTM( Novo Nordisk, A/S 제품으로 열적으로 안정한 알파 - 아밀라아제 )의 불활성은 65℃에서 일어났다. 상기 두 경우에 사용된 ADD 제품의 농도는 " 예비 - 함침 " 의 조건과 동일하였다 : 물 ℓ당 14 gm의 제품 ( 갤런경도당 7 g ). 보여지는 바와같이 (제 11a도 및 제 11b도 ), 두형태의 M197T 변종은 첫번째 측정이 수행되기 전에 불활성된 TermamyeTM과 M197A ( A4 형 )보다 훨씬 안정하였다. 이러한 안정성의 이점은 다음의 실험지침서에 의해 측정되는 바와같이 전분의 존재 또는 부재하에서도 나타났다. 아밀라아제를 테스트 튜브내에서 미리 가온시킨 5 ml의 ADD및 SavinaseTM에 가하고, 와륜시킨 후 가용성 기질 측정법을 이용하여 시간의 함수로서 활성을 측정하였다. "+전분" 튜브에는 측부가 구워진 ( 140℃, 60분 ) 스파게티 전분이 들어있었다. 결과는 제 11a 도 및 제 11b 도에 나타내었다.
실 시 예 9
M15X 변종의 특성화
모든 M15X변종들을 바실러스 서브틸러스내에서 증식시키고 제 13 도에 나타낸바와같이 발현 정도를 모니터하였다. 아밀라아제를 분리시켜 20 - 70 % 암모늄 설페이트 컷으로 부분 정제시켰다. 가용성 기질상의 상기 변종들의 특이 활성은 실시예 3 에 따라 특정하였다 (제 14 도). 많은 M15X 아밀라아제가 SpezymeRAA20 보다 큰 특이 활성을 지닌다. 5 mM의 CaCl2의 존재하에 pH 5, 50 mM의 아세테이트버퍼내 90℃ 에서 5분동안 아밀라아제를 가열시킴으로써 상기 변종에 대한 탁상 가열 안정성을 측정하였다 (제 15 도). 이 측정법에서는 SpezymeRAA20 뿐아니라 대부분의 변종들에 대하여도 수행하였다. 이 측정법에서 합리적인 안정성 (합리적인 안정성이란 SpezymeRAA20의 열안정성의 최소한 약 60 %를 보유하는 것으로 정의함 )을 나타내는 변종들의 전분에 대한 특이 활성 및 pH 5.5 에서의 액화 성능에 대하여 테스트하였다. 이러한 돌연변이종중 가장 중요한 돌연변이종을 제 16 도에 나타내었다. M15D, N, T 및 L 은 pH 5.5 에서의 액화에서 SpezymeRAA20보다 성능이 우수하였고 가용성 기질 측정법 및 전분 가수분해 측정법 모두에서 증대된 특이 활성을 나타내었다.
일반적으로, 우리는 15 위치의 메티오닌을 치환시킴으로써 낮은 pH 에서의 증대된 액화 성능 및/또는 증대된 특허 활성을 갖는 변종들을 얻을 수 있음을 발견하였다.
실 시 예 10
트립토판의 산화감수성
클로라민 - T ( 소듐 N - 클로로 - p - 톨루엔설폰이미드 ) 는 선택적 산화제인데, 중성 또는 염기성 pH 에서 메티오닌을 메티오닌 설폭사이드로 산화시킨다. 산성 pH 에서 클로라민 - T 는 메티오닌 및 트립토판 둘다를 수식시킬 것이다 ( Schecter, Y., Burstein, Y. 및 Patchornik, A. (1975) Biochemistry 14 (20) 4497 - 4503 ).
제 17도에서는 pH 8.0 에서 클로라민 - T에 의해 비. 리케니포미스 알파 - 아밀라아제가 불활성되는 것을 보여준다 ( AA20 = 0.65 mg/ml, M197A = 1.7 mg/ml, M197L = 1.7 mg/ml ). 이 데이타는 197 위치의 메티오닌을 류신 또는 알라닌으로 바꿈으로써 알파 - 아밀라아제의 불활성을 막을 수 있음을 보여준다. 역으로, 제 18도에 나타낸바와 같이, pH 4.0 에서 M197A 및 Ml97L의 불활성이 진행되지만 추가량의 클로라민 - T 가 요구되지는 않는다 ( 제 18 도 ; AA20 = 0.22 mg/ml, M197A = 4.3 mg/ml, M197L = 0.53 mg/ml ; pH 4.0 에서 200 mM의 Na 아세테이트 ). 이는 트립토판 잔기 또한 클로라민 - T 매개된 불활성 반응에 관련되어 있음을 시사해준다. 더우기, 트립신 매핑 및 연속적으로 아미노산 시퀀싱하면 138 위치의 트립토판이 클로라민 - T 에 의해 산화되었음을 나타낸다 (데이타는 나타내지 않았음 ). 이를 입증하기 위하여, 하기와 같이 트립토판 138 에 부위 지향적 돌연변이 유전자를 만들었다 :
알파 - 아밀라아제 이중 돌연변이 유전자 W138 및 M197 제조
혹종의 W138 ( F, Y 및 A ) 변종을 M197T ( 실시예 3 에 따라 제조한 ) 와함께 이중 돌연변이 유전자로서 제조하였다. 이중 돌연변이 유전자는 실시예 1 및 3 에 기술한 방법에 따라 제조하였다. 일반적으로, DNA의 단일 음성 사슬은 비. 리케니포미스 알파 - 아밀라아제 M197T 돌연변이 유전자의 1.72 kb 코딩서열 ( PstI - SstI )의 M13MP18 클론에서 얻었다. 부위 - 지향적 돌연변이유발은 하기에 나타낸 프라이머를 이용하고, 실질적으로 클레노우 대신 T4 유전자 32 단백질 및 T4 중합효소를 치환한 것외엔 Zoller, M 등의 방법으로 수행하였다.
적당한 돌연변이 유전자로 클론들을 동정시키기 위하여 프라이머는 모두 단일부위 및 목적하는 돌연변이 유전자를 함유하고 있다.
트립토판 138 - 페닐아라닌
트립토판 138 - 티로신
트립토판 138 - 알라닌 :이 프라이머논 또한 138 위치의 업스트림 및 다운스트림에 단일 위치를 도입한다.
돌연변이 유전자는 제한 분석법으로 동정하였고 W138F 및 W138Y 는 DNA 시퀀싱으로 확인되었다. W138A 서열은 단일 BspE I 및 Xma I 부위 사이의 누클레오타이드 삭제가 있었으나 나머지 유전자는 정확하게 서열되었음을 밝혀 주었다. W138X 및 M197T 돌연변이 유전자 둘다를 함유하는 1.37 kb SstII/SstI 단편을 M13MP18 에서 발현 벡터 pBLapr로 이동시켜 pBLapr ( W138F, M197T ) 및 PBLapr ( W138Y, M197T )를 얻었다. 138 위치에서 다른 아미노산 치환체들을 함유하는 카세트를 클론시키는 것에 유용하기 때문에 단일 BspEI 및 XmaI 부위를 함유하는 단편은 pBLapr ( BspEI, XmaI, M197T ) 로 클론시켰다.
아미노산 위치 138 에서의 단일 돌연변이
전기한 실시예에 기술한 일반적인 방법에 따라, W138 ( F, Y, L, H 및 C )의 혹종의 단일 변종을 제조하였다.
실시예 7의 플라스미드 pBLapr ( W138X, M197T ) 내 M197T 돌연변이 유전자를 함유하는 1.24 kb Asp718 - SstI 단편을 197 메티오닌인 야생형 단편에 의해 치환시켜 pBLapr ( W138F ), pBLapr ( W138Y ) 및 pBLapr ( BspEI, XmaI ) 을 얻었다.
돌연변이 유전자 W138L, Wl38H 및 W138C는 다음 프라이머를 사용하여 합성 카세트를 pBLapr ( BspEI. XmaI ) 으로 리게이션시켜 제조하였다.
트립토판 138 - 류신
트립토판 138 - 히스티딘
트립토판 138 - 시스테인
이중 돌연변이 유전자 M197T/W138F 및 M197T/W138Y 와 클로라민 - T 의 반응을 야생형과 비교하였다 ( AA20 = 0.75 mg/ml, M197T/W138F = 0.64 mg/ml, M197T/W138Y = 0.60 mg/ml : pH 50 mM의 Na 아세테이트 ), 제 19도에 나타낸 결과는 트립토판 138의 돌연변이 유발이 클로라민 - T에 대한 변종의 내성을 더 강화시켜줌을 보여준다.
서열 목록
(1) 서열 정보 :
(i) 출원인 : 제넨코 인터내셔널, 아이엔씨.
(ii) 발명의 명칭 : 산화 안정성 알파-아밀라아제
(iii) 서열 개수 : 68
(iv) 주소
(A) 수신인 : 제넨코 인터내셔널, 아이엔씨.
(B) 거리 : 180 킴볼 웨이
(C) 시 : 사우쓰 샌 프란시스코
(D) 주 : 캘리포니아
(E) 국명 : 미합중국
(F) 우편번호 : 94080
(v) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매질 형태 : 플러피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환기종
(C) 작동시스템 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1.0, 버젼 #1.25
(vi) 본 출원의 자료 :
(A) 출원 번호 :
(B) 출원일 :
(C) 분류 :
(viii) 대리인/대행인 정보
(A) 성명 : 호언, 마가렛 에이.
(B) 등록번호 : 33,401
(C) 조회/사건 등록서 번호 : GC220-2
(ix) 원거리 통신 정보 :
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(2) 서열식별번호 : 1 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 56 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 1 :
(2) 서열식별번호 : 2 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 ;
(A) 길이 : 29 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 2 :
(2) 서열식별번호 : 3 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 34 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
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(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 3 :
(2) 서열식별번호 : 4 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 36 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
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(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 4 :
(2) 서열식별번호 : 5 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 26 개의 염기쌍
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(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 24 개의 염기쌍
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(i) 서열 특성 :
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(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 35 개의 염기쌍
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(2) 서열식별번호 : 9 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 36 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
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(ii) 분자 형태 DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 9 :
(2) 서열식별번호 10 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 45 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 10 :
(2) 서열식별번호 : 11 에 대한 정보
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 36 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 11 :
(2) 서열식별번호 : 12 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 21 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 ; 12 :
(2) 서열식별번호 : 13 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 ;
(A) 길이 : 38 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 13 :
(2) 서열식별번호 : 14 에 대한 정보
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 41 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 14 :
(2) 서열식별번호 : 15 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 41 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 15 :
(2) 서열식별번호 : 16 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 41 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 16 :
(2) 서열식별번호 : 17 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 41 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 17 :
(2) 서열식별번호 : 18 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 41 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(0) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 18 :
(2) 서열식별번호 : 19 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 41 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 19 :
(2) 서열식별번호 ; 20 에 대한 정보 ;
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 41 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 20 :
(2) 서열식별번호 : 21 에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 41 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 21 :
(2) 서열식별번호 22 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 41 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 22 :
(2) 서열식별번호 : 23 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 41 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 23 :
(2) 서열식별번호 24 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 41 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(B) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 24 :
(2) 서열식별번호 : 25 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 41개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 25 :
(2) 서열식별번호 : 26 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 41 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 26 :
(2) 서열식별번호 : 27 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 41 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 서열식별번호 : 27 :
(2) 서열식별번호 28 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 ;
(A) 길이 : 41 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 28 :
(2) 서열식별번호 : 29 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 41 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 29 :
(2) 서열식별번호 : 30 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 41 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 30 :
(2) 서열식별번호 : 31 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 1968 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 31 :
(2) 서열식별번호 : 32 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 483 개의 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : 단백질
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 32 :
(2) 서열식별번호 : 33 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 511 개의 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : 단백질
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 33 :
(2) 서열식별번호 : 34 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 520 개의 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : 단백질
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 34 :
(2) 서열식별번호 : 35 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 548 개의 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : 단백질
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 35 :
(2) 서열식별번호 : 36 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 483 개의 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : 단백질
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 36 :
(2) 서열식별번호 : 37 에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 487 개의 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : 단백질
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 37 :
(2) 서열식별번호 : 38 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 32 개의 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : 단백질
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 38 :
(2) 서열식별번호 : 39 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 33 개의 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : 단백질
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 39 :
(2) 서열식별번호 : 40 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 35개의 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : 단백질
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 40 :
(2) 서열식별번호 : 41 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 32 개의 아미노산
(B) 형태 : 아미노산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : 단백질
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 41 :
(2) 서열식별번호 : 42 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 33 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 42 :
(2) 서열식별번호 : 43 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 33 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 43 :
(2) 서열식별번호 : 44 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 66 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 44 :
(2) 서열식별번호 : 45 에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 42 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 45 :
(2) 서열식별번호 : 46 에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 42 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 46 :
(2) 서열식별번호 : 47 에 대한 정보:
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 42 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 47 :
(2) 서열식별번호 : 48 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 24 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 48 :
(2) 서열식별번호 : 49 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 26 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 49 :
(2) 서열식별번호 : 50 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 24 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 50 :
(2) 서열식별번호 : 51 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 24 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 51 :
(2) 서열식별번호 52 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 24 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 52 :
(2) 서열식별번호 : 53 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 24 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 53 :
(2) 서열식별번호 : 54 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 24 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 54 :
(2) 서열식별번호 : 55 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 24 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 55 :
(2) 서열식별번호 : 56 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 24 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 56 :
(2) 서열식별번호 : 57 에 대한 정보 :
(j) 서열 특성 :
(A) 길이 24 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 57 :
(2) 서열식별번호 : 58 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 24 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 58 :
(2) 서열식별번호 : 59 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 24 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 59 :
(2) 서열식별번호 : 60 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 24 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본좨
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 60 :
(2) 서열식별번호 : 61 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 24 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 61 :
(2) 서열식별번호 : 62 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 24 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 62 :
(2) 서열식별번호 : 63 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 24 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 63 :
(2) 서열식별번호 : 64 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 24 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 64 :
(2) 서열식별번호 : 65 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 24 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 65 :
(2) 서열식별번호 : 66 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 24 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 66 :
(2) 서열식별번호 : 67 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 24 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(B) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 67 :
(2) 서열식별번호 : 68 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 24 개의 염기쌍
(B) 형태 : 핵산
(C) 사슬성 : 일본쇄
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 형태 : DNA (게놈)
(xi) 서열 서술 : 서열식별번호 : 68 :

Claims (11)

  1. 바실러스(Bacillus)로부터 유래된 돌연변이 알파-아밀라제를 암호화하고,
    (a) 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis) 내의 M197에 상응하는 위치에서, 트레오닌, 류신, 알라닌, 아르기닌, 아스파테이트, 아스파트산, 글루타민산, 글리신, 이소류신, 라이신, 페닐알리닌, 프롤린, 세린, 발린, 히스티딘 및 글루타민으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산의 치환 또는 메티오닌 잔기의 삭제; 또는
    (b) 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis) 내의 M15에 상응하는 위치에서 메티오닌 잔기에 대해 류신, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파테이트, 세린, 발린 및 이소류신으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산의 치환; 또는 (a)의 삭제 또는 치환 및 (b)의 치환을 포함하는 DNA.
  2. 제 1 항의 DNA 를 함유하는 발현 벡터.
  3. 제 2 항의 발현 벡터로 형질전환된 그람양성 세포.
  4. 서열식별번호 37에 해당하는 아미노산 서열을 포함하는 알파 - 아밀라아제를 암호화하는 DNA.
  5. 제 4 항의 DNA 를 함유하는 발현 벡터.
  6. 제 5 항의 발현벡터로 형질전환된 그람양성 세포.
  7. 제 4 항에 있어서, 상기 알파 아밀라제가 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) 알파-아밀라제 내의 W138에 상응하는 아미노산에서 추가의 치환을 포함하는 DNA.
  8. 아미노산 잔기 M15, M197 및/또는 W138의 삭제 또는 치환을 갖는 서열식별번호 37의 아미노산 서열을 갖는 돌연변이 알파-아밀라제를 암호화하는 DNA.
  9. 제 8 항의 DNA를 함유하는 발현 벡터.
  10. 제 9 항의 발현 벡터로 형질전환된 그람양성 세포.
  11. (a) 제 3 항에 따른 그람양성 세포의 성장 및 배양에 유용한 배양배지를 제조하는 단계:
    (b) 상기 그람양성 세포를 적절한 조건하에서 배양하여 상기 그람양성 세포에 의한 상기 알파-아밀라제의 생성을 유도하는 단계; 및
    (c) 선택적으로 상기 그람양성 세포로부터 상기 알파-아밀라제를 분리하는단계를 포함하는, 제 3항의 그람양성 세포로써 돌연변이 알파-아밀라제를 생성하는 방법.
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