ES2432519T3 - Mutantes de alfa-amilasa - Google Patents

Abstract

Variante de la α-amilasa progenitora tipo Termamyl, que tiene la secuencia SEC ID N.º: 2 donde dicha variante constade la SEC ID N.º: 2 con una de las siguientes mutaciones seleccionadas de: i)H156Y+A181T+A209V; ii)H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S; iii)A1*+N2*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H35I+ H156Y+A181T+A209V; iv)A1*+N2*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H35I+ H156Y+A181T+N190F+A209V; v)A1*+N2*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H35I+ H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S, donde un asterisco (*) indica deleción del aminoácido.

Description

Mutantes de alfa-amilasa

5 CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere, entre otras cosas, a variantes nuevas de a-amilasas progenitoras tipo Termamyl, en particular a variantes que presentan alteraciones en una o más propiedades (con respecto a la progenitora) que son ventajosas con respecto a las aplicaciones de las variantes, en particular, en el tratamiento del

10 almidón industrial (p. ej., licuefacción o sacarificación del almidón).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] Las a-amilasas (a-1,4-glucan-4-glucanohidrolasas, EC 3,2,1,1) constituyen un grupo de enzimas que catalizan la

15 hidrólisis del almidón y otros oligo y polisacáridos 1,4-glucosídicos lineales y ramificados, y existe una muy amplia bibliografía científica y de patentes relativa a esta clase de enzimas muy importantes industrialmente.

[0003] Entre las descripciones más recientes en relación a las a-amilasas, el documento WO 96/23874 proporciona datos estructurales de cristales tridimensionales por rayos X para una a-amilasa tipo Termamyl que consiste en 300 20 residuos de aminoácidos N-terminales de a-amilasa de B. amyloliquefaciens que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 4 en la presente y los aminoácidos 301-483 del extremo C. -terminal de la aamilasa de B. licheniformis que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 2 en la presente (estando este último disponible comercialmente con el nombre comercial Termamyl™), y que está por tanto muy relacionada con las a-amilasas de Bacillus industrialmente importantes (que en este contexto se incluyen dentro del

25 significado del término “a-amilasas tipo Termamyl”, y que incluye, entre otros, las a-amilasas de B. licheniformis, B. amyloliquefaciens y B. stearothermophilus). El documento WO 96/23874 también describe la metodología para diseñar, en base a un análisis de la estructura de una a-amilasa progenitora tipo Termamyl, variantes de la a-amilasa progenitora tipo Termamyl que presentan propiedades alteradas relativas a la progenitora.

30 BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

[0004] Como se ha indicado anteriormente, la presente invención se refieren, entre otras cosas, a nuevas variantes (mutantes) alfa-amilolíticas de una a-amilasa tipo Termamyl, en particular a variantes que presentan propiedades alteradas que son ventajosas con respecto al tratamiento industrial del almidón (licuefacción o sacarificación del almidón

35 y similares).

[0005] Alteraciones en propiedades que se han conseguido en mutantes de la descripción son alteraciones en, por ejemplo, la especifidad de sustrato, unión de sustrato, modelo de segmentación de sustrato, termoestabilidad, pH/perfil de actividad, pH/perfil de estabilidad [tal como estabilidad aumentada en valores de pH bajos (p. ej. pH<6, en particular

40 pH<5) o altos (p. ej. pH>9)], estabilidad hacia oxidación, dependencia de Ca2+, actividad específica, y otras propiedades de interés. Por ejemplo, la alteración puede suponer una variante que, en comparación con la a-amilasa progenitora tipo Termamyl, tiene una dependencia reducida de Ca2+ y/o un pH/perfil de actividad alterado.

[0006] La descripción se refiere además, entre otras cosas, a variantes construcciones de ADN que codifican variantes

45 de la invención, a métodos para preparar variantes de la invención, y al uso de variantes de la invención, solas o en combinación con otras enzimas alfa-amilolíticas, en varios procesos industriales, por ejemplo, la licuefacción de almidón.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

50 La a-amilasa tipo Termamyl

[0007] Es bien conocido que varias a-amilasas producidas por Bacillus spp. son altamente homólogas en el nivel aminoácido. Por ejemplo, la a-amilasa de B. licheniformis que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 2 (disponible comercialmente como Termamyl™) se ha descubierto que es aproximadamente un 89% 55 homóloga con la a-amilasa de B. amyloliquefaciens que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 4 y aproximadamente un 79% homóloga con la a-amilasa de B.stearothermophilus que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 6. Otras a-amilasas homólogas incluyen una a-amilasa derivada de una cepa de Bacillus sp. NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 o DSM 9375, todas ellas aparecen descritas en detalle en el documento WO 95/26397, y la a-amilasa descrita por Tsukamoto et al., Biochemical and Biophysical Research 60 Communications, 151 (1988), pp. 25-31 . Otras a-amilasas homólogas incluyen una a-amilasa producida por la cepa de

B. licheniformis descrita en el documento EP 0252666 (ATCC 27811), y las a-amilasas identificadas en los documentos WO 91/00353 y WO 94/18314 . Otras a-amilasas de B. licheniformis tipo Termamyl son Optitherm™ y Takatherm™ (disponibles en Solvay), Maxamyl™ (disponibles en Gist-brocades/Genencor), Spezym AA™ (disponible en Genencor), y Keistase™ (disponible en Daiwa).

5 [0008] Debido a la homología sustancial encontrada entre estas a-amilasas, se considera que pertenecen a la misma clase de a-amilasas, concretamente a la clase de "a-amilasas tipo Termamyl".

[0009] Por tanto, en el contexto presente, el término "a-amilasa tipo Termamyl" tiene por objetivo indicar una a-amilasa que, en el nivel de aminoácido, muestra una homología sustancial con el Termamyl™, es decir, la a-amilasa de B. 10 licheniformis que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 2 del presente documento. En otras palabras, una a-amilasa tipo Termamyl es una a-amilasa que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 2, n.º 4 o n.º 6 del presente documento, o la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 1 del documento WO 95/26397 (dicha secuencia de aminoácidos se muestra en la Fig. 1 y Fig. 2 del presente documento) o en la SEC ID N.º 2 del documento WO 95/26397 (dicha secuencia de aminoácidos se muestra en la Fig. 2 del presente documento) o 15 en Tsukamoto et al., 1988, (dicha secuencia de aminoácidos se muestra en la Fig. 2 del presente documento) o i) que muestra al menos un 60%, tal como al menos 70%, por ejemplo al menos un 75%, o al menos un 80%, por ejemplo al menos un 85%, al menos un 90% o al menos un 95% de homología con al menos uno de dichas secuencias de aminoácidos y/o ii) muestra reactividad cruzada inmunológica con un anticuerpo producido contra al menos una de dichas a-amilasas, y/o iii) está codificada por la secuencia de ADN que hibridiza a las secuencias de ADN que codifican 20 las a-amilasas anteriormente especificadas que son evidentes a partir de las SEQ ID Nos. 1, 3 y 5 de la presente solicitud (dichas secuencias de codificación codifican las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID Nos. 2, 4 y 6 del presente documento, respectivamente), a partir de la SEC ID N.º 4 del documento WO 95/26397 (dicha secuencia de ADN, junto con el codón de parada TAA, se muestran en la Fig. 1 del presente documento y codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1 del presente documento) y a partir de la SEC ID N.º 5 del documento

25 WO 95/26397, respectivamente.

[0010] En conexión con la propiedad i), la "homología" puede ser determinada mediante el uso de cualquier algoritmo convencional, preferiblemente mediante el uso del programa GAP del paquete GCG versión 7.3 (Junio 1993) usando valores por defecto para penalizaciones por hueco [Genetic Computer Group (1991) Manual del programa para el

30 paquete GCG, versión 7, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EE. UU. 53711 ].

[0011] Propiedad ii) de la a-amilasa, es decir, la reactividad cruzada inmunológica, se puede ensayar usando un anticuerpo generado contra, o reactivo con, al menos un epítopo de la a-amilasa tipo Termamyl relevante. El anticuerpo, que puede ser monoclonal o policlonal, puede ser producido por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se

35 describe por Hudson et al., 1989. La reactividad cruzada inmunológica puede determinarse utilizando ensayos conocidos en la técnica, ejemplos de los cuales son ensayo de inmunodifusión radial o de Western Blot, por ejemplo, como se describe por Hudson et al., 1989. A este respecto, la reactividad cruzada inmunológica entre las a-amilasas que tienen las secuencias de aminoácidos SEC ID Nos. 2, 4 y 6, respectivamente, se ha encontrado.

40 [0012] La sonda de oligonucleótido utilizada en la caracterización de la a-amilasa tipo Termamyl de acuerdo con la propiedad iii) anteriormente mencionada se pueden preparar adecuadamente sobre la base de la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos completa o parcial de la a-amilasa en cuestión. Las condiciones adecuadas para evaluar la hibridación incluyen remojo previo en 5x SSC y prehibridación durante 1 h a ~ 40 °C en una solución de formamida al 20%, solución de 5xDenhardt, fosfato de sodio 50 mM, pH 6,8, y 50 Ig de ADN de timo de ternera, sonicado y

45 desnaturalizado, seguido de hibridación en la misma solución complementada con 100μM ATP durante 18h a ~ 40 °C, u otros métodos descritos por, por ejemplo, Sambrook y col., 1989.

[0013] En el presente contexto, "deriva de" pretende no solo indicar una a-amilasa producida o producible por una cepa del organismo en cuestión, sino también una a-amilasa codificada por una secuencia de ADN aislada a partir de tal cepa

50 y producida en un organismo huésped transformado con dicha secuencia de ADN . Finalmente, el término pretende indicar una a-amilasa que está codificada por una secuencia de ADN de origen sintético y/o de ADNc y que tiene las características de identificación de la a-amilasa en cuestión. El término también pretende indicar que la a-amilasa progenitora puede ser una variante de una forma natural de a-amilasa, es decir, una variante que es el resultado de una modificación (inserción, sustitución, deleción) de uno o más residuos de aminoácidos de la a-amilasa de origen natural.

55 a-amilasas híbridas progenitoras

[0014] La a-amilasa progenitora puede ser una a-amilasa híbrida, es decir, una a-amilasa que comprende una combinación de secuencias de aminoácidos parciales derivadas de al menos dos a-amilasas.

60 [0015] La a-amilasa híbrida progenitora puede ser una que sobre la base de la homología de aminoácidos y/o la reactividad inmunológica cruzada y/o hibridación del ADN (como se definió anteriormente) puede ser determinada para pertenecer a la familia de a-amilasas tipo Termamyl. En este caso, la a-amilasa híbrida está normalmente compuesta de al menos una parte de una a-amilasa tipo Termamyl y parte(s) de una o más a-amilasas seleccionadas a partir de aamilasas de tipo Termamyl o a-amilasas no de tipo Termamyl de origen microbiano (bacteriano o fúngico) y/o de origen de mamífero.

[0016] Por ejemplo, la a-amilasa progenitora puede comprender una parte C- terminal de una a-amilasa derivada de

5 una cepa de B. licheniformis, y una parte N-terminal de una a-amilasa derivada de una cepa de B. amyloliquefaciens o una cepa de B. stearothermophilus. Por ejemplo, la a-amilasa progenitora puede comprender al menos 430 residuos de aminoácidos de la parte C- terminal de la a-amilasa de B. licheniformis, y puede, por ejemplo, comprender a) un segmento de aminoácidos correspondiente a los 37 residuos de aminoácidos de N-terminal de la a-amilasa de B. amyloliquefaciens que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 4 y un segmento de aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácidos C-terminal 445 de la a-amilasa de B. licheniformis que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 2, o b) un segmento de aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácidos N-terminal 68 de la a-amilasa de B. stearothermophilusque tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 6 y un segmento de aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácidos C-terminal 415 de la aamilasa de B. licheniformis que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 2.

15 [0017] Una realización preferida de una variante de la invención es un derivado de una a-amilasa B. licheniformis (como a-amilasa tipo Termamyl p), tal como la a-amilasa de B. licheniformis que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 2.

Construcción de variantes de la invención

[0018] La construcción de la variante de interés puede llevarse a cabo mediante el cultivo de un microorganismo que comprende una secuencia de ADN que codifica la variante bajo condiciones que son propicias para producir la variante. La variante puede luego ser recuperada posteriormente del caldo de cultivo resultante. Esto se describe en detalle más

25 adelante.

Propiedades alteradas de variantes de la divulgación

[0019] A continuación se analiza la relación entre mutaciones que pueden estar presentes en las variantes de la divulgación, y las alteraciones deseables en propiedades (relativas a aquellos una a-amilasa progenitora tipo Termamyl) que pueden resultar de ello.

Disminución de la dependencia de Ca2±

35 [0020] Es altamente deseable poder disminuir la dependencia de Ca2+ de una a-amilasa tipo Termamyl. En consecuencia, un aspecto de la divulgación está relacionado con una variante de una a-amilasa tipo Termamyl. Dicha variante muestra actividad a-amilasa y presenta una disminución de la dependencia a Ca2+ en comparación con la aamilasa progenitora. Una disminución de la dependencia de Ca2+ tendrá, en general, la consecuencia funcional de que la variante muestre una actividad amilolítica satisfactoria en presencia de una concentración más baja de iones de calcio en el medio extraño que es necesario para la enzima madre. Tendrá más a menudo la consecuencia de que la variante sea menos sensible que la progenitora a las condiciones desionizantes de calcio, tal como la que se obtienen en medios que contienen agentes complejantes de calcio (tales como determinados mejoradores de detergentes).

[0021] La disminución en la dependencia de Ca2+ de una variante de la divulgación puede ventajosamente conseguirse,

45 por ejemplo, mediante el aumento de la afinidad de unión de Ca2+ relativa a la de la a-amilasa progenitora tipo Termamyl; en otras palabras, cuanto más fuerte sea la unión de Ca2+ en la enzima, menor será la dependencia de Ca2+.

[0022] Puede que se mencione aquí que el documento WO 96/23874 establece que se cree que los residuos de aminoácidos situados dentro de 10 Å de un ión de sodio o de calcio están implicados en, o son de importancia para, la capacidad de unión de Ca2+ de la enzima, y que a este respecto la mutación N104D [de la a-amilasa de B. licheniformis que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 2, o una mutación (N a D) equivalente o de una posición equivalente en otra a-amilasa tipo Termamyl] se considera que es de especial interés con respecto a la disminución de la dependencia de Ca2+ de una a-amilasa tipo Termamyl.

55 [0023] Otras mutaciones mencionadas en el documento WO 96/23874 como de posible importancia en relación con la dependencia de Ca2+ incluyen mutaciones que se contemplan en el mismo para conseguir un aumento de la unión del calcio (y/o la termoestabilidad de la enzima) a través de la estabilización del dominio C (tal y como se define en el documento WO 96/23874) de la estructura tridimensional de una a-amilasa tipo Termamyl a través de la formación, por ejemplo, de puentes de cisteína o puentes salinos. Así, el documento WO 96/23874 divulga que el dominio C de la aamilasa de B. licheniformis que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 2 puede ser estabilizado mediante la introducción de un puente de cisteína entre el dominio A y el dominio C (tal y como se define en el documento WO 96/23874) mediante la introducción de las siguientes mutaciones:

A349C+I479C y/o L346C+I430C.

[0024] Del mimos modo, el documento WO 96/23874 divulga que se puede obtener un puente de sal mediante la introducción de una o más de las siguientes mutaciones en la a-amilasa de B. licheniformis que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 2:

5 N457D,E

N457D,E+K385R

F350D,E+I430R,K

F350D,E+I411R,K

y que el sitio de calcio del Dominio C puede ser estabilizado mediante la sustitución de los residuos de aminoácidos

15 H408 y/o G303 con cualquier otro residuo de aminoácido, en particular, mediante la introducción de una de las sustituciones:

H408Q, E, N, D y/o G303N, D, Q, E

que se contemplan para proporcionar una mejor unión de calcio o protección contra la depleción de calcio. (mutaciones similares en posiciones equivalentes de otras a-amilasas tipo Termamyl están aquí englobadas).

[0025] Otras mutaciones de sustitución (relativas a a-amilasa de B. Licheniformis, la SEC ID N.º 2) que se describen en el documento WO 96/23874 como de importancia aparente, entre otros, en el contexto de la reducción de la

25 dependencia de calcio incluyen las siguientes: R23K, H156Y, A181T, A209V, R214, G310D y P345 (o mutaciones equivalentes en posiciones equivalentes en otra a-amilasa tipo Termamyl).

[0026] En el contexto de la presente descripción, otras mutaciones de sustitución que parecen ser de importancia, entre otras cosas, en relación con la reducción de la dependencia de calcio incluyen las siguientes mutaciones en el dominio B (tal y como se define en el documento WO 96/23874):

A181E, D, Q, N, V (que parecen dar como resultado la protección del sitio de unión de Ca2+ más exterior en la región de unión entre el dominio A y el dominio B, hasta cierto punto);

35 I201 (aminoácido más voluminoso), por ejemplo, I201W, F, L (que parecen dar como resultado ligeras alteraciones en la geometría de la región en las inmediaciones del sitio(s) de unión de Ca2+-Na+-Ca2+ en la región de unión entre el dominio A y el dominio B, y en la geometría y/o el tamaño de un cerca del hueco/cavidad), y

Y203E,Q (que se cree que da como resultado una unión más fuerte del ion Ca2+ más exterior en su sitio de unión en la región de unión entre el dominio A y el dominio B);

(o mutaciones equivalentes en posiciones equivalentes en otra a-amilasa tipo Termamyl).

PH óptimo alterado (perfil de pH/actividad alterada)

45 [0027] El documento WO 96/23874 describe que se contempla como posible el cambiar el pH óptimo de una a-amilasa tipo Termamyl, o la actividad enzimática de la misma a un pH dado, cambiando el pKa de los residuos del sitio activo, y que esto puede lograrse, por ejemplo, mediante el cambio de la interacción electrostática o la interacción hidrofóbica entre los grupos funcionales de las cadenas laterales de aminoácidos del residuo de aminoácido que debe ser modificado y de sus alrededores.

[0028] En el contexto de la presente descripción, se cree sobre la base de consideraciones electrostáticas [véase, por ejemplo, MK Gilson, Current Opinion in Structural Biology 5 (1995) págs. 216-223 ; y B. Honig y A. Nicholls, Science 268 (1995) págs. 1144-1149; y referencias en ellos fijados] y consideraciones de higroscopicidad en relación con la

55 estructura tridimensional de la a-amilasa tipo Termamyl descrita en el documento WO 96/23874, que las mutaciones de relevancia, entre otras cosas, para alterar (aumentar o disminuir) el pH óptimo de una a-amilasa tipo Termamyl incluyen las siguientes mutaciones o equivalentes de las mismas [refiriéndose aquí a la secuencia de a-amilasa de B. licheniformis (SEQ ID NO 2)]:

Q9K,L,E; F11R,K,E; E12Q; D100N,L; V101H,R,K,D,E,F; V102A,T; I103H,K; N104R, K, D; H105R,K,D,E,W,F; L196R,K, D,E,F,Y; I212R,K,D,E; L230H,K,I; A232G,H,F,S,V; V233D; K234L,E; I236R,K,N,H,D,E; L241R,K,D,E,F; A260S; W263H; Q264R,D,K,E; N265K,R,D; A269R,K,D,E; L270R,K,H,D,E; V283H,D; F284H; D285N,L; V286R,K,H,D,E; Y290R,E; V312R,K,D,E; F323H; D325N; N326K,H,D,L; H327Q,N,E,D,F; Q330L,E; G332D; Q333R,K,H,E,L; S334A,V,T,L,I,D; L335G,A,S,T,N; E336R+R375E; T337D,K; T338D,E; T339D; Q360K,R,E; D365N;

65 G371D,R;

Aumento de la estabilidad a pH bajo (ácido) [0029] En el contexto de la presente descripción, las mutaciones (sustituciones de aminoácidos) de importancia con 5 respecto a la consecución de una mayor estabilidad a pH bajo parecen incluir mutaciones correspondientes a las siguientes mutaciones en la a-amilasa de B. licheniformis que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC

ID N.º 2: mutaciones en posiciones H68, H91, H247, R305, K306, H382, K389, H405, H406, H450 o R483; las mutaciones:

H140Y;

15 H142Y; H156Y; H159Y; H140D+H142R; H140K+H142D; o

25 H142Y+H156Y

así como combinaciones de dos o más de cualquiera de estas mutaciones.

Aumento de la termoestabilidad y/o condiciones óptimas de temperatura alteradas (perfil de temperatura/actividad

alterado) [0030] Un aspecto adicional de la descripción se refiere a una variante de una a-amilasa progenitora tipo Termamyl. Dicha variante es el resultado de uno o más residuos de aminoácidos que han sido eliminados de, sustituido en o

35 añadido a la a-amilasa progenitora a fin de lograr una mayor termoestabilidad de la variante. [0031] Puede que se mencione que, en relación a la consecución de un aumento de la termoestabilidad, el documento WO 96/23874 describe que una variante particularmente interesante de una a-amilasa un tipo Termamyl comprende una mutación correspondiente a una de las siguientes mutaciones (utilizando la numeración de la secuencia de

aminoácidos de a-amilasa de B. licheniformis mostrada en la SEC ID N.º 2): L61W,V,F; Y62W;

45 F67W; K106R,F,W; G145F,W I212F,L,W,Y,R,K; S151 sustituido con cualquier otro residuo de aminoácido y en particular con F,W,I o L; 55 R214W; Y150R,K; F143W; y/o R146W. [0032] El documento WO 96/23874 divulga además a este respecto que las mutaciones correspondientes a una o más 65 de las siguientes mutaciones en la a-amilasa de B. licheniformis que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la

SEC ID N.º 2 son de interés en relación con el logro de una termoestabilidad aumentada respecto a la de la a-amilasa progenitora:

L241I,F,Y,W; y/o 5 I236L,F,Y,W

L7F, I, W

V259F,I,L

F284W

F350W

15 F343W

L427F,L,W

V481,F,I,L,W

[0033] En el contexto de la presente descripción, se puede observar a partir de una alineación de las secuencias de aminoácidos de a-amilasas de diversas especies de Bacillus que la a-amilasa de B. licheniformis y la a-amilasa de B. amyloliquefaciens contienen ambas una "inserción" o tres aminoácidos en relación con, por ejemplo, la a-amilasa de B.

25 stearothermophilus.

[0034] A partir de un modelo de la estructura de la. a-amilasa de B. licheniformis construida sobre la base de la estructura tridimensional de la a-amilasa tipo Termamyl descrita en el documento WO 96/23784 (vide supra), teniendo en cuenta la homología de la a-amilasa de B. licheniformis con la a-amilasa tipo Termamyl en cuestión, se puede observar que la "inserción" mencionada anteriormente se encuentra dentro de una parte de la estructura designada "bucle de 8" en el documento WO 96/23784, haciendo este bucle más voluminoso en la a-amilasa de B. licheniformis que en la a-amilasa tipo Termamyl y que da como resultado un bucle que sobresale de la estructura, lo que posiblemente desestabiliza de la estructura. Por lo tanto, se contempla que la deleción de uno o más aminoácidos en la región en cuestión en la a-amilasa de B. licheniformis o B. amyloliquefaciens mejorará la termpoestabilidad de estas a

35 amilasas.

[0035] Especialmente interesante a este respecto es la supresión de tres aminoácidos dentro de la secuencia parcial de T369 a I377 (en referencia a la secuencia de aminoácidos de a-amilasa de B . licheniformis se muestra en la SEC ID N.º 2), es decir, la secuencia parcial: T369-K370-G371-D372-S373-Q374-R375-E376-I377 (o la secuencia parcial correspondiente en la la a-amilasa de B. amyloliquefaciens). Además de tales deleciones, la sustitución de uno o más de los aminoácidos no eliminados dentro de esta última secuencia parcial puede también ser ventajosa.

[0036] Deleciones preferibles de tres aminoácidos en la secuencia parcial de T369 a I377 (en la a-amilasa de B.licheniformis) son la supresión de K370+G371+D372 (es decir, K370*+G371*+ D372*) o la supresión de

45 D372+S373+Q374 (es decir, D372*+*+Q374 S373*) (o deleciones equivalentes en la secuencia parcial correspondiente en la la a-amilasa de B. amyloliquefaciens).

[0037] Otro tipo de mutación que parece ser de valor en la mejora de la termoestabilidad de estas a-amilasas es la sustitución (reemplazo) de la totalidad de la secuencia de aminoácidos parcial de T369 a I377 (en referencia a la secuencia de la a-amilasa de B. licheniformis) por una de las siguientes secuencias parciales de seis aminoácidos (secuencia de numeración creciente de izquierda a derecha): I-P-T-H-S-V; I-P-T-H-G-V, y I-P-Q-Y-N-I (o una de las mismas sustituciones de la secuencia parcial correspondiente en la la a-amilasa de B. amyloliquefaciens).

[0038] Otras mutaciones que, aparentemente, pueden ser de alguna importancia en relación a la consecución de un

55 aumento de la termoestabilidad incluyen sustituciones de aminoácidos en las siguientes posiciones (en referencia a la SEC ID N.º 2):

R169 (por ejemplo R169I,L,F,T);

R173 (especialmente R173I,L,F,T);

I201F;

I212F;

65 A209L,T; o V208I

así como combinaciones de dos o más de cualquiera de estas mutaciones.

5 El aumento de la termoestabilidad a un pH ácido y/o a una baja concentración de Ca2+

[0039] En el contexto de la divulgación, las mutaciones que parecen ser de particular relevancia en relación con la obtención de variantes según la invención con mayor termoestabilidad a pH ácido (pH <7) y/o a una baja concentración

10 de Ca2+ incluyen mutaciones en las posiciones siguientes (en relación con la a-amilasa de B. licheniformis, (SEC ID N.º 2):

H156, N172, A181, N188, N190, H205, D207, A209, A210, E211, Q264, N265

15 [0040] Se puede mencionar aquí que los residuos de aminoácidos N y E, respectivamente, en las posiciones correspondientes a los N109 y E211, respectivamente, en la SEC ID N.º 2 constituyen residuos de aminoácidos que se conservan en numerosas a-amilasas tipo Termamyl. Así, por ejemplo, las posiciones correspondientes de estos residuos en las secuencias de aminoácidos de varias a-amilasas tipo Termamyl que ya se han mencionado(vide supra) son de la siguiente manera:

a-amilasa tipo Termamyl

posición N posición E

B. licheniformis (SEC ID N.º 2) B. amyloliquefaciens (SEC ID N.º 4) B. stearothermophilus (SEC ID N.º 6) Bacillus NCIB 12512 (WO 95/26397) Bacillus NCIB 12513 (WO 95/26397) "Bacillus sp. #707" (Tsukamoto et al.)

N190 N190 N193 N195 N195 N195 E211 E211 E210 E212 E212 E212

[0041] Las mutaciones de estos residuos de aminoácidos conservados parecen ser muy importantes en relación con la mejora de la termoestabilidad a pH ácido y/o a una baja concentración de calcio, y las mutaciones siguientes son de 25 particular interés a este respecto (con referencia a la numeración de la secuencia de aminoácidos de a-amilasa de B.

licheniformis mostrada en la SEC ID N.º 2): H156Y,D 30 N172R,H,K A181T N188P 35 N190L,F H205C 40 D207Y A209L,T,V A210S 45 E211Q Q264A,E,L,K,S,T 50 N265A,S,T,Y así como cualquier combinación de dos o más de estas mutaciones. [0042] Un ejemplo de una doble mutación particularmente interesante a este respecto es Q264S+N265Y.

Patrón de escisión alterado

5 [0043] En el proceso de licuefacción del almidón es deseable usar una a-amilasa que sea capaz de degradar las moléculas de almidón en oligosacáridos ramificados largos, en vez de una a-amilasa lo que dé lugar a la formación de oligosacáridos ramificados más cortos, (como a-amilasas tipo Termamyl convencionales). Los oligosacáridos ramificados cortos (precursores de panosa) no son hidrolizados satisfactoriamente por las pululanasas, que se utilizan después del tratamiento de a-amilasa en el proceso de licuefacción, pero antes de la adición de una amiloglucosidasa

10 sacarificante (glucoamilasa). Por lo tanto, en presencia de los precursores de panosa, la mezcla de producto presente después del tratamiento de glucoamilasa contiene una proporción significativa de la así llamada dextrina límite, corta y ramificada, a saber, el trisacárido panosa. La presencia de panosa reduce el rendimiento de sacarificación significativamente y es por lo tanto indeseable.

15 [0044] Por lo tanto, un objetivo de la presente divulgación es llegar a una a-amilasa mutante que tenga características de degradación de almidón modificadas adecuadamente, pero que conserve la termoestabilidad de la a-amilasa progenitora tipo Termamyl.

[0045] Se puede mencionar aquí que, de acuerdo con el documento WO 96/23874, se espera que las variantes que 20 comprenden al menos una de las siguientes mutaciones eviten la escisión cerca del punto de ramificación:

V54L,I,F,Y,W,R,K,H,E,Q

D53L, I, F, Y, W

25 Y56W

Q333W

30 G57todos los residuos de aminoácidos posibles

A52residuos de aminoácidos más largos que A, por ejemplo, A52W,Y,L,F,I.

Aumento de la actividad específica

35 [0046] En un aspecto adicional de la presente invención, las mutaciones importantes con respecto a la obtención de variantes que muestran un aumento de la actividad específica parecen incluir mutaciones correspondientes a las siguientes mutaciones en la a-amilasa de B. licheniformis que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 2:

40 mutación (sustitución de aminoácidos) en la posición Q264 (por ejemplo, Q264R, K, S);

así como combinaciones de dos o más de cualquiera de estas últimas mutaciones, o combinaciones de una, dos o más de estas últimas mutaciones con la siguiente mutación múltiple:

45 A1*+N2*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H35I

Mutaciones generales en variantes de la divulgación

[0047] Se puede preferir que una variante de la invención comprenda una o más modificaciones además de las

50 descritas anteriormente. Así, puede ser ventajoso que uno o más residuos de prolina presentes en la parte de la variante de a-amilasa que está modificada sea/sean sustituidos por un residuo no prolina que puede ser cualquiera de l residuos no prolina posibles de origen natural, y que preferiblemente es una alanina, glicina, serina, treonina, valina o leucina.

55 [0048] Análogamente, se puede preferir que uno o más residuos de cisteína presentes entre los residuos de aminoácidos con el que la a-amilasa progenitora es modificada sea/sean sustituidos por un residuo no cisteína tal como serina, alanina, treonina, glicina, valina o leucina.

[0049] Además, una variante de la divulgación puede - o como la única modificación o bien en combinación con

60 cualquiera de las modificaciones descritas más arriba- ser modificada de modo que uno o más Asp y/o Glu presentes en un fragmento de aminoácidos correspondiente al fragmento de aminoácido 185 -209 de la SEC ID N.º 2 se sustituye por un Asn y/o Gln, respectivamente. También es de interés la sustitución, en la a-amilasa tipo Termamyl, de uno o más de los residuos de Lys presentes en un fragmento de aminoácidos correspondiente al fragmento de aminoácidos 185-209 de la SEC ID N.º 2 por una Arg.

[0050] Se entenderá que la presente divulgación abarca las variantes que incorporan dos o más de las modificaciones descritas más arriba.

5 [0051] Además, puede ser ventajoso introducir mutaciones puntuales en cualquiera de las variantes descritas en este documento.

Los métodos para preparar variantes de a-amilasa

10 [0052] Varios métodos para introducir mutaciones en genes son conocidos en la técnica. Después de una breve discusión sobre la clonación de las secuencias de ADN que codifican la a-amilasa, se discutirán los métodos para generar mutaciones en sitios específicos dentro de la secuencia que codifica la a-amilasa.

Clonación de una secuencia de ADN que codifica una a-amilasa

15 [0053] La secuencia de ADN que codifica una a-amilasa progenitora puede ser aislada de cualquier célula o microorganismo que produce la a-amilasa en cuestión, usando varios métodos bien conocidos en la técnica. En primer lugar, un debería construirse una genoteca de ADN y/o de ADNc genómico utilizando ADN cromosómico o ARN mensajero del organismo que produce la a-amilasa que debe ser estudiada. Entonces, si la secuencia de aminoácidos

20 de la a-amilasa es conocida, sondas de oligonucleótidos homólogas y marcadas pueden ser sintetizadas y utilizadas para identificar los clones que codifican la a-amilasa a partir de una genoteca preparada a partir del organismo en cuestión. Alternativamente, una sonda de oligonucleótido marcada que contiene secuencias homólogas a un gen de aamilasa conocido podría ser utilizada como sonda para identificar clones que codifican la a-amilasa, usando hibridación y condiciones de lavado de una exigencia menor.

25 [0054] Sin embargo, otro método para la identificación de clones que codifican la a-amilasa implicaría insertar fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, tal como un plásmido, tranformando la bacteria negativa de aamilasa con la genoteca de ADN genómico resultante, y, a continuación, poner en placas las bacterias transformadas sobre agar con un sustrato para la a-amilasa, permitiendo de este modo que los clones que expresan la a-amilasa sean

30 identificados.

[0055] Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica la enzima puede ser preparada sintéticamente mediante métodos estándar establecidos, por ejemplo, el método de fosforamidita descrito por S.L. Beaucage y M.H. Caruthers (1981) o el método descrito por Matthes et al. (1984). En el método de fosforamidita, los oligonucleótidos son

35 sintetizados, por ejemplo, en un sintetizador automático de ADN, purificados, fortalecidos, ligados y clonados en vectores apropiados.

[0056] Por último, la secuencia de ADN puede ser de origen genómico mixto y de origen sintético, de origen sintético y de ADNc mixto o genómico mixto y origen de ADNc, preparado ligando fragmentos de origen sintético, genómico o de

40 ADNc (según sea apropiado, los fragmentos correspondientes a varias partes de la secuencia de ADN entera), de acuerdo con técnicas estándar. La secuencia de ADN también se puede preparar por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores específicos, por ejemplo como se describe en el documento EE.UU. 4.683.202 o RK Saiki et al. (1988).

45 Mutagénesis dirigida al sitio

[0057] Una vez que una secuencia de ADN que codifica a-amilasa ha sido aislada y e identificados los sitios deseables para la mutación, se pueden introducir mutaciones usando oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias de nucleótidos que flanquean los sitios de mutación deseados; nucleótidos mutantes se insertan durante la

50 síntesis de oligonucleótidos. En un método específico, un espacio monocatenario de ADN, que enlaza la secuencia que codifica la a-amilasa, se crea en un vector que lleva el gen de a-amilasa. Luego el nucleótido sintético, que lleva la mutación deseada, se hibrida con una porción homóloga del ADN monocatenario. El hueco restante se rellena entonces con ADN polimerasa I (fragmento de Klenow) y el constructo se liga usando ligasa T4. Un ejemplo específico de este método se describe en Morinaga et al. (1984). El documento EE.UU. 4.760.025 describe la introducción de

55 oligonucleótidos que codifican mutaciones múltiples mediante la realización de alteraciones menores del casete. Sin embargo, una variedad aún mayor de mutaciones puede ser introducida en cualquier momento mediante el método de Morinaga, ya que una multitud de oligonucleótidos, de varias longitudes, se puede introducir.

[0058] Otro método para introducir mutaciones en secuencias de ADN que codifican la a-amilasa se describe en Nelson

60 and Long (1989). Se trata de la generación de 3er paso de un fragmento de PCR que contiene la mutación deseada introducida usando una cadena de ADN sintetizada químicamente como uno de los cebadores en las reacciones de PCR. Del fragmento generado por PCR, un fragmento de ADN que lleva la mutación puede ser aislado por escisión con endonucleasas de restricción y reinsertado en un plásmido de expresión.

Mutagénesis aleatoria

[0059] La mutagénesis aleatoria se lleva a cabo adecuadamente ya sea como mutagénesis aleatoria localizada o 5 específica de la región en al menos tres partes del gen que se traduce en la secuencia de aminoácidos en cuestión, o dentro de todo el gen.

[0060] El documento WO 96/23874 divulga que, en relación con la consecución de la unión mejorada de un sustrato (es decir, la unión mejorada de una especie de hidratos de carbono, tales como la amilosa o la amilopectina) por una

10 variante de a-amilasa tipo Termamyl, modificada (por ejemplo, superior) especificidad de sustrato y/o modificado (por ejemplo, superior) especificidad con respecto a la escisión (hidrólisis) del sustrato, las siguientes posiciones de codón de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 2 (o posiciones del codón equivalentes para otra a-amilasa progenitora tipo Termamyl en el contexto de la divulgación) parece ser particularmente apropiado para la determinar:

15 13-18

50-56

70-76 20 102-109

163-172

25 189-199

229-235

360-364 30 327-335

Mejora del rendimiento de licuefacción a bajo pH y baja concentración de iones de calcio

35 [0061] Para que una a-amilasa sea utilizada en un proceso de licuefacción de almidón, es de particular interés que sea termoestable y capaz de funcionar a pH bajo y concentraciones bajas de calcio Con el fin de mejorar estas propiedades de una a-amilasa progenitora tipo Termamyl, en particular, la B. a-amilasa de Blicheniformis o una variante o híbrido de la misma, se puede realizar una mutagénesis aleatoria (preferiblemente mediante el uso de cebadores de oligonucleótidos dopados o púas) seguida de la selección adecuada de las enzimas mutadas resultantes. La dirección

40 de la selección de las regiones a aleatorizar y la selección de dopaje se basan principalmente en la estabilización de los iones de calcio que ya están presentes, y en la mejora de las interacciones electrostáticas residuo/residuo o dominio/dominio a pH bajo. Además, se pueden seleccionar las regiones que se ha demostrado que incluyen posiciones importantes para la consecución de un buen rendimiento licuefacción del almidón. Con el fin de preparar una variante de una a-amilasa tipo Termamyl que tenga las propiedades anteriores, al menos una de las siguientes regiones puede ser

45 ventajosamente sometida a mutagénesis aleatoria (la numeración de los residuos de aminoácidos siendo como en la SEC ID N.º 2)

Región Residuo Descripción

I: 153-163 Región de calcio entre el dominio A y B, que también contiene H156

II: 178-192 Región de calcio entre el dominio A & B

III: 193-214 Región de calcio entre el dominio A y B, que también contiene A209

IV: 232-237 Región de calcio entre el dominio A & B

V: 297-308 Región de calcio entre el dominio A & B

VI: 403-409 Región de calcio entre el dominio A & B

VII: 428-435 Región de calcio entre el dominio A & B

VIII: 131-136 Región que contiene H133

IX: 164-175 Región en contacto con H133 región

X: 262-278 Región que contiene Q264

[0062] Preferiblemente, dos, tres o cuatro de las regiones más arriba se someten a mutagénesis aleatoria en la construcción de una nueva variante de a-amilasa de la divulgación. Por ejemplo, las siguientes combinaciones de 5 regiones son adecuadamente sometidas a mutagénesis aleatoria:

VIII+IX

VIII+IX+II

10 II+III+IV

IV+I

15 [0063] Además, se prefiere que la mutagénesis se lleve a cabo mediante el uso de oligonucleótidos dopados o enriquecidos. El dopaje se lleva a cabo preferiblemente a fin de introducir aminoácidos que contribuyen a la mejora de la estabilidad a bajo pH ya la reducción de la dependencia de calcio a pH bajo de la variante de a-amilasa resultante. Además, cuando se selecciona el esquema de dopaje, en general, debe evitarse la posibilidad de introducir los residuos Asn y Gln, ya que los residuos Asn y Gln en general se asocian con la inestabilidad a un pH bajo. Preferiblemente,

20 cuando un residuo Pro puede ser insertado con beneficios potenciales (por ejemplo, como se evaluó a partir de consideraciones de proteínas estructurales), el esquema de dopaje se prepara para incluir una preferencia por la introducción de un residuo Pro.

[0064] La a-amilasa tipo Termamyl que debe ser sometida a mutagénesis aleatoria de acuerdo con el principio anterior

25 puede ser cualquier a-amilasa de tipo salvaje o una variante de la misma que contenga una o más mutaciones. La progenitora puede ser un híbrido entre al menos dos a-amilasas como se explica en más detalle en este documento. Preferiblemente, la a-amilasa progenitora es un mutante de la a-amilasa de B. licheniformis que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 2 que contiene al menos una mutación, y preferiblemente mutaciones múltiples. La a-amilasa progenitora puede ser, de forma alternativa, una a-amilasa híbrida que contiene al menos una parte de la

30 a-amilasa de B. licheniformis (SEC ID N.º 2). Ejemplos específicos de a-amilasas progenitoras adecuadas para la mutagénesis de acuerdo con los principios descritos anteriormente incluyen: variantes de la a-amilasa de B. licheniformis (SEC ID N.º 2) que contienen al menos uno de, es decir, uno, dos, tres, cuatro o todas las cinco de las mutaciones H156Y, A181T, N190F, A209V y Q264S.

35 [0065] En relación con lo anterior, un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un método para generar una variante de una a-amilasa progenitora tipo Termamyl, dicha variante presenta una mayor estabilidad a pH bajo y a baja concentración de calcio con relación a la progenitora, comprendiendo el método:

someter una secuencia de ADN que codifica la a-amilasa progenitora tipo Termamyl a mutagénesis aleatoria,

40 Este último método de la invención se lleva a cabo preferiblemente usando cebadores dopados, como se describe en los ejemplos de trabajo en este documento (vide infra).

Método de realización de la mutagénesis aleatoria

45 [0066] La mutagénesis aleatoria de una secuencia de ADN que codifica una a-amilasa progenitora a realizar de acuerdo con el paso a) del método anteriormente descrito de la invención puede llevarse a cabo convenientemente mediante el uso de cualquier método conocido en la técnica.

50 [0067] Por ejemplo, la mutagénesis aleatoria se puede realizar mediante el uso de un agente mutagenizante físico o químico adecuado, mediante el uso de un oligonucleótido adecuado, o sometiendo la secuencia de ADN a mutagénesis generada por PCR. Además, la mutagénesis aleatoria se puede realizar mediante el uso de cualquier combinación de estos agentes mutagenizantes.

55 [0068] El agente mutagenizante puede, por ejemplo, ser uno que induzca transiciones, transversiones, inversiones, aleatorización, deleciones y/o inserciones.

[0069] Ejemplos de un agente mutagenizante físico o químico adecuado para el presente propósito incluyen irradiación ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, etil

60 metano sulfonato (EMS), bisulfito de sodio, ácido fórmico, y análogos de nucleótidos.

[0070] Cuando se usan tales agentes, la mutagénesis se realiza normalmente mediante la incubación de la secuencia de ADN que codifica la enzima madre que debe ser mutagenizada en presencia del agente mutagenizante de elección bajo condiciones adecuadas para que la mutagénesis tenga lugar, y seleccionando el ADN mutado que tiene las

65 propiedades deseadas.

[0071] Cuando la mutagénesis se realiza mediante el uso de un oligonucleótido, el oligonucleótido puede ser dopado o enriquecido con los tres nucleótidos no progenitores durante la síntesis del oligonucleótido en las posiciones que han de ser cambiadas. El dopaje o enriquecimiento se puede hacer de manera que se eviten los codones de los aminoácidos no deseados. El oligonucleótido dopado o enriquecido puede ser incorporado en el ADN que codifica la enzima

5 amilolítica mediante cualquier técnica publicada, usando, por ejemplo PCR, LCR o cualquier ADN polimerasa y ligasa.

[0072] Preferiblemente, el dopaje se lleva a cabo usando "dopaje aleatorio constante", en el que el porcentaje de tipo salvaje y mutación en cada posición está predefinido. Además, el dopaje puede ser dirigido para que tenga una preferencia para la introducción de nucleótidos determinados, y de ese modo una preferencia para la introducción de

10 uno o más residuos de aminoácidos específicos. El dopaje puede, por ejemplo, realizarse con el fin de permitir la introducción de un 90% de tipo salvaje y un 10% de mutaciones en cada posición. Una consideración adicional en la elección del sistema de dopaje es genética, así como las limitaciones estructurales de las proteínas. El esquema de dopaje puede realizarse usando el programa DOPE (véanse los ejemplos de trabajo en este documento), que, entre otras cosas, asegura que se evite la introducción de codones de parada.

15 [0073] Cuando se utiliza la mutagénesis generada por PCR, bien un gen tratado químicamente o bien uno no tratado que codifica una enzima de a-amilasa progenitora es sometido a PCR bajo condiciones que aumentan la mala incorporación de nucleótidos (Deshler 1992; Leung et al., Technique, Vol.1, 1989, pp. 11-15).

20 [0074] Una cepa mutadora de E. coli (Fowler et al., Molec. Gen. Genet., 133, 1974, pp. 179-191), S. cereviseae o cualquier otro organismo microbiano puede ser usado para la mutagénesis aleatoria del ADN que codifica la enzima amilolítica, por ejemplo, transformando un plásmido que contiene la enzima madre en la cepa mutadora, creciendo la cepa mutadora con el plásmido y aislando el plásmido mutado de la cepa mutadora. El plásmido mutado puede posteriormente ser transformado en el organismo de expresión.

25 [0075] La secuencia de ADN a mutagenizar puede estar convenientemente presente en una genoteca genómica o de ADNc preparada a partir de un organismo que exprese la enzima amilolítica madre. Alternativamente, la secuencia de ADN puede estar presente en un vector adecuado tal como un plásmido o un bacteriófago, que como tal puede ser incubado con o, si no, expuesto al agente mutagenizante. El ADN a mutagenizar puede también estar presente en una

30 célula huésped ya sea por estar integrado en el genoma de dicha célula o estando presente en un vector albergado en la célula. Finalmente, el ADN a mutagenizar puede estar en forma aislada. Se entenderá que la secuencia de ADN que debe ser sometida a mutagénesis aleatoria es preferiblemente una secuencia de ADNc o de ADN genómico.

[0076] En algunos casos puede ser conveniente amplificar la secuencia de ADN mutada antes de realizar el paso de

35 expresión (b) o el paso de detección (c). Tal amplificación puede llevarse a cabo de conformidad con métodos conocidos en la técnica, siendo el método actualmente preferido la amplificación generada por PCR usando cebadores oligonucleótidos preparados sobre la base de la secuencia de ADN o de aminoácidos de la enzima madre.

[0077] Después de la incubación con o de la exposición al agente mutagenizante, el ADN mutado se expresa mediante

40 el cultivo de una célula huésped adecuada que lleva la secuencia de ADN bajo condiciones que permitan que la expresión tenga lugar. La célula huésped usada para este propósito puede ser una que ha sido transformada con la secuencia de ADN mutada, opcionalmente presente en un vector, o una que se llevó a la secuencia de ADN que codifica la enzima madre durante el tratamiento de mutagénesis. Ejemplos de células huésped adecuadas son las siguientes: bacterias gram positivas tales comoBacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis,

45 Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans orStreptomyces murinus; y las bacterias gramnegativas tales como E.coli.

[0078] La secuencia de ADN mutada puede comprender además una secuencia de ADN que codifique funciones que 50 permitan la expresión de la secuencia de ADN mutada.

[0079] Mutagénesis aleatoria localizada: la mutagénesis aleatoria puede ventajosamente estar localizada en una parte de la a-amilasa progenitora en cuestión. Esto puede, por ejemplo, ser ventajoso cuando determinadas regiones de la enzima han sido identificadas como de importancia particular para una propiedad dada de la enzima, y cuando se

55 modifican se espera que den lugar a una variante con propiedades mejoradas. Tales regiones pueden normalmente ser identificadas cuando la estructura terciaria de la enzima madre ha sido dilucidada y relacionada con la función de la enzima.

[0080] La mutagénesis aleatoria localizada se realiza convenientemente mediante el uso de técnicas de mutagénesis 60 generadas por PCR como se describió anteriormente, o cualquier otra técnica adecuada conocida en la técnica.

[0081] Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica la parte de la secuencia de ADN que debe ser modificada puede ser aislada, por ejemplo, al ser insertada en un vector adecuado, y dicha parte puede posteriormente ser sometida a mutagénesis mediante el uso de cualquiera de los métodos de mutagénesis mencionados anteriormente.

65 [0082] Con respecto al paso de selección en el método anteriormente mencionado de la invención, este puede ser convenientemente realizado mediante el uso de un ensayo como se describe en relación con el Ejemplo 2 en este documento.

5 [0083] Con respecto a la selección, en general, un ensayo de filtro basado en lo siguiente es generalmente aplicable:

Un microorganismo capaz de expresar la enzima mutada amilolítica de interés es incubado en un medio adecuado y bajo condiciones adecuadas para que la enzima sea secretada, disponiendo el medio de un filtro doble que comprende un primer filtro de unión a proteínas y en la parte superior del mismo un segundo filtro que muestra una capacidad baja de unión a proteínas. El microorganismo está localizado en el segundo filtro. Después de la incubación, el primer filtro que comprende enzimas segregadas a partir de los microorganismos se separan del segundo filtro que comprende los microorganismos. El primer filtro se somete a la selección de la actividad enzimática deseada y se identifican las colonias microbianas correspondientes presentes en el segundo filtro.

15 [0084] El filtro utilizado para la unión de la actividad enzimática puede ser cualquier filtro de unión a proteínas, por ejemplo nylon o nitrocelulosa. La parte superior del filtro que lleva las colonias del organismo de expresión puede ser cualquier filtro que tenga poca o ninguna afinidad por las proteínas de unión, por ejemplo, acetato de celulosa o Durapore™ . El filtro puede ser pretratado con cualquiera de las condiciones a ser utilizadas para la selección o puede ser tratado durante la detección de la actividad enzimática.

[0085] La actividad enzimática puede ser detectada por un tinte, indicador de fluorescencia, precipitación, indicador de pH, absorbancia IR o cualquier otra técnica conocida para la detección de la actividad enzimática.

[0086] El compuesto de detección puede ser inmovilizado por cualquier agente de inmovilización, por ejemplo, agarosa, 25 agar, gelatina, poliacrilamida, almidón, papel de filtro, tela, o cualquier combinación de agentes de inmovilización.

[0087] La actividad de a-amilasa es detectada mediante amilopectina marcada Cibacron Red, que está inmovilizada en agarosa. Para la selección de variantes con una mayor estabilidad térmica y de pH alto, el filtro con las variantes de aamilasa se incubaron en un tampón a pH 10,5 y 60 ° o 65 °C durante un tiempo especificado, se enjuagó brevemente en agua desionizada y se colocó en la matriz de amilopectina-agarosa para la detección de la actividad. La actividad residual se ve como la lisis de Cibacron Red por degradación de la amilopectina. Las condiciones se eligen para ser de manera que la actividad debida a la a-amilasa que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 2 apenas pueda ser detectada. Variantes estabilizadas muestran, en las mismas condiciones, el aumento de la intensidad del color debido a una mayor liberación de Cibacron Red.

35 [0088] Para la selección de variantes con una actividad óptima a una temperatura inferior y/o por encia de un rango de temperatura más amplio, el filtro con las variantes unidas es colocado directamente en la placa de sustrato amilopectina-Cibacron Rojo y se incubó a la temperatura deseada (por ejemplo, 4 °C, 10 °C o 30 °C) durante un tiempo determinado. Después de este tiempo, la actividad debiao a la a-amilasa que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 2 apenas puede ser detectada, mientras que las variantes con actividad óptima a una temperatura inferior mostrarán un aumento de lisis amilopectina. Antes de la incubación en la matriz de amilopectina, la incubación en todos los tipos de medios deseados -por ejemplo, soluciones que contienen Ca2+, detergentes, EDTA u otros aditivos pertinentes- puede llevarse a cabo con el fin de seleccionar la dependencia cambiada o la reacción de las variantes en cuestión con tales aditivos.

45 Pruebas de variantes de la divulgación

[0089] La prueba de variantes de la invención puede llevarse a cabo convenientemente mediante la determinación de la actividad que degrada almidón de la variante, por ejemplo, mediante el cultivo de células huésped transformadas con una secuencia de ADN que codifica una variante en una placa de agarosa que contiene almidón y la identificación de células huésped que degradan el almidón. Pruebas adicionales en cuanto a propiedades alteradas (incluyendo la actividad específica, especificidad de sustrato, patrón de escisión, termoactivation, pH óptimo, dependencia del pH, condiciones óptimas de temperatura, y cualquier otro parámetro) pueden llevarse a cabo de conformidad con métodos conocidos en la técnica.

55 Expresión de variantes de a-amilasas

[0090] De acuerdo con la divulgación, una secuencia de ADN que codifica la variante producida por métodos anteriormente descritos, o por cualesquiera métodos alternativos conocidos en la técnica, puede ser expresada, en forma de enzima, usando un vector de expresión que normalmente incluye secuencias de control que codifican un promotor, operador, el sitio de unión al ribosoma, señal de iniciación de la traducción, y, opcionalmente, un gen represor

o varios genes activadores.

[0091] El vector de expresión recombinante que lleva la secuencia de ADN que codifica una variante de a-amilasa de la 65 invención puede ser cualquier vector que pueda convenientemente ser sometido a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector dependerá a menudo de la célula huésped en la que se va a introducir. Así, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un bacteriófago o un elemento extracromosómico, minicromosoma o un cromosoma artificial. Alternativamente, el vector puede ser uno que,

5 cuando se introduce en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se replica junto con el cromosoma(s) en el que se ha integrado.

[0092] En el vector, la secuencia de ADN debería estar operativamente conectada a una secuencia promotora adecuada. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad transcripcional en la célula 10 huésped de elección y puede ser derivado de genes que codifican proteínas bien homólogas o heterólogas a la célula huésped. Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de ADN que codifica una variante de a-amilasa de la invención, especialmente en un huésped bacteriano, son el promotor del operón lac de E. coli, Streptomyces coelicolor los del gen de agarasa dagA de promotores, los promotores del Bacillus licheniformis gen de a-amilasa (amyL), los promotores de los géneros Bacillus stearothermophilus, gen de amilasa maltogénica (amyM), 15 los promotores de los géneros Bacillus amyloliquefaciens a-amilasa (amyQ), los promotores de los géneros Bacillus subtilis genes xylA y xylB etc Para la transcripción en un huésped fúngico, ejemplos de promotores útiles son aquellos derivados del gen que codifica la amilasa TAKA de A. oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, A. niger neutro a-amilasa, A. niger estable a los ácidos a-amilasa, glucoamilasa de A. niger, lipasa de Rhizomucor miehei, la proteasa alcalina de A. oryzae, A. oryzae, triosa fosfato isomerasa o A. nidulans, acetamidasa. Para la transcripción en

20 un huésped fúngico, ejemplos de promotores útiles son aquellos derivados del gen que codifica . TAKA amilasa A.oryzae, proteinasa aspártica Rhizomucor miehei, a-amilasa neutra de A.niger, a-amilasa ácido establede A. niger, glucoamilasa A. niger, lipasa Rhizomucor miehei, proteasa alcalina A. oryzae, isomerasa de fosfato de triosaA.oryzae o acetamidasa A.nidulans.

25 [0093] El vector de expresión de la invención también puede comprender un terminador de transcripción adecuado y, en eucariotas, secuencias de poliadenilación operativamente conectadas a la secuencia de ADN que codifica la variante de a-amilasa de la invención. Las secuencias de terminación y de poliadenilación pueden derivar adecuadamente pueden de las mismas fuentes que el promotor.

30 [0094] El vector puede comprender además una secuencia de ADN que permita que el vector se replique en la célula huésped en cuestión. Ejemplos de tales secuencias son los orígenes de replicación de plásmidos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 y pIJ702.

[0095] El vector también puede comprender un marcador seleccionable, por ejemplo, un gen cuyo producto

35 complementa un defecto en la célula huésped, tales como los genes dal de B. subtilis o B. licheniformis, o uno que confiera resistencia a antibióticos tales como ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o resistencia a la tetraciclina. Por otra parte, el vector puede comprender marcadores de selección de Aspergillus tales como amdS, argB, niaD y sC, un marcador que dé lugar a resistencia a la higromicina, o la selección puede llevarse a cabo mediante la cotransformación, por ejemplo, como se describe en el documento WO 91/17243.

40 [0096] Mientras que la expresión intracelular puede ser ventajosa en algunos aspectos, por ejemplo, cuando se utilizan determinadas bacterias como células huésped, se prefiere generalmente que la expresión sea extracelular. En general, el las a-amilasas Bacillus mencionadas en este documento comprenden una prerregión que permite la secreción de la proteasa expresada en el medio de cultivo. Si se desea, esta prerregión puede ser sustituida por una prerregión

45 diferente o secuencia señal, convenientemente realizada mediante la sustitución de las secuencias de ADN que codifican las respectivas prerregiones.

[0097] Los procedimientos usados para enlazar el constructo de ADN de la invención que codifica una variante de aamilasa, el promotor, terminador y otros elementos, respectivamente, y para insertarlas en vectores adecuados que

50 contienen la información necesaria para la replicación, son bien conocidos para las personas expertas en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989)).

[0098] La célula de la invención, ya sea que comprende una construcción de ADN o un vector de expresión de la invención tal como se ha definido anteriormente, se utiliza ventajosamente como una célula huésped en la producción 55 recombinante de una variante de a-amilasa de la invención. La célula puede ser transformada con el constructo de ADN de la invención que codifica la variante, integrando convenientemente el constructo de ADN (en una o más copias) en el cromosoma huésped. Esta integración se considera generalmente que es una ventaja, ya que es más probable que la secuencia de ADN se mantenga estable en la célula. La integración de los constructos de ADN en el cromosoma huésped puede ser realizada según métodos convencionales, por ejemplo, por recombinación homóloga o heteróloga.

60 Alternativamente, la célula puede ser transformada con un vector de expresión como se ha descrito anteriormente en relación con los diferentes tipos de células huésped.

[0099] La célula de la invención puede ser una célula de un organismo superior tal como un mamífero o un insecto, pero es preferiblemente una célula microbiana, por ejemplo, una célula bacteriana o una fúngica (incluyendo la

65 levadura).

[0100] Ejemplos de bacterias adecuadas son las bacterias grampositivas como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, o Streptomyces lividans orStreptomyces murinus, o las bacterias gramnegativas como la E. coli. La transformación de las bacterias puede, por

5 ejemplo, ser efectuada por transformación de protoplastos o mediante el uso de células competentes de una manera conocida per se.

[0101] El organismo de la levadura puede ser seleccionado favorablemente de una especie de Saccharomyces o Schizosaccharomyces, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae. El hongo filamentoso puede pertenecer ventajosamente

10 a una especie de Aspergillus, por ejemplo, Aspergillus oryzae o Aspergillus niger. Las células fúngicas pueden ser transformadas mediante un proceso que implica la formación de protoplastos y la transformación de los protoplastos seguido de la regeneración de la pared celular en una manera conocida per se. Un procedimiento adecuado para la transformación de células huéspedes de Aspergillus se describe en el documento EP 238 023.

15 [0102] En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere a un método de producción de una variante de aamilasa de la invención, dicho método comprende el cultivo de una célula huésped como se ha descrito anteriormente bajo condiciones propicias para la producción de la variante y la recuperación de la variante de las células y/o medio de cultivo.

20 [0103] El medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para el cultivo de la célula huésped en cuestión y obtener la expresión de la variante de a-amilasa de la invención. Los medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o pueden ser preparados según recetas publicadas (por ejemplo, como se describe en catálogos de la American Type Culture Collection).

25 [0104] La variante de a-amilasa secretada de las células huésped puede ser convenientemente recuperada del medio de cultivo mediante procedimientos bien conocidos, incluyendo la separación de las células del medio por centrifugación

o filtración, y precipitación de los componentes proteínicos del medio por medio de un sal tal como sulfato de amonio, seguido del uso de procedimientos cromatográficos tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, o similares .

30 Aplicaciones industriales

[0105] Las variantes de a-amilasa de esta invención poseen propiedades valiosas que permiten una variedad de aplicaciones industriales. En particular, variantes de la enzima de la invención son aplicables como componente en

35 composiciones detergentes de lavado, lavavajillas y de limpieza de superficies duras. Numerosas variantes son particularmente útiles en la producción de edulcorantes y etanol a partir de almidón, y/o para el desencolado textil. Condiciones para procesos de conversión de almidón convencionales, incluyendo la licuefacción del almidón y/o procesos de sacarificación, están descritos en, por ejemplo, EE.UU. 3.912.590 y en las publicaciones de patente EP N.º 252,730 y 63,909 .

40 [0106] Producción de edulcorantes a partir de almidón : Un proceso " tradicional " para la conversión de almidón en jarabes de fructosa normalmente consiste en tres procesos enzimáticos consecutivos, a saber, un proceso de licuefacción seguido de un proceso de sacarificación y un proceso de isomerización. Durante el proceso de licuefacción, el almidón se degrada a dextrinas por una a-amilasa (por ejemplo, Termamyl™) a valores de pH entre 5.5 y 6.2 y a

45 temperaturas de 95 a 160 °C durante un período de aprox. 2h. Con el fin de garantizar una estabilidad enzimática óptima bajo estas condiciones, se añade 1 mM de calcio (40 ppm de iones libres de calcio).

[0107] Después del proceso de licuefacción las dextrinas se convierten en dextrosa mediante la adición de una glucoamilasa (por ejemplo, AMG™) y una enzima desramificante, tal como una isoamilasa o una pululanasa (por 50 ejemplo, Pro-mozyme™). Antes de esta etapa, el pH se reduce a un valor por debajo de 4.5, manteniendo la temperatura alta (por encima de 95 °C), y la actividad a-amilasa de licuación se desnaturaliza. La temperatura se baja a 60 °C y se añaden la glucoamilasa y la enzima desramificante. El proceso de sacarificación procede durante 24-72 horas. Después del proceso de sacarificación el pH se aumenta a un valor en el intervalo de 6-8, preferiblemente pH 7.5, y el calcio se elimina mediante intercambio iónico. El jarabe de dextrosa es luego convertido en jarabe rico en

55 fructosa usando, por ejemplo, un glucosa isomerasa inmovilizada (tal como Sweetzyme™).

[0108] Al menos 3 mejoras enzimáticas de este proceso podrían contemplarse. Las tres mejoras, todas ellas, podrían ser vistas como beneficios individuales, pero cualquier combinación (por ejemplo, 1+2, 1+3, 2+3 o 1+2+3) se podría emplear:

60 Mejora 1. Reducción de la dependencia de calcio de la a-amilasa de licuación.

[0109] Se requiere que la adición de calcio libre asegure adecuadamente una alta estabilidad de la a-amilasa, pero el calcio libre inhibe fuertemente la actividad de la glucosa isomerasa y necesita ser eliminado, por medio de una 65 operación de unidad costosa, hasta un punto en el que reduzca el nivel de calcio libre por debajo de 3-5 ppm. Los

ahorros de costes se podrían obtener si tal operación pudiera ser evitada y el proceso de licuefacción pudiera ser realizado sin adición de iones de calcio libres.

[0110] Para lograrlo, es necesaria una a-amilasa tipo Termamyl con menor dependencia del calcio que sea estable y 5 altamente activa a concentraciones bajas de calcio libre (<40 ppm). Tal a-amilasa tipo Termamyl debería tener un pH óptimo a un pH en el rango de 4.5 a 6.5, preferiblemente en el intervalo de 4.5 a 5.5.

Mejora 2. Reducción de la formación de productos de Maillard indeseados

10 [0111] La extensión de la formación de productos de Maillard no deseados durante el proceso de licuefacción depende del pH. El pH bajo favorece la reducción de la formación de productos de Maillard. Por lo tanto, sería deseable poder bajar el pH del proceso de alrededor de pH 6,0 a un valor de alrededor de pH 4,5, por desgracia, todas las a-amilasas tipo Termamyl termoestables y conocidas comúnmente no son muy estables a pH bajo (es decir, pH <6,0) y su actividad específica es generalmente baja.

15 [0112] El logro del objetivo antes mencionado requiere una a-amilasa tipo Termamyl que es estable a pH bajo en el rango de 4.5 a 5.5 y en las concentraciones de calcio libre en el rango de 0-40 ppm, y que mantiene una alta actividad específica.

20 Mejora 3.

[0113] Se ha informado anteriormente (patente de EE.UU. 5.234.823) que en caso de sacarificación con glucoamilasa de A. niger y pululanasa de B. acidopullulyticus, la presencia de la actividad de a-amilasa residual del proceso de licuefacción puede conducir a la disminución de los rendimientos de dextrosa si la a-amilasa no es inactivada antes de 25 la fase de sacarificación. Esta inactivación típicamente puede llevarse a cabo mediante el ajuste del pH por debajo de

4.3 a 95 °C, antes de bajar la temperatura a 60 °C para la sacarificación.

[0114] La razón de este efecto negativo en el rendimiento de dextrosa no se entiende completamente, pero se supone que la a-amilasa de licuefacción (por ejemplo, Termamyl™ 120 L de B. licheniformis). genera "dextrinas límite" (que son

30 sustratos pobres para pululanasa de B. acidopullulyticus) mediante hidrólisis de enlaces glucosídicos alfa 1,4 cerca y a ambos lados de los puntos de ramificación en la amilopectina. La hidrólisis de estas dextrinas límite por la glucoamilasa conduce a una acumulación del trisacárido panosa, que solo es hidrolizado lentamente por la glucoamilasa.

[0115] El desarrollo de una a-amilasa termoestable que no sufra de esta desventaja sería una mejora de proceso 35 importante, ya que no sería necesario ningún paso de inactivación por separado.

[0116] Si se desarrolla una a-amilasa tipo Termamyl estable a pH bajo, una alteración de la especificidad podría ser una ventaja necesaria en combinación con el aumento de la estabilidad a pH bajo.

40 [0117] La metodología y los principios de la presente invención permiten diseñar y producir variantes de acuerdo con la divulgación que tienen propiedades requeridas como se indicó anteriormente. A este respecto, las mutaciones particularmente interesantes son las mutaciones en una a-amilasa tipo Termamyl [por ejemplo Termamyl™ en sí mismo (a-amilasa de B. licheniformis; SEC ID N.º 2), o una a-amilasa tipo Termamyl que tiene una secuencia de aminoácidos N-terminal (es decir, la secuencia parcial hasta la posición del aminoácido correspondiente a la posición 35 en

45 Termamyl™) que es idéntica a la de a-amilasa de B. amyloliquefaciens (SEC ID N.º 4), es decir, una a-amilasa tipo Termamyl que tiene la siguiente secuencia N-terminal con respecto a la secuencia de aminoácidos de Termamyl™:

A1*+N2*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H35I, donde un asterisco (*) indica deleción del residuo de aminoácido en cuestión] en posiciones correspondientes a cualquiera de las siguientes posiciones en

50 Termamyl™:

H156

A181

55 A209

[0118] Sustituciones particularmente preferidas en las posiciones indicadas anteriormente son las siguientes:

60 H156Y

A181T

A209V

las siguientes mutaciones múltiples: H156Y+A181T+A209V; H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S

5 A1*+N2*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H35I+H156Y+A181T+A 209V; A1*+N2*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H35I+H156Y+A181T+N 190F+A209V; o A1*+N2*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H35I+H156Y+A181T+N 190F+A209V+Q264S.

[0119] Como ya se ha indicado, numerosas variantes de acuerdo con la invención son particularmente adecuadas para su uso en la conversión del almidón, por ejemplo, en la licuefacción de almidón. A este respecto, un aspecto adicional de la presente descripción se refiere a composiciones que comprenden una mezcla de:

(i) la a-amilasa de B. licheniformis que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID N.º 2 con una o más variantes (aamilasas mutantes) derivadas de (como la a-amilasa tipo Termamyl) la a-amilasa de B. stearothermophilus que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID N.º 6; o

(ii) la a-amilasa de B. stearothermophilus que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID N.º 6 conuna o más variantes (a-amilasas mutantes) derivadas de una o más a-amilasas tipo Termamyl (por ejemplo, de la a-amilasa de B. licheniformis que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID N.º 2 o de una de las otras a-amilasas progenitoras tipo Termamyl nombradas específicamente en este documento); o

(iii) una o más variantes (a-amilasas mutantes) derivadas de (como la a-amilasa tipo Termamyl) la a-amilasa de B. stearothermophilus que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID N.º 6 con una o más variantes (a-amilasas mutantes) según la invención derivadas de una o más a-amilasas tipo Termamyl (por ejemplo, de la a-amilasa de B. licheniformis que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID N.º 2 o de una de las otras a-amilasas progenitoras tipo Termamyl

25 nombradas específicamente en este documento).

[0120] Mutaciones preferidas de una variante de a-amilasa de B. stearothermophilus a incorporar en dicha mezcla incluye sustituciones en N193 y/o en E210, y/o las deleciones de pares R179*+G180* o I181*+G182* (usando la numeración de la secuencia de aminoácidos para esta a-amilasa particular).

[0121] Las composiciones de uno de los últimos tipos, que contienen a-amilasa de B. stearothermophilus o una variante de la misma de acuerdo con la invención, parecen tener un gran potencial para su uso en la licuefacción de almidón. La relación (expresada, por ejemplo, en términos de mg de proteína amilolítica activa por litro de medio líquido) entre los componentes a-amilolíticos individuales de una mezcla dada dependerá de la naturaleza exacta y las propiedades de

35 cada componente.

Composiciones detergentes

[0122] Como se mencionó anteriormente, las variantes de la invención convenientemente se pueden incorporar en las composiciones detergentes. Se hace referencia, por ejemplo, al documento WO 96/23874 y WO 97/07202 para más detalles relativos a ingredientes pertinentes de composiciones detergentes (tales como detergentes para lavar platos o ropa), métodos apropiados de formulación de las variantes en tales composiciones detergente, y para ejemplos de tipos pertinentes de composiciones detergentes.

45 [0123] Composiciones detergentes que comprenden una variante de la invención pueden comprender adicionalmente una o más de otros enzimas, tales como una lipasa, cutinasa, proteasa, celulasa, peroxidasa o lacasa, y/u otra aamilasa.

[0124] Variantes de a-amilasa de la invención pueden ser incorporadas en detergentes a concentraciones empleadas convencionalmente. En la actualidad se contempla que una variante de la invención se pueda incorporar en una cantidad correspondiente a 0,00001-1mg (calculado como proteína enzimática pura activa) de a-amilasa por litro de líquido de lavado/lavaplatos usando niveles de dosificación convencionales de detergente.

[0125] La presente invención se describe adicionalmente con referencia al dibujo adjunto, en el que:

55 La Fig. 1 muestra la secuencia de ADN, junto con el codón de parada TAA, que codifica la cepa de Bacillus NCIB 12512 de a-amilasa que se describe en el documento WO 95/26397, junto con la secuencia de aminoácidos de la a-amilasa codificada (véase la Fig. 2).

La Fig. 2 es una alineación de las secuencias de aminoácidos de cuatro a-amilasas progenitoras tipo Termamyl. Los números en el extremo izquierdo designan las secuencias de aminoácidos respectivas como sigue:

la secuencia de aminoácidos de la cepa de Bacillus NCIB 12512 de a-amilasa que se describe en el documento WO 95/26397;

65 2: la secuencia de aminoácidos de la cepa de Bacillus NCIB 12513 de a-amilasa que se describe en el documento WO 95/26397;

3: la secuencia de aminoácidos de la a-amilasa de B. stearothermophilus como se muestra en la SEC ID 5 N.º 6 en este documento;

4: la secuencia de aminoácidos de la cepa Bacillus sp. # 707 de a-amilasa descrita por Tsukamoto et al. en Biochem. Biophys. Res. Commun. 151 (1988), págs.25-31 .

10 [0126] Los números en el extremo derecho de la figura dan el número total corriente de aminoácidos para cada una de las secuencias en cuestión. Nótese que para la secuencia numerada 3 (correspondiente a la secuencia en la SEQ ID N º 6), la alineación da como resultado "huecos" en las posiciones correspondientes al aminoácido N º 1 y N º 175, respectivamente, en las secuencias numeradas 1, 2 y 4.

15 [0127] La Fig. 3 ilustra la estrategia de PCR empleada en el Ejemplo 2 (véase más adelante).

MATERIALES Y MÉTODOS

Construcción de pSNK101

20 [0128] Este vector transportador de E. coli/Bacillus se puede utilizar para introducir mutaciones sin expresión de la aamilasa en E. coli y luego ser modificado de tal manera que la a-amilasa sea activa en Bacillus . El vector se construyó de la siguiente manera: El gen de la a-amilasa en el vector pX (pDN1528 con las siguientes alteraciones dentro de amyL: BAN (1-33), H156Y, A181T, N190F, A209V, Q264S, el plásmido pDN1528 se describe adicionalmente en el

25 Ejemplo 1) fue inactivado mediante la interrupción en el sitio PstI en la región codificante 5' del gen de la a-amilasa mediante un fragmento de 1,2 kb que contiene un fragmento de origen de E. coli. Este fragmento se amplificó a partir de las pUC19 (GenBank n º de acceso: X02514) utilizando el cebador directo: 5'-gacctgcagtcaggcaacta-3' y el cebador inverso: 5'-tagagtcgacctgcaggcat-3'. La amplificación de PCR y el plásmido que contiene el gen pX de a-amilasa fueron digeridos con PstI a 37 °C durante 2 horas. El fragmento de vector pX y el amplicón de origen E. coli fueron ligados a

30 temperatura ambiente durante 1 hora y transformados en E. coli mediante electrotransformación. El vector resultante se denomina pSnK101.

Fermentación y purificación de variantes de a-amilasa

35 [0129] Una cepa de B. subtilis que albergue el plásmido de expresión relevante se coloca en líneas sobre una placa de agar LB con 15 Ig/ml de cloranfenicol a partir de un calco a -80 °C, y se cultivaron durante la noche a 37 °C. Las colonias se transfirieron a 100 ml de medios BPX suplementados con 15 Ig/ml de cloranfenicol en un matraz de agitación de 500 ml. Composición del medio BPX:

Almidón de patata 100 g/l

Harina de cebada 50 g/l

BAN 5000 SKB 0,1 g/l

Caseinato sódico 10 g/l

Harina de soja 20 g/l

Na2 HPO4, 12 H2O 9 g/l

Pluronic™ 0,1 g/l

40 [0130] El cultivo es agitado a 37ºC a 270 rpm durante 5 días.

[0131] Las células y restos celulares se eliminan del caldo de fermentación por centrifugado a 4500 rpm en 20-25 minutos. Después, el sobrenadante se filtra para obtener una solución completamente clara. El filtrado se concentra y se 45 lava en un filtro UF (membrana de corte de 10000) y el tampón se cambia a 20 mM de acetato de pH 5,5. El producto filtrado por UF es aplicado en una S-sepharose F.F. y se realiza la elución mediante una elución por fases con 0.2 M NaCl en el mismo tampón. El eluato es dializado contra 10 mM de Tris, pH 9.0 y aplicado en una Q-sepharose F.F. y eluido con un gradiente lineal de 0-0,3 M de NaCl sobre 6 volúmenes de columna. Las fracciones que contienen la actividad (medida por el ensayo Phadebas) son agrupadas, el pH se ajustó a pH 7.5 y el color restante fue eliminado

50 mediante un tratamiento con 0,5% W/vol. de carbón activo en 5 minutos.

Ensayo para la actividad a-amilasa

[0132] La actividad a-amilasa está determinada por un método que utiliza comprimidos de Phadebas® como sustrato. Los comprimidos de Phadebas.(Phadebas® Amylase Test, suministrada por Pharmacia Diagnostic) contienen un 5 polímero de almidón azul insoluble entrecruzado que ha sido mezclado con albúmina de suero bovino y una sustancia del tampón y colocado en comprimidos.

[0133] Para cada medición individual una pastilla es suspendida en un tubo que contiene 5 ml de tampón Britton-Robinson 50 mM (50 mM de ácido acético, 50 mM de ácido fosfórico, 50 mM de ácido bórico, 0,1 mM de CaCl2, pH

10 ajustado al valor de interés con NaOH). La prueba es realizada al baño maría a la temperatura de interés. La a-amilasa que debe evaluarse es diluida en x ml de 50 mM de tampón Britton-Robinson. 1 ml de esta solución de a-amilasa es añadido a 5 ml de tampón Britton-Robinson 50 mM. El almidón es hidrolizado por la a-amilasa dando fragmentos azules solubles. La absorbancia de la solución azul resultante, medida espectrofotométricamente a 620 nm, es una función de la actividad a-amilasa.

15 [0134] Es importante que la absorbancia medida de 620 nm después de 10 o 15 minutos de incubación (duración de la prueba) esté en el intervalo de 0,2 a 2,0 unidades de absorbancia a 620 nm. En este intervalo de absorbancia hay linealidad entre actividad y absorbencia (ley de Lambert-Beer). La dilución de la enzima debe en consecuencia ser ajustada para cumplir este criterio. Bajo un grupo especifico de condiciones (temp., pH, tiempo de reacción, condiciones

20 del tampón) 1 mg de una a-amilasa dada hidrolizará una cantidad determinada de sustrato y se producirá un color azul. La intensidad del color es medida a 620 nm. La absorbencia medida es directamente proporcional a la actividad específica (actividad/mg de proteína pura de a-amilasa) de la a-amilasa en cuestión bajo el grupo dado de condiciones.

Método general para la mutagénesis aleatoria mediante el uso del programa DOPE

25 [0135] La mutagénesis aleatoria puede llevarse a cabo mediante los siguientes pasos:

1.

Seleccionar las regiones de interés para la modificación de la enzima madre.

2.

Decidir sobre sitios de mutación y sitios no mutados en la región seleccionada.

3. Decidir qué tipo de mutaciones deberían llevarse a cabo, por ejemplo, con respecto a la estabilidad deseada y/o el 30 rendimiento de la variante que se construirá.

4.

Seleccionar mutaciones estructuralmente razonables.

5.

Ajustar los residuos seleccionados por el paso 3 con respecto al paso 4.

6.

Analizar mediante el uso de un algoritmo de dopado adecuado la distribución de nucleótidos.

7.

Si es necesario, ajustar los residuos deseados al realismo del código genético (por ejemplo, teniendo en cuenta las

35 limitaciones que resultan del código genético (por ejemplo, con el fin de evitar la introducción de codones de parada)) (la persona experta será consciente de que algunas combinaciones de codón no se pueden utilizar en la práctica y tendrá que ser adaptado).

8. Producir cebadores.

9. Realizar mutagénesis aleatoria mediante el uso de los cebadores. 40 10. Seleccionar las variantes de a-amilasa resultantes mediante la selección de las propiedades mejoradas deseadas.

[0136] Algoritmos de dopado adecuados para su uso en el paso 6 son bien conocidos en la técnica. Un algoritmo es descrito por Tomandl, D. et al., Journal of Computer-Aided Molecular Design, 11 (1997), pp. 29-38). Otro algoritmo, DOPE, es descrito a continuación:

45 Programa de dopado

[0137] El programa "DOPE" es un algoritmo informático útil para optimizar la composición de nucleótidos de un codón triplete de tal manera que codifica una distribución de aminoácidos que se asemeja más a la distribución de

50 aminoácidos deseada. Con el fin de evaluar cuál de las distribuciones posibles es la más similar a la distribución de aminoácidos deseada, se necesita una función de puntuación. En el programa "Dope" se encontró la siguiente función que se adapta:

donde xi son las cantidades obtenidas de ácidos y grupos de aminoácidos, calculada por el programa de aminoácidos, yi

55 son las cantidades deseadas de ácidos y grupos de aminoácidos amino definidos por el usuario del programa (por ejemplo, especificar cuáles de los 20 aminoácidos o codones de parada se quieren introducir, por ejemplo, con un cierto porcentaje (por ejemplo 90% Ala, 3% Ile, 7% de Val), wi se asignan factores de peso tal como se define por el usuario del programa (por ejemplo, en función de la importancia de tener un residuo de aminoácido específico insertado en la posición en cuestión). N es 21 más el número de grupos de aminoácidos tal como se define por el usuario del programa.

60 Para los propósitos de esta función 0 ° se define como 1.

[0138] Un algoritmo de Monte-Carlo (un ejemplo es el descrito por Valleau, J.P. & Whittington, S.G. (1977) A guide to Mont Carlo for statistical mechanics: 1 Highways. In "Stastistical Mechanics, Part A" Equlibrium Techniqeues ed. B.J. Berne, New York: Plenum) se utiliza para encontrar el valor máximo de esta función. En cada iteración se realizan los siguientes pasos:

5 1.Una nueva composición de nucleótidos aleatoria se elige para cada base, donde la diferencia absoluta entre la corriente y la nueva composición es menor que o igual a d para cada uno de los cuatro nucleótidos G, A, T, C en las tres posiciones del codón (véase la definición de d).

2.Las puntuaciones de la nueva composición y la composición actual se comparan mediante el uso de la función s como se describe anteriormente. Si la nueva puntuación es superior o igual a la puntuación de la composición actual, la nueva composición se mantiene y la composición actual se cambia a la nueva. Si la nueva puntuación es más pequeña, la probabilidad de mantener la nueva composición es exp(1000(new_score-current_score)).

[0139] Un ciclo consiste normalmente en -1000 iteraciones como se describió anteriormente en donde d va decreciendo

15 linealmente de 1 a 0. Cien o más ciclos se llevan a cabo en un proceso de optimización. La composición de nucleótidos que resulta en la puntuación más alta se presenta finalmente.

EJEMPLO 1

Construcción de variantes de Termamyl™

[0140] Termamyl (a-amilasa de B. licheniformis de la SEC ID N.º: 2) se expresa en B. subtilis a partir de un plásmido indicado pDN1528. Este plásmido contiene el gen completo que codifica Termamyl, amyL, cuya expresión está dirigida por su propio promotor. Además, el plásmido contiene el origen de replicación, ori, del plásmido pUB110 y el gen cat del

25 plásmido pC194 que confiere resistencia hacia el cloranfenicol. pDN1528 se muestra en la Fig. 9 del documento WO 96/23874.

[0141] Se preparó un vector de la mutagénesis específica que contiene una mayor parte de la región codificante de la SEC ID N.º 1. Las características importantes de este vector, denominado pJeEN1, incluyen un origen de replicación derivado de los plásmidos pUC, el gen cat que confiere resistencia hacia el cloranfenicol, y una versión con desplazamiento de marco del gen bla, cuyo tipo salvaje normalmente confiere resistencia hacia la ampicilina (fenotipo amp R). Esta versión mutada resulta en un fenotipo amps. El plásmido pJeEN1 se muestra en la Fig. 10 del documento WO 96/23874, y el E. coli origen de replicación, ori, bla, cat, la versión 5'-truncada del gen de amilasa Termamyl, y sitios de restricción seleccionados están indicados en el plásmido.

35 [0142] Las mutaciones se introducen en amyL por el método descrito por Deng y Nickoloff (1992, Anal. Biochem. 200, pp. 81-88) salvo que los plásmidos con el "cebador de selección" (cebador # 6616, véase más adelante) incorporados sean seleccionados en base al fenotipo ampR de células de E. coli transformadas que contienen un plásmido con un gen bla reparado, en lugar de emplear la selección por digestión con enzimas de restricción como se explica en Deng y Nickoloff. Productos químicos y enzimas usados para la mutagénesis fueron obtenidos a partir del kit de mutagénesis ChameleonÔ de Stratagene (número de catálogo 200509).

[0143] Después de la verificación de la secuencia de ADN en los plásmidos variantes, el gen truncado, que contiene la alteración deseada, es subclonado en pDN1528 como un fragmento PstI-EcoRI y transformado en la cepa de Bacillus

45 subtilis con depleción de proteasa y amilasa SHA273 (descrita en WO92/11357 y WO95/10603 para expresar la enzima variante.

[0144] La variante de Termamyl V54W fue construida por el uso del siguiente cebador de mutagénesis (escrito 5'a 3', de izquierda a derecha): PG GTC GTA GGC ACC GTA GCC CCA ATC CGC TTG

[0145] La variante de Termamyl A52W+V54W fue construida por el uso del siguiente cebador de mutagénesis (escrito 5'a 3', de izquierda a derecha): PG GTC GTA GGC ACC GTA GCC CCA ATC CCA TTG GCT CG Cebador # 6616 (escrito 5'a 3', de izquierda a derecha, P denota un fosfato 5'): P CTG TGA CTG GTG AGT ACT CAA CCA AGT C

55 [0146] La variante de Termamyl V54E fue construida por el uso del siguiente cebador de mutagénesis (escrito 5'-3', de izquierda a derecha): PGG TCG TAG GCA CCG TAG CCC TCA TCC GCT TG

[0147] La variante de Termamyl V54M fue construida por el uso del siguiente cebador de mutagénesis (escrito 5'-3', de izquierda a derecha): PGG TCG TAG GCA CCG TAG CCC ATA TCC GCT TG

[0148] La variante de Termamyl V54I fue construida por el uso del siguiente cebador de mutagénesis (escrito 5'-3', de izquierda a derecha): PGG TCG TAG GCA CCG TAG CCA ATA TCC GCT TG

65 [0149] Las variantes de Termamyl Y290E y Y290K fueron construidas mediante el uso del siguiente cebador de la mutagénesis (escrito 5'-3', de izquierda a derecha): PGC AGC ATG GAA CTG CTY ATG AAG AGG CAC GTC AAA C Y representa una mezcla igual de C y T. La presencia de un codón que codifica bien glutamato o lisina en la posición 290 fue verificada por secuenciación del ADN.

[0150] La variante de Termamyl N190F fue construida por el uso del siguiente cebador de la mutagénesis (escrito 5'-3', 5 de izquierda a derecha): PCA TAG TTG CCG AAT TCA TTG GAA ACT TCC C

[0151] La variante de Termamyl N188P+N190F fue construida por el uso del siguiente cebador de la mutagénesis (escrito 5'-3', de izquierda a derecha): PPCA TAG TTG CCG AAT TCA GGG GAA ACT TCC CAA TC

10 [0152] La variante de Termamyl H140K+H142D fue construida por el uso del siguiente cebador de la mutagénesis (escrito 5'-3', de izquierda a derecha): PCC GCG CCC CGG GAA ATC AAA TTT TGT CCA GGC TTT AAT TAG

[0153] La variante de Termamyl H156Y fue construida por el uso del siguiente cebador de la mutagénesis (escrito 5'-3', de izquierda a derecha): PCA AAA TGG TAC CAA TAC CAC TTA AAA TCG CTG

15 [0154] La variante de Termamyl A181T fue construida por el uso del siguiente cebador de la mutagénesis (escrito 5'-3', de izquierda a derecha): PCT TCC CAA TCC CAA GTC TTC CCT TGA AAC

[0155] La variante de Termamyl A209V fue construida por el uso del siguiente cebador de la mutagénesis (escrito 5'-3', 20 de izquierda a derecha): PCTT AAT TTC TGC TAC GAC GTC AGG ATG GTC ATA ATC

[0156] La variante de Termamyl Q264S fue construida por el uso del siguiente cebador de la mutagénesis (escrito 5'-3', de izquierda a derecha): PCG CCC AAG TCA TTC GAC CAG TAC TCA GCT ACC GTA AAC

25 [0157] La variante de Termamyl S187D fue construida por el uso del siguiente cebador de la mutagénesis (escrito 5'-3', de izquierda a derecha): PGC CGT TTT CAT TGT CGA CTT CCC AAT CCC

[0158] La variante de Termamyl DELTA (K370-G371-D372) (es decir, eliminada de residuos de aminoácidos nos. 370, 371 y 372) fue construida por el uso del siguiente cebador de la mutagénesis (escrito 5'-3', de izquierda a derecha): 30 PGG AAT TTC GCG CTG ACT AGT CCC GTA CAT ATC CCC

[0159] La variante de Termamyl DELTA(D372-S373-Q374) fue construida por el uso del siguiente cebador de mutagénesis (escrito 5'-3', de izquierda a derecha):PGG CAG GAA TTT CGC GAC CTT TCG TCC CGT ACA TAT C

35 [0160] Las variantes de Termamyl A181T y A209V fueron combinadas a A181T+A209V mediante la digestión del A181T que contiene plásmido tipo pDN1528 (es decir, pDN1528 conteniendo dentro de amyL la mutación que da como resultado la alteración de A181T) y el plásmido tipo pDN1528 que contiene A209V (es decir, pDN1528 que contiene dentro amyL la mutación que da como resultado la alteración A209V) con la enzima de restricción Cla I que corta los plásmidos tipo pDN1528 dos veces dando como resultado un fragmento de 1116 pb y la parte-vector (es decir, contiene

40 el origen de replicación del plásmido) de 3850 pb. El fragmento que contiene la mutación A209V y la parte del vector que contiene la mutación A181T se purificaron mediante el kit de extracción de gel QIAquick (adquirido de Qiagen) después de la separación en un gel de agarosa. El fragmento y el vector fueron ligados y transformados en la cepa deBacillus subtilis con depleción de proteasa y amilasa mencionada anteriormente. El plásmido de amy+ (limpieza de zonas en almidón que contiene placas de agar) y los transformantes resistentes a cloranfenicol fueron analizados para

45 la presencia de ambas mutaciones en el plásmido.

[0161] En forma similar a como se ha descrito anteriormente, H156Y y A209V fueron combinados utilizando las endonucleasas de restricción Acc65I y EcoRI, dando H156Y+A209V.

50 [0162] H156Y +A209V y A181T+A209V fueron combinadas en H156Y+ A181T+A209V mediante el uso de endonucleasas de restricción Acc65I y HindIII.

[0163] Los 35 residuos N-terminales de la parte madura de la variante de Termamyl H156Y+A181T+A209V fueron sustituidos por los 33 residuos N-terminales de la a-amilasa de B. amyloliquefaciens (SEC ID N.º 4) (que en el presente 55 contexto se denomina BAN) por un enfoque de SOE-PCR (Higuchi et al. 1988, Nucleic Acids Research 16:7351) de la siguiente manera:

Cebador 19364 (secuencia 5'-3'): CCT CAT TCT GCA GCA GCA GCC GTA AAT GGC ACG CTG

60 Cebador 19362: CCA GAC GGC AGT AAT ACC GAT ATC CGA TAA ATG TTC CG

Cebador 19363: CGG ATA TCG GTA TTA CTG CCG TCT GGA TTC

Cebador 1C: CTC GTC CCA ATC GGT TCC GTC 65

[0164] Una PCR estándar, reacción en cadena de la polimerasa, se llevó a cabo utilizando la polimerasa termoestable Pwo de Boehringer Mannheim según las instrucciones del fabricante y los ciclos de temperatura: 5 minutos a 94 °C, 25 ciclos de (94 °C durante 30 segundos, 50 °C durante 45 segundos, 72 °C durante 1 minuto), 72 °C durante 10 minutos.

5 [0165] Un fragmento de aproximadamente 130 pb fue amplificado en una primera PCR denotada PCR1 con los cebadores 19364 y 19362 en un fragmento de ADN que contiene el gen que codifica la a-amilasa de B. amyloliquefaciens.

[0166] Un fragmento de aproximadamente 400 pb fue amplificado en otra PCR denotada PCR2 con los cebadores 10 19363 y 1C en el molde pDN1528.

[0167] PCR1 y PCR2 fueron purificadas a partir de un gel de agarosa y usadas como moldes en PCR3 con los cebadores 19364 y 1C, que dieron lugar a un fragmento de aproximadamente 520 pb. Este fragmento contiene así una parte del ADN que codifica el extremo N-terminal de BAN fusionado a una parte del ADN que codifica el Termamyl a

15 partir del aminoácido 35.º.

[0168] El fragmento de 520 pb se subclonó en un plásmido tipo pDN1528 (que contiene el gen que codifica la variante de Termamyl H156Y+A181T+A209V) mediante la digestión con endonucleasas de restricción Pst I y SacII, la ligadura y la transformación de la cepa de B. subtilis como se ha descrito anteriormente. La secuencia de ADN entre los sitios de

20 restricción Pst I y Sac II se verificó mediante secuenciación de ADN de los plásmidos extraídos de amy+y transformantes resistentes al cloramfenicol.

[0169] La construcción final que contiene el extremo N-terminal correcto de BAN yH156Y+ A181T+A209V fue marcada como BAN(1-35)+ H156Y+ A181T+A209V.

25 [0170] N190F fue combinado con BAN(1-35)+ H156Y+ A181T+A209V dando BAN(1-35)+ H156Y+ A181T+N190F+A209V mediante la realización de mutagénesis como se describió anteriormente exepto que la secuencia de amyL en pJeEN1 fue sustituida por la secuencia de ADN que codifica la variante de Termamyl BAN(135)+ H156Y+ A181T+A209V

30 [0171] Q264S fue combinado con BAN (1-35)+H156Y+A181T+A209V dando BAN (135)+H156Y+A181T+A209V+Q264S mediante la realización de mutagénesis como se describió anteriormente exepto que la secuencia de amyL en pJeEN fue sustituida por la secuencia de ADN que codifica la variante de Termamyl BAN (1-35)+H156Y+A181T+A209V.

35 [0172] BAN(1-35)+ H156Y+ A181T+A209V+Q264S y BAN(1-35)+ H156Y+ A181T+N190F+A209V fueron combinados en BAN(1-35)+ H156Y+ A181T+N190F+A209V+Q264S utilizando endonucleasas de restricciónBsaHI (BsaHI sitio fue introducido cerca de la mutación A209V) y PstI.

40 EJEMPLO 2

Construcción, localizada por mutagénesis aleatoria dopada, de variantes de a-amilasa tipo Termamyl que tienen una mejor estabilidad a pH bajo y una dependencia reducida de iones de calcio para la estabilidad en comparación con la enzima madre

45 [0173] Las a-amilasas son de gran importancia para el proceso de licuefacción del almidón industrial. La variante de la a-amilasa deBlicheniformis termpoestable consistiendo en los aminoácido 1-33 de la amilasa de B. amyloliquefaciens (SEC ID N.º 4) fusionados a los aminoácidos 36-483 de la amilasa de B. licheniformis (SEC ID N.º 2) y que comprende además las siguientes mutaciones:

50 Y156, T181, F190, V209 y S264 (la construcción de esta variante se describe en el Ejemplo 1)

tiene una estabilidad muy satisfactoria a bajo pH y concentraciones bajas de calcio. En un intento de mejorar aún más la estabilidad a bajo pH y baja concentración de calcio de dicha variante de a-amilasa, se llevó a cabio una mutagénesis

55 aleatoria en regiones preseleccionadas.

[0174] Las regiones fueron:

Región Residuo

I: Phe153-Thr163

II: Gln178-Asn192

III: His205-Arg214

IV: Ala232-Asp237 [0175] Los números bajo % total dan el número total de aminoácidos de tipo salvaje (wt.) deseados en una región determinada después de dopaje. El número se obtiene por la multiplicación del número de posiciones mutadas (por ejemplo, 8 con respecto a la región I) por sus respectivos wt. en peso. Con respecto a la región I, el % total deseado es

y

VIII:

Gly131-Lys136

IX:

Asp164-Tyr175

X:

Tyr 262-Thr278

Región cambiada

% total % medio Número de residuos

I:

35 88 8 de 11

II:

20 86 11 de 15

III:

27 88 10 de 10

IV:

34 91 11 de 12

VIII:

39 86 6 de 6

IX:

46 93 12 de 12

X:

27 90 12 de 13

VIII+IX:

18

VIII+IX+II:

4

II+III+IV:

2

IV+I:

12

5 80*80*90*90*90*90*95*90/100 = 35%.

[0176] El % medio es el nivel de dopaje medio para el número total de posiciones de la región en cuestión (por ejemplo, 11 posiciones con respecto a la región I). Para la región I el % medio se calcula de la siguiente forma: 80+80+90+90+90+90+95+90= 705 dividido por 11=88%

10 [0177] El software de DOPE (ver Materiales y Métodos) se utilizó para determinar los codones enriquecidos para cada cambio sugerido en las siete regiones minimizando la cantidad de codones de parada. La distribución exacta de nucleótidos se calculó en las tres posiciones del codón para dar la población sugerida de cambios de aminoácidos. Las regiones dopadas fueron dopados específicamente en las posiciones indicadas para tener una alta probabilidad de tener

15 los residuos deseados, pero todavía permitir otras posibilidades.

[0178] Por ejemplo, el original H156 en la secuencia wt. fue mutada en una Y, es decir, un nuevo codón, y luego dopado 10% para los demás residuos. Esa es la secuencia de ADN que tiene el código para una Y en lugar de una H. En la posición 156 la Tyr ha sido programado para ser 90% deseada y otros residuos se han permitido libremente. Para

20 algunas posiciones no era posible crear la población sugerida de residuos de aminoácidos debido a que el código genético restringía los residuos deseados estructural y funcionalmente. Los resultantes siete oligonucleótidos dopados se muestran en las tablas 1-7: con las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos wt. y la distribución de nucleótidos para cada posición dopada. Todos los cebadores de la genoteca se sintetizaron en forma de cadenas con sentido.

25 Tabla 1: Genoteca DASI (Phe153-Thr163)

Distribución de nucleótidos para cada posición dopada.

1:

80% T,20% A.

2:

96% A, 2% G, 2% C.

3:

98% A, 2% T.

4:

93% T, 4% G, 3% A.

5:

97% A, 3% G.

6:

98% T, 2% A.

7:

97% A, 3% C.

8:

90% C, 10% T.

9:

95% C, 5% A.

Tabla 2: Genoteca DASII (Gln178-Asn192)

Distribución de nucleótidos para cada posición dopada.

1: 93% C, 7%A.

2: 84% G, 16% T.

3: 95% G, 5%A.

4: 95% G, 5% C.

5: 94%A, 6% G.

6: 95% C, 5%A.

7: 62% T, 38% G.

8: 87% T, 13% A.

9: 91% G, 9% C.

10: 92% G, 8% T.

11: 90% G, 5%A, 5% C.

12: 88% A, 12% C.

13: 88% A, 12% C.

14: 93%T, 5%A, 2% C.

15: 97% T, 3% G.

16: 86% G, 14% A.

17: 89% G, 11% C.

18: 60% G, 40% T.

Tabla 3: Genoteca DASIII (His205-Arg214) Distribución de nucleótidos para cada posición dopada.

1: 89% C, 11% T.

2: 89% A, 11% G.

3: 95% C, 2.5 %T, 2.5% A.

4: 96% G, 1%A, 3%T.

5: 96%A, 4% C.

6: 98%T,2%A.

7: 95% G, 2.5% A, 2.5% C.

8: 93% G, 7%A.

9: 96%T,4%A.

10: 84% A, 16% G.

11: 81% G, 7%A, 7%T, 5% C.

12: 98% C, 2% A.

13: 96% G, 4% C.

14: 94% G, 6% T.

15: 82% A, 18% T.

16: 50% A, 50% T.

17: 90% A, 10% G.

18: 70% A, 30% C.

19: 86% G, 14% A

Tabla 4: Genoteca DASIV (Ala232-Asp243)

Distribución de nucleótidos para cada posición dopada.

1: 93% G, 3.5% A, 3.5% T.

2: 94% C, 4%T.

3: 94%T, 6% C.

4: 93% C, 2%T,2%A, 3% G.

5: 98%A,2%T.

6: 98%T,2%A.

7: 95%A, 5% C.

8: 94%A, 6% G.

9: 90% T, 10% A.

10: 89% T, 11% A.

11: 89% C, 11% A.

12: 95% T, 5% A.

13: 64% C, 33% T, 3% A.

14: 93% A, 7% T.

15: 90% A, 10% C.

16: 90% G, 5%A, 5% C

17: 90% T, 10% A

Tabla 5: Genoteca DASVIII (Gly131-Lys136)

Distribución de nucleótidos para cada posición dopada.

1:

91% G, 9% A.

2:

87% G, 13% C.

3:

90% T, 10% G.

4:

90% G, 10% T.

5:

85% C, 8% T, 7% A.

6:

89% A, 9% T, 2% C.

7:

88% T, 12% A

8:

88% T, 11% C, 1% G

9:

92% A, 8% T

10:

93% A, 7% G

5

Tabla 6: Genoteca DASIX (Asp164-Tyr175)

Distribución de nucleótidos para cada posición dopada.

1: 94% G, 6%A.

2: 96%T, 4% G.

3: 92%T, 4%A, 4% G.

4: 95%A, 5% G.

5: 93% C, 7%A.

6: 92%T,8%A.

7: 90% A, 5% G,5% C.

8: 90% G, 10% A.

9: 92%A, 6% G, 2%T.

10: 92% T, 8% A.

11: 50% T, 50% C.

12: 96% A, 4% T. Tabla 7: Genoteca DASX (Tyr262-Asn278)

Distribución de nucleótidos para cada posición dopada.

1: 95%A,5%T.

2: 97%A, 3% G.

3: 95% G, 2.5% A, 2.5% C.

4: 94% T, 6.2% G.

5: 97%A,3%T.

6: 94%A, 3% G, 3% C.

7: 95% G, 5%A.

8: 95%T,5%A.

9: 52%T, 45% C, 3%A.

10: 96% T, 4% C.

11: 60% A, 40% G.

12: 90% G, 10% A.

13: 94% G, 6% C.

14: 81% G, 8%A, 8%T, 3% C.

15: 98% C, 2% T.

16: 90% C, 10% A.

17: 50% G, 50% T.

18: 90% A, 10% T.

19: 90%A, 5% G, 5% C.

20: 95% A, 5% T.

21: 91% T,9% A.

22: 92% A, 8% G.

23: 94%A, 3% G, 3% C.

24: 93% G, 7% A.

25: 90% A, 10% G.

5 Mutagénesis aleatoria

[0179] Los oligonucleótidos enriquecidos aparentes de las Tablas 1-7 (que, por definición común, se designa FDAS en la Fig. 3) y cebadores reversos RDAS para cada región y cebadores de B. licheniformis específicos que cubren los sitios SacII y SalI se utilizan para generar fragmentos de genoteca de PCR mediante el método de extensión de 10 solapamiento (Horton et al., Gene, 77 (1989), pp . 61-68) un solapamiento de 21 bp. La Figura 3 muestra la estrategia PCR. Los fragmentos de PCR se clonaron en el vector transportador de E. coli/Bacillus pSNK101 (véase Materiales y Métodos) que permite la mutagénesis en E. coli y la expresión inmediata en Bacillus subtilis previniendo la acumulación letal de amilasas en E. coli. Después de establecer los fragmentos de PCR clonados en E. coli, un fragmento de pUC19 modificado se digirió fuera del plásmido y el promotor y el gen Termamyl mutado se conecta físicamente y la expresión

15 puede tener lugar en Bacillus.

Selección

[0180] Las siete genotecas pueden ser examinadas en el bajo pH y los ensayos de filtros de calcio bajo se describen a continuación. 5

Ensayo de filtro de bajo pH

[0181] Genotecas de Bacillus se colocan en un sándwich de acetato de celulosa (OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania) - y filtros de nitrocelulosa (Protran-Ba 85, Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania) en placas de agar TY con 10 10 mg/ml de cloranfenicol a 37 °C durante al menos 21 horas. La capa de acetato de celulosa se encuentra en la placa de agar TY.

[0182] Cada sándwich de filtro se marca específicamente con una aguja después de la colocarse en placa, pero antes de la incubación con el fin de poder localizar variantes positivas en el filtro y el filtro de nitrocelulosa con variantes 15 enlazadas se transfiere a un recipiente con tampón de citrato, pH 4,5 y se incubó a 80 °C durante 15 min. Los filtros de acetato de celulosa con colonias se almacenan en las placas TY a temperatura ambiente hasta su uso. Después de la incubación, se detecta actividad residual en placas que contenían 1% de agarosa, almidón de 0,2% en tampón citrato, pH 6,0. Las placas de ensayo con filtros de nitrocelulosa se marcan de la misma manera que el sándwich de filtro y se incuban durante 2 horas. a 50°C. Después de la eliminación de los filtros, las placas de ensayo se tiñeron con una

20 solución de Lugol 10%. Variantes degradantes del almidón son detectadas como puntos blancos sobre un fondo azul oscuro y luego se identifican en las placas de almacenamiento. Variantes positivas se volvieron a seleccionar dos veces bajo las mismas condiciones que la primera selección.

Ensayo de filtro de bajo nivel de calcio

25 [0183] El ensayo se realiza de la misma manera que el ensayo de filtro de bajo pH con las siguientes modificaciones: El filtro con las proteínas unidas se incuba a 95 °C, pH 6,0 durante 1 h. con diferentes concentraciones de EDTA (0,001 mM - 100 mM).

30 [0184] Las siguientes variantes se obtuvieron por el método anterior (BAN designa la la a-amilasa de B. amyloliquefaciens).

* BAN/híbrido Termamyl*+ H156Y+A181T+N190F+ A209V+Q264S+E211Q

35 •BAN/híbrido Termamyl*+H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S+H205C+D207Y+A210S

[0185] Las mutaciones indicadas en negrita fueron introducidas por el método de mutagénesis aleatoria. Los datos de estabilidad para estas variantes aparecen en la Tabla 11 en el Ejemplo 3.

40 [0186] De una manera análoga a la descrita anteriormente, la mutagénesis aleatoria de las siete regiones identificadas anteriormente se llevan a cabo en la a-amilasa progenitora de B. licheniformis de la SEC ID N.º 2. El esquema de dopaje se determina de manera análoga a la utilizada anteriormente.

EJEMPLO 3 45

Medición del calcio y la estabilidad dependiente del pH

[0187] Normalmente, el proceso de licuefacción industrial se ejecuta utilizando pH 6,0-6,2 como pH de licuefacción y una adición de 40 ppm de calcio libre con el fin de mejorar la estabilidad a 95 °C-105 °C. Algunas de las sustituciones 50 propuestas en este documento se han realizado con el fin de mejorar la estabilidad en

1.

pH inferior a pH 6,2 y/o

2.

en los niveles de calcio libre inferior a 40 ppm de calcio libre.

[0188] Tres métodos diferentes han sido usados para medir las mejoras en estabilidad obtenidas por las diferentes 55 sustituciones en Termamyl:

1. Un ensayo que mide la estabilidad a pH reducido ligeramente, pH 5,5, en presencia de 40 ppm de calcio libre. (de este modo, se mide la mejora de la estabilidad a pH bajo). 10 μg de la variante fueron incubados bajo las condiciones siguientes: Una solución de 0,1 M acetato, pH 0,1 ajustado a pH 5,5, que contiene 40 ppm de calcio y 5% p/p de

60 almidón de maíz común (libre de calcio). La incubación se hizo en al baño maría a 95 °C durante 30 minutos.

2. Otro ensayo que mide la estabilidad en la ausencia de calcio libre y donde el pH se mantiene a pH 6,2. Este ensayo mide la disminución de la sensibilidad al calcio: 10 Ig de la variante fueron incubados bajo las condiciones siguientes: Una solución de acetato 0.1 M, pH ajustado a pH 6,2, que contiene 5% p/p de almidón de maíz común (libre de calcio). La incubación se hizo en al baño maría a 95 °C durante 30 minutos.

5 3. Un tercer ensayo donde las condiciones de los ensayos n.º 1 y 2 hayan sido combinados. Este ensayo mide la estabilidad en la ausencia de calcio libre y a pH bajo (pH 5.5).

4. Un cuarto ensayo similar al n.º 3. donde el pH se ha reducido aún más a pH 5,0

10 Determinación de la estabilidad

[0189] Todos los ensayos de estabilidad de 1,2, 3 y 4 se han realizado utilizando la misma configuración. El método fue:

[0190] La enzima fue incubada bajo las condiciones pertinentes (1-4). Se tomaron muestras a 0, 5, 10, 15 y 30 minutos

15 y se diluyeron 25 veces (misma dilución para todas las muestras tomadas) en tampón de ensayo (0,1 M tampón 50 mM Britton pH 7,3) y la actividad se midió usando el ensayo de Phadebas (Pharmacia) bajo condiciones estándar de pH 7.3, 37 °C.

[0191] La actividad medida antes de la incubación (0 minutos) fue usada como referencia (100%). La disminución en 20 porcentaje se calculó como una función del tiempo de incubación. La tabla muestra la actividad residual después de 30 minutos de incubación.

Determinación de la actividad específica.

25 [0192] La actividad específica se determinó usando el ensayo de Phadebas (Pharmacia) como actividad/mg de enzima. La actividad se determinó usando el ensayo de a-amilasa que se describe en la sección Materiales y Métodos del presente documento.

Resultados: 30 [0193]

Tabla 8: Método de Estabilidad n.º1./Mejora de la estabilidad a pH bajo

Variante

actividad residual después de 30min. de incubación Actividad específica, 37°C, pH 7.3. Porcentaje con respecto al Termamyl

Termamyl wt.

5% 100%

H156Y

15% 100%

A209V

18% 100%

Q264S

30% 130%

H156Y+A181T+ A209V

39% 100%

H133Y+H156Y+ A181T+A209V+ H293Y+A294V+ G310D+H450Y

58% 85%

BAN/Termamyl

48% 115%

híbrido*+H156Y+A181T+ A209V

Tabla 9: Método de Estabilidad n.º2./Disminución de la sensibilidad de calcio

Variante

actividad residual después de 30min. de incubación Actividad específica, 37°C, pH 7.3. Porcentaje con respecto al Termamyl

Termamyl wt.

52% ---

H156Y

70% ---

A209V

75% ---

A181T

57% 115%

N190F

34% 140%

N190F+N188P

57% 190%

Tabla 10: Método de Estabilidad n.º3./Mejora de la estabilidad a pH bajo+disminución de la sensibilidad de calcio

Variante

Actividad residual después de 30min. de incubación Actividad específica, 37°C, pH 7.3 Unidades/mg enzima

Termamyl wt.

3% ---

BAN/híbrido Termamyl*+H156Y+A181T+ A209V

20% ---

Q264S

5% ---

H140K+H142D

5% 115%

V128E

50%** 115%

BAN/híbridoTermamyl*+ H156Y+A181T+ N190F+ A209V

39% 170%

BAN/híbrido Termamyl*+ H156Y+A181T+ A209V+Q264S

29% 175%

BAN/híbrido Termamyl*+ H156Y+A181T+N19 0F+A209V+Q264S

57% 210%

* BAN (a-amilasa de B. amyloliquefaciens (SEC ID N.º 4)/Termamyl (a-amilasa de B. licheniformis (SEC ID N.º 2) híbrido PCR. Los primeros 33 aminoácidos N-terminales son BAN y el resto 36-483 son Termamyl (la construcción de la variante se describe en el Ejemplo 1). ** Medido después de 5min. de incubación En comparación con Termamyl wt., que bajo las mismas condiciones muestra la actividad residual de 36%.

Tabla 11: Método de Estabilidad n.º4./Mejora de la estabilidad a pH bajo (pH 5,0)+disminución de la sensibilidad de calcio

Variante

Actividad residual después de 30min. de incubación Actividad específica, 37°C, pH 7.3 Unidades/mg enzima

BAN/híbrido Termamyl*+ H156Y+A181T+N19 0F+ A209V+Q264S

9% 210%

BAN/híbrido Termamyl*+ H156Y+A181T+N19 0F+ A209V+Q264S+E211Q

28% 160%

BAN/híbrido Termamyl*+ H156Y+A181T+N190F+ A209V+Q264S+H205C+D207Y+A21 0S

33% 130%

* como se indica en relación a la Tabla 10

[0194] Las variantes en la anterior Tabla 11 se construyeron por medio de la mutagénesis aleatoria localizada descrita en el Ejemplo 2.

10 EJEMPLO 5 Estabilidad de la a-amilasa a pH bajo y alta temperatura

15 [0195] Este ejemplo resume los resultados de la estabilidad de las variantes caracterizadas por un ensayo fluorimétrico a 70°C bajo dos condiciones diferentes, (1) pH 4.5 y 1 mM CaCl2 y (2) pH 6.2 y 10 IM CaCl2.

Descripción del método

[0196] Todos los experimentos de fluorescencia se realizaron en un espectrómetro de luminiscencia Perkin-Elmer LS50 usando un soporte de 4 cubetas. La temperatura se controló mediante un baño de agua circulante y se midió directamente en la cubeta usando un termómetro digital Noronix (modelo NTD 100). Durante las mediciones, la mezcla

5 completa de los reactivos en la cubeta se aseguró usando agitadores magnéticos que operan a una alta velocidad de agitación. Las cubetas fueron tapadas con tapas de teflón para minimizar la evaporación.

[0197] La fluorescencia intrínseca de las proteínas (debido a las cadenas laterales Trp) se monitorizó mediante excitación a 280 nm y emisión a 350 nm. El ancho de las hendiduras fue 5 nm.

10 [0198] Durante las mediciones cinéticas, 4 reacciones se controlaron en paralelo. Los datos fueron recogidos en el diálogo de Wavelength Programme, permitiendo la recogida de datos automática durante un período prolongado (por ejemplo, más de una hora).

15 [0199] El despliegue se efectuó a 70°C. Las condiciones de despliegue fueron.

(1)

50 mM NaOAc pH 4.5 y 1 mM CaCl2

(2)

50 mM NaOAc pH 6.2 y 10 IM CaCl2 .

20 La concentración de proteína fue 5 Ig/ml y el glicerol fue de 0,5% en p/v (a partir de la solución madre de proteína).

[0200] Nota: Hubo alguna variación de un día a otro en el valor absoluto de las medias veces de despliegue debido a leves variaciones de temperatura (ocasionadas por, por por ejemplo, diferentes cantidades de agua en el baño maría).

25 Sin embargo, Termamyl se incluyó siempre como una de las cuatro enzimas analizadas en cada experimento, por lo que es en efecto un estándar interno. Tasas de despliegue en relación con este estándar interno fueron satisfactoriamente reproducibles (realizados por triplicado). El análisis de datos se realizó utilizando el software GraphPad Prism. A pH 4,5, los datos que se desarrollan se podrían encajar muy satisfactoriamente con un decaimiento exponencial simple con desvío:

30 donde F es la fluorescencia medida, A es la amplitud del despliegue, t es el tiempo y ty es la media de tiempo de desarrollo.

[0201] A pH 6,2, el despliegue era más complejo (implicando una primera fase lag), y los datos no pudieron ser

35 encajados en eq. 1. En su lugar, el tiempo necesario para que la señal de fluorescencia se deteriorara al 50% de la señal inicial se utilizó como una aparente ty.

[0202] A partir de estos tiempos medios, el cambio en la energía libre de despliegue con relación al de Termamyl podría ser calculado de la siguiente manera:

40 donde R es la constante universal de los gases y T es la temperatura (el valor de R*T es 0,5919, dando un valor DDG en kcal/mol)

[0203] Mediante la conversión de los datos a valores DDG, los efectos desestabilizadores/estabilizadores de diferentes 45 mutaciones se pueden comparar directamente y se examinaron para aditividad (DDG = DDG+DD1+212G) y sinergia (DDG1+2 > DDG1+DDG2) donde DDG1+2 es la energía-efecto de la introducción de las mutaciones 1 y 2.

Resultados

50 [0204] El despliegue de las amilasas a bajo pH y alta temperatura puede ser seguido por la caída de la fluorescencia Trp. A pH 4,5 y 1 mM CaCl2, todas las amilasas se despliegan con bastante rapidez.

[0205] Los datos que se desarrollan a pH 4,5 se ajustan mejor a una ecuación exponencial doble que a una ecuación exponencial simple. Sin embargo, ya que la segunda fase es muy lenta, se aproxima por una desviación lineal (ecuación

55 1). El despliegue a pH 6,2 y 10 IM de CaCl2 a 70 °C es mucho menos rápido que a pH 4.5 a pesar de la baja [Ca2+]. El despliegue está lejos de completarse en una hora y no es posible ajustar los datos a una ecuación exponencial simple. En su lugar, el tiempo necesario para que la señal de fluorescencia caiga al 50% de la señal inicial se utiliza como una aparente ty . Los resultados del ensayo de fluorescencia se presentan en la Tabla 12.

60 Tabla 12 Tabla 12

Resumen de los datos de despliegue de variantes de Termamyl pH 4,5 y pH 6,2 a 70°C. A pH 4,5, t y Termamyl = 200 s, a pH de 6,2, t y Termamyl = 2800 s. DDG = -RT*ln (t y Termamyl /ty mutante)

pH 4.5, 1 mM CaCl2

pH 6.2, 10 IM CaCl2

Mutación

DDG (kcal/mol) ty /ty Termamyl 1 DDG (kcal/mol) ty /ty Termamyl amilo

Tipo salvaje

0 1.0 0 1.0

A209V

-0.36 1.85 -0.72 3.39

H133Y+A209V

-0.77 3.67 -0.61 2.78

H156Y

0.06 0.90 -0.10 1.18

A181T

-0.06 1.10 -0.28 1.60

A181T+A209V

-0.44 2.09 < -1 (73%) a > 5

S187D

0.37 0.54 0.19 0.72

H450Y

-0.49 2.29 0.15 0.78

L270D

-0.35 1.8 -0.10 1.2

A181T+H156Y

-0.17 1.34 -0.62 2.84

H133I

-0.33 1.75 -0.42 2.02

H133Y+H156Y+A181T+ A209V+H293Y+A294V+ G310D+H450Y

-0.96 5.10 < -1 (58%) a >5

V128E

-0.10 1.2 -0.25 1.5

H156Y+A181T+A209V

-0.32 1.71 -0.49 2.30

H156Y+A181T+A209V+ H450Y

-0.42 2.05 -0.63 2.92

H156Y+A181T+A209V+ H450Y+H133I

-0.81 3.9 < -1 (65%)a > 5

H156Y+A181T+A209V+ H133I

-0.70 3.3 < -1 (77%)a > 5

Q264S

-0.26 1.6 -0.14 1.3

H156Y+A181T+A209V+ Delta (1,2)+L3V+M15T+ R23K+S31A+A32E+Y33H+A3

-0.43 2.1 -0.82 4.0

5S+E36D+H37I

Q264S+N265Y

-0.33 1.8 -0.07 1.1

Q264S+N265Y+N190F

-1.07 6.1 -0.67 3.1

Q264S+N265Y+N190F+ H133I+A209V

-1.66 16.5 <-1(82%)a > 5

H156Y+A181T+A209V+ Delta(1,2)+ L3V+M15T+ R23K+S31A+A32E+Y33H+ A35S+E36D+H37I+N190F

-0.30 1.7 <-1(66%)a > 5

H156Y+A181T+A209V+Delt a(1,2) +L3V+M15T+ R23K+S31A+A32E+Y33H+ A35S+E36D+H37I+Q264S

-0.43 2.1 -0.86 4.3

Resumen de los datos de despliegue de variantes de Termamyl pH 4,5 y pH 6,2 a 70°C. A pH 4,5, t y Termamyl = 200 s, a pH de 6,2, t y Termamyl = 2800 s. DDG = -RT*ln (t y Termamyl /ty mutante)

pH 4.5, 1 mM CaCl2

pH 6.2, 10 IM CaCl2

Mutación

DDG (kcal/mol) ty /ty Termamyl 1 DDG (kcal/mol) ty /ty Termamyl amilo

H156Y+A181T+A209V+Delt a(1,2)+ L3V+M15T+ R23K+S31A+A32E+Y33H+ A35S+E36D+H37I Q264S+N190F

-0.36 1.8 <-1(76%)a > 5

H156Y+A181T+A209V+N190 F+Q264S

-1.3 8.6 < -1 (66%)a > 5

a El porcentaje indica el nivel al que había disminuido el nivel de fluorescencia inicial en el transcurso de 3 horas a 70 °C. El lento declive es indicativo de una alta estabilidad.

EJEMPLO 5

Variantes de a-amilasa con aumento de la actividad específica

5 [0206] Este ejemplo resume los resultados de variantes caracterizadas por tener un aumento de la actividad específica en comparación con Termamyl wt. La presencia de estas sustituciones, ya sea en combinación unas con otras o como sustituciones individuales añadido a las sustituciones de estabilización aumenta la actividad específica de la variante resultante. La actividad específica se determinó usando el ensayo de a-amilasa (Phadebas) descrito en los Materiales y

10 Métodos, donde se determinó la actividad/mg de enzima. La actividad se determinó utilizando la siguiente descripción en donde el pH fue de 7,3, temperatura de 37 °C y 15 minutos de tiempo de prueba, y el tampón tal como se ha definido.

MUTACIÓN

ACTIVACIÓN SPEC. (ENSAYO PHADEBAS), ÍNDICE CON RESPECTO AL TERMAMYL WT .

S187D

260%

V54I

160%

BAN/híbrido Termamyl: (L(1,2) +L3V+M15T+R23K+S31A+A3 2E+Y33H+A35S+E36D+H37I)

140%

L(D372+S373+Q374)

125%

L(K370+G371+D372)

125%

BAN/híbrido Termamyl: (L(1,2) +L3V+M15T+R23K+S31A+A3 2E+Y33H+A35S+E36D+H37I)+L(D372+5373+Q374)+ V54I+S187D

360%

Q264S

130%

Y290E

155%

Y290K

140%

N190F

150%

15 EJEMPLO 6

Pruebas de especificidad de variantes (sacarificación)

[0207] Se ha informado anteriormente (patente de EE.UU. 5.234.823) que, en caso de sacarificación con glucoamilasa

20 y pululanasa, la presencia de la actividad de a-amilasa residual que surge del proceso de licuefacción puede llevar a rendimientos más bajos de glucosa, si la a-amilasa no está inactivada antes de la etapa de sacarificación. Esta inactivación se puede lleva a cabo típicamente mediante el ajuste del pH por debajo de 4.3 a 95 °C, antes de bajar la temperatura a 60 °C para la sacarificación.

25 [0208] La razón de este efecto negativo en el rendimiento de la glucosa no se entiende completamente, pero se supone que la a-amilasa liquefactante(por ejemplo Termamyl 120 L de B. licheniformis) genera "dextrinas límite" (que son sustratos pobres para la pululanasa), mediante hidrólisis de enlaces glucosídicos alfa-1,4 cerca y en ambos lados de los puntos de ramificación en la amilopectina. La hidrólisis de estas dextrinas límite por la glucoamilasa conduce a una acumulación del trisacárido panosa, que es hidrolizado sólo lentamente por la glucoamilasa.

30 [0209] El desarrollo de una a-amilasa termoestable, que no sufra de esta desventaja sería una mejora significativa, ya que no haría falta ninguna etapa de inactivación por separado.

[0210] Diversas variantes de a-amilasa de B. licheniformis, con especificidad alterada, fueron evaluadas mediante sacarificación de un sustrato DE 10 maltodextrina con glucoamilasa de A. niger y pululanasa de B.acidopullulyticus en condiciones en las que la amilasa variante estaba activa.

5 [0211] Las reacciones de sacarificación se controlaron mediante la toma de muestras a intervalos de 24 horas y analizándolas por HPLC. Las condiciones de reacción estándar fueron:

Concentración de sustrato

28.2% p/p Temperatura 60°C pH inicial (a 60°C) 4.7 Dosis de enzima

Glucoamilasa 0.18 AG/g DS pululanasa 0.06 PUN/g DS a-amilasa 60 NU/g DS

Se utilizaron las siguientes enzimas:

10 Glucoamilasa:

AMG (Novo Nordisk) 153 AG/g Pululanasa: Promozyme (Novo Nordisk) 295 PUN/g a-amilasa:

Termamyl (Novo Nordisk) 135 KNU/g V54Y 313 KNU/g A52W 5,116 NU/ml D53E 3,280 NU/ml D53W 599 NU/ml A52W+V54Y 134 NU/ml

Las mutaciones que figuran en la lista de a-amilasa anterior se utilizan para indicar las variantes de a-amilasa de B. licheniformis (SEC ID N.º 2) (Termamyl) que ha sido modificada por la mutación(es) indicada(s).

15 [0212] Los sustratos para la sacarificación fueron preparados disolviendo 230g de maltodextrina secada por pulverización DE 10, preparada a partir de almidón de maíz común, en 460 ml de agua desionizada hirviendo y ajustando la sustancia seca a aproximadamente 30% p/p. El pH se ajustó a 4,7 (medido a 60 °C) y partes alícuotas de sustrato correspondientes a 15 g de peso en seco fueron transferidas a matraces de vidrio de 50 ml de tapa azul.

20 [0213] Los matraces se colocaron a continuación en un baño de agua con agitación equilibrado a 60 °C, y los enzimas añadidas. El pH se reajustó a 4,7 en caso necesario. Se tomaron periódicamente muestras de 2 ml, el pH se ajustó a aproximadamente 3,0 y después se calentó en un baño de agua hirviendo durante 15 minutos para inactivar las enzimas. Después de enfriar, las muestras se trataron con aproximadamente 0,1 g de resina de intercambio de iones de

25 lecho mixto (BIO-Rad 501 X8 (D)) durante 30 minutos en un mezclador giratorio para eliminar las sales y N soluble. Después de la filtración, la composición de carbohidratos se determinó por HPLC. Después de 72 horas, se obtuvieron los siguientes resultados:

a-amilasa añadida % DP1 % DP2 % DP3 % DP4+

Ninguno (control) 96.59 2.2 0.3 1.0 V54Y 96.5 2.2 0.4 0.9 A52W+V54Y 96.4 2.2 0.5 0.9 Termamyl 96.3 2.1 0.8 0.8

30 En comparación con el control (sin presencia de a-amilasa activa durante la licuefacción), la presencia de variantes de a-amilasa activa V54Y y A52W+V54Y no dio lugar a niveles elevados de panosa (DP3).

[0214] Si se utilizan estas variantes de a-amilasa para la licuefacción de almidón, no será necesario inactivar la enzima antes del comienzo de la sacarificación.

5 EJEMPLO 7 Evaluación de las variantes de B. licheniformis en condiciones de licuefacción simulada

[0215] El proceso estándar para la licuefacción de almidón industrial comprende dos etapas, a las normalmente se hace

10 referencia como licuefacción primaria y secundaria. En la primera etapa, un 30-40 % p/p de suspensión de almidón a un pH de 5,5-6,0, a la que se ha añadido una a-amilasa termoestable de B. licheniformis o B. stearothermophillus, se calienta a 105-110 °C en un cocedor en chorro donde se inyecta vapor vivo en la corriente de almidón. Después de un tiempo de mantenimiento de 5-10 minutos bajo presión a esta temperatura, el almidón licuado es somete a enfriamiento rápido a una temperatura aproximadamente de 95 ºC y se mantuvo a esa temperatura durante 60-120 minutos.

15 [0216] Con el fin de evaluar pequeñas cantidades de enzimas a escala de laboratorio se utilizó el método siguiente:

Alícuotas de 10 g de una suspensión de almidón de maíz común (Cerestar GL 3406) en agua desionizada (aprox. 30 % p/p) se pesaron en matraces cónicos de 100 ml (Schott GL 125), que están equipados con

20 tapones de rosca de cierre hermético. El pH, el nivel de calcio y la dosis de la enzima en la suspensión pueden ser variados.

Para cada conjunto diferente de condiciones experimentales se utilizan 4 matraces. Los matraces se colocaron en un baño de aceite con agitación (Heto VS 01) mantenido a 105 °C. Después de un período de 7 minutos, se

25 vierte aceite frío en el baño para bajar la temperatura a 95 °C. Para cada serie de experimentos, los matraces se retiran después de 20, 40, 60 y 90 minutos y se enfrian inmediatamente con agua corriente. Una gota de HCl 1 N se añade a cada matraz para inactivar la enzima. La reacción se controla midiendo el DE (contenido de azúcares reductores expresados como glucosa) utilizando el método de Neocuproine.

30 [0217] Los detalles de este método se pueden encontrar en "Determination of reducing sugar with improved precision. Dygert, Li, Florida and Thomas, Anal Biochem, 13, 368 (1965).

[0218] Los siguientes DE se registraron después de 90 minutos

• Híbrido = híbrido de PCR BAN/Termamyl como se describe en Ejemplo 3

5 REFERENCIAS CITADAS [0219] Klein, C., et al., Biochemistry 1992, 31, 8740-8746,

10 Mizuno, H., et al., J. Mol. Biol. (1993) 234, 1282-1283, Chang, C., et al, J. Mol. Biol. (1993) 229, 235-238, 15 Larson, S.B., J. Mol. Biol. (1994) 235, 1560-1584, Lawson, C.L., J. Mol. Biol. (1994) 236, 590-600, Qian, M., et al., J. Mol. Biol. (1993) 231, 785-799, 20 Brady, R.L., et al., Acta Crystallogr. sect. B, 47, 527-535, Swift, H.J., et al., Acta Crystallogr. sect. B, 47, 535-544 25 A. Kadziola, Ph.D. Tesis: "An alpha-amylase from Barley and its Complex with a Substrate Analogue Inhibitor Studied by X-ray Crystallography", Department of Chemistry University of Copenhagen 1993 MacGregor, E.A., Food Hydrocolloids, 1987, Vol.1, No. 5-6, p. 30 B. Diderichsen and L. Christiansen, Cloning of a maltogenic a-amylase from Bacillus stearothermophilus, FEMS Microbiol. letters: 56: pp. 53-60 (1988) Hudson et al., Practical Immunology, Third edition (1989), Blackwell Scientific Publications,

Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989

S.L. Beaucage y M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981, pp. 1859-1869

5 Matthes et al., The EMBO J. 3, 1984, pp. 801-805 .

R.K. Saiki et al., Science 239, 1988, pp. 487-491 .

10 Morinaga et al., (1984, Biotechnology 2:646-639) Nelson and Long, Analytical Biochemistry 180, 1989, pp. 147-151 Hunkapiller et al., 1984, Nature 310:105-111

R. Higuchi, B. Krummel, and R.K. Saiki (1988). A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucl. Acids Res. 16:7351-7367 .

Dubnau et al., 1971, J. Mol. Biol. 56, pp. 209-221 . 20 Gryczan et al., 1978, J. Bacteriol. 134, pp. 318-329 . S.D. Erlich, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. 74, pp. 1680-1682 .

Boel et al., 1990, Biochemistry 29, pp. 6244-6249 .

LISTADO DE SECUENCIAS

[0220] En las siguientes SEC ID Nos. 1, 3, 5 y 5', se ilustran la secuencia de codificación y la secuencia 3' de los genes

30 de a-amilasa relevantes. La secuencia 5' es la primera parte separada de la secuencia escrita con letras minúsculas, la secuencia de codificación es la parte intermedia de la secuencia, donde la secuencia señal está escrita con letras minúsculas y la secuencia que codifica la a-amilasa madura está escrita con letras mayúsculas, y la secuencia de 3' es la tercera parte separada de la secuencia escrita con letras minúsculas.

35 SEC ID N.º 1 aagagcagagaggacggatttcctgaaggaaatccgtttttttatttt SEC ID No. 2

SEC ID N.º 3

SEC ID N.º 4

SEC ID N.º 5

tgcctgcga SEC ID N.º 6

SEC ID N.º 10

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1. Variante de la a-amilasa progenitora tipo Termamyl, que tiene la secuencia SEC ID N.º: 2 donde dicha variante consta de la SEC ID N.º: 2 con una de las siguientes mutaciones seleccionadas de:

   5 i)H156Y+A181T+A209V;

   ii)H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S;

   10 iii)A1*+N2*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H35I+ H156Y+A181T+A209V;

   iv)A1*+N2*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H35I+ H156Y+A181T+N190F+A209V;

   v)A1*+N2*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H35I+ H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S, 15 donde un asterisco (*) indica deleción del aminoácido.
2. 2. Constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una variante de a-amilasa según la

   reivindicación 1. 20

3. 3.

   Vector de expresión recombinante que lleva un constructo de ADN según la reivindicación 2.

4. 4.

   Célula que se transforma con un constructo de ADN según la reivindicación 2 o un vector según la reivindicación 3.

   25 5. Célula según la reivindicación 4, que es un microorganismo.

5. 6.

   Célula según la reivindicación 4, que es una bacteria o un hongo.

6. 7.

   Célula según la reivindicación 6, que es una bacteria gram positiva tal como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis,

   30 Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus o Bacillus thuringiensis.
7. 8. Uso de una variante de a-amilasa según la reivindicación 1 para lavar y/o lavar platos.

   35 9. Uso de una variante de a-amilasa según la reivindicación 1 para desencolado textil.
8. 10. Uso de una variante de a-amilasa según la reivindicación 1 para licuefacción de almidón.
9. 11. Aditivo detergente que comprende una variante de a-amilasa según la reivindicación 1, opcionalmente en forma de 40 granulado no pulverulento, líquido estabilizado o enzima protegida.
10. 12. Aditivo detergente según la reivindicación 11 que contiene desde 0,02 hasta 200 mg de proteína enzimática/g de aditivo.

    45 13. Aditivo detergente según la reivindicación 11 o 12, que adicionalmente comprende otra enzima tal como una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra enzima amilolítica y/o una celulasa.
11. 14. Composición detergente que comprende una variante de a-amilasa según la reivindicación 1.

    50 15. Composición detergente según la reivindicación 14 que comprende adicionalmente otra enzima tal como una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra enzima amilolítica y/o una celulasa.
12. 16. Composición detergente para el lavado de platos manual o automático que comprende una variante de a-amilasa

    según la reivindicación 1. 55
13. 17. Composición detergente para el lavado de platos según la reivindicación 16 que comprende adicionalmente otra enzima tal como una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra enzima amilolítica y/o una celulasa.
14. 18. Composición para el lavado de ropa a mano o automático que comprende una variante de a-amilasa según la 60 reivindicación 1.

15. 19.

    Composición detergente para el lavado de ropa según la reivindicación 18, que comprende adicionalmente otra enzima tal como una proteasa, una lipasa, una peroxidasa, otra enzima amilolítica y/o una celulasa.

16. 20.

    Método para generar una variante según la reivindicación 1, variante que presenta una mayor estabilidad a pH bajo en relación con la progenitora, comprendiendo el método el someter una secuencia de ADN que codifica la a-amilasa progenitora tipo Termamyl a mutagénesis dirigida al sitio.