CN114846023A - 成麦芽五糖/麦芽六糖变体α-淀粉酶 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了涉及成麦芽五糖/麦芽六糖α‑淀粉酶的组合物和方法。变体α‑淀粉酶可用于例如淀粉液化和糖化，用于清洁衣物、餐具洗涤、和其他应用中的淀粉污渍，用于纺织品加工(例如脱浆)，在动物饲料中用于改善消化率，以及用于烘焙和酿造。

Description

成麦芽五糖/麦芽六糖变体α-淀粉酶
技术领域
本发明公开了涉及成麦芽五糖/麦芽六糖变体α-淀粉酶的组合物和方法。变体α-淀粉酶可用于例如清洁淀粉污渍、淀粉液化和糖化、纺织品脱浆、烘焙、和酿造。
背景技术
淀粉由直链淀粉(15％-30％w/w)和支链淀粉(70％-85％w/w)的混合物组成。直链淀粉由具有分子量(MW)为从约60,000至约800,000的α-1,4-连接的葡萄糖单元的直链组成。支链淀粉是每24-30个葡萄糖单元含有α-1,6分支点的支链聚合物；其MW可高达1亿。
α-淀粉酶通过随机切割内部的α-1,4-糖苷键来水解淀粉、糖原和相关多糖。α-淀粉酶，特别是来自芽孢杆菌属(Bacilli)的α-淀粉酶已经用于各种不同的目的，包括淀粉液化和糖化、纺织品脱浆、纸张和纸浆工业中的淀粉修饰、酿造、烘焙、用于食品工业的糖浆的生产、用于发酵工艺的原料的生产、以及用于动物饲料中以增加可消化性。这些酶还可用于在餐具洗涤和衣物洗涤期间除去淀粉污垢和污渍。
α-淀粉酶水解淀粉所产生的产物在连续葡萄糖分子的数量方面有所不同。大多数商业α-淀粉酶生产从葡萄糖(G1)到麦芽七糖(G7)的一系列产品。由于不完全清楚的原因，产生大量麦芽五糖和麦芽六糖的α-淀粉酶似乎对某些商业应用(包括掺入洗涤剂清洁组合物中)特别有用。许多出版物已经描述了产生麦芽五糖/麦芽六糖的α-淀粉酶以及其他中的突变。尽管如此，对更稳健和性能更好的工程化的α-淀粉酶分子的需求仍然存在。
发明内容
本发明的组合物和方法涉及成麦芽五糖/麦芽六糖变体淀粉酶多肽及其使用方法。本发明的组合物和方法的各方面和实施例总结在以下分别编号的段落中：
1.在一个方面，提供了一种重组、非天然存在的亲本变体α-淀粉酶分子，其包含参考SEQ ID NO:1进行编号的位置91处的突变和α-淀粉酶TIM筒结构底部的氨基酸残基处的突变，所述底部的氨基酸残基定义为残基6、7、40、96、98、100、229、230、231、262、263、285、286、287、288、322、323、324、325、362、363、和364，其中所述亲本分子的位置28处存在的野生型氨基酸残基能带正电荷。
2.在如段落1所述的变体α-淀粉酶的一些实施例中，所述位置91处的突变是将天然存在的残基取代为带正电荷的残基。
3.在如段落1或2所述的变体α-淀粉酶的一些实施例中，所述位置91处的突变是将天然存在的残基取代为精氨基(即X91R)。
4.在如段落1-3中任一项所述的变体α-淀粉酶的一些实施例中，所述α-淀粉酶TIM筒结构底部的至少一个突变选自由以下组成的组：X40N、X40D、X100F、X100L、X263Y、X288D、X288K、X288Q、X324R、X324N、X324M、X364L、和X364M。
5.在如段落1-4中任一项所述的变体α-淀粉酶的一些实施例中，所述α-淀粉酶TIM筒结构底部的至少一个突变选自由以下组成的组：T40N、T40D、Y100F、Y100L、F263Y、S288D、S288K、S288Q、I324R、I324N、I324M、Y364L、和Y364M。
6.在另一方面，提供了一种重组、非天然存在的变体α-淀粉酶，其包含位置91处的精氨酸和不存在于天然存在的α-淀粉酶中的以下特征中的至少一个：位置40处的N或D，位置100处的F或L，位置263处的Y，位置288处的D、K或Q，位置324处的R、N或M，或位置364处的L或M。
7.在一些实施例中，如段落1-6中任一项所述的变体α-淀粉酶进一步包含环中残基处的突变，所述环包含参考SEQ ID NO:1进行编号的表面暴露的残基167、169、171、172、和176。
8.在如段落7所述的变体α-淀粉酶的一些实施例中，所述环中的至少一个突变选自由以下组成的组：X167F、X169H、X171Y、X172R、X172N、和X176S。
9.在如段落8所述的变体α-淀粉酶的一些实施例中，所述环中的至少一个突变选自由以下组成的组：W167F、Q169H、R171Y、Q172R、Q172N、和R176S。
10.在一些实施例中，如段落1-6中任一项所述的变体α-淀粉酶进一步包含参考SEQ ID NO:1进行编号的位置167处的F、位置169处的H、位置171处的Y、位置172处的R或N、或位置176处的S。
11.在另一方面，提供了一种重组、非天然存在的变体α-淀粉酶，其包含参考SEQID NO:1进行编号的位置172处的突变和位置288处的突变。
12.在另一方面，提供了一种重组、非天然存在的变体α-淀粉酶，其包含参考SEQID NO:1进行编号的位置172处的精氨酸或天冬酰胺和位置288处的天冬氨酸。
13.在一些实施例中，如段落1-12中任一项所述的变体α-淀粉酶进一步包含参考SEQ ID NO:1进行编号的位置116和/或281处的突变。
14.在一些实施例中，如段落1-12中任一项所述的变体α-淀粉酶进一步包含参考SEQ ID NO:1进行编号的位置116处的精氨酸或位置281处的丝氨酸。
15.在一些实施例中，如段落1-14中任一项所述的变体α-淀粉酶进一步包含参考SEQ ID NO:1进行编号的位置190和/或244处的突变。
16.在一些实施例中，如段落1-14中任一项所述的变体α-淀粉酶具有参考SEQ IDNO:1进行编号的位置190处的脯氨酸和/或位置244处的丙氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺。
17.在一些实施例中，如段落1-16中任一项所述的变体α-淀粉酶进一步包含使用SEQ ID NO:1的，相当于R181、G182、T183、和G184的至少两个残基的缺失。
18.在一些实施例中，如段落1-16中任一项所述的变体α-淀粉酶进一步包含相当于R181和G182或残基T183和G184的残基的成对缺失。
19.在另一方面，提供了一种重组、非天然存在的变体α-淀粉酶，其包含：
使用SEQ ID NO:1进行编号的(i)选自由以下组成的组的取代：
(a)X40N-X91R-X169H-X183M-X281N、
(b)X172R-X190P-X288D、
(c)X172R-X244E-X288D-X474R、
(d)X91R-X172R-X190P-X324M、
(e)X40N-X91R-X190P-X263Y、
(f)X40N-X91R-X244E-X364L、
(g)X91R-X172R-X190P-X324R、
(h)X91R-X116R-X172R-X244E-X281S-X288D、
(i)X40N-X91R-X100F-X116R-X172N-X244Q-X281S、
(j)X40N-X91R-X172R-X244Q-X263Y-X281S、
(k)X91R-X172R-X190P-X324N、
(l)X40D-X91R-X172R-X190P-X281S-X324R、和
(m)X364L；以及
(ii)残基的成对缺失，所述残基选自由相当于以下的残基组成的组：
181和182、以及
183和184。
20.在一些实施例中，如段落19所述的变体α-淀粉酶包含：
使用SEQ ID NO:1进行编号的(i)选自由以下组成的组的取代：
(a)T40N-S91R-Q169H-T183M-H281N、
(b)Q172R-E190P-S288D、
(c)Q172R-S244E-S288D-S474R、
(d)S91R-Q172R-E190P-I324M、
(e)T40N-S91R-E190P-F263Y、
(f)T40N-S91R-S244E-Y364L、
(g)S91R-Q172R-E190P-I324R、
(h)S91R-W116R-Q172R-S244E-H281S-S288D、
(i)T40N-S91R-Y100F-W116R-Q172N-S244Q-H281S、
(j)T40N-S91R-Q172R-S244Q-F263Y-H281S、
(k)S91R-Q172R-E190P-I324N、
(l)T40D-S91R-Q172R-E190P-H281S-I324R、和
(m)Y364L；以及
(ii)残基的成对缺失，所述残基选自由以下组成的组：
R181和G182、以及
T183和G184。
21.在另一方面，提供了重组、非天然存在的变体α-淀粉酶，其包含以下特征中的三个或更多个：(a)位置40处的D或N和/或位置91处的R，和(b)位置100处的F，位置263处的Y，位置288处的D，位置324处的M、N或R，和/或位置364处的L，任选地与(c)位置169处的H，位置183M处的M，位置281处的N或S，位置172处的N或R，位置190处的P，位置244处的E、Q或R，位置474处的R，和/或位置116处的R的组合，(d)任选地与(e)位置181和182或183和184处的成对缺失的组合，在所有情况下，使用SEQ ID NO:1进行编号。
22.在一些实施例中，如段落1-21中任一项所述的变体α-淀粉酶与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的氨基酸序列同一性。
23.在另一方面，提供了一种洗涤剂组合物，所述洗涤剂组合物包含如段落1-22中任一项所述的变体α-淀粉酶。
24.在一些实施例中，如段落23所述的洗涤剂组合物进一步包含来自吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)的变体枯草杆菌蛋白酶，所述变体枯草杆菌蛋白酶具有氨基酸取代X39E、X99R、X126A、X127E、和X128G，并且进一步包含参考SEQ ID NO:5进行编号的选自由以下组成的组的一个或多个额外的取代：N74D-M211L-N253P、R179Q-M211L-N253P、N74D-N253P、N85R-G160Q-R179Q-M211L-N212S-N253P、R179Q-N253P、G160Q-R179Q-M211L-N212S-N253P、R179Q-M211L、G160Q-R179Q-M211L-N253P、G160Q-R179Q-N212S-N253P、N74D-M211L、M211L-N242D、G160Q-R179Q-M211L-N212S、N74D-R179Q-M211L-N253P、G160Q-R179Q-M211L、G160Q-R179Q-N253P、N74D-Q200L-M211L、N74D-G160Q-N212S-N253P、N74D-G160Q-M211L-N253P、G160Q-R179Q、G160Q-R179Q-N212S、N74D-G160Q-N253P、N74D-G160Q-R179Q-M211L-N212S-N253P、N74D-N085R-G160Q-R179Q-M211L、N74D-G160Q-M211L-N212S-N253P、N74D-N085R-N116R-Q200L-Q256E、N74D-G160Q-R179Q-N212S-N253P、N74D-G160Q-M211L-N212S、N74D-G160Q、N74D-G160Q-R179Q-M211L-N253P、N74D-R179Q-M211L、N74D-G160Q-N212S、N74D-G160Q-M211L、N74D-G160Q-R179Q-N253P、N74D、N74D-G160Q-R179Q-M211L-N212S、N74D-N085R-M211L-N212S、N74D-G160Q-R179Q-N212S、N74D-G160Q-R179Q-M211L、N74D-M211L-Q256E、N74D-G160Q-R179Q、R179Q-M211L-N212S-N253P、R179Q-M211L-N212S、N74D-N085R-R179Q-M211L-N212S、N74D-M211L-N212S、N74D-R179Q-M211L-N212S、N74D-M211L-N242D、N74D-Q200L-M211L-Q256E、N74D-Q200L-M211L-N242D-Q256E、N74D-Q200L、N74D-M211N-N212Q、N74D-M211N-N212Q-Q256E、N74D-M211N-Q256E、N74D-M211Q、N74D-M211Q-N212Q、N74D-M211Q-N212Q-Q256E、N74D-M211Q-Q256E、N74D-N198A-M211Q、N74D-N198A-M211Q-N212Q、N74D-N198A-M211Q-Q256E、N74D-N198G-M211Q、N74D-N198G-M211Q-N212Q、N74D-N198G-M211Q-Q256E、N74D-N198K-M211Q-N212Q、N74D-N198L-M211Q-N212Q、N74D-N198Q-M211Q-N212Q、N74D-N198R-M211Q-N212Q、N74D-N198T-M211Q-N212Q、N74D-N198V-M211Q-N212Q、N74D-N212Q-Q256E、N74D-Q256E、N74D-R207Q、N74D-R207Q-M211N、N74D-R207Q-M211N-N212Q、N74D-R207Q-M211N-N212Q-Q256E、N74D-R207Q-M211N-Q256E、N74D-R207Q-M211Q、N74D-R207Q-M211Q-N212Q、N74D-R207Q-M211Q-N212Q-Q256E、N74D-R207Q-N212Q、N74D-R207Q-N212Q-Q256E、N74D-R207Q-Q256E、N74D-N198S-M211Q、和N74D-N198L-M211Q，并且与SEQ ID NO:6具有至少90％的氨基酸序列同一性。
25.在另一方面，提供了一种用于将淀粉转化为寡糖的方法，所述方法包括使所述淀粉与有效量的如段落1-22中任一项所述的变体α-淀粉酶接触。
26.在另一方面，提供了一种用于从表面除去淀粉污渍或污垢的方法，所述方法包括使所述表面与有效量的如段落1-22中任一项所述的变体α-淀粉酶接触，并且允许所述多肽水解存在于所述淀粉污渍中的淀粉组分以产生溶解于水性组合物中的较小的衍生自淀粉的分子，从而从所述表面除去所述淀粉污渍。
27.在另一方面，提供了核酸，其编码如段落1-22中任一项所述的变体α-淀粉酶。
28.在另一方面，提供了宿主细胞，其包含如段落27所述的核酸。
从以下说明书和所附实例中，本发明的组合物和方法的这些及其他方面和实施例将是清楚的。
附图说明
图1显示AA2560、AA707、AA560、和AAI10的Clustal W氨基酸序列比对。
图2显示AA2560淀粉酶通过中心β-筒的视图。筒底部的残基显示为呈球形的α-碳位置。给出了这些位置的氨基酸编号。
图3显示AA2560淀粉酶的中心β-筒的侧视图，其以前面氨基酸82-94处的螺旋定向。筒底部的残基显示为呈球形的α-碳位置和指示的位置编号。
图4是显示AA2560结构模型中的两个螺旋的剖视图。位置28和91以棒状表示。左图显示以棒状表示的野生型Arg28和Ser91。右图显示以棒状表示的S91R变体中两个Arg残基的接近位置。
图5是显示AA2560、AA560、AA707、和AAI10组合变体在清洁测定中的性能的表。
具体实施方式
描述了涉及成麦芽五糖/麦芽六糖变体淀粉酶的组合物和方法。变体是通过如所附实例中详述的实验方法发现的。变体淀粉酶的示例性应用是用于清洁餐具洗涤、衣物和其他应用中的淀粉污渍，用于淀粉液化或糖化，用于纺织品加工(例如脱浆)，在动物饲料中用于改善消化率，以及用于烘焙和酿造。下文详细描述了这些组合物和方法的这些和其他方面。
在描述本发明的组合物和方法的各个方面和实施例之前，描述了以下定义和缩写。
1.定义和缩写
根据这一详细说明，以下缩写和定义适用。应当注意单数形式“一个/一种(a/an)”和“该/所述(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另有清楚地指示。因此，例如，提及“酶”包括多种此类酶，并且提及“剂量”包括提及本领域技术人员已知的一次或多次剂量及其等效物等。
将本文件组织成若干部分以便于阅读；然而，读者将领会的是，在一个部分中进行的陈述可能适用于其他部分。以这种方式，用于本公开的不同部分的标题不应被解释为限制。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。为了清楚起见，以下术语定义如下。
1.1.缩写和首字母缩略词
除非另外说明，否则以下缩写/首字母缩略词具有以下含义：
℃ 摄氏度
ADW 自动餐具洗涤
dH2O或DI 去离子水
dIH2O 去离子水，Milli-Q过滤
DNA 脱氧核糖核酸
EC 酶学委员会
g或gm 克
GA 葡糖淀粉酶
H2O 水
HDD 重垢粉末洗涤剂
HDL 高密度液体洗涤剂
hr 小时
HSG 高泡沫颗粒状洗涤剂
kDa 千道尔顿
kg 千克
M 摩尔
mg 毫克
min 分钟
mL和ml 毫升
mm 毫米
mM 毫摩尔
MW 分子量
MWU 经修饰的Wohlgemuth单位；1.6x10-5mg/MWU＝活性单位
PI 性能指数
ppm 百万分率，例如μg蛋白质/克干固体
sec 秒
sp. 物种
U 单位
v/v 体积/体积
w/v 重量/体积
w/w 重量/重量
wt％ 重量百分比
μg 微克
μL和μl 微升
μm 微米
μM 微摩尔
1.2.定义
术语“α-淀粉酶”或“淀粉分解酶”或通常淀粉酶是指这样的酶：除其他事项之外，其能够催化淀粉的降解。α-淀粉酶是切割淀粉中α-D-(1→4)O-糖苷键的水解酶。通常，α-淀粉酶(EC 3.2.1.1；α-D-(1→4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)被定义为内切作用的酶，其以随机方式切割淀粉分子内的α-D-(1→4)O-糖苷键，产生含有三个或更多个(1-4)-α-连接的D-葡萄糖单元的多糖。相反地，外切作用的淀粉分解酶，例如β-淀粉酶(EC 3.2.1.2；α-D-(1→4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)和一些产物特异性α-淀粉酶(如生麦芽糖α-淀粉酶(EC 3.2.1.133))从底物的非还原端切割多糖分子。β-淀粉酶、α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20；α-D-葡萄糖苷葡糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3；α-D-(1→4)-葡聚糖葡糖水解酶)和产物特异性淀粉酶(如麦芽四糖苷酶(EC 3.2.1.60)和麦芽六糖苷酶(EC3.2.1.98))可以生产特定长度的麦芽寡糖或富含糖浆的特定麦芽寡糖。一些细菌α-淀粉酶主要从淀粉和相关的α-1,4-葡聚糖中产生麦芽四糖(G4)、麦芽五糖(G5)或麦芽六糖(G6)，而大多数α-淀粉酶进一步将它们转化为葡萄糖和或麦芽糖作为最终产物。G6淀粉酶(如衍生自芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)DSM 12649(即STAINZYMETM的亲本)的AA560淀粉酶和芽孢杆菌属物种707淀粉酶)，也被称为成麦芽六糖α-淀粉酶(EC 3.2.1.98)，在技术上是外切作用的，但与α-淀粉酶相比具有类似的结构，并且在某些情况下似乎对一些相同的有益突变有应答。
本文中的“酶单位”是指在特定测定条件下每次形成的产物量。例如，“葡糖淀粉酶活性单位”(GAU)被定义为在60℃，pH 4.2下，每小时从可溶性淀粉底物(4％DS)中产生1g葡萄糖的酶量。“可溶性淀粉单位”(SSU)是在pH 4.5，50℃下，每分钟从可溶性淀粉底物(4％DS)中产生1mg葡萄糖的酶量。DS是指“干固体”
术语“淀粉”是指由植物的复合多糖碳水化合物组成的任何材料，这些复合多糖碳水化合物由具有式(C6H10O5)x(其中“X”可以是任何整数)的直链淀粉和支链淀粉构成。该术语包括植物基材料，例如谷物、谷类、草、块茎和根，并且更特别地，从小麦、大麦、玉米、黑麦、稻、高粱、麸、木薯、粟、买罗高粱(milo)、马铃薯、甘薯、和树薯(tapioca)淀粉获得的材料。术语“淀粉”包括颗粒状淀粉。术语“颗粒状淀粉”是指生淀粉(即未烹调的淀粉)，例如，未经历糊化的淀粉。
如本文所使用的，术语“液化”或“使液化”是指淀粉转化为粘度更低和更短链糊精的工艺。
关于多肽，术语“野生型”、“亲本”或“参照”是指在一个或多个氨基酸位置处不包含人为取代、插入或缺失的天然存在的多肽。类似地，关于多核苷酸，术语“野生型”、“亲本”或“参照”是指不包括人为核苷变化的天然存在的多核苷酸。然而，注意编码野生型、亲本、或参照多肽的多核苷酸不限于天然存在的多核苷酸，并且涵盖编码野生型、亲本、或参照多肽的任何多核苷酸。
对野生型多肽的提及应理解为包括多肽的成熟形式。“成熟”多肽或其变体是其中不存在信号序列的多肽或变体，例如，在多肽表达期间或之后从未成熟形式的多肽切割。
关于多肽的术语“变体”是指与指定的野生型、亲本或参照多肽不同的多肽，因为它包括一种或多种天然存在的或人为的氨基酸取代、插入或缺失。类似地，关于多核苷酸的术语“变体”是指在核苷酸序列方面与指定的野生型、亲本或参照多核苷酸不同的多核苷酸。野生型、亲本或参照多肽或多核苷酸的特性将从上下文中显而易见。
在本发明α-淀粉酶的情况下，“活性”是指α-淀粉酶活性，其可以如本文所述测量。
术语“性能益处”是指分子的期望特性上的改善。示例性的性能益处包括但不限于：淀粉底物水解增加，谷物、谷类或其他淀粉底物的液化性能增强，清洁性能增强，热稳定性增强，洗涤剂稳定性增强，储存稳定性增强，溶解度增加，pH曲线改变，钙依赖性降低，比活性增加，底物特异性经修饰，底物结合经修饰，pH依赖性活性经修饰，pH依赖性稳定性经修饰，氧化稳定性增加，和表达增加。在一些情况下，性能益处是在相对较低的温度下实现的。在一些情况下，性能益处是在相对较高的温度下实现的。
术语“蛋白酶”(“protease”和“proteinase”)是指具有进行“蛋白水解”或“蛋白水解切割”的能力的酶蛋白，该“蛋白水解”或“蛋白水解切割”是指水解将形成该蛋白质的肽或多肽链中的氨基酸连接在一起的肽键。蛋白酶作为蛋白质消化酶的这种活性被称为“蛋白水解活性”。
术语“丝氨酸蛋白酶”是指切割蛋白质中的肽键的酶，其中酶丝氨酸在酶活性位点处充当亲核氨基酸。基于其结构将丝氨酸蛋白酶分为两大类：胰凝乳蛋白酶样(胰蛋白酶样)或枯草杆菌蛋白酶样。最常用于衣物和餐具洗涤剂中的是丝氨酸蛋白酶，特别是枯草杆菌蛋白酶。
“组合变体”是包括两个或更多个突变，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个取代、缺失、和/或插入的变体。
术语“重组”当用于提及主题细胞、核酸、蛋白质或载体时，表明受试者已经从其天然状态被修饰。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内没有发现的基因，或者以不同于在自然界发现的水平或在不同于在自然界发现的条件下表达天然基因。重组核酸与天然序列相差一个或多个核苷酸，和/或可操作地连接到异源序列，例如，表达载体中的异源启动子。重组蛋白可以与天然序列相差一个或多个氨基酸，和/或与异源序列融合。包含编码淀粉酶的核酸的载体是重组载体。
术语“回收的”、“分离的”和“单独的”是指从如天然存在的与其天然相关的至少一种其他材料或组分中除去的化合物、蛋白质(多肽)、细胞、核酸、氨基酸、或者其他指定的材料或组分。其“分离的”多肽包括但不限于含有在异源宿主细胞中表达的分泌多肽的培养液。
术语“纯化的”是指处于相对纯的状态的材料(例如，分离的多肽或多核苷酸)，例如，至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯、或甚至至少约99％纯。
术语“富集的”是指处于约50％纯、至少约60％纯、至少约70％纯、或甚至至少约70％纯的材料(例如，分离的多肽或多核苷酸)。
关于酶的术语“热稳定的”和“热稳定性”是指酶在暴露于升高的温度后保持活性的能力。酶(例如淀粉酶)的热稳定性通过以分钟、小时或天给出的其半衰期(t1/2)来测量，在此期间酶活性的一半在限定条件下丧失。半衰期可以通过测量暴露于(即，受挑战于)升高的温度后的残余α-淀粉酶活性来计算。
关于酶的“pH范围”是指在其下酶显示催化活性的pH值的范围。
关于酶的术语“pH稳定”和“pH稳定性”涉及在较大范围的pH值内，酶保持预定时间段(例如，15min.、30min.、1小时)的活性的能力。
术语“氨基酸序列”与术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”同义，并且可互换地使用。当此类氨基酸序列显示出活性时，它们可以被称为“酶”。使用针对氨基酸残基的常规单字母或三字母密码，采用标准氨基端-至-羧基端取向(即N→C)表示氨基酸序列。
术语“核酸”涵盖能够编码多肽的DNA、RNA、异源双链体、以及合成分子。核酸可以是单链的或双链的，并且可以含有化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”可互换地使用。由于遗传密码是简并的，因此可以使用多于一个密码子来编码特定氨基酸，并且本发明的组合物和方法涵盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另有说明，否则核酸序列以5′-至-3′取向呈现。
“合成的”分子通过体外化学或酶促合成而不是通过生物体产生。
在将核酸序列插入细胞的上下文中，术语“引入”意指本领域已知的“转染”、“转化”或“转导”。
“宿主菌株”或“宿主细胞”是已经引入了表达载体、噬菌体、病毒或其他DNA构建体，包括编码目的多肽(例如，淀粉酶)的多核苷酸的生物。示例性宿主菌株是能够表达目的多肽和/或发酵糖类的微生物细胞(例如，细菌、丝状真菌和酵母)。术语“宿主细胞”包括从细胞产生的原生质体。
关于多核苷酸或蛋白质的术语“异源”是指不是天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。
关于多核苷酸或蛋白质的术语“内源”是指天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。
术语“表达”是指基于核酸序列产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译两者。
“信号序列”是附接到蛋白质的N末端部分的氨基酸序列，该氨基酸序列有利于蛋白质在细胞外的分泌。细胞外蛋白的成熟形式缺乏在分泌过程中被切除的信号序列。
“生物学活性的”是指具有指定生物活性，例如酶活性的序列。
术语“比活性”是指在特定条件下每单位时间通过酶或酶制剂可转化为产物的底物的摩尔数。比活性通常表示为单位(U)/mg蛋白质。
如本文所使用的，“水硬度”是水中存在的矿物质(例如，钙和镁)的量度。
“包含淀粉酶的经培养的细胞材料”或类似语言是指包括淀粉酶作为组分的细胞裂解物或上清液(包括介质)。细胞材料可以来自异源宿主，其在培养物中生长，目的是产生淀粉酶。
“序列同一性百分比”意指当使用具有默认参数的CLUSTAL W算法比对时，特定序列具有与指定参照序列中的氨基酸残基同一的至少一定百分比的氨基酸残基。参见Thompson等人(1994)Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680。CLUSTAL W算法的默认参数是：
Figure BDA0003699957980000151
与参考序列相比，缺失被视为不同一的残基。
术语“干固体含量”(ds)是指基于干重百分比的、浆料的总固体。术语“浆料”指含有不可溶固体的水性混合物。
短语“同时糖化和发酵(SSF)”是指生物化学品的生产工艺，其中在同一工艺步骤中存在微生物如产乙醇微生物和至少一种酶如淀粉酶。SSF包括在相同的反应容器中同时将淀粉底物(颗粒状、液化的或溶解的)水解为糖类(包括葡萄糖)和将糖类发酵为醇类或其他的生物化学品或生物材料。
“产乙醇微生物”是指具有将糖或寡糖转化为乙醇的能力的微生物。
术语“发酵饮料”是指通过包括发酵工艺(例如微生物发酵，如细菌和/或真菌发酵)的方法生产的任何饮料。
术语“麦芽”是指任何发芽的谷类谷粒，如发芽的大麦或小麦。
术语“醪液”是指任何含有淀粉和/或糖的植物材料如谷粉(例如包括压碎的大麦麦芽、压碎的大麦)和/或其他辅料或其组合的含水浆料，随后与水混合以分离成麦芽汁和废糟。
术语“麦芽汁”是指糖化醪制备期间，对谷粉进行提取后，未发酵的液体流出物(run-off)。
术语“约”是指参照值的±15％。
2.成麦芽五糖/麦芽六糖α-淀粉酶变体
描述了成麦芽五糖/麦芽六糖α-淀粉酶的组合变体，其在自动餐具洗涤(ADW)应用中显示高程度的性能。这些变体与来自芽孢杆菌属物种的α-淀粉酶(在本文中称为AA2560，并且先前在WO 2018/184004中鉴定为BspAmy24(SEQ ID NO:1))最密切相关。AA2560α-淀粉酶的成熟氨基酸序列如以下SEQ ID NO:1所示：
Figure BDA0003699957980000161
Figure BDA0003699957980000171
密切相关的成麦芽五糖/麦芽六糖α-淀粉酶来自芽孢杆菌属物种707，在本文中称为“AA707”。AA707α-的成熟氨基酸序列如以下SEQ ID NO:2所示：
Figure BDA0003699957980000172
另一密切相关的成麦芽五糖/麦芽六糖α-淀粉酶来自芽孢杆菌属物种，称为AA560。AA560的成熟氨基酸序列如下SEQ ID NO:3所示：
Figure BDA0003699957980000173
Figure BDA0003699957980000181
基于氨基酸序列同一性，另一假设的成麦芽五糖/麦芽六糖α-淀粉酶来自另一芽孢杆菌属物种，并且在本文中称为AAI10。AAI10α-淀粉酶的成熟氨基酸序列如以下SEQ IDNO:4所示：
Figure BDA0003699957980000182
这四种α-淀粉酶的比对示于图1中。氨基酸序列同一性总结于表1中。AA707、AA560和AAI10都与AA2560具有大于80％的氨基酸。
表1.α-淀粉酶的氨基酸序列同一性
Figure BDA0003699957980000183
本发明的变体的一个特征是位置91处的突变和/或α-淀粉酶TIM筒结构的底部处的至少一个突变。筒底部的残基具有大于零的溶剂可及表面积，并且位于或邻近核心β-筒结构，位于筒的与活性位点相对的一侧，以及含有每条链的N-末端的一侧。使用MOE2018.01(化学计算集团公司(Chemical Computing Group)，蒙特利尔)、使用默认参数、并且基于使用默认参数和来自pdb的1BLI结构的MOE 2018.01构建的AA2560同源模型来计算溶剂可及表面积。相关残基位于参考SEQ ID NO:1进行编号的位置6、7、40、96、98、100、229、230、231、262、263、285、286、287、288、322、323、324、325、362、363、和364处。可以借助图2和3中的图像来理解这些筒底部残基的结构意义。在所有情况下，残基排列在TIM筒结构的底部，其表示α-淀粉酶和许多其他酶的主要结构特征。残基91处的示例性突变是将极性残基取代为带电荷的残基，特别是带正电荷的残基(如精氨酸(即X91R))，其在AA2560的情况下是特定取代S91R。
值得注意的例外是，Amy707不同于AA2560、AAI10、和AA560(以及来自噬细胞菌属物种(Cytophaga sp.)(Jeang,C-L.等人(2002)Applied and Environmental Microbiolgy[应用与环境微生物学],68:3651-54；Genbank保藏号AAA22231)，芽孢杆菌属物种TS-23(Lin,L-L.等人(1997)J Appl Microbiol[应用微生物学杂志],82:325-34；Genbank保藏号AAA63900)和其他的淀粉酶)，因为它在位置28处不具有能带正电荷的氨基酸残基。参考SEQID NO:1进行编号的AA2560、AAI10、和AA560具有Arg或His侧链(位置28)，而Amy707具有Asn，其不能带正电荷(表2)。
表2.四种淀粉酶位置28处的氨基酸侧链
淀粉酶 位置28处的野生型残基
AA707 Asn
AA2560 Arg
AAl10 His
AA560 Arg
因此，在AA2560、AA560、AAI10、和许多其他的淀粉酶中，Ser91突变为Arg将导致两个带正电荷的氨基酸的位置非常接近，如从图4中所示的AA2560的模型明显看出的。在不限于理论的情况下，假设这些残基的接近位置可以通过将螺旋重新定位在位置22-37和82-95处(作为电荷-电荷排斥的结果)而有利地影响许多淀粉酶(如AA2560)的活性。相比之下，野生型Amy707中的Asn28可能能与位置91处的Arg形成氢键，这可能导致更紧密的相互作用(可能不利于Amy707的活性)。如上文和下文，将SEQ ID NO:1用于编号。
筒底部残基的示例性突变是包括但不限于以下的取代：X40N、X40D、X100F、X100L、X263Y、X288D、X288K、X288Q、X324R、X324N、X324M、X364L、和X364M，其中“X”是先前存在于野生型亲本α-淀粉酶中的氨基酸残基。参考AA2560的特定突变是T40N、T40D、Y100F、Y100L、F263Y、S288D、S288K、S288Q、I324R、I324N、I324M、Y364L、和Y364M。
以不同方式描述，变体具有包括以下的一个、两个、三个或更多个特征：位置40处的N或D，位置100处的F或L，位置263处的Y，位置288处的D、K或Q，位置324处的R、N或M，或位置364处的L或M。
虽然位置91处的突变和筒底部的突变组合产生了优越的性能优势，但单独每个突变似乎都产生了益处，并且一些本发明的变体仅在一个位置/结构处具有突变。
变体可以额外地在环中具有特征突变，该环包括参考SEQ ID NO:1进行编号的表面暴露的残基167、169、171、172、和176。示例性突变包括但不限于取代：X167F、X169H、X171Y、X172R、X172N、和X176S，以及特别地W167F、Q169H、R171Y、Q172R、Q172N、和R176S。以不同方式描述，变体特征取代包括参考SEQ ID NO:1进行编号的位置167处的F、位置169处的H、位置171处的Y、位置172处的R或N、和/或位置176处的S。
变体可以额外地在位置116和281处具有特征突变，这些特征突变被认为影响溶解度。这些位置处的示例性突变是取代X116R和X281S，特别地取代W116R和H281S。
变体可以额外地在参考SEQ ID NO:1进行编号的位置190和/或244处具有特征稳定突变。此类突变已被很好地分类，并包括在目前可商购的α-淀粉酶(用于清洁、谷物加工和纺织品加工)中。这些残基中的示例性突变是取代X190P和X244A，E或Q，特别地E190P、S244A、S244E、和S244Q。位置275和279处的突变与位置190处的突变的组合也是令人感兴趣的。
变体可以额外地在参考SEQ ID NO:1进行编号的位置1、7、118、195、202、206、321、245、和459处具有特征突变，这些变体被包括在目前可商购的α-淀粉酶中或被提出用于此类应用。
变体可以进一步包括与对应于使用SEQ ID NO:1进行编号的R181、G182、T183、和G184的钙结合环相邻的X1G/X2G2基序中的缺失。在一些实施例中，变体α-淀粉酶包括对应于R181和G182，或T183和G184的氨基酸残基的相邻、成对缺失。对应于R181和G182的氨基酸残基中的缺失可以称为“ΔRG”，而对应于位置183处的残基(通常是T、D、或H)和G184的氨基酸残基的缺失可适当地称为“ΔTG”、“ΔDG”、“ΔHG”等。两种成对缺失似乎在α-淀粉酶中产生相同效果。
变体可以进一步包括用于在其他α-淀粉酶中使用的先前描述的突变，这些α-淀粉酶与(i)熟知的芽孢杆菌属α-淀粉酶(例如自地衣芽孢杆菌(B.lichenifomis)(即BLA和LAT)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)(即BSG)和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquifaciens)(即P00692、BACAM和BAA))或其杂交体中的任一种，(ii)归类为碳水化合物-活性酶数据库(CAZy)家族13α-淀粉酶的任何α-淀粉酶，或(iii)在这以前以描述性术语“Termamyl-样”提及的任何淀粉酶具有类似的折叠和/或具有60％或更高的氨基酸序列同一性。示例性α-淀粉酶包括但不限于来自芽孢杆菌属物种SG-1、芽孢杆菌属物种707的那些，和被称为A7-7、SP722、DSM90 14、和KSM AP1378的α-淀粉酶。类似地，本文所述的突变的任何组合都可以在这些α-淀粉酶(无论它们是否被描述为产麦芽五糖/麦芽六糖α-淀粉酶)中产生性能优势。
以下列出了特定预期的组合变体(使用SEQ ID NO:1进行编号)。如上所述，预计具有ΔR183-ΔT184而不是ΔR181-ΔG182的类似变体的性能与详细描述的那些一样好。
T40-S91-Q169-ΔR181-ΔG182-T183-H281
Q172-ΔR181-ΔG182-E190-S288
Q172-ΔR181-ΔG182-S244-S288-S474
S91-Q172-ΔR181-ΔG182-E190-I324
T40-S91-ΔR181-ΔG182-E190-F263
T40-S91-ΔR181-ΔG182-S244-Y364
S91-Q172-ΔR181-ΔG182-E190-I324
S91-W116-Q172-ΔR181-ΔG182-S244-H281-S288
T40-S91-Y100-W116-Q172-ΔR181-ΔG182-S244-H281
T40-S91-Q172-ΔR181-ΔG182-S244-F263-H281
S91-Q172-ΔR181-ΔG182-E190-I324
T40-S91-Q172-ΔR181-ΔG182-E190-H281-I324
Y364-ΔR181-ΔG182
在相关的α-淀粉酶(包括先前工程化的α-淀粉酶)中，突变可以描述为：
X40-X91-X169-ΔR181-ΔG182-X183-X281
X172-ΔR181-ΔG182-X190-X288
X172-ΔR181-ΔG182-X244-X288-X474
X91-X172-ΔR181-ΔG182-X190-X324
X40-X91-ΔR181-ΔG182-X190-X263
X40-X91-ΔR181-ΔG182-X244-X364
X91-X172-ΔR181-ΔG182-X190-X324
X91-X116-X172-ΔR181-ΔG182-X244-X281-X288
X40-X91-X100-X116-X172-ΔR181-ΔG182-X244-X281
X40-X91-X172-ΔR181-ΔG182-X244-X263-X281
X91-X172-ΔR181-ΔG182-X190-X324
X40-X91-X172-ΔR181-ΔG182-X190-X281-X324
X364L-ΔR181-ΔG182
此类变体包括具有以下特征中的两个、三个、四个、五个、六个或更多个特征的那些：(a)位置40处的D或N和/或位置91处的R和(b)位置100处的F，位置263处的Y，位置288处的D，位置324处的M、N或R，和/或位置364处的L，任选地与(c)位置169处的H，位置183M处的M，位置281处的N或S，位置172处的N或R，位置190处的P，位置244处的E、Q或R，位置474处的R，位置116处的R的组合，任选地与位置181和182或183和184处的成对缺失的组合。
以下列出了测试变体中的特定取代：
T40N-S91R-Q169H-ΔR181-ΔG182-T183M-H281N
Q172R-ΔR181-ΔG182-E190P-S288D
Q172R-ΔR181-ΔG182-S244E-S288D-S474R
S91R-Q172R-ΔR181-ΔG182-E190P-I324M
T40N-S91R-ΔR181-ΔG182-E190P-F263Y
T40N-S91R-ΔR181-ΔG182-S244E-Y364L
S91R-Q172R-ΔR181-ΔG182-E190P-I324R
S91R-W116R-Q172R-ΔR181-ΔG182-S244E-H281S-S288D
T40N-S91R-Y100F-W116R-Q172N-ΔR181-ΔG182-S244Q-H281S
T40N-S91R-Q172R-ΔR181-ΔG182-S244Q-F263Y-H281S
S91R-Q172R-ΔR181-ΔG182-E190P-I324N
T40D-S91R-Q172R-ΔR181-ΔG182-E190P-H281S-I324R
Y364L-ΔR181-ΔG182
应当理解，当α-淀粉酶天然具有以上列出的突变时(即，其中野生型α-淀粉酶已经包含被鉴定为突变的残基)，那么特定突变不适用于该分子。然而，其他描述的突变可以与在该位置处的天然存在的残基组合作用。
本发明的变体α-淀粉酶还可以包括氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加(例如小于10、小于9、小于8、小于7、小于6、小于5、小于4、小于3或甚至小于2个取代、缺失或添加)。预期此类变体具有与衍生其的α-淀粉酶类似的活性。本发明的变体α-淀粉酶还可以在它们的N或C-末端包括一个或几个残基的微小缺失和/或延伸。此类微小变化不可能破坏本文所述的发明概念。
本发明的淀粉酶可以是“前体”、“未成熟”或“全长”的，在这种情况下，它们包含信号序列；或“成熟”的，在这种情况下，它们缺乏信号序列。成熟形式的多肽通常是最有用的。除非另有说明，本文使用的氨基酸残基编号是指相应淀粉酶多肽的成熟形式。
在一些实施例中，变体α-淀粉酶与SEQ ID NO:1、2、3、或4具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或者甚至至少99％、但小于100％的氨基酸序列同一性。
2.5.编码变体淀粉酶多肽的核苷酸
在另一方面，提供了编码变体α-淀粉酶多肽的核酸。该核酸可以编码特定淀粉酶多肽，或与特定α-淀粉酶具有指定程度的氨基酸序列同一性的α-淀粉酶。
在一些实施例中，该核酸编码α-淀粉酶，该α-淀粉酶与SEQ ID NO:1、2、3、或4具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％、但少于100％的氨基酸序列同一性。应当理解，由于遗传密码的简并性，多个核酸可以编码相同的多肽。
在一些实施例中，该核酸在严格或非常严格条件下与编码α淀粉酶的核酸(或与编码α淀粉酶的核酸互补的核酸)杂交，该α-淀粉酶与SEQ ID NO:1、2、3、或4具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％、但少于100％的氨基酸序列同一性。
3.变体α-淀粉酶的生产
本发明的变体α-淀粉酶可以使用本领域熟知的方法，例如通过分泌或细胞内表达，在宿主细胞中产生。发酵、分离和浓缩技术是本领域熟知的，并且可使用常规方法来制备浓缩的、含变体α-淀粉酶多肽的溶液。
对于生产规模的回收，可以如上一般情况下所述通过用聚合物絮凝除去细胞来富集或部分纯化变体α-淀粉酶多肽。可替代地，可以通过微滤富集或纯化酶，然后使用可用的膜和设备通过超滤进行浓缩。然而，对于一些应用，酶不需要富集或纯化，并且可以裂解和使用全培养液培养物而无需进一步处理。然后可以将酶加工成例如颗粒。
4.含有变体α-淀粉酶的清洁组合物
本发明组合物和方法的一个方面涉及一种清洁组合物，该清洁组合物包括作为用于例如自动和手动餐具洗涤(ADW)、衣物洗涤和其他硬表面清洁的组分的变体α-淀粉酶。
4.1.概述
优选地，变体α-淀粉酶以常规用于已知α-淀粉酶的浓度或低于该浓度掺入洗涤剂配制品中。由于所述α-淀粉酶变体在性能上优于任何先前可用的，因此与现有的α-淀粉酶相比，预期其在标准剂量下提供优越的性能，并在较低剂量下提供类似的性能。用于包含本发明的α-淀粉酶的洗涤剂组合物的特定形式和配制品描述如下。
4.2.自动餐具洗涤(ADW)洗涤剂组合物
示例性ADW洗涤剂组合物包括非离子表面活性剂，包括乙氧基化非离子表面活性剂、醇烷氧基化表面活性剂、环氧封端的聚(氧基烷基化)醇或胺氧化物表面活性剂，它们以0重量％至10重量％的量存在；助洗剂(在5％-60％范围内的助洗剂)包括：磷酸盐助洗剂(例如单磷酸盐、二磷酸盐、三聚磷酸盐、其他低聚磷酸盐、三聚磷酸钠-STPP)，和无磷酸盐助洗剂(例如基于氨基酸的化合物，包括甲基-甘氨酸-二乙酸(MGDA)及其盐和衍生物、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)及其盐和衍生物、亚氨基二琥珀酸(IDS)及其盐和衍生物、羧基甲基菊粉及其盐和衍生物、次氮基三乙酸(NTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、β-丙氨酸二乙酸(β-ADA)及其盐)，多元羧酸及其部分或完全中和盐的均聚物和共聚物，单体多元羧酸和羟基羧酸及其盐，它们在0.5重量％至50重量％的范围内；在约0.1重量％至约50重量％的范围内的磺化/羧化聚合物以提供尺寸稳定性；在约0.1重量％至约10重量％范围内的干燥助剂(例如，聚酯，尤其是阴离子聚酯(任选地与具有利于缩聚的3至6个官能团-典型地酸、醇或酯官能团的另外的单体一起)，聚碳酸酯-、聚氨酯-和/或聚脲-聚有机硅氧烷化合物或其前体化合物，特别是反应性环状碳酸酯和尿素类型)；在约1重量％至约20重量％的范围内的硅酸盐(包括硅酸钠或硅酸钾，例如二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶页硅酸盐)；无机漂白剂(例如，过氧水合物盐例如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)和有机漂白剂(例如有机过氧酸，包括二酰基和四酰基过氧化物，尤其是二过氧十二烷二酸、二过氧十四烷二酸、和二过氧十六烷二酸)；漂白活化剂(即有机过酸前体，其在约0.1重量％至约10重量％的范围内)；漂白催化剂(例如锰三氮杂环壬烷及相关络合物、Co、Cu、Mn和Fe双吡啶胺及相关络合物、以及五胺乙酸钴(III)及相关络合物)；在约0.1重量％至5重量％的范围内的金属护理剂(例如苯并三氮唑、金属盐和络合物、和/或硅酸盐)；每克自动餐具洗涤剂组合物的从约0.01mg至5.0mg活性酶范围内的酶(例如蛋白酶、α-淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂合酶、甘露聚糖酶、角质酶、漆酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、酰基转移酶、过水解酶、芳基酯酶、及其混合物)；以及酶稳定剂组分(例如寡糖、多糖、和无机二价金属盐)。
表2中示出了特定的示例性ADW组合物，其中至少一些本发明的变体已经过测试。
表2.示例性ADW组合物
Figure BDA0003699957980000271
4.3.重垢液体(HDL)衣物洗涤剂组合物
示例性HDL衣物洗涤剂组合物包括去污表面活性剂(10％至40％wt/wt)，包括阴离子清洁表面活性剂(选自以下组：直链或支链或无规链、取代或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐和/或其混合物)和任选地非离子表面活性剂(选自以下组：直链或支链或无规链、取代或未取代的烷基烷氧基化醇，例如C8-C18烷基乙氧基化醇和/或C6-C12烷基苯酚烷氧基化物)，其中阴离子清洁表面活性剂(具有从6至9的亲水指数(HIc))与非离子清洁表面活性剂的重量比大于1:1。适合的去污表面活性剂还包括阳离子去污表面活性剂(选自以下组：烃基吡啶鎓化合物、烃基季铵化合物、烃基季鏻化合物、烃基叔锍化合物、和/或其混合物)；兼性离子和/或两性去污表面活性剂(选自以下组：链烷醇胺磺基甜菜碱)；两性表面活性剂；半极性非离子表面活性剂及其混合物。
组合物可以任选地包括由两亲烷氧基化油脂清洁聚合物组成的表面活性增强聚合物，这些两亲烷氧基化油脂清洁聚合物(选自以下组：具有支链亲水和疏水特性的烷氧基化聚合物，例如烷氧基化聚亚烷基亚胺(在0.05wt％-10wt％范围内))和/或无规接枝聚合物(典型地包含含有选自由以下组成的组的单体的亲水主链：不饱和的C1-C6羧酸、醚、醇、醛、酮、酯、糖单元、烷氧基单元、马来酸酐、饱和的多元醇(如甘油)及其混合物)；以及一个或多个疏水侧链，该疏水侧链选自由以下组成的组：C4-C25烷基基团、聚丙烯、聚丁烯、饱和的C1-C6单羧酸的乙烯酯、丙烯酸或甲基丙烯酸的C1-C6烷基酯及其混合物。
该组合物可以包括额外的聚合物，如污垢释放聚合物(包括阴离子封端的聚酯(例如SRP1)；包含至少一种单体单元的聚合物(处于无规或嵌段构型)，该单体单元选自糖、二羧酸、多元醇及其组合；基于乙二醇对苯二甲酸酯的聚合物及其共聚物(处于无规或嵌段构型)，例如Repel-o-tex SF、SF-2和SRP6、Texcare SRA100、SRA300、SRN100、SRN170、SRN240、SRN300和SRN325、Marloquest SL)；抗再沉积聚合物(0.1wt％至10wt％，包括羧酸酯聚合物，如包含至少一种单体的聚合物，该单体选自丙烯酸、马来酸(或马来酸酐)、富马酸、衣康酸、乌头酸、中康酸、柠康酸、亚甲基丙二酸及其任何混合物；乙烯基吡咯烷酮均聚物；和/或聚乙二醇，分子量范围为从500至100,000Da)；纤维素聚合物(包括那些选自烷基纤维素、烷基烷氧基烷基纤维素、羧基烷基纤维素、烷基羧基烷基纤维素的纤维素聚合物，它们的实例包括羧甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、甲基羧甲基纤维素以及其混合物)和聚合羧酸酯(如马来酸酯/丙烯酸酯无规共聚物或者聚丙烯酸酯均聚物)。
该组合物可以进一步包括饱和或不饱和脂肪酸，优选饱和或不饱和的C12-C24脂肪酸(0wt％至10wt％)；沉积助剂(其实例包括多糖；优选纤维素聚合物；聚联丙烯二甲基卤化铵(DADMAC))；和DAD MAC与乙烯基吡咯烷酮、丙烯酰胺、咪唑、咪唑啉卤化物及其混合物的共聚物(处于无规或嵌段构型)；阳离子瓜耳胶；阳离子纤维素，如阳离子羟乙基纤维素；阳离子淀粉；阳离子聚丙烯酰胺，及其混合物。
该组合物可以进一步包含染料转移抑制剂，其实例包括锰酞菁、过氧化物酶、聚乙烯基吡咯烷酮聚合物、聚胺N-氧化物聚合物、N-乙烯基吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯基噁唑烷酮和聚乙烯基咪唑和/或其混合物；螯合剂，其实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五亚甲基膦酸(DTPMP)、羟基乙烷二膦酸(HEDP)、乙二胺N,N'-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、丙二胺四乙酸(PDTA)、2-羟基吡啶-N-氧化物(HPNO)、或甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸N,N-二乙酸(N,N-二羧基甲基谷氨酸四钠盐(GLDA)、次氮基三乙酸(NTA)、4,5-二羟基间苯二磺酸、柠檬酸及其任何盐、N-羟基乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、N-羟基乙基亚氨基二乙酸(HEIDA)、二羟基乙基甘氨酸(DHEG)、乙二胺四丙酸(EDTP)、及其衍生物。
该组合物优选地包括选自以下的酶(通常约0.01wt％活性酶至0.03wt％活性酶)：蛋白酶、α-淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂合酶、甘露聚糖酶、角质酶、漆酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、酰基转移酶、过水解酶、芳基酯酶、及其任何混合物。该组合物可以包括酶稳定剂(其实例包括多元醇，例如丙二醇或甘油；糖或糖醇；乳酸；可逆蛋白酶抑制剂；硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯；或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸)。
该组合物任选地包括硅树脂或基于脂肪酸的泡沫抑制剂；调色染料、钙和镁阳离子、视觉信号传导成分、抗泡沫剂(0.001wt％至约4.0wt％)和/或结构剂/增稠剂(0.01wt％至5wt％，其选自由以下组成的组：甘油二酸酯和甘油三酸酯、乙烯乙二醇二硬脂酸酯、微晶纤维素、基于纤维素的材料、超细纤维素、生物聚合物、黄原胶、结冷胶、及其混合物)。
组合物可以是任何液体形式，例如液体或凝胶形式，或其任何组合。该组合物可以处于任何单位剂量形式，例如小袋。
4.4.重垢干/固体(HDD)衣物洗涤剂组合物
示例性HDD衣物洗涤剂组合物包含去污表面活性剂，其包括阴离子去污表面活性剂(例如，直链或支链或无规链、取代或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐和/或其混合物)；非离子去污表面活性剂(例如，直链或支链或无规链、取代或未取代的C8-C18烷基乙氧基化物和/或C6-C12烷基苯酚烷氧基化物)；阳离子去污表面活性剂(例如，烷基吡啶化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物，烷基三元锍化合物及其混合物)；兼性离子和/或两性去污表面活性剂(例如，链烷醇胺磺基甜菜碱)、两性表面活性剂、半极性非离子表面活性剂；及其混合物；助洗剂，包括无磷酸盐助洗剂(例如沸石助洗剂，其实例包括在0wt％至小于10wt％范围内的沸石A、沸石X、沸石P和沸石MAP)，磷酸盐助洗剂(例如在0wt％至小于10wt％范围内的三聚磷酸钠)，柠檬酸、柠檬酸盐和次氮基三乙酸，硅酸盐(例如，在0wt％至小于10wt％的范围内的硅酸钠或硅酸钾或偏硅酸钠，或层状硅酸盐(SKS-6))；碳酸盐(例如，在0wt％至小于80wt％范围内的碳酸钠和/或碳酸氢钠)；和漂白剂，这些漂白剂包括光漂白剂(例如磺化锌酞菁、磺化铝酞菁、呫吨染料及其混合物)；疏水或亲水性漂白活化剂(例如十二烷酰氧基苯磺酸盐、癸酰基氧基苯磺酸盐、癸酰基氧基苯甲酸或其盐、3,5,5-三甲基己酰基氧基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺-TAED、壬酰基氧基苯磺酸盐-NOBS、腈季铵盐及其混合物)；过氧化氢源(例如，无机过氧水合物盐，其实例包括过硼酸盐、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐或过硅酸盐的单或四水合钠盐)；预先形成的亲水和/或疏水过酸(例如过羧酸和盐、过碳酸和盐、过碘酸和盐，过氧单硫酸和盐、及其混合物)；和/或漂白催化剂(例如，亚胺漂白促进剂，其实例包括亚胺阳离子和聚离子、亚胺两性离子、改性胺、改性氧化胺、N-磺酰基亚胺、N-膦酰基亚胺、N-酰基亚胺、噻二唑二氧化物、全氟亚胺、环状糖酮及其混合物)；和含金属的漂白催化剂(例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子以及辅助金属阳离子(如锌或铝)和螯合物(如乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)及其水溶性盐))。
组合物优选地包括酶，例如蛋白酶、α-淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、胆碱氧化酶、过氧化物酶/氧化酶、果胶酸裂合酶、甘露聚糖酶、角质酶、漆酶、磷脂酶、溶血磷脂酶、酰基转移酶、过水解酶、芳基酯酶、及其任何混合物。
该组合物可以任选地包括额外的洗涤剂成分，包括香料微囊剂、淀粉包封的香料协调剂、调色剂、额外的聚合物(包括织物完整性和阳离子聚合物)、染料锁定成分、织物柔顺剂、增亮剂(例如C.I.荧光增亮剂)、絮凝剂、螯合剂、烷氧基化聚胺、织物沉积助剂和/或环糊精。
4.5.额外的酶
本文描述的清洁组合物中的任何一个均可以包括任何数量的额外的酶。通常，该一种或多种酶应与所选择的洗涤剂相容(例如，在pH最佳、与其他酶和非酶成分的相容性等方面)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。提供以下酶作为实例。
蛋白酶：
适合的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些蛋白酶。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体，连同天然加工的蛋白质。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶、碱性微生物蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、或胰凝乳蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶，尤其是衍生自芽孢杆菌属物种的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147、和枯草杆菌蛋白酶168(参见例如，WO 1989/06279)。示例性蛋白酶包括但不限于WO 1995/23221、WO 1992/21760、WO2008/010925、WO 2010/0566356、WO 2011/072099、WO 2011/13022、WO 2011/140364、WO2012/151534、WO 2015/038792、WO 2015/089441、WO 2015/089447、WO 2015/143360、WO2016/001449、WO 2016/001450、WO 2016/061438、WO 2016/069544、WO 2016/069548、WO2016/069552、WO 2016/069557、WO 2016/069563、WO 2016/069569、WO 2016/087617、WO2016/087619、WO 2016/145428、WO 2016/174234、WO 2016/183509、WO 2016/202835、WO2016/205755、WO 2008/0090747、WO 2018/118950、WO 2018/169750、WO/2018/118917、US5,801,039、US 5,340,735、US 5,500,364、US 5,855,625、RE 34606、US 5,955,340、US 5,700,676、US 6,312,936、US 6,482,628、US 8,530,219中描述的那些；以及WO 2007/044993、WO 2009/058303、WO 2009/058661、WO 2014/071410、WO 2014/194032、WO 2014/194034、WO 2014/194054和WO 2014/194117中描述的金属蛋白酶。
示例性商业蛋白酶包括但不限于MAXATASE、MAXACAL、MAXAPEM、
Figure BDA0003699957980000321
Figure BDA0003699957980000322
OXP、
Figure BDA0003699957980000323
PREFERENZTM蛋白酶(例如P100、P110、P280、P300)、EFFECTENZTM蛋白酶(例如P1000、P1050、P2000)、EXCELLENZTM蛋白酶(例如P1000)、
Figure BDA0003699957980000324
和PURAFAST(美国丹尼斯科公司(Danisco US))；
Figure BDA0003699957980000325
ULTRA、
Figure BDA0003699957980000326
Figure BDA0003699957980000327
16L、
Figure BDA0003699957980000328
ULTRA、
Figure BDA0003699957980000329
PRIMASE、DURAZYM、
Figure BDA00036999579800003210
Figure BDA00036999579800003211
PROGRESS
Figure BDA00036999579800003212
Figure BDA00036999579800003213
和
Figure BDA00036999579800003214
(诺维信公司(Novozymes))；BLAPTM和BLAPTM变体(汉高公司(Henkel))；LAVERGYTM PRO 104L(BASF)、和
Figure BDA00036999579800003215
(嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)枯草杆菌蛋白酶(花王公司(Kao)))。适合的蛋白酶包括特别选择或工程化以在相对低温下起作用的天然存在的蛋白酶或者工程化变体。
在本发明组合物和方法的特定实施例中，所述α-淀粉酶变体与来自吉氏芽孢杆菌的变体枯草杆菌蛋白酶(称为BG46)组合使用，该变体枯草杆菌蛋白酶具有氨基酸取代X39E、X99R、X126A、X127E、和X128G，并且进一步具有选自由以下组成的组的一个或多个额外的取代：N74D-M211L-N253P、R179Q-M211L-N253P、N74D-N253P、N85R-G160Q-R179Q-M211L-N212S-N253P、R179Q-N253P、G160Q-R179Q-M211L-N212S-N253P、R179Q-M211L、G160Q-R179Q-M211L-N253P、G160Q-R179Q-N212S-N253P、N74D-M211L、M211L-N242D、G160Q-R179Q-M211L-N212S、N74D-R179Q-M211L-N253P、G160Q-R179Q-M211L、G160Q-R179Q-N253P、N74D-Q200L-M211L、N74D-G160Q-N212S-N253P、N74D-G160Q-M211L-N253P、G160Q-R179Q、G160Q-R179Q-N212S、N74D-G160Q-N253P、N74D-G160Q-R179Q-M211L-N212S-N253P、N74D-N085R-G160Q-R179Q-M211L、N74D-G160Q-M211L-N212S-N253P、N74D-N085R-N116R-Q200L-Q256E、N74D-G160Q-R179Q-N212S-N253P、N74D-G160Q-M211L-N212S、N74D-G160Q、N74D-G160Q-R179Q-M211L-N253P、N74D-R179Q-M211L、N74D-G160Q-N212S、N74D-G160Q-M211L、N74D-G160Q-R179Q-N253P、N74D、N74D-G160Q-R179Q-M211L-N212S、N74D-N085R-M211L-N212S、N74D-G160Q-R179Q-N212S、N74D-G160Q-R179Q-M211L、N74D-M211L-Q256E、N74D-G160Q-R179Q、R179Q-M211L-N212S-N253P、R179Q-M211L-N212S、N74D-N085R-R179Q-M211L-N212S、N74D-M211L-N212S、N74D-R179Q-M211L-N212S、N74D-M211L-N242D、N74D-Q200L-M211L-Q256E、N74D-Q200L-M211L-N242D-Q256E、N74D-Q200L、N74D-M211N-N212Q、N74D-M211N-N212Q-Q256E、N74D-M211N-Q256E、N74D-M211Q、N74D-M211Q-N212Q、N74D-M211Q-N212Q-Q256E、N74D-M211Q-Q256E、N74D-N198A-M211Q、N74D-N198A-M211Q-N212Q、N74D-N198A-M211Q-Q256E、N74D-N198G-M211Q、N74D-N198G-M211Q-N212Q、N74D-N198G-M211Q-Q256E、N74D-N198K-M211Q-N212Q、N74D-N198L-M211Q-N212Q、N74D-N198Q-M211Q-N212Q、N74D-N198R-M211Q-N212Q、N74D-N198T-M211Q-N212Q、N74D-N198V-M211Q-N212Q、N74D-N212Q-Q256E、N74D-Q256E、N74D-R207Q、N74D-R207Q-M211N、N74D-R207Q-M211N-N212Q、N74D-R207Q-M211N-N212Q-Q256E、N74D-R207Q-M211N-Q256E、N74D-R207Q-M211Q、N74D-R207Q-M211Q-N212Q、N74D-R207Q-M211Q-N212Q-Q256E、N74D-R207Q-N212Q、N74D-R207Q-N212Q-Q256E、N74D-R207Q-Q256E、N74D-N198S-M211Q、和N74D-N198L-M211Q，其中氨基酸位置通过对应于SEQ ID NO:5的氨基酸序列进行编号，其中该变体与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少90％的氨基酸序列同一性。示出了这些氨基酸序列，如以下：
BG46蛋白酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)：
QQTVPWGITRVQAPAVHNRGITGSGVRVAILDSGISAHSDLNIRGGASFVPGEPTTADLNGHGTHVAGTVAALNNSIGVIGVAPNAELYAVKVLGANGSGSVSGIAQGLEWAATNNMHIANMSLGSDFPSSTLERAVNYATSRDVLVIAATGNNGSGSVGYPARYANAMAVGATDQNNRRANFSQYGTGIDIVAPGVNVQSTYPGNRYVSMNGTSMATPHVAGAAALVKQRYPSWNATQIRNHLKNTATNLGNSSQFGSGLVNAEAATR
具有取代S39E、S99R、S126A、D127E、和F128G的BG46的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)：
QQTVPWGITRVQAPAVHNRGITGSGVRVAILDSGISAHEDLNIRGGASFVPGEPTTADLNGHGTHVAGTVAALNNSIGVIGVAPNAELYAVKVLGANGRGSVSGIAQGLEWAATNNMHIANMSLGAEGPSSTLERAVNYATSRDVLVIAATGNNGSGSVGYPARYANAMAVGATDQNNRRANFSQYGTGIDIVAPGVNVQSTYPGNRYVSMNGTSMATPHVAGAAALVKQRYPSWNATQIRNHLKNTATNLGNSSQFGSGLVNAEAATR
脂肪酶：
适合的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的、蛋白水解修饰的或蛋白工程化的突变体。有用的脂肪酶的实例包括但不限于来自腐质酶属(Humicola)(同义词嗜热丝孢菌属)的脂肪酶，例如来自绵毛状腐质菌(H.lanuginosa)(疏棉状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus))(参见例如EP 258068和EP 305216)、来自特异腐质霉(H.insolens)(参见例如，WO 96/13580)；假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶(例如，来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或假产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)；参见例如，EP 218 272)；洋葱假单胞菌(P.cepacia)(参见例如，EP 331 376)；施氏假单胞菌(P.stutzeri)(参见例如，GB 1,372,034)；萤光假单胞菌(P.fluorescens)；假单胞菌属物种菌株SD 705(参见例如，WO 95/06720和WO 96/27002)；威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(参见例如WO 96/12012)；芽孢杆菌属脂肪酶(例如，来自枯草芽孢杆菌；参见例如，Dartois等人(1993),Biochemica et Biophysica Acta[生物化学与生物物理学报],1131:253-360)；嗜热脂肪芽孢杆菌(参见例如，JP 64/744992)；或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(参见例如,WO 91/16422)。考虑用于配制品中的额外的脂肪酶变体包括例如WO 92/05249、WO 94/01541、WO95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079、WO 97/07202、EP 407225和EP 260105中描述的那些。
示例性商业脂肪酶包括但不限于M1 LIPASE、LUMA FAST和LIPOMAX(杰能科公司(Genencor))；
Figure BDA0003699957980000351
Figure BDA0003699957980000352
和
Figure BDA0003699957980000353
ULTRA(诺维信公司)；和LIPASE P(天野药业有限公司(Amano Pharmaceutical Co.Ltd))。
聚酯酶：
适合的聚酯酶可以包括在组合物中，例如描述于例如WO 01/34899、WO 01/14629、和US 6,933,140中的那些。
淀粉酶：
本发明的组合物可以与其他淀粉酶组合，包括其他α-淀粉酶。当不同的α-淀粉酶表现出不同的性能特征并且多种不同的α-淀粉酶的组合导致提供不同α-淀粉酶的益处的组合物时，这种组合是特别令人希望的。其他α-淀粉酶包括可商购的α-淀粉酶，如但不限于
Figure BDA0003699957980000361
Figure BDA0003699957980000362
和BANTM(诺和诺德公司(Novo Nordisk A/S)和诺维信公司)；
Figure BDA0003699957980000363
Figure BDA0003699957980000364
和PREFERENZTM(来自杜邦工业生物科学公司(DuPont Industrial Biosciences))。示例性α-淀粉酶描述于WO 94/18314 A1、WO 2008/0293607、WO 2013/063460、WO 10/115028、WO 2009/061380 A2、WO 2014/099523、WO 2015/077126 A1、WO 2013/184577、WO 2014/164777、W0 95/10603、WO 95/26397、WO 96/23874、WO 96/23873、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60060、WO 00/29560、WO 99/23211、WO99/46399、WO 00/60058、WO 00/60059、WO 99/42567、WO 01/14532、WO 02/092797、WO 01/66712、WO 01/88107、WO 01/96537、WO 02/10355、WO 2006/002643、WO 2004/055178、和WO98/13481中。
纤维素酶:
可以将纤维素酶添加到组合物中。适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰刀菌属(Fusarium)、梭孢壳属、枝顶孢属(Acremonium)的纤维素酶，例如，在例如美国专利号4,435,307；5,648,263；5,691,178；5,776,757；和WO 89/09259中公开的从特异腐质霉(Humicola insolens)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)产生的真菌纤维素酶。考虑使用的示例性纤维素酶是对纺织品具有颜色护理益处的那些。此类纤维素酶的实例是描述于例如EP0495257、EP 0531372、WO 96/11262、WO 96/29397、和WO 98/08940中的纤维素酶。其他实例是纤维素酶变体，如WO 94/07998；WO 98/12307；WO 95/24471；PCT/DK 98/00299；EP531315；美国专利号5,457,046、5,686,593、和5,763,254中描述的那些。示例性纤维素酶包括WO 2005054475、WO 2005056787、US 7,449,318、US 7,833,773、US 4,435,307；EP0495257；和美国临时申请号62/296,678和62/435340中描述的那些。示例性商业纤维素酶包括但不限于
Figure BDA0003699957980000371
Figure BDA0003699957980000372
和
Figure BDA0003699957980000373
PREMIUM(诺维信公司)；
Figure BDA0003699957980000374
100、
Figure BDA0003699957980000375
200/220和
Figure BDA0003699957980000376
2000(美国丹尼斯克公司)；
Figure BDA0003699957980000377
(AB酶制剂公司(ABEnzymes))和KAC-500(B)(花王公司(Kao Corporation))。
甘露聚糖酶：
示例性甘露聚糖酶包括但不限于细菌或真菌来源的那些甘露聚糖酶，例如像如WO2016007929；USPN 6566114、6602842、和6440991；和国际申请号PCT/US 2016/060850和PCT/US 2016/060844中所描述的。示例性甘露聚糖酶包括但不限于细菌或真菌来源的那些甘露聚糖酶，例如像如WO 2016007929；USPN 6566114、6602842、和6440991；和国际申请号PCT/US 2016/060850和PCT/US 2016/060844中所描述的。
过氧化物酶/氧化酶：
考虑用于组合物中的适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属(Coprinus)(例如来自灰盖鬼伞(C.cinereus))的过氧化物酶、及其变体，如WO 93/24618、WO 95/10602、以及WO 98/15257中所述的那些。可商购的过氧化物酶包括例如GUARDZYMETM(诺和诺德公司和诺维信公司)。
洗涤剂组合物还可以包含2,6-β-D-果聚糖水解酶，其对于除去/清洁存在于家用和/或工业纺织品/衣物上的生物膜是有效的。
通过添加含有一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包含所有这些酶的组合的添加剂，可以将一种或多种洗涤剂酶包含在洗涤剂组合物中。洗涤剂添加剂，即单独的添加剂或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆料等。示例性洗涤剂添加剂配制品包括但不限于颗粒(特别是无尘颗粒)、液体(特别是稳定的液体)或浆料。
过水解酶：
过水解酶包括在例如WO 2005/056782、WO 2007/106293、WO 2008/063400、WO2008/106214、和WO 2008/106215中所描述的。
核酸酶：
合适的核酸酶包括但不限于WO 2015/181287、WO 2015/155350、WO 2016/162556、WO 2017/162836、WO 2017/060475(例如SEQ ID NO:21)、WO 2018/184816、WO 2018/177936、WO 2018/177938、WO 2018/185269、WO 2018/185285、WO 2018/177203、WO 2018/184817、WO 2019/084349、WO 2019/084350、WO 2019/081721、WO 2018/076800、WO 2018/185267、WO 2018/185280、和WO 2018/206553中所描述的那些。
可以与本发明的变体α-淀粉酶组合使用的其他核酸酶包括Nijland,R.等人.(2010)PLoS ONE[公共科学图书馆：综合]5-e15668和Whitchurch,C.B.等人.(2002)Science[科学]295:1487中所描述的那些。
4.6.清洁组合物的形式
洗涤剂组合物可以是任何方便的形式，例如条状、片剂、粉末、颗粒、糊剂、或液体。液体洗涤剂可以是水性的，典型地含有高达约70％的水和0％至约30％的有机溶剂。还考虑了含有约30％或更少水的紧密洗涤剂凝胶。本发明的变体α-淀粉酶与洗涤剂组合物的已知形式和配制品相容，并且本文描述了特定形式和配制品。
WO 2013063460中描述了许多示例性洗涤剂配制品，其中可以向这些配制品中添加本发明的α-淀粉酶(或在一些情况下该α-淀粉酶被鉴定为这些配制品的组分)。这些包括可商购的单位剂量洗涤剂配制品/包装，如
Figure BDA0003699957980000381
UltraPacks(汉高公司)、
Figure BDA0003699957980000382
Quantum(利洁时公司(Reckitt Benckiser))、CLOROXTM 2Packs(高乐士公司(Clorox))、OxiClean Max Force Power Paks(杜威公司(Church&Dwight))、
Figure BDA0003699957980000391
Stain Release、
Figure BDA0003699957980000392
Pods、
Figure BDA0003699957980000393
ActionPacs、
Figure BDA0003699957980000394
Platimun、
Figure BDA0003699957980000395
和Pure essential(宝洁公司(Procter&Gamble))。单位剂量配制品和包装描述于例如US 20090209445 A1、US 20100081598 A1、US 7001878 B2、EP 1504994 B1、WO 2001085888 A2、WO 2003089562 A1、WO 2009098659 A1、WO 2009098660 A1、WO2009112992 A1、WO 2009124160 A1、WO 2009152031 A1、WO 2010059483 A1、WO2010088112 A1、WO 2010090915 A1、WO 2010135238 A1、WO 2011094687 A1、WO2011094690 A1、WO 2011127102 A1、WO 2011163428 A1、WO 2008000567 A1、WO2006045391 A1、WO 2006007911 A1、WO 2012027404 A1、EP 1740690 B1、WO 2012059336A1、US 6730646 B1、WO 2008087426 A1、WO 2010116139 A1、和WO 2012104613 A1中。
5.使用变体α-淀粉酶的碳水化合物加工
变体α-淀粉酶可用于各种工业碳水化合物加工应用。例如，变体α-淀粉酶可以用于淀粉转化工艺，特别是在经历了液化的淀粉的糖化工艺中。所需的终产物可以是通过淀粉底物的酶促转化可以产生的任何产物。例如，所需的产物可以是富含葡萄糖和麦芽糖的糖浆，该糖浆可以用于其他工艺(例如HFCS的制备)，或可以被转化成许多其他有用的产物，例如抗坏血酸中间体(例如葡糖酸盐；2-酮-L-古洛糖酸；5-酮-葡糖酸盐；和2,5-二酮葡糖酸盐)；1,3-丙二醇；芳香族氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)；有机酸(例如乳酸盐、丙酮酸盐、琥珀酸盐、异柠檬酸盐、和草酰乙酸盐)；氨基酸(例如丝氨酸和甘氨酸)；抗生素；抗菌剂；酶；维生素；和激素。
淀粉转化工艺可以是设计用于产生用于燃料或饮用的醇(即，可饮用的醇)的发酵工艺的前体或与其同时进行。本领域普通技术人员知道可以用于生产这些终产物的各种发酵条件。变体α-淀粉酶也可用于食物制备的组合物和方法中。变体α-淀粉酶的这些各种用途在下文更详细地描述。
5.1.淀粉底物的制备
用于制备用于本文公开的方法中的淀粉底物的方法是已知的。可以从例如块茎、根、茎、豆类、谷物或全谷类获得有用的淀粉底物。更特别地，可以从玉米、穗轴、小麦、大麦、黑麦、黑小麦、买罗高粱、西米、粟、木薯、树薯、高粱、稻、碗豆、菜豆、香蕉、或马铃薯中获得颗粒状淀粉。特别考虑的淀粉底物是玉米淀粉和小麦淀粉。来自谷粒的淀粉可以是磨碎的或完整的，并且包括玉米固体，例如籽粒、麸皮和/或穗轴。淀粉也可以是高度精制的生淀粉或来自淀粉精制工艺的原料。
5.2.淀粉的糊化和液化
糊化通常在淀粉底物与α-淀粉酶接触的同时进行或糊化之后淀粉底物与α-淀粉酶接触，尽管可以任选地添加额外的液化诱导酶。在一些实施例中，将如上文所述制备的淀粉底物用水制成浆料。为了优化α-淀粉酶的稳定性和活性，取决于所用变体α-淀粉酶的特性，典型地将浆料的pH调节至约pH 4.5-6.5，并且还可以添加约1mM的钙(约40ppm的游离钙离子)。液化后剩余在浆料中的α-淀粉酶可以经由许多方法进行灭活，包括在随后的反应步骤中降低pH或在酶依赖于钙的情况下从浆料中除去钙。淀粉加α-淀粉酶的浆料可以通过喷射式蒸煮锅(将其蒸汽加热至105℃)连续泵送。然后使浆料冷却至室温。
5.3.糖化
可以使用变体α-淀粉酶，任选地在另外一种或多种酶的存在下，将液化淀粉糖化成富含低DP(例如DP1+DP2)糖的糖浆。糖化的产物的确切组成取决于所使用的酶的组合以及所加工的颗粒状淀粉的类型。
液化通常作为连续工艺进行，而糖化通常作为分批工艺进行。糖化典型地在约60℃-65℃的温度和约4.0-4.5的pH(例如pH 4.3)下最有效，有必要冷却液化淀粉和调节液化淀粉的pH。糖化通常在搅拌槽中进行，这可能需要几个小时来填充或清空。酶典型地以固定比率添加到干燥固体中(槽被填充时)，或者以单剂量添加(在填充阶段开始时)。制备糖浆的糖化反应典型地进行约24-72小时，例如24-48小时。例如，当已经获得最大或所需的DE时，通过加热至85℃持续5min来停止反应。随着累积的葡萄糖经由酶促逆转反应和/或用热力学平衡的方法再聚合成异麦芽糖和/或其他逆转产物，进一步孵育将导致更低的DE，最终达到约90DE。
5.4.异构化
可以将通过用变体α-淀粉酶处理生产的可溶性淀粉水解产物转化为基于高果糖淀粉的糖浆(HFSS)(如高果糖玉米糖浆(HFCS))。可以使用葡萄糖异构酶(特别是固定在固体支持物上的葡萄糖异构酶)来实现此转化。将pH增加至约6.0至约8.0，例如pH 7.5(取决于异构酶)，并通过离子交换除去Ca2+。适合的异构酶包括
Figure BDA0003699957980000411
IT(诺维信公司)；
Figure BDA0003699957980000412
IMGI、和
Figure BDA0003699957980000413
G993、
Figure BDA0003699957980000414
Figure BDA0003699957980000415
G993、
Figure BDA0003699957980000416
G993液体、和
Figure BDA0003699957980000417
IGI。异构化后，混合物典型地含有约40％-45％的果糖(例如42％的果糖)。
5.5.发酵
可溶性淀粉水解产物，特别是富含葡萄糖的糖浆，可以通过典型地在约32℃的温度下，例如从30℃至35℃(对于产生醇的酵母)，使淀粉水解产物与发酵生物接触来发酵。发酵的温度和pH将取决于发酵生物。EOF产品包括代谢产物，如柠檬酸、乳酸、琥珀酸、谷氨酸一钠、葡萄糖酸、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸钾、衣康酸和其他羧酸、葡萄糖酸δ-内酯、异抗坏血酸钠、赖氨酸和其他氨基酸、ω3脂肪酸、丁醇、异戊二烯、1,3-丙二醇和其他生物材料。
5.6.变体α-淀粉酶与其他酶的组合
变体α-淀粉酶可以与葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)组合。示例性葡糖淀粉酶来自木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、踝节菌属(Talaromyces)、梭菌属(Clostridium)、镰刀菌属(Fusarium)、梭孢壳属(Thielavia)、嗜热丝孢菌属(Thermomyces)、阿太菌属(Athelia)、腐质霉属(Humicola)、青霉属(Penicillium)、密瑚菌属(Artomyces)、褐褶菌属(Gloeophyllum)、密孔菌属(Pycnoporus)、齿耳菌属(Steccherinum)、栓菌属(Trametes)等。适合的商业葡糖淀粉酶包括AMG 200L；AMG 300L；SANTM SUPER和AMGTM E(诺维信公司)；
Figure BDA0003699957980000421
300和OPTIDEX L-400(美国丹尼斯科公司)；AMIGASETM 和AMIGASETM PLUS(DSM)；
Figure BDA0003699957980000422
G900(酶生物系统公司(EnzymeBio-Systems))；和
Figure BDA0003699957980000423
G990ZR。
可以与变体α-淀粉酶一起使用的其他适合的酶包括植酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、β-淀粉酶、异淀粉酶、α-葡糖苷酶、纤维素酶、木聚糖酶、其他半纤维素酶、β-葡糖苷酶、转移酶、果胶酶、脂肪酶、角质酶、酯酶、氧化还原酶、不同的α-淀粉酶或其组合。
包含本发明α-淀粉酶的组合物可以是水性或非水性配制品、颗粒、粉末、凝胶、浆料、糊剂等，其可进一步包含本文列出的额外的酶中的任何一种或多种，以及缓冲液、盐、防腐剂、水、共溶剂、表面活性剂等。
6.纺织品脱浆组合物和用途
还考虑了使用淀粉酶处理织物(例如，使纺织品脱浆)的组合物和方法。织物处理方法是本领域中熟知的(参见例如，美国专利号6,077,316)。例如，可以通过包括使织物与溶液中的α-淀粉酶接触的方法来改善织物的手感和外观。织物可以在压力下用溶液进行处理。
可以在纺织品的编织期间或之后或在脱浆阶段期间或一个或多个额外的织物加工步骤中应用α-淀粉酶。在纺织品的编织期间，线暴露于相当大的机械应变。在机械织机上编织之前，通常用上浆淀粉或淀粉衍生物涂覆经纱以增加其抗张强度并防止断开。可在编织之中或之后施用α-淀粉酶以除去这些上浆淀粉或淀粉衍生物。编织之后，可以在进一步处理织物之前使用α-淀粉酶来除去浆涂层以确保均一和耐洗的结果。
α-淀粉酶可以单独使用或与其他脱浆化学试剂和/或脱浆酶一起使用，以作为洗涤剂添加剂(例如在水性组合物中)使织物(包括含棉的织物)脱浆。α-淀粉酶还可以用于在靛蓝染色的牛仔织物和服装上产生石磨的外观的组合物和方法中使用。对于衣服生产而言，织物可被裁剪和缝制成衣服或服装，其随后被精整(finish)。特别地，对于牛仔布的生产，开发了不同的酶促精整方法。牛仔服装的精整通常是以酶促脱浆步骤开始的，其中使服装经受淀粉分解酶的作用以为织物提供柔软性，使棉更易于进行随后的酶促精整步骤。α-淀粉酶可以用于下列方法中：精整加工牛仔服装(例如“生物磨砂工艺”)、酶促脱浆并为织物提供柔软性和/或精整加工方法。
7.用于烘焙和食物制备的组合物和方法
本发明的组合物和方法还涉及食物组合物，其包括但不限于食品、动物饲料和/或食物/饲料添加剂(包含变体α-淀粉酶)，和用于制备这种食物组合物的方法(该方法包括将变体α-淀粉酶与一种或多种食物成分混合)，或其用途。此外，本发明的组合物和方法涉及烘焙组合物(包括但不限于焙烤食品用面粉、生面团、烘焙添加剂和/或烘焙产品)。
9.酿造组合物
本发明的变体α-淀粉酶可以是在酿造工艺(即制备发酵的麦芽饮料)中使用的酿造组合物的组分。非可发酵碳水化合物形成最终啤酒中的大部分溶解固体。此残余物的存留是因为麦芽淀粉酶不能够水解淀粉的α-1,6-键。α-淀粉酶，任选地与葡糖淀粉酶和任选地支链淀粉酶和/或异淀粉酶的组合，有助于将淀粉转化为糊精和可发酵糖，降低最终啤酒中残留的非可发酵碳水化合物。
出于所有目的，本文引用的所有参考文献均通过引用以其全文并入本文。为了进一步说明组合物和方法及其优点，给出以下具体实例，应理解它们是说明性的而不是限制性的。
实例
实例1.AA2560变体
蛋白质表达、纯化和定量：
将ΔR181和ΔG182(即ΔRG)背景中的AA2560组合变体制成合成基因，并使用标准程序引入合适的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)细胞中。通过DNA测序确认所有突变。使细胞在适于地衣芽孢杆菌宿主中蛋白质表达和分泌的培养基中生长72小时。通过离心来收获分泌的蛋白质。通过用苯基琼脂糖6快速流动树脂(通用电气医疗公司(GEHealthcare))的疏水相互作用色谱法实现纯化。将纯化的蛋白质在标准配方缓冲液(pH 8)中稳定，该缓冲液含有HEPES(作为缓冲剂)、氯化钙和丙二醇。通过同时使用氨基酸分析、高效液相色谱法(HPLC)和在280nm处的吸光度来确定蛋白质浓度。
酶性能测定：
α-淀粉酶的活性通过在洗涤剂背景中从白色三聚氰胺砖上去除染色的淀粉污渍确定。将购自测试材料中心(Center for Testmaterials)的含有食品着色剂的混合玉米/稻彩色淀粉砖和混合玉米/稻淀粉砖(目录号DM277和DM71)分别用于确定α-淀粉酶的清洁活性。将砖固定在96孔板(含有在水性缓冲液中稀释到工作范围内的淀粉酶溶液)上，并添加到WFKB洗涤剂(WFK Testgewebe公司，布鲁克格根，德国)的预制洗涤剂溶液中，使得总体积为300μL。然后将含有彩色淀粉污渍的预成像三聚氰胺砖固定在96孔板的顶部，使得搅拌组件可以使含酶洗涤剂溅到淀粉污渍的表面上。洗涤反应在50℃下在250rpm的振荡下进行15分钟。在洗涤反应后，然后将三聚氰胺砖在水下短暂漂洗、干燥并再成像。α-淀粉酶的活性计算为洗涤前和洗涤后图像的RGB(颜色)值的差值。洗涤后图像越白，酶活性越高。性能指数(PI)计算为：
Figure BDA0003699957980000441
组合变体相对于ΔRG变体的性能指标：
表3中列出了变体在相对于野生型变体的性能指数方面的清洁性能。将DM277命名为污渍1，并将DM71命名为污渍2。
表3.两种不同污渍的变体性能
突变 PI-1 PI-2
ΔR181-ΔG182 -1- -1-
T40N-S91R-Q169H-ΔR181-ΔG182-T183M-H281N 1.18 1.60
Q172R-ΔR181-ΔG182-E190P-S288D 1.09 1.36
Q172R-ΔR181-ΔG182-S244E-S288D-S474R 1.15 1.82
S91R-Q172R-ΔR181-ΔG182-E190P-I324M 1.26 1.95
T40N-S91R-ΔR181-ΔG182-E190P-F263Y 1.20 1.99
T40N-S91R-ΔR181-ΔG182-S244E-Y364L 1.20 2.19
S91R-Q172R-ΔR181-ΔG182-E190P-I324R 1.26 1.84
S91R-W116R-Q172R-ΔR181-ΔG182-S244E-H281S-S288D 1.29 2.19
T40N-S91R-Y100F-W116R-Q172N-ΔR181-ΔG182-S244Q-H281S 1.24 1.88
T40N-S91R-Q172R-ΔR181-ΔG182-S244Q-F263Y-H281S 1.19 1.94
S91R-Q172R-ΔR181-ΔG182-E190P-I324N 0.96 1.44
T40D-S91R-Q172R-ΔR181-ΔG182-E190P-H281S-I324R 1.04 0.99
ΔR181-ΔG182-Y364L 2.90 2.23
表2中的所有变体在测试的一种或多种污渍和洗涤条件下的性能等于或优于
Figure BDA0003699957980000451
Plus 12L(诺维信公司)。
实例2.额外的AA2560、AA707和AAI10变体
为了证实实例1中描述的组合突变在其他亲本分子中的有益效果，如所述制备并测试了额外的AA2560、AA707和AAI10变体。这些分子额外地包括位置181和182、183和184处的缺失，或不包括缺失。通过DNA测序确认所有突变。
变体的性能是相对于最接近的亲本测量的，即“非缺失”分子中的组合变体是相对于各自的野生型分子测量的。“双缺失”分子中的组合变体是相对于各自的双缺失分子测量的。结果示于图5的表中。
结果表明，除AA707外，不同亲本分子之间的突变具有高度可转移性。在本文的具体实施方式部分提出了AA707对Ser91位置处突变的不同行为的解释。

Claims (28)

1.一种重组、非天然存在的亲本变体α-淀粉酶分子，其包含参考SEQ ID NO:1进行编号的位置91处的突变和α-淀粉酶TIM筒结构底部的氨基酸残基处的突变，所述底部的氨基酸残基定义为残基6、7、40、96、98、100、229、230、231、262、263、285、286、287、288、322、323、324、325、362、363、和364，其中所述亲本分子的位置28处存在的野生型氨基酸残基能带正电荷。
2.如权利要求1所述的变体α-淀粉酶，其中所述位置91处的突变是将所述天然存在的残基取代为带正电荷的残基。
3.如权利要求1或2所述的变体α-淀粉酶，其中所述位置91处的突变是将所述天然存在的残基取代为精氨基(即X91R)。
4.如权利要求1-3中任一项所述的变体α-淀粉酶，其中所述α-淀粉酶TIM筒结构底部的至少一个突变选自由以下组成的组：X40N、X40D、X100F、X100L、X263Y、X288D、X288K、X288Q、X324R、X324N、X324M、X364L、和X364M。
5.如权利要求1-4中任一项所述的变体α-淀粉酶，其中所述α-淀粉酶TIM筒结构底部的至少一个突变选自由以下组成的组：T40N、T40D、Y100F、Y100L、F263Y、S288D、S288K、S288Q、I324R、I324N、I324M、Y364L、和Y364M。
6.一种重组、非天然存在的变体α-淀粉酶，其包含位置91处的精氨酸和不存在于天然存在的α-淀粉酶中的以下特征中的至少一个：位置40处的N或D，位置100处的F或L，位置263处的Y，位置288处的D、K或Q，位置324处的R、N或M，或位置364处的L或M。
7.如权利要求1-6中任一项所述的变体α-淀粉酶，其进一步包含环中残基处的突变，所述环包含参考SEQ ID NO:1进行编号的表面暴露的残基167、169、171、172、和176。
8.如权利要求7所述的变体α-淀粉酶，其中所述环中的至少一个突变选自由以下组成的组：X167F、X169H、X171Y、X172R、X172N、和X176S。
9.如权利要求8所述的变体α-淀粉酶，其中所述环中的至少一个突变选自由以下组成的组：W167F、Q169H、R171Y、Q172R、Q172N、和R176S。
10.如权利要求1-6中任一项所述的变体α-淀粉酶，其进一步包含参考SEQ ID NO:1进行编号的位置167处的F、位置169处的H、位置171处的Y、位置172处的R或N、或位置176处的S。
11.一种重组、非天然存在的变体α-淀粉酶，其包含参考SEQ ID NO:1进行编号的位置172处的突变和位置288处的突变。
12.一种重组、非天然存在的变体α-淀粉酶，其包含参考SEQ ID NO:1进行编号的位置172处的精氨酸或天冬酰胺和位置288处的天冬氨酸。
13.如权利要求1-12中任一项所述的变体α-淀粉酶，其进一步包含参考SEQ ID NO:1进行编号的位置116和/或281处的突变。
14.如权利要求1-12中任一项所述的变体α-淀粉酶，其进一步包含参考SEQ ID NO:1进行编号的位置116处的精氨酸或位置281处的丝氨酸。
15.如权利要求1-14中任一项所述的变体α-淀粉酶，其进一步包含参考SEQ ID NO:1进行编号的位置190和/或244处的突变。
16.如权利要求1-14中任一项所述的变体α-淀粉酶，其具有参考SEQ ID NO:1进行编号的位置190处的脯氨酸和/或位置244处的丙氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺。
17.如权利要求1-16中任一项所述的变体α-淀粉酶，其进一步包含使用SEQ ID NO:1的，相当于R181、G182、T183、和G184的至少两个残基的缺失。
18.如权利要求1-16中任一项所述的变体α-淀粉酶，其进一步包含相当于R181和G182或残基T183和G184的残基的成对缺失。
19.一种重组、非天然存在的变体α-淀粉酶，其包含
使用SEQ ID NO:1进行编号的(i)选自由以下组成的组的取代：
(a)X40N-X91R-X169H-X183M-X281N、
(b)X172R-X190P-X288D、
(c)X172R-X244E-X288D-X474R、
(d)X91R-X172R-X190P-X324M、
(e)X40N-X91R-X190P-X263Y、
(f)X40N-X91R-X244E-X364L、
(g)X91R-X172R-X190P-X324R、
(h)X91R-X116R-X172R-X244E-X281S-X288D、
(i)X40N-X91R-X100F-X116R-X172N-X244Q-X281S、
(j)X40N-X91R-X172R-X244Q-X263Y-X281S、
(k)X91R-X172R-X190P-X324N、
(l)X40D-X91R-X172R-X190P-X281S-X324R、和
(m)X364L；以及
(ii)残基的成对缺失，所述残基选自由相当于以下的残基组成的组：
181和182、以及
183和184。
20.如权利要求19所述的重组、非天然存在的变体α-淀粉酶，其包含
使用SEQ ID NO:1进行编号的(i)选自由以下组成的组的取代：
(a)T40N-S91R-Q169H-T183M-H281N、
(b)Q172R-E190P-S288D、
(c)Q172R-S244E-S288D-S474R、
(d)S91R-Q172R-E190P-I324M、
(e)T40N-S91R-E190P-F263Y、
(f)T40N-S91R-S244E-Y364L、
(g)S91R-Q172R-E190P-I324R、
(h)S91R-W116R-Q172R-S244E-H281S-S288D、
(i)T40N-S91R-Y100F-W116R-Q172N-S244Q-H281S、
(j)T40N-S91R-Q172R-S244Q-F263Y-H281S、
(k)S91R-Q172R-E190P-I324N、
(l)T40D-S91R-Q172R-E190P-H281S-I324R、和
(m)Y364L；以及
(ii)残基的成对缺失，所述残基选自由以下组成的组：
R181和G182、以及
T183和G184。
21.一种重组、非天然存在的变体α-淀粉酶，其包含以下特征中的三个或更多个：(a)位置40处的D或N和/或位置91处的R，和(b)位置100处的F，位置263处的Y，位置288处的D，位置324处的M、N或R，和/或位置364处的L，任选地与(c)位置169处的H，位置183M处的M，位置281处的N或S，位置172处的N或R，位置190处的P，位置244处的E、Q或R，位置474处的R，和/或位置116处的R的组合，(d)任选地与(e)位置181和182或183和184处的成对缺失的组合，在所有情况下，使用SEQ ID NO:1进行编号。
22.如权利要求1-21中任一项所述的变体α-淀粉酶，其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的氨基酸序列同一性。
23.一种洗涤剂组合物，其包含如权利要求1-22中任一项所述的变体α-淀粉酶。
24.如权利要求23所述的洗涤剂组合物，其进一步包含来自吉氏芽孢杆菌(Bacillusgibsonii)的变体枯草杆菌蛋白酶，所述变体枯草杆菌蛋白酶具有氨基酸取代X39E、X99R、X126A、X127E、和X128G，并且进一步包含参考SEQ ID NO:5进行编号的选自由以下组成的组的一个或多个额外的取代：N74D-M211L-N253P、R179Q-M211L-N253P、N74D-N253P、N85R-G160Q-R179Q-M211L-N212S-N253P、R179Q-N253P、G160Q-R179Q-M211L-N212S-N253P、R179Q-M211L、G160Q-R179Q-M211L-N253P、G160Q-R179Q-N212S-N253P、N74D-M211L、M211L-N242D、G160Q-R179Q-M211L-N212S、N74D-R179Q-M211L-N253P、G160Q-R179Q-M211L、G160Q-R179Q-N253P、N74D-Q200L-M211L、N74D-G160Q-N212S-N253P、N74D-G160Q-M211L-N253P、G160Q-R179Q、G160Q-R179Q-N212S、N74D-G160Q-N253P、N74D-G160Q-R179Q-M211L-N212S-N253P、N74D-N085R-G160Q-R179Q-M211L、N74D-G160Q-M211L-N212S-N253P、N74D-N085R-N116R-Q200L-Q256E、N74D-G160Q-R179Q-N212S-N253P、N74D-G160Q-M211L-N212S、N74D-G160Q、N74D-G160Q-R179Q-M211L-N253P、N74D-R179Q-M211L、N74D-G160Q-N212S、N74D-G160Q-M211L、N74D-G160Q-R179Q-N253P、N74D、N74D-G160Q-R179Q-M211L-N212S、N74D-N085R-M211L-N212S、N74D-G160Q-R179Q-N212S、N74D-G160Q-R179Q-M211L、N74D-M211L-Q256E、N74D-G160Q-R179Q、R179Q-M211L-N212S-N253P、R179Q-M211L-N212S、N74D-N085R-R179Q-M211L-N212S、N74D-M211L-N212S、N74D-R179Q-M211L-N212S、N74D-M211L-N242D、N74D-Q200L-M211L-Q256E、N74D-Q200L-M211L-N242D-Q256E、N74D-Q200L、N74D-M211N-N212Q、N74D-M211N-N212Q-Q256E、N74D-M211N-Q256E、N74D-M211Q、N74D-M211Q-N212Q、N74D-M211Q-N212Q-Q256E、N74D-M211Q-Q256E、N74D-N198A-M211Q、N74D-N198A-M211Q-N212Q、N74D-N198A-M211Q-Q256E、N74D-N198G-M211Q、N74D-N198G-M211Q-N212Q、N74D-N198G-M211Q-Q256E、N74D-N198K-M211Q-N212Q、N74D-N198L-M211Q-N212Q、N74D-N198Q-M211Q-N212Q、N74D-N198R-M211Q-N212Q、N74D-N198T-M211Q-N212Q、N74D-N198V-M211Q-N212Q、N74D-N212Q-Q256E、N74D-Q256E、N74D-R207Q、N74D-R207Q-M211N、N74D-R207Q-M211N-N212Q、N74D-R207Q-M211N-N212Q-Q256E、N74D-R207Q-M211N-Q256E、N74D-R207Q-M211Q、N74D-R207Q-M211Q-N212Q、N74D-R207Q-M211Q-N212Q-Q256E、N74D-R207Q-N212Q、N74D-R207Q-N212Q-Q256E、N74D-R207Q-Q256E、N74D-N198S-M211Q、和N74D-N198L-M211Q，并且与SEQ ID NO:6具有至少90％的氨基酸序列同一性。
25.一种用于将淀粉转化为寡糖的方法，所述方法包括使淀粉与有效量的如权利要求1-22中任一项所述的变体α-淀粉酶接触。
26.一种用于从表面除去淀粉污渍或污垢的方法，所述方法包括使所述表面与有效量的如权利要求1-22中任一项所述的变体α-淀粉酶接触，并且允许多肽水解存在于所述淀粉污渍中的淀粉组分以产生溶解于水性组合物中的较小的衍生自淀粉的分子，从而从所述表面除去所述淀粉污渍。
27.一种核酸，其编码如权利要求1-22中任一项所述的变体α-淀粉酶。
28.一种宿主细胞，其包含如权利要求27所述的核酸。
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