JP2009072204A - α−アミラーゼ変異体 - Google Patents
α−アミラーゼ変異体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009072204A JP2009072204A JP2008308503A JP2008308503A JP2009072204A JP 2009072204 A JP2009072204 A JP 2009072204A JP 2008308503 A JP2008308503 A JP 2008308503A JP 2008308503 A JP2008308503 A JP 2008308503A JP 2009072204 A JP2009072204 A JP 2009072204A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amylase
- bacillus
- termamyl
- variant
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/02—Monosaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【解決手段】本発明は、親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体であって、α−アミラーゼ活性を有し、且つ前記親のα−アミラーゼと比較すると次の性質:基質特異性、基質結合、基質開裂パターン、熱安定性、pH/活性プロフィール、pH/安定性プロフィール、酸化に対する安定性、Ca2+依存性および比活性のうちの少なくとも1つの性質に変更を示す変異体に関する。
【選択図】なし
Description
本発明は、特に、親のテルマミル(Termamyl)様α−アミラーゼの新規変異体、特に工業的デンプン加工(例えばデンプンの液化または糖化)における該変異体の適用に関して有利である1または複数の性質に変化を示す(親に比較して)変異体に関する。
α−アミラーゼ(α−1,4−グルカン−4−グルカノヒドロラーゼ、EC 3.2.1.1)は、デンプン並びに他の直鎖および分枝鎖1,4−グルコシドオリゴ糖および多糖の加水分解を触媒することができる酵素の一群を構成する。この産業上非常に重要な酵素の群に関する特許および科学文献は非常に多数存在する。
上述したように、本発明は特に、テルマミル様α−アミラーゼの新規α−デンプン分解性変異体、特に工業的デンプン加工(デンプン液化、糖化など)に関して有利である変更された性質を示す変異体に関する。
テルマミル様α−アミラーゼ
バシラス種により生産される多数のα−アミラーゼがアミノ酸レベルで高度に相同であることは周知である。例えば、配列番号2に示されるアミノ酸配列を含んで成るB.リヘニフォルミス(B. licheniformis)α−アミラーゼ〔テルマミル(TermamylTM、商標)として市販されている〕は、配列番号4に示されるアミノ酸配列を含んで成るB.アミロリクファシエンス(B. amyloliquefaciens)α−アミラーゼと約89%相同であり、そして配列番号6に示されるアミノ酸配列を含んで成るB.ステアロサーモフィラス(B. stearothermophilus)α−アミラーゼと約79%相同であることがわかっている。他の相同α−アミラーゼとしては、バシラス種NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513またはDSM 9375の株に由来するα−アミラーゼ(それらは全てWO 95/26397 中に詳細に記載されている)およびTsukamoto 他, Biochemical and Biophysical Research Communications, 第151 巻, 第1号, 1988により記載されたα−アミラーゼが挙げられる。更に別の相同α−アミラーゼとしては、EP 0252666中に記載されたB.リヘニフォルミス(B. licheniformis)(ATCC 27811)株により生産されるα−アミラーゼ、並びにWO 91/00353 およびWO 94/18314 において同定されたα−アミラーゼが挙げられる。他の市販のテルマミル様B.リヘニフォルミスα−アミラーゼは、OptithermTMおよびTakathermTM(Solvayから入手可能)、MaxamylTM(Gistbrocades/Genencor から入手可能)、Spezym AATM(Genencorから入手可能)並びにKeistaseTM(Daiwa から入手可能)である。
親のα−アミラーゼはハイブリッドα−アミラーゼであってもよく、即ち、少なくとも2つのα−アミラーゼに由来する部分アミノ酸配列の組合せを含んで成るα−アミラーゼであってもよい。
着目の変異体の作製は、変異体を生産する助けとなる条件下で、該変異体をコードするDNA配列を含んで成る微生物を培養することにより達成される。続いて該変異体を得られた培養ブロスから回収することができる。これについては下記に詳細に記載する。
下記において本発明の変異体中に存在し得る変異間の関係、およびそれから生じ得る望ましい性質の変更(親のテルマミル様α−アミラーゼのものに相対して)を説明する。
テルマミル様α−アミラーゼのCa2+依存性を減少できることが非常に好ましい。従って、本発明の第一の面は、α−アミラーゼ活性を示し且つ親のα−アミラーゼに比較して減少したCa2+依存性を有する親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体に関する。減少したCa2+依存性は、該変異体が、親酵素に必要であるよりも低い外来媒質中のカルシウムイオン濃度の存在下で十分なデンプン分解活性を示すという機能的結果を一般にもたらすだろう。更に、該変異体が、例えばカルシウム錯生成剤(例えば或る種の洗剤ビルダー)を含有する媒質中において得られる状態のようなカルシウムイオン涸渇状態に対して親酵素よりも敏感でないという結果をしばしば有するだろう。
A349C+I479Cおよび/またはL346C+I430C。
N457D,E
N457D,E + K385R
F350D,E + I430R,K
F350D,E + I411R,K
を導入することによって塩橋を得ることができること、そして
アミノ酸残基H408および/またはG303を別の任意のアミノ酸残基で置換することにより、特に良好なカルシウム結合またはカルシウム涸渇からの保護を提供すると考えられる次の置換:
H408Q,E,N,D および/またはG303N,D,Q,E
の1つを導入することにより、ドメインCのカルシウム結合部位が安定化され得ることを記載している。
(別のテルマミル様α−アミラーゼの同等位置における同等な変異もこれに包含される)。
A181E,D,Q,N,V (これはドメインAとドメインBの間の接合領域中の最も外側のCa2+結合部位を或る程度遮蔽すると思われる);
I201(嵩張ったアミノ酸)、例えばI201W,F,L (これはドメインAとドメインBの間の接合領域中のCa2+−Na+ −Ca2+結合部位に近接した領域の幾何学、並びに近くの孔/くぼみの幾何学および/またはサイズのわずかな変更をもたらすと思われる);および
Y203E,Q (これはドメインAとドメインBの間の接合領域中の最も外側のCa2+結合部位におけるCa2+イオンの一層強力な結合をもたらすと思われる)
(または別のテルマミル様α−アミラーゼの同等位置における同等の変異)。
WO 96/23874 は、活性部位残基のpKaを変更することにより、テルマミル様α−アミラーゼの最適pHまたは与えられたpHでのそれの酵素活性を変更することができると考えられること、そしてこれは例えば、変更しようとするアミノ酸残基のアミノ酸側鎖の官能基とその付近の官能基との静電気的相互作用または疎水的相互作用を変えることにより達成できることを記載している。
本発明において、低pHでの高められた安定性を達成することに関して重要である変異(アミノ酸置換)は、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するB.リヘニフォルミスα−アミラーゼ中の下記の変異に相当する変異を含むと思われる:
H68, H91, H247, R305, K306, H382, K389, H405, H406, H450またはR483の位置における変異;
H140Y; H142Y; H156Y; H159Y; H140D+H142R; H140K+H142DまたはH142Y+H156Y ;
並びにそれらの変異のいずれか2つ以上の組合せ。
本発明の別の面は、親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体であって、高められた耐熱性の変異体を得るように親のα−アミラーゼから1もしくは複数のアミノ酸残基が削除されているか、置換されているかまたは付加されている変異体に関する。
L61W,V,F;
Y62W;
F67W;
K106R,F,W;
G145F,W;
I212F,L,W,Y,R,K;
任意の別のアミノ酸残基、特に F,W,Iもしくは Lで置き換えられた
S151;
R214W;
Y150R,K;
F143W; および/または
R146W 。
L214I,F,Y,W ; および/または
I236L,F,Y,W
L7F,I,W
V259F,I,L
F284W
F350W
F343W
L427F,L,W
V481F,I,L,W 。
R169(例えばR169I,L,F,T );
R173(特にR173I,L,F,T );
I201F;
I212F;
A209L,T;または
V208I
並びにそれらの変異のいずれか2つ以上の組合せ。
本発明において、酸性pH(pH<7)および/または低Ca2+濃度で高められた耐熱性を有する本発明の変異体を得ることに関して特に関連性があると思われる変異としては、次の位置における変異が挙げられる(B.リヘニフォルミスα−アミラーゼ、配列番号2に関して):
H156, N172, A181, N188, N190, H205, D207, A209, A210, E211,Q264, N265
H156Y,D
N172R,H,K
A181T
N188P
N190L,F
H205C
D207Y
A209L,T,V
A210S
E211Q
Q264A,E,L,K,S,T
N265A,S,T,Y
並びにそれらの変異の2以上の任意組合せ。
変更された開裂パターン
デンプン液化工程では、デンプン分子をより短鎖の分枝状オリゴ糖に分解する(通常のテルマミル様α−アミラーゼのように)よりも長鎖オリゴ糖に分解することができるα−アミラーゼを使うことが望ましい。生成した短鎖の分枝状オリゴ糖(パノース前駆体)は、液化工程におけるα−アミラーゼ処理の後で且つ糖化用アミログルコシダーゼ(グルコアミラーゼ)の添加の前に使われるプルラナーゼにより、十分に加水分解されない。よって、パノース前駆体の存在下では、グルコアミラーゼ処理後に存在する生成物混合物は、短鎖の分枝状の、いわゆるリミットデキストリン、すなわち三糖パノースを相当な比率で含み得る。パノースの存在は糖化収率をかなり減少させるので、望ましくない。
V54L,I,F,Y,W,R,K,H,E,Q
D53L,I,F,Y,W
Y56W
Q333W
G57 あらゆる可能なアミノ酸残基
A52 A より大きいアミノ酸残基、例えばA52W,Y,L,F,I。
本発明の更に別の面では、増加した比活性を示す変異体を得ることに関して重要な変異は、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するB.リヘニフォルミスα−アミラーゼ中の次の変異に相当する変異を含むようである:
S187(特にS187D )もしくはQ264(例えばQ264R,K,S )の位置における変異(アミノ酸置換);
Y290(特にY290E,K )の位置における変異(置換);
変異V54I;
並びにこれらの変異のうちのいずれか2つ以上の組合せ、またはこれらの変異のうちの1つもしくは2つ以上と下記の多重変異との組合せ:
A1* +N2* +L3V +M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H35I。
本発明の変異体が上記に概説したものに加えて1または複数の変更を含んで成ることが好ましいかもしれない。よって、変更されるα−アミラーゼ変異体の一部分に存在する1もしくは複数のプロリン残基が非プロリン残基(これは天然に存在する可能な非プロリン残基のいずれであってもよく、好ましくはアラニン、グリシン、セリン、スレオニン、バリンまたはロイシンである)により置換されていることが有利かもしれない。
更に、本発明の変異体は、唯一の変更としてまたは上述の変更のいずれかとの組合せとして、配列番号2のアミノ酸断片185 〜209に相当するアミノ酸断片中に存在する1もしくは複数のAsp および/またはGlu がそれぞれAsn および/またはGln により置き換えられるように変更されてもよい。同じく着目されるのは、配列番号2のアミノ酸断片185 〜209 に相当するアミノ酸断片中に存在する1または複数のLys 残基の、Arg による置換である。
遺伝子に変異を導入する方法は当業界において幾つか知られている。α−アミラーゼをコードするDNA配列のクローニングの簡単な説明の後で、α−アミラーゼコード配列中の特定部位に変異を作製する方法を記載することにする。
親のα−アミラーゼをコードするDNA配列は、当業界で周知である様々な方法を使って、問題のα−アミラーゼを産生する任意の細胞または微生物から単離することができる。まず、研究しようとするα−アミラーゼを産生する生物体から染色体DNAまたはメッセンジャーRNAを使ってゲノムDNAライブラリーおよび/またはcDNAライブラリーを作製する。次いで、そのα−アミラーゼのアミノ酸配列が既知であるなら、相同の標識オリゴヌクレオチドプローブを合成し、それを使って、問題の生物体から調製したゲノムライブラリーからα−アミラーゼをコードするクローンを同定することができる。あるいは、既知のα−アミラーゼ遺伝子に相同である配列を含む標識オリゴヌクレオチドプローブをプローブとして使って、低緊縮性のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、α−アミラーゼをコードするクローンを同定することができる。
一度α−アミラーゼをコードするDNA配列が単離され、そして望ましい変異部位が同定されれば、合成オリゴヌクレオチドを使って変異を導入することができる。それらのオリゴヌクレオチドは所望の変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含み;変異ヌクレオチドはオリゴヌクレオチド合成中に挿入される。特別な方法では、α−アミラーゼコード配列をブリッジする一本鎖のDNAギャップを、α−アミラーゼ遺伝子を担持するベクター中で作製する。次いで、所望の変異を有する合成ヌクレオチドを一本鎖DNAの相同部分にアニールせしめる。次いで残りのギャップをDNAポリメラーゼI(クレノウ断片)を使ってフィルインし、T4リガーゼを使って構成物を連結せしめる。この方法の具体例はMorinaga他 (1984) に記載されている。米国特許第4,760,025 号明細書は、カセットのわずかな変更を行うことによる多重変異をコードするオリゴヌクレオチドの導入を開示している。しかしながら、様々な長さを有する多数のオリゴヌクレオチドを導入することができるため、もっと多様な変異を何時でもMorinaga法により導入することができる。
ランダム変異誘発は、問題のアミノ酸配列に翻訳する遺伝子の少なくとも3部分における限局化されたもしくは領域特異的なランダム変異誘発として、または全遺伝子内で実施される。
13〜18
50〜56
70〜76
102 〜109
163 〜172
189 〜199
229 〜235
360 〜364
327 〜335
デンプン液化工程に用いることができるα−アミラーゼの場合、耐熱性であり且つ低pHおよび低カルシウムイオン濃度で機能することができることが特に重要である。親のテルマミル様α−アミラーゼ、特にB.リヘニフォルミスα−アミラーゼまたはそれの変異体もしくはハイブリッドのそれらの性質を改善するために、ランダム変異誘発(好ましくはドープまたはスパイクしたオリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより)に続いて、得られた変異型酵素の適切な選択を行うことができる。ランダムにする領域の選択およびドーピングの選択の傾向は主に、既に存在するカルシウムイオンの安定化、および低pHでの残基/残基またはドメイン/ドメイン静電的相互作用の改善に基づく。加えて、良好なデンプン液化性能を得るのに重要な位置を含むことが証明されている領域を選択することができる。
領域 残基 説明
I: 153-163 H156も含む、ドメインAとBの間のカルシウム領域
II: 178-192 ドメインAとBの間のカルシウム領域
III: 193-214 A209も含む、ドメインAとBの間のカルシウム領域
IV: 232-237 ドメインAとBの間のカルシウム領域
V: 297-308 ドメインAとCの間のカルシウム領域
VI: 403-409 ドメインAとCの間のカルシウム領域
VII: 428-435 ドメインAとCの間のカルシウム領域
VIII: 131-136 H133 を含む領域
IX: 164-175 H133 領域と接する領域
X: 262-278 Q264 を含む領域
VIII+IX
VIII+IX+II
II+III+IV
IV+I
(a) 親のテルマミル様α−アミラーゼをコードするDNA配列をランダム変異誘発にかけ;
(b) 段階(a)で得られた変異型DNA配列を宿主細胞中で発現せしめ;そして
(c) 親のα−アミラーゼに比較して高められた低pHおよび低カルシウム濃度での安定性を有する変異型α−アミラーゼを発現する宿主細胞についてスクリーニングする
ことを含んで成る方法に関する。
本発明の上記方法の段階(a)は、好ましくは本明細書中の実施例(下記参照)に記載される通り、ドープされたプライマーを使って実施される。
上記方法の段階(a)に従って実施することができる親のα−アミラーゼをコードするDNA配列のランダム変異誘発は、便利には当業界で既知である任意の方法を使って実施することができる。
グラム陽性菌、例えばバシラス・サチリス(Bacillus subtilis)、バシラス・リヘニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バシラス・レンタス(Bacillus lentus)、バシラス・ブレビス(Bacillus brevis)、バシラス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)、バシラス・アルカロフィラス(Bacillus alkalophilus)、バシラス・アミロリクファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バシラス・コアギュランス(Bacillus coagulans)、バシラス・サーキュランス(Bacillus circulans)、バシラス・ロータス(Bacillus lautus)、バシラス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バシラス・スリンジエンシス(Bacillus thuringiensis)、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)またはストレプトマイセス・ムリナス(Streptomyces murinus);およびグラム陰性菌、例えばE.コリ(E. coli)。
限局化ランダム変異誘発:ランダム変異誘発は、有利には問題の親のα−アミラーゼの一部に限局化することができる。これは、例えば、酵素の或る領域が酵素の所定の性質に特に重要であると同定されている時、および変更すると改善された性質を有する変異体をもたらすと期待される時に有利であり得る。そのような領域は通常、親酵素の三次元構造が明らかにされており且つ該酵素の機能に関連づけられている時は同定することができる。
着目の変異型デンプン分解酵素を発現することができる微生物を、該酵素を分泌させるのに適当な培地上で且つ適当な条件下でインキュベートし、ここで前記培地には第一のタンパク質結合性フィルターと、その上に置かれた低タンパク質結合力を有する第二のフィルターとを含んで成る二重フィルターが用意される。微生物は第二のフィルター上に置かれる。インキュベーション後、微生物から分泌された酵素を含んで成る第一のフィルターを、微生物を含んで成る第二のフィルターから分離する。第一のフィルターを所望の酵素活性についてのスクリーニングにかけ、そして第二のフィルター上に存在する対応する微生物コロニーを同定する。
本発明の変異体の試験は、適当には、例えばデンプン含有アガロース平板上で変異体をコードするDNA配列により形質転換された宿主細胞を増殖させ、そしてデンプン分解性宿主細胞を同定することによって該変異体のデンプン分解活性を決定することにより、実施することができる。変更された性質(比活性、基質特異性、開裂パターン、熱活性化、最適pH、pH依存性、最適温度および他の任意のパラメーターを含む)に関する追加の試験は、当業界で既知の方法に従って実施することができる。
本発明によれば、上述の方法によりまたは当業界で既知の任意の別法により生産される変異体をコードするDNA配列は、典型的にはプロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、および場合により、リプレッサー遺伝子または様々なアクチベーター遺伝子をコードする調節配列を含有する発現ベクターを使って、酵素形態で発現せしめることができる。
本発明のα−アミラーゼ変異体は、様々な工業的用途に備えた価値ある性質を有する。特に本発明の酵素変異体は、洗剤、食器洗い用洗剤、および硬質面洗浄用洗剤組成物中の一成分としての潜在的用途があるが、それはデンプンからの甘味料およびエタノールの製造において並びに織物製織にも有用である。従来のデンプン転化工程並びに液化および/または糖化工程の条件は、例えば米国特許第3,912,590 号並びに欧州特許公報第252,730 号および同第63,909号に記載されている。
デンプンから果糖シロップへの「伝統的な」転化方法は、通常3つの連続した酵素処理工程、即ち液化工程の後の糖化工程と同化工程から成る。液化工程中に、デンプンは5.5 〜6.2 のpH値で且つ95〜160 ℃の温度で約2時間に渡りα−アミラーゼ(例えばTermamyl)(登録商標)によりデキストリンに分解される。これらの条件下での最適な酵素安定性を確保するために、1mMのカルシウムが添加される(40 ppmの遊離カルシウムイオン)。
α−アミラーゼの高安定性を適切に確保するためには遊離カルシウムの付加が要求されるけれども、遊離カルシウムはグルコースイソメラーゼの活性を強く阻害するので、費用のかかる単位操作を使って、遊離カルシウムのレベルが3〜5ppm 以下になる程度まで除去する必要がある。そのような操作が回避でき、そして液化工程が遊離カルシウムイオンの添加なしに実施できれば、コストの削減が得られるだろう。
液化工程中の不用なマイラード生成物の形成の程度はpHに依存する。マイラード生成物の形成の減少には低pHが好ましい。よって、該工程のpHをpH 6.0付近からpH 4.5付近の値に下げることができることが望ましいだろう。不運にも、一般に既知である全ての耐熱性テルマミル様α−アミラーゼは低pH(即ちpH<6.0 )においてあまり安定でなく、そしてそれらの比活性は一般に低い。
A.ニガー(A. niger)のグルコアミラーゼとB.アシドプルリチカス(B. acidopullulyticus)のプルラナーゼを使って糖化すると、糖化工程の前にα−アミラーゼを不活性化しなければ液化工程からの残余α−アミラーゼ活性の存在がデキストロースの低収率を引き起こし得ることは以前に報告されている(米国特許第5,234,823号)。この不活性化は、典型的には糖化のために温度を60℃に下げる前に、95℃でpHを4.3 以下に調製することにより行うことができる。
A1*+N2*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H35I(ここで星印(*) は問題のアミノ酸残基の欠失を示す)〕
中の次の位置のいずれかに相当する位置のところでの変異:
H133
H156
A181
A209
G310
H450
V128
N104
V54
S187
H293
A294
(上記アミノ酸残基の各々は任意の別のアミノ酸残基により、すなわちA, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, YおよびV の中から選ばれた任意の別の残基により置き換えることができる)
並びに次の三重欠失:
K370*+G371*+D372*
D372*+S373*+Q374*
である。
H133I
H156Y
A181T
A209V
G310D
H450Y
V128E
N104D
V54W,Y,F,I,L
S187D
H293Y
A294V。
N172(例えば N172R,K), S187(例えば S187D), N188(例えばN188P), N190(例えば N190L,F), H205(例えば H205C), D207(例えば D207D), A210(例えば A210S), Q264(例えば Q264S)もしくはN265(例えば N265Y)の位置での変異;
次の多重変異:
(i) 配列番号2に示される配列を有するB.リヘニフォルミスからのα−アミラーゼと配列番号6に示される配列を有するB.ステアロサーモフィラスα−アミラーゼ(親のテルマミル様α−アミラーゼとして)に由来する本発明の1もしくは複数の変異体(変異体α−アミラーゼ)との混合物;または
(ii) 配列番号6に示される配列を有するB.ステアロサーモフィラスからのα−アミラーゼと、1もしくは複数の別の親のテルマミル様α−アミラーゼ(例えば配列番号2に示される配列を有するB.リヘニフォルミスα−アミラーゼ、または本明細書中に具体的に言及された別の親のテルマミル様α−アミラーゼのうちの1つ)に由来する本発明の1もしくは複数の変異体(変異体α−アミラーゼ)との混合物;または
(iii) 配列番号6に示される配列を有するB.ステアロサーモフィラスα−アミラーゼ(親のテルマミル様α−アミラーゼとして)に由来する本発明の1もしくは複数の変異体(変異体α−アミラーゼ)と、1もしくは複数の別の親のテルマミル様α−アミラーゼ(例えば配列番号2に示される配列を有するB.リヘニフォルミスα−アミラーゼ、または本明細書中に具体的に言及された別の親のテルマミル様α−アミラーゼのうちの1つ)に由来する本発明の1もしくは複数の変異体(変異体α−アミラーゼ)との混合物
を含んで成る組成物に関する。
上述したように、本発明の変異体は適切に洗剤組成物中に配合することができる。洗剤組成物(例えば洗濯用または食器洗い用洗剤)の関連成分、そのような洗剤組成物への該変異体の適当な配合方法、および洗剤組成物のタイプの例については、例えば、WO 96/23874およびWO 97/07202 を参照のこと。
pSNK101 の作製
このE.コリ/バシラスシャトルベクターを使ってE.コリ中でα−アミラーゼを発現させることなく変異を導入し、次いでα−アミラーゼがバシラス菌中で活性であるような形に変更することができる。該ベクターは次のようにして作製した:pXベクター中のα−アミラーゼ遺伝子(amyL中に次の変異:BAN(1-33), H165Y, A181T,N190F, A209V, Q264S を有するpDN1528 ;プラスミドpDN1528 については実施例1で更に説明する)を、α−アミラーゼ遺伝子の5′コード領域中のPstI部位をE.コリ由来断片を含む1.2 kb断片により中断することにより不活性化した。この断片を、正プライマー:5'-gacctgcagtcaggcaacta-3'と逆プライマー:5'-tagagtcgacctgcaggcat-3'を使ってpUC19 (GenBank 受入番号:X02514)から増幅せしめた。α−アミラーゼ遺伝子を含むpXプラスミドとPCRアンプリコンを37℃で2時間PstIで消化した。pXベクター断片とE.コリ由来アンプリコンを室温で1時間連結せしめ、次いで電気形質転換によりE.コリ中に形質転換せしめた。得られたベクターをpSnK101と命名した。
関連の発現プラスミドを含むB.サチリス株を、−80℃の保存株から15μg/mlのクロラムフェニコールを有するLB寒天平板上に画線し、そして37℃で一晩増殖させた。500 mlの振盪フラスコに入った15μg/mlのクロラムフェニコールを補足したBPX培地 100mlにコロニーを移した。BPX 培地の組成は下記の通りであった:
ジャガイモデンプン 100 g/l
大麦粉 50 g/l
BAN 5000 SKB 0.1 g/l
カゼイン酸ナトリウム 10 g/l
大豆かす 20 g/l
Na2HPO4 ・12 H2O 9 g/l
プルロニック(商標) 0.1 g/l
α−アミラーゼ活性は、基質としてPhadebas(商標)錠を使った方法により測定する。Phadebas錠(Pharmacia Diagnosticにより供給されるPhadebasTM Amylase Test )は、ウシ血清アルブミンと緩衝物質と混合されそして錠剤に成形されている架橋した不溶性青色デンプンポリマーを含む。
ランダム変異誘発は、次の段階により実施することができる:
1.親酵素において変異のための着目領域を選択する
2.選ばれた領域において変異部位と非変異部位を決定する
3.例えば作製しようとする変異体の所望の安定性および/または 性能に関して、ど んな種類の変異を行うのかを決定する
4.構造上理に適った変異を選択する
5.段階3により選択された残基を段階4に関して調整する
6.適当なドープ演算法の使用によりヌクレオチド分布を解析する
7.必要なら、所望の残基を遺伝暗号リアリズムに合わせる(例えば遺伝暗号から生じる 拘束を考慮に入れて)(例えば終止コドンの導入を避けるために)(当業者は或るコ ドンの組合せが実際には使用できず修正改変を必要とするということに気付くだろう )
8.プライマーを作製する
9.該プライマーを使用してランダム変異誘発を実施する
10. 所望の改善された性質についてスクリーニングすることにより、得られたα−アミラ ーゼ変異体を選択する。
段階6での使用に適当なDOPE演算法は当業界において周知である。1つの演算法はTomandl, D. 他、Journal of Computer-AidedMolecular Design, 11 (1997) 29-38 頁により記載されている。別の演算法DOPEを下記に記載する:
「DOPE」プログラムは、コドントリプレットが所望のアミノ酸分布に最も類似しているアミノ酸分布をコードするような方法でコドントリプレットのヌクレオチド組成を最適化するのに有用なコンピューター演算法である。可能な分布のいずれが所望のアミノ酸分布に最も類似しているかを評価するために、スコアリング関数が必要である。「DOPE」プログラムでは、次の関数が適当であることがわかった:
1.各塩基について、現組成と新組成との間の絶対差が、コドンの3つの位置全部での4 つのヌクレオチドG,A,T,Cの各々についてのdより小さいかまたは等しくなる 、新規ランダムヌクレオチド組成を選択する(dの定義については下記参照)。
2.上記に記載したような関数sを使うことにより、新組成のスコアと現組成のスコアを 比較する。もし新組成のスコアが現組成のスコアよりも高いかまたは等しいならば、 新組成を維持しそして現組成を新組成に変更する。もし新組成のスコアが小さければ 、新組成を維持する確率は
テルマミル(配列番号2のB.リヘニフォルミスα−アミラーゼ)はpDN1528 と称するプラスミドからB.サチリス中で発現される。このプラスミドはテルマミルをコードする完全遺伝子amyLを含み、その発現は自身のプロモーターにより指令される。更に、このプラスミドはプラスミドpUB110からの複製開始点ori と、クロラムフェニコールに対する耐性を付与するプラスミドpUC194からのcat 遺伝子を含む。pDN1528 はWO 96/23874 の図9に示されている。
PG GTC GTA GGC ACC GTA GCC CCA ATC CGC TTG
PG GTC GTA GGC ACC GTA GCC CCA ATC CCA TTG GCT CG
P CTG TGA CTG GTG AGT ACT CAA CCA AGT C
PGG TCG TAG GCA CCG TAG CCC TCA TCC GCT TG
PGG TCG TAG GCA CCG TAG CCC ATA TCC GCT TG
PGG TCG TAG GCA CCG TAG CCA ATA TCC GCT TG
PGC AGC ATG GAA CTG CTY ATG AAG AGG CAC GTC AAA C
YはCとTの等量混合物を表す。290 位におけるグルタミン酸またはリジンのいずれかをコードするコドンの存在をDNA配列決定により確かめた。
PCA TAG TTG CCG AAT TCA TTG GAA ACT TCC C
PCA TAG TTG CCG AAT TCA GGG GAA ACT TCC CAA TC
PCC GCG CCC CGG GAA ATC AAA TTT TGT CCA GGC TTT AAT TAG
PCA AAA TGG TAC CAA TAC CAC TTA AAA TCG CTG
PCT TCC CAA TCC CAA GTC TTC CCT TGA AAC
PCTT AAT TTC TGC TAC GAC GTC AGG ATG GTC ATA ATC
PCG CCC AAG TCA TTC GAC CAG TAC TCA GCT ACC GTA AAC
PGC CGT TTT CAT TGT CGA CTT CCC AAT CCC
PGG AAT TTC GCG CTG ACT AGT CCC GTA CAT ATC CCC
PGG CAG GAA TTT CGC GAC CTT TCG TCC CGT ACA TAT C
プライマー 19364:CCT CAT TCT GCA GCA GCA GCC GTA AAT GGC
ACG CTG
プライマー 19362:CCA GAC GGC AGT AAT ACC GAT ATC CGA TAA
ATG TTC CG
プライマー 19363:CGG ATA TCG GTA TTA CTG CCG TCT GGA TTC
プライマー 1C : CTC GTC CCA ATC GGT TCC GTC
PCR1と名付けた第一のPCRにおいて、プライマー19364と19362を使って、B.アミロリクファシエンスα−アミラーゼをコードする遺伝子を含むDNA断片上で約130 bp断片を増幅せしめた。
低pHでの安定性の改善および安定性の対カルシウムイオン依存性の減少を有するテルマミル様α−アミラーゼ変異体の、限局化されたランダムドープ変異誘発による作製
領域 残基
I: Phe153−Thr163
II: Gln178−Asn192
III: His205−Arg214
IV: Ala232−Asp237
VIII: Gly131−Lys136
IX: Asp164−Tyr175
X: Tyr262−Thr278
80×80×90×90×90×90×95×90/100 = 35 %である。
80+80+90+90+90+90+95+90=705 を11で割って=88%。
153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163
Phe Lys Trp Tyr Trp Tyr His Phe Asp Gly Thr
TGG 67T 8AT TTT GAC GGA A9C GAT TGG GAC GAG TCC CGA AAG 3'
1: 80%T,20%A
2: 96%A,2%G,2%C
3: 98%A,2%T
4: 93%T,4%G,3%A
5: 97%A,3%G
6: 98%T,2%A
7: 97%A,3%C
8: 90%C,10%T
9: 95%C,5%A
178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192
Gln Gly Lys Thr Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Phe Gly Asn
TGG GAT 89G GA10 GTT A11T 1213T GAA T1415 161718 AAC TAT GAT
TAT TTG ATG TAT 3'
1: 93%C,7%A
2: 84%G,16%T
3: 95%G,5%A
4: 95%G,5%C
5: 94%A,6%G
6: 95%C,5%A
7: 62%T,38%G
8: 87%T,13%A
9: 91%G,9%C
10: 92%G,8%T
11: 90%T,5%A,5%C
12: 88%A,12%C
13: 88%A,12%C
14: 93%T,5%A,2%C
15: 97%T,3%G
16: 86%G,14%A
17: 89%G,11%C
18: 60%G,40%T
205 206 207 208 209 210 211 212 213 214
His Pro Asp Val Val Ala Glu Ile Lys Arg
8910 1112T 13A14 15T16 A17A 1819A TGG GGC ACT TGG TAT GCC AAT 3'
1: 89%C,11%T
2: 89%A,11%G
3: 95%C,2.5 %T,2.5 %A
4: 96%G,1%A,3%T
5: 96%A,4%C
6: 98%T,2%A
7: 95%G,2.5 %a,2.5 %C
8: 93%G,7%A
9: 96%T,4%A
10: 84%A,16%G
11: 81%G,7%A,7%T,5%C
12: 98%C,2%A
13: 96%G,4%C
14: 94%G,6%T
15: 82%A,18%T
16: 50%A,50%T
17: 90%A,10%G
18: 70%A,30%C
19: 86%G,14%A
232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243
Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe Leu Arg Asp
7TT A8G T9T 1011T T12T 13T14 1516G GA17 TGG GTT AAT CAT GTC
AGG GAA
1: 93%G,3.5 %A,3.5 %T
2: 94%C,4%T
3: 94%T,6%C
4: 93%C,2%T,2%A,3%G
5: 98%A,2%T
6: 98%T,2%A
7: 95%A,5%C
8: 94%A,6%G
9: 90%T,10%A
10: 89%T,11%A
11: 89%C,11%A
12: 95%T,5%A
13: 64%C,33%T,3%A
14: 93%A,7%T
15: 90%A,10%C
16: 90%G,5%A,5%C
17: 90%T,10%A
131 132 133 134 135 136
Gly Glu His Leu Ile Lys
78A 9TA A10G GCC TGG ACA CAT TTT CAT TTT 3'
1: 91%G,9%A
2: 87%G,13%C
3: 90%T,10%G
4: 90%G,10%T
5: 85%C,8%T,7%A
6: 89%A,9%T,2%C
7: 88%T,12%A
8: 88%T,11%C,1%G
9: 92%A,8%T
10: 93%A,7%G
164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175
Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr
3CG CGA A4G 56A A7T A8G 91011 T12T AAG TTT CAA GGA AAG GCT
TGG 3'
1: 94%G,6%A
2: 96%T,4%G
3: 92%T,4%A,4%G
4: 95%A,5%G
5: 93%C,7%A
6: 92%T,8%A
7: 90%A,5%G,5%C
8: 90%G,10%A
9: 92%A,6%G,2%T
10: 92%T,8%A
11: 50%T,50%C
12: 96%A,4%T
262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276
Tyr Trp Ser Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Asn Lys
277 278
Thr Asn
7A8 91011 1213T 1415T 16T17 GA18 A19T T20T 21T22 A23C A24G
ACA 25AT TTT AAT CAT TCA GTG TTT GAC 3'
1: 95%A,5%T
2: 97%A,3%G
3: 95%G,2.5 %A,2.5 %C
4: 94%T,6.2 %G
5: 97%A,3%T
6: 94%A,3%G,3%C
7: 95%G,5%A
8: 95%T,5%A
9: 52%T,45%C,3%A
10: 96%T,4%C
11: 60%A,40%G
12: 90%G,10%A
13: 94%G,6%C
14: 81%G,8%A,8%T,3%C
15: 98%C,2%T
16: 90%C,10%A
17: 50%G,50%T
18: 90%A,10%T
19: 90%A,5%G,5%C
20: 95%A,5%T
21: 91%T,9%A
22: 92%A,8%G
23: 94%A,3%G,3%C
24: 93%G,7%A
25: 90%A,10%G
表1〜7から明らかなスパイクしたオリゴヌクレオチド(図3では共通名FDASと表示)および各領域についての逆プライマーRDAS並びにSacII 部位とSalI部位を包含する特異的B.リヘニフォルミスプライマーを使って、重複伸長法〔Horton他, Gene, 77 (1989),61-68〕により、21 bp の重複部分を有するPCR−ライブラリー断片を作製する。図3はPCR法を示す。PCR断片をE.コリ/バシラスシャトルベクター pSNK101(材料と方法の項目を参照のこと)中でクローニングしてE.コリ中での変異誘発およびバシラス・サチリス中での迅速発現を可能にし、E.コリ中での致死的なアミラーゼの蓄積を防止する。E.コリ中にクローン化PCR断片が確証された後、変異pUC19 断片をプラスミドから消化して取り出し、プロモーターと変異型テルマミル遺伝子を物理的に連結せしめ、そしてバシラス中での発現を行うことができる。
7つのライブラリーを後述の低pHフィルターアッセイおよび低カルシウムフィルターアッセイにおいてスクリーニングすることができる。
バシラス菌ライブラリーを、10μg/mlクロラムフェニコールを含むTY寒天平板上に置いた、酢酸セルロース(OE 67, Schleicher& Schuell, Dassel, Germany)とニトロセルロースフィルター(Protran-Ba 85, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany)のサンドイッチの上に37℃で少なくとも21時間置く。酢酸セルロース層をTY寒天平板上にのせる。
このアッセイは、次の変更の他は低pHフィルターアッセイと同じやり方で実施する:タンパク質が結合したフィルターを、様々なEDTA濃度(0.001 mM〜100 mM)で95℃, pH 6.0にて1時間インキュベートする。
・BAN /テルマミルハイブリッド* +H156Y +A181T +N190F + A209V +Q264S +E211Q
・BAN /テルマミルハイブリッド* +H156Y +A181T +N190F + A209V +Q264S +H205C
+D207Y +A210S
カルシウム−およびpH−依存型安定性の測定
一般に、工業的液化工程は、95〜105 ℃での安定性を高めるために40 ppmの遊離カルシウムの添加を伴ってそして液化pHとしてpH6.0-6.2 を使って行われる。ここに提案される置換のうちの幾つかは、
1.pH 6.2より低いpHおよび/または
2.40 ppmより低い遊離カルシウム濃度での安定性を高めるために実施した。
1.40 ppmの遊離カルシウムの存在下で、わずかに下げたpH(pH5.5)での安定性を測定する第一のアッセイ。(これにより、低pHでの安定性の向上が測定される。)10μg の変異体を次の条件下でインキュベートした:40 ppmカルシウムと5%w/w 汎用コーンスターチ(カルシウム不含有)を含む、pH 5.5にpH調整した0.1 M酢酸塩溶液。インキュベーションは95℃の湯浴中で30分間実施した。
2.遊離カルシウムの不在下でそしてpHをpH 6.2に維持した中で安定性を測定する第二のアッセイ。このアッセイはカルシウム感受性の減少を測定する。10μg の変異体を次の条件下でインキュベートした:5%w/w 汎用コーンスターチ(カルシウム不含有)を含む、pH 6.2にpH調整した0.1 M酢酸塩溶液。インキュベーションは95℃の湯浴中で30分間実施した。
3.第一アッセイと第二アッセイの条件を組み合わせた第三のアッセイ。このアッセイはカルシウムの不在下で且つ低pH(pH 5.5)での安定性を測定する。
4.pHを更にpH 5.0に下げた第三アッセイと同様の第四のアッセイ。
安定性試験1,2,3および4は全て同じ設定を使って行った。方法は以下の通りであった:
酵素を適切な条件(1〜4)下でインキュベートした。0,5,10, 15および30分目に試料を取り、アッセイ緩衝液(0.1 M 50mMBritton 緩衝液 pH 7.3)中に25倍希釈し(採取した試料全てについて同じ希釈度)、そして標準条件(pH 7.3, 37℃)においてPhadebasアッセイ(Pharmacia) を使って活性を測定した。
Phadebasアッセイ(Pharmacia) を使って、活性/mg酵素として比活性を測定した。活性は本明細書中の材料と方法の項目に記載したα−アミラーゼアッセイを使って測定した。
結果:
表8:安定性試験方法1/低pH安定性の向上
* *インキュベーション5分後に測定した値。同じ条件下で36%残余活性を示す野性型テルマミルと比較せよ。
上記表11中の変異体は、実施例2に記載の限局化ランダム変異誘発を使って作製した。
低pHおよび高温でのα−アミラーゼ安定性
この実施例は、2つの異なる条件:(1)pH 4.5で1 mM CaCl2および(2)pH 6.2で10μM CaCl2 のもとで、70℃にて蛍光アッセイにより特徴付けられた変異体の安定性結果を要約する。
全ての蛍光実験は4キュベットホルダーを使って Perkin-ElmerLS-50 蛍光光度計上で実施した。温度は循環水浴により制御し、Noronix Digital Thermometer (NTD 100型) を使ってキュベット中で直接測定した。測定の間、高攪拌速度で駆動する磁気攪拌器を使って、キュベット中の試薬の徹底的な混合を確保した。蒸発を最小限にするためにキュベットにテフロン(登録商標)の蓋をした。
(1) 50 mM NaOAc pH 4.5および1 mM CaCl2
(2) 50 mM NaOAc pH 6.2および10μM CaCl2
タンパク質濃度は5μg/mlであり、グリセロール濃度は 0.5%w/v であった(タンパク質原液から)。
それらの半時間値(t1/2 )から、次のようにして、テルマミルのものに比較した変性の自由エネルギーの変化を計算することができた:
(R*Tの値は0.5919であり、DDG値はキロカロリー/モルで与える)。
低pHおよび高温でのアミラーゼの変性(ほぐれ)は、Trp 蛍光の減衰により追跡することができる。pH 4.5および1 mM CaCl2では、全てのアミラーゼがかなり迅速に変性する。
増加した比活性を有するα−アミラーゼ変異体
この実施例は、野性型テルマミルに比較して増加した比活性を有することにより特徴付けられる変異体の結果を要約する。安定化する置換に加えた単一置換としてのまたは互いに組み合わせたこれらの置換の存在は、生成する変異体の比活性を増加させる。比活性は、「材料と方法」のところに記載したα−アミラーゼ(Phadebas)アッセイを使って測定し、活性/mg酵素として表した。下記記載の通り活性を測定した。ここでpHは7.3 、温度は37℃、試験時間は15分であり、そして緩衝液は明記した通りであった。
特定変異体の試験(糖化)
グルコアミラーゼおよびプルラナーゼを使って糖化する時、α−アミラーゼを糖化工程前に不活性化しなければ、液化工程からくる残余α−アミラーゼ活性の存在がグルコースの低収率を引き起こし得ることは以前に報告されている(米国特許第5,234,823 号)。この不活性化は典型的には、糖化に向けて温度を60℃に下げる前に、95℃でpHを4.3 より低く調整することにより行うことができる。
基質濃度 28.2% w/w
温度 60℃
初期pH(60℃で) 4.7
酵素用量
グルコアミラーゼ 0.18 AG/g DS
プルラナーゼ 0.06 PUN/g DS
α−アミラーゼ 60 NU/g DS
次の酵素を使った:
グルコアミラーゼ:AMG (Novo Nordisk) 153 AG/g
プルラナーゼ:Promozyme (Novo Nordisk) 295 PUN/g
α−アミラーゼ:Termamyl (Novo Nordisk) 135 KNU/g
V54Y 313 KNU/g
A52W 5,116 NU/ml
D53E 3,280 NU/ml
D53W 599 NU/ml
A52W+V54Y 134 NU/ml
模擬液化条件下でのB.リヘニフォルミス変異体の評価
工業的デンプン液化方法は、通常第一液化と第二液化と呼ばれる2工程を含んで成る。第一工程では、B.リヘニフォルミスまたはB.ステアロサーモフィラスからの耐熱性α−アミラーゼが添加されているpH 5.5〜6.0 の30〜40%(w/w) デンプンスラリーを、デンプン流中に新鮮蒸気を注入するジェットクッカ中で105 〜110 ℃に加熱する。この温度で加圧下で5〜10分間の保持時間後、液化したデンプンを約95℃にフラッシュ冷却し、そしてこの温度を60〜120分間維持する。
脱イオン水中の汎用コーンスターチ(Cerestar GL 3406)の懸濁液(約30% w/w)の10 gアリコートを、100 mlの三角フラスコ(Schott GL 125 )中に秤量し、それを締り嵌めスクリューキャップで締り嵌める。懸濁液中のpH、カルシウムレベルおよび酵素用量は変更することができる。
90分後に下記のDEが記録された。
Claims (23)
- 親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体であって、前記変異体はα−アミラーゼ活性を有し且つ前記親のα−アミラーゼと比較すると次の性質:基質特異性、基質結合、基質開裂パターン、熱安定性、pH/活性プロフィール、pH/安定性プロフィール、酸化に対する安定性、Ca2+依存性および比活性のうちの少なくとも1つの性質に変更を示し、前記変異体は配列番号2に示されるアミノ酸配列中に下記の変異の1つまたは複数に相当する1つまたは複数の変異:
・変異:A181E,D,Q,N,V; I201W,F,L を含む、I201(嵩張ったアミノ酸); Y203Q; Q9K,L,E; F11R,K,E; E12Q; D100N,L;
V101H,R,K,D,E,F; V102A,T; I103H,K; N104R,K,D;
H105R,K,D,E,W,F; L196R,K,D,E,F,Y; I212R,K,D,E; L230H,K,I;
A232G,H,F,S,V; V233D; K234L,E; I236R,K,N,H,D,E;
L241R,K,D,E,F; A260S; W263H; Q264R,D,K,E; N265K,R,D;
A269R,K,D,E; L270R,K,H,D,E; V283H,D; F284H; D285N,L;
V286R,K,D,E; Y290R,E,K; V312R,K,D,E; F323H; D325N;
N326K,H,D,L; H327Q,N,E,D,F; Q330L,F; G332D;
Q333R,K,H,E,L; S334A,V,T,L,I,D; L335G,A,S,T,N;
E336R+R375E; T337D,K; T338D,E; T339D; Q360K,R,E;
D365N;またはG371D,R ;
・H68, H91, H247, R305, K306, H382, K389, H405, H406, H450またはR483の位置における置換;
・変異:H140Y; H142Y; H159Y; H140D+H142R; H140K+H142D;またはH142Y+H156Y ;
・欠失:K370*+G371*+D372* またはD372*+S373*+Q374* を含む、T369からI377までの部分配列中の3アミノ酸の欠失;
・次の配列(配列番号は左から右に増加する):I-P-T-H-S-V; I-P-T-H-G-V; I-P-Q-Y-N-Iのうちの1つによる、T369からI377までの部分アミノ酸配列の置換;
・R169I,L,F,T またはR173I,L,F,T を含む、R169またはR173の位置における置換;
・変異:H156D; I201F; I212F; A209L,T; またはV208I ;
・N172R,H,K; A181T; N188P; N190L,F; H205C; D207Y; A209L,T,V; A210S; E211Q; Q264A,E,L,K,S,T; N265A,S,T,Y; または
Q264S+N265Y を含む、N172, A181, N188, N190, H205, D207, A209, A210, E211, Q264またはN265の位置における置換;
・変異:
H156Y+A181T+A209V ;
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S ;
A1*+N2*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+
H35I+H156Y+A181T+A209V;
A1*+N2*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+
H35I+H156Y+A181T+N190F+A209V ; または
A1*+N2*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+
H35I+H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S
を含んで成る変異体。 - 親のテルマミル様α−アミラーゼに比較して高められた、低pHおよび低Ca2+濃度での安定性を示し、且つ次の変異:
H156Y+A181T+A209V ;
H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S ;
A1*+N2*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+
H35I+H156Y+A181T+A209V;
A1*+N2*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+
H35I+H156Y+A181T+N190F+A209V ; または
A1*+N2*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+
H35I+H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S
から選ばれた変異を含んで成る、請求項1に記載の変異体。 - 前記親のテルマミル様α−アミラーゼが、
配列番号2に示される配列を有するB.リヘニフォルミスα−アミラーゼ;
配列番号4に示される配列を有するB.アミロリクファシエンスα−アミラーゼ;
配列番号6に示される配列を有するB.ステアロサーモフィラスα−アミラーゼ;
図1および2に示される配列を有するバシラスNCIB 12512株α−アミラーゼ;
図2に示される配列を有するバシラスNCIB 12513株α−アミラーゼ;および
図2に示される配列を有するバシラス種 #707 α−アミラーゼ
から選ばれる、請求項1または2に記載の変異体。 - 請求項1〜3のいずれか一項に記載のα−アミラーゼ変異体をコードするDNA配列を含んで成る、DNA構成物。
- 請求項4に記載のDNA構成物を担持する組換え発現ベクター。
- 請求項4に記載のDNA構成物または請求項5に記載のベクターにより形質転換されている細胞。
- 微生物である、請求項6に記載の細胞。
- 細菌または真菌である、請求項6に記載の細胞。
- グラム陽性菌、例えばバシラス・サチリス(Bacillus subtilis)、バシラス・リヘニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バシラス・レンタス(Bacillus lentus)、バシラス・ブレビス(Bacillus brevis)、バシラス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)、バシラス・アルカロフィラス(Bacillus alkalophilus)、バシラス・アミロリクファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バシラス・コアギュランス(Bacillus coagulans)、バシラス・サーキュランス(Bacillus circulans)、バシラス・ロータス(Bacillus lautus)またはバシラス・スリンジエンシス(Bacillus thuringiensis)である、請求項8に記載の細胞。
- 洗浄および/または食器洗いのための、請求項1〜3のいずれか一項に記載のα−アミラーゼ変異体の使用。
- 織物デサイジングのための、請求項1〜3のいずれか一項に記載のα−アミラーゼ変異体の使用。
- デンプン液化のための、請求項1〜3のいずれか一項に記載のα−アミラーゼ変異体の使用。
- 場合により無塵性粉末、安定化液体または保護酵素の形で請求項1〜3のいずれか一項に記載のα−アミラーゼ変異体を含んで成る洗剤添加剤。
- 添加剤1gあたり0.02〜200 mgの酵素タンパク質を含有する、請求項13に記載の洗剤添加剤。
- 別の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、別のデンプン分解酵素および/またはセルラーゼを更に含んで成る、請求項13または14に記載の洗剤添加剤。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載のα−アミラーゼ変異体を含んで成る洗剤組成物。
- 別の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、別のデンプン分解酵素および/またはセルラーゼを更に含んで成る、請求項16に記載の洗剤組成物。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載のα−アミラーゼ変異体を含んで成る手動または自動食器洗い用洗剤組成物。
- 別の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、別のデンプン分解酵素および/またはセルラーゼを更に含んで成る、請求項18に記載の食器洗い用洗剤組成物。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載のα−アミラーゼ変異体を含んで成る手動または自動洗濯用洗剤組成物。
- 別の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、別のデンプン分解酵素および/またはセルラーゼを更に含んで成る、請求項20に記載の洗濯用洗剤組成物。
- 下記のもの:
(i) 配列番号2に示される配列を有するB.リヘニフォルミスからのα−アミラーゼと、配列番号6に示される配列を有するB.ステアロサーモフィラスα−アミラーゼ(親のテルマミル様α−アミラーゼとして)に由来する本発明の1または複数の変異体との混合物;
(ii) 配列番号6に示される配列を有するB.ステアロサーモフィラスからのα−アミラーゼと、1または複数の別の親のテルマミル様α−アミラーゼに由来する1または複数の本発明の変異体との混合物;または
(iii) 配列番号6に示される配列を有するB.ステアロサーモフィラスα−アミラーゼ(親のテルマミル様α−アミラーゼとして)に由来する1または複数の本発明の変異体と、1または複数の別の親のテルマミル様α−アミラーゼに由来する1または複数の本発明の変異体との混合物
を含んで成る組成物。 - 親のテルマミル様α−アミラーゼの変異体の作製方法であって、前記変異体は親のα−アミラーゼと比較して高められた低pHおよび低カルシウム濃度での安定性を示し、
(a) 親のテルマミル様α−アミラーゼをコードするDNA配列をランダム変異誘発にかけ、
(b) 段階(a)で得られた変異型DNA配列を宿主細胞中で発現せしめ、そして
(c) 親のα−アミラーゼに比較して高められた低pHおよび低カルシウム濃度での安定性を有する変異型α−アミラーゼを発現する宿主細胞についてスクリーニングする
ことを含んで成る方法。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DK51596 | 1996-04-30 | ||
DK71296 | 1996-06-28 | ||
DK77596 | 1996-07-11 | ||
DK126396 | 1996-11-08 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP53837397A Division JP4290763B2 (ja) | 1996-04-30 | 1997-04-30 | α―アミラーゼ変異体 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009072204A true JP2009072204A (ja) | 2009-04-09 |
JP4580012B2 JP4580012B2 (ja) | 2010-11-10 |
Family
ID=27439333
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP53837397A Expired - Lifetime JP4290763B2 (ja) | 1996-04-30 | 1997-04-30 | α―アミラーゼ変異体 |
JP2008308503A Expired - Lifetime JP4580012B2 (ja) | 1996-04-30 | 2008-12-03 | α−アミラーゼ変異体 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP53837397A Expired - Lifetime JP4290763B2 (ja) | 1996-04-30 | 1997-04-30 | α―アミラーゼ変異体 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (10) | US6143708A (ja) |
EP (1) | EP0904360B1 (ja) |
JP (2) | JP4290763B2 (ja) |
CN (1) | CN1246455C (ja) |
AU (1) | AU2692897A (ja) |
BR (1) | BR9708887B1 (ja) |
DK (1) | DK0904360T3 (ja) |
ES (1) | ES2432519T3 (ja) |
WO (1) | WO1997041213A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017505129A (ja) * | 2014-02-07 | 2017-02-16 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | グルコースシロップ生産用組成物 |
Families Citing this family (224)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6440716B1 (en) * | 1995-02-03 | 2002-08-27 | Novozymes A/S | α-amylase mutants |
CA2247501A1 (en) * | 1996-03-07 | 1997-09-12 | The Procter & Gamble Company | Detergent compositions comprising improved amylases |
AU2692897A (en) * | 1996-04-30 | 1997-11-19 | Novo Nordisk A/S | Alpha-amylase mutants |
US6211134B1 (en) * | 1996-05-14 | 2001-04-03 | Genecor International, Inc. | Mutant α-amylase |
US6080568A (en) * | 1997-08-19 | 2000-06-27 | Genencor International, Inc. | Mutant α-amylase comprising modification at residues corresponding to A210, H405 and/or T412 in Bacillus licheniformis |
US6361989B1 (en) | 1997-10-13 | 2002-03-26 | Novozymes A/S | α-amylase and α-amylase variants |
EP1023439B1 (en) * | 1997-10-13 | 2009-02-18 | Novozymes A/S | alpha-AMYLASE MUTANTS |
CA2845178A1 (en) | 1997-10-30 | 1999-05-14 | Novozymes A/S | .alpha.-amylase mutants |
US6876932B1 (en) | 1998-02-27 | 2005-04-05 | Novozymes A/S | Maltogenic alpha-amylase variants |
CN1292028B (zh) * | 1998-02-27 | 2013-08-14 | 诺维信公司 | 麦芽α淀粉酶变体 |
WO1999046399A1 (en) * | 1998-03-09 | 1999-09-16 | Novo Nordisk A/S | Enzymatic preparation of glucose syrup from starch |
US6287826B1 (en) * | 1998-03-09 | 2001-09-11 | Novo Nordisk A/S | Enzymatic preparation of glucose syrup from starch |
US6887986B1 (en) | 1998-11-16 | 2005-05-03 | Novozymes A/S | α-amylase variants |
US6197565B1 (en) * | 1998-11-16 | 2001-03-06 | Novo-Nordisk A/S | α-Amylase variants |
DK1165762T3 (da) * | 1999-03-30 | 2007-09-03 | Novozymes As | Alpha-amylase varianter |
US6410295B1 (en) | 1999-03-30 | 2002-06-25 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants |
EP1067181A1 (en) * | 1999-06-10 | 2001-01-10 | Rijksuniversiteit te Groningen | Enzyme selection |
WO2001034784A1 (en) * | 1999-11-10 | 2001-05-17 | Novozymes A/S | Fungamyl-like alpha-amylase variants |
US7005288B1 (en) | 1999-11-10 | 2006-02-28 | Novozymes A/S | Fungamyl-like alpha-amylase variants |
JP5571274B2 (ja) * | 2000-03-08 | 2014-08-13 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | 改変された特性を有する変異体 |
WO2001088107A2 (en) * | 2000-05-12 | 2001-11-22 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants with altered 1,6-activity |
DZ3349A1 (fr) * | 2000-07-28 | 2002-02-07 | Henkel Kgaa | Nouvelle enzyme amylolytique issue de bacillus sp. a 7-7 (dsm 12368) ainsi que produits de lavage et nettoyage contenant ledit enzyme amylolytique |
WO2002010355A2 (en) * | 2000-08-01 | 2002-02-07 | Novozymes A/S | Alpha-amylase mutants with altered stability |
US20020155574A1 (en) * | 2000-08-01 | 2002-10-24 | Novozymes A/S | Alpha-amylase mutants with altered properties |
JP4426716B2 (ja) * | 2000-10-11 | 2010-03-03 | 花王株式会社 | 高生産性α−アミラーゼ |
EP1975229A3 (en) * | 2000-10-13 | 2009-03-18 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variant with altered properties |
AU2002210380A1 (en) * | 2000-10-13 | 2002-04-22 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variant with altered properties |
DE60234523D1 (de) * | 2001-05-15 | 2010-01-07 | Novozymes As | Alpha-amylasevariante mit veränderten eigenschaften |
DE10138753B4 (de) * | 2001-08-07 | 2017-07-20 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Wasch- und Reinigungsmittel mit Hybrid-Alpha-Amylasen |
US20040063184A1 (en) | 2002-09-26 | 2004-04-01 | Novozymes North America, Inc. | Fermentation processes and compositions |
EP2500423B1 (en) | 2003-02-26 | 2015-06-17 | Danisco US Inc. | Amylases producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same |
CN102277341B (zh) | 2003-03-10 | 2015-07-22 | 诺维信公司 | 酒精产品生产方法 |
CN100506997C (zh) | 2003-05-30 | 2009-07-01 | 诺维信公司 | 酒精产品生产方法 |
US20040253696A1 (en) | 2003-06-10 | 2004-12-16 | Novozymes North America, Inc. | Fermentation processes and compositions |
ES2425351T3 (es) | 2003-06-25 | 2013-10-14 | Novozymes A/S | Polipéptidos que tienen actividad de alfa-amilasa y polinucleótidos que codifican los mismos |
JP2007509630A (ja) | 2003-10-28 | 2007-04-19 | ノボザイムス ノース アメリカ,インコーポレイティド | ハイブリッド酵素 |
WO2005111203A2 (en) * | 2004-04-08 | 2005-11-24 | Genencor International, Inc. | MUTANT α ΑMYLASES |
US7332319B2 (en) * | 2004-05-27 | 2008-02-19 | Genencor International, Inc. | Heterologous alpha amylase expression in Aspergillus |
DK1781790T3 (en) | 2004-07-05 | 2016-01-18 | Novozymes As | ALFA-amylase variants WITH CHANGED PROPERTIES |
DE102004047777B4 (de) | 2004-10-01 | 2018-05-09 | Basf Se | Alpha-Amylase-Varianten mit erhöhter Lösungsmittelstabilität, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung |
DE102004047776B4 (de) | 2004-10-01 | 2018-05-09 | Basf Se | Gegen Di- und/oder Multimerisierung stabilisierte Alpha-Amylase-Varianten, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung |
JP4190479B2 (ja) * | 2004-10-22 | 2008-12-03 | ライオン株式会社 | アミラーゼ含有粒状洗剤組成物 |
EP1811863B1 (en) * | 2004-10-22 | 2012-09-12 | Cargill, Incorporated | Process for the production of maltodextrins |
ES2543131T3 (es) | 2004-12-22 | 2015-08-14 | Novozymes North America, Inc. | Enzimas para tratamiento de almidón |
US20060147581A1 (en) | 2004-12-22 | 2006-07-06 | Novozymes A/S | Hybrid enzymes |
ATE530643T1 (de) * | 2004-12-30 | 2011-11-15 | Genencor Int | Säureaktive fungale protease |
BRPI0611932A2 (pt) * | 2005-06-24 | 2011-01-04 | Novozymes As | amilase, uso da mesma, composição farmacêutica, e, método para o tratamento de uma doença |
EP1941049A4 (en) | 2005-09-20 | 2011-12-21 | Novozymes North America Inc | PROCESS FOR PRODUCING A FERMENTATION PRODUCT |
US20080318284A1 (en) | 2005-12-22 | 2008-12-25 | Novozymes North America, Inc. | Processes for Producing a Fermentation Product |
CN101405397A (zh) | 2006-03-22 | 2009-04-08 | 诺维信北美公司 | 发酵方法 |
US7968318B2 (en) | 2006-06-06 | 2011-06-28 | Genencor International, Inc. | Process for conversion of granular starch to ethanol |
US7629158B2 (en) | 2006-06-16 | 2009-12-08 | The Procter & Gamble Company | Cleaning and/or treatment compositions |
US20090226564A1 (en) * | 2006-06-30 | 2009-09-10 | Novozymes A/S | Bacterial alpha-amylase variants |
CA2681328C (en) | 2007-03-14 | 2015-10-06 | Danisco Us Inc. | Production of ethanol from barley and ddgs containing reduced beta-glucan and phytic acid |
BRPI0809096A2 (pt) | 2007-03-23 | 2014-09-09 | Danisco Us Inc Genecor Division | Produção aumentada de amilase através da adição n-terminal à proteína amilase madura |
US10023881B2 (en) | 2007-04-24 | 2018-07-17 | Novozymes A/S | Detoxifying pre-treated lignocellulose-containing materials |
ES2425596T3 (es) | 2007-09-03 | 2013-10-16 | Novozymes A/S | Detoxificación y reciclaje de soluciones de lavado utilizadas en el pretratamiento de materiales con contenido de lignocelulosa |
US8206966B2 (en) * | 2007-11-05 | 2012-06-26 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase variants with altered properties |
JP2011510665A (ja) * | 2008-02-04 | 2011-04-07 | ダニスコ・ユーエス・インク | バチルス・ステアロテルモフィルスアルファ・アミラーゼの変異種とその用途 |
WO2009134670A2 (en) * | 2008-04-30 | 2009-11-05 | Danisco Us Inc., Genencor Division | New chimeric alpha-amylase variants |
EP2364363A2 (en) | 2008-06-23 | 2011-09-14 | Novozymes A/S | Processes for producing fermentation products |
WO2010036515A1 (en) | 2008-09-25 | 2010-04-01 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase blends and methods for using said blends |
DK2344650T3 (da) | 2008-09-30 | 2014-07-14 | Novozymes North America Inc | Forbedring af enzymatisk hydrolyse af forbehandlet lignocelluloseholdigt materiale med distillers dried grain med solubles (ddg/s) |
EP2346978A2 (en) | 2008-10-15 | 2011-07-27 | Novozymes A/S | Brewing process |
WO2010059413A2 (en) | 2008-11-20 | 2010-05-27 | Novozymes, Inc. | Polypeptides having amylolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same |
WO2010074999A1 (en) | 2008-12-15 | 2010-07-01 | Danisco Us Inc. | Hybrid alpha-amylases |
US20120028299A1 (en) | 2008-12-30 | 2012-02-02 | Novozymes North America, Inc. | Enzymatic Hydrolysis Of Pretreated Lignocellulose-Containing Material With Dissolved Air Flotation Sludge |
WO2010078392A2 (en) | 2008-12-31 | 2010-07-08 | Novozymes North America, Inc. | Processes of producing fermentation products |
JP5558490B2 (ja) | 2009-01-19 | 2014-07-23 | バイエル・クロップサイエンス・アーゲー | 環状ジオンならびに殺虫剤、殺ダニ剤および/または殺真菌剤としてのその使用 |
EP2216393B1 (en) * | 2009-02-09 | 2024-04-24 | The Procter & Gamble Company | Detergent composition |
CN102421911B (zh) * | 2009-05-12 | 2016-05-25 | 丹尼斯科美国公司 | 以改良的液化方法发酵的乙醇产量 |
WO2011000924A1 (en) | 2009-07-03 | 2011-01-06 | Abbott Products Gmbh | Spray-dried amylase, pharmaceutical preparations comprising the same and use |
DK2454590T3 (en) | 2009-07-17 | 2016-12-05 | Novozymes As | A method of analysis of cellulose degradation by hydrolysis of the cellulose-containing material |
CA2771071C (en) | 2009-08-07 | 2020-03-10 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase blend for starch processing and method of use thereof |
US20110091938A1 (en) * | 2009-10-20 | 2011-04-21 | Grain Processing Corporation | Starch Hydrolysis |
CA2782128C (en) | 2009-11-30 | 2019-01-15 | Novozymes A/S | Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same |
WO2011066576A1 (en) | 2009-11-30 | 2011-06-03 | Novozymes A/S | Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same |
AU2010276471B2 (en) | 2009-12-01 | 2015-05-14 | Novozymes A/S | Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same |
WO2011076123A1 (en) | 2009-12-22 | 2011-06-30 | Novozymes A/S | Compositions comprising boosting polypeptide and starch degrading enzyme and uses thereof |
CN102884197A (zh) | 2010-01-29 | 2013-01-16 | 诺维信公司 | 具有酶预处理的沼气生产方法 |
WO2011100161A1 (en) | 2010-02-09 | 2011-08-18 | Novozymes North America, Inc. | Addition of alpha - glucosidase and cobalt for producing fermentation products from starch |
US8883456B2 (en) | 2010-03-30 | 2014-11-11 | Novozymes North America, Inc. | Processes of producing a fermentation product |
ES2565060T3 (es) | 2010-04-14 | 2016-03-31 | Novozymes A/S | Polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa y polinucleótidos que codifican los mismos |
CN103140586A (zh) | 2010-08-02 | 2013-06-05 | 诺维信北美公司 | 产生发酵产物的方法 |
EP2637515B1 (en) | 2010-11-08 | 2017-09-06 | Novozymes A/S | Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same |
CN103298932B (zh) | 2010-11-08 | 2016-08-10 | 诺维信公司 | 具有葡糖淀粉酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸 |
BR112013012357A2 (pt) | 2010-11-19 | 2016-10-11 | Novozymes North America Inc | processos de produzir um produto de fermentação, de produzir um açúcar, de produzir uma dextrina e de produzir sacarose, e, composição |
WO2012093041A1 (en) | 2011-01-04 | 2012-07-12 | Novozymes A/S | Process for producing biogas from pectin and lignocellulose containing material |
WO2012109119A2 (en) | 2011-02-07 | 2012-08-16 | Novozymes North America, Inc. | Process of producing a fermentation product |
BR112013027582A2 (pt) | 2011-04-29 | 2017-02-14 | Danisco Us Inc Genencor Div | uso de celulase e glicoamilase para aprimorar os rendimentos de etanol de fermentação |
WO2013000945A1 (en) | 2011-06-28 | 2013-01-03 | Novozymes A/S | Biogas from enzyme-treated bagasse |
EP2540824A1 (en) * | 2011-06-30 | 2013-01-02 | The Procter & Gamble Company | Cleaning compositions comprising amylase variants reference to a sequence listing |
KR20140056237A (ko) | 2011-06-30 | 2014-05-09 | 노보자임스 에이/에스 | 알파-아밀라제 변이체 |
CA2840962C (en) | 2011-07-06 | 2021-04-13 | Novozymes A/S | Alpha amylase variants and polynucleotides encoding same |
BR112013032861A2 (pt) | 2011-07-22 | 2017-01-24 | Novozymes North America Inc | métodos para aumentar a atividade da enzima celulolítica durante a hidrólise do material celulósico, para hidrolisar um material celulósico pré-tratado, para a produção de um produto da fermentação, e para a fermentação de um material celulósico pré-tratado |
EP2748188A4 (en) | 2011-08-26 | 2015-03-18 | Novozymes As | POLYPEPTIDES HAVING GLUCOAMYLASE ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING THESE POLYPEPTIDES |
US9534239B2 (en) | 2011-09-06 | 2017-01-03 | Novozymes A/S | Glucoamylase variants and polynucleotides encoding same |
EP2766476B1 (en) | 2011-10-11 | 2017-05-31 | Novozymes A/S | Glucoamylase variants and polynucleotides encoding same |
MX353581B (es) | 2011-10-11 | 2018-01-19 | Novozymes North America Inc | Procesos para producir productos de fermentacion. |
ES2644727T3 (es) | 2011-12-02 | 2017-11-30 | Novozymes A/S | Proceso de licuefacción con alfa-amilasas y proteasas seleccionadas |
WO2013083801A2 (en) | 2011-12-09 | 2013-06-13 | Novozymes A/S | Biogas from substrates comprising animal manure and enzymes |
US20150017670A1 (en) | 2011-12-21 | 2015-01-15 | Novozymes, Inc. | Methods For Determining The Degradation Of A Biomass Material |
EP2859110B1 (en) | 2012-03-30 | 2022-10-26 | Novozymes North America, Inc. | Processes of producing fermentation products |
RU2014150072A (ru) | 2012-05-11 | 2016-07-10 | Новозимс А/С | Способ пивоварения |
ES2909509T3 (es) * | 2012-06-08 | 2022-05-06 | Danisco Us Inc | Variante de alfa-amilasas con mayor actividad en polímeros de almidón |
EP2785746B1 (en) | 2012-08-09 | 2016-10-12 | Cargill, Incorporated | Process for starch liquefaction |
EP2884852B1 (en) | 2012-08-17 | 2019-05-15 | Novozymes A/S | Thermostable asparaginase variants and polynucleotides encoding same |
EP3321353A1 (en) | 2012-12-11 | 2018-05-16 | Danisco US Inc. | Yeast host cells epxressing a glucoamylase from aspergillus fumigatus and methods of use thereof |
WO2014106593A1 (en) * | 2013-01-03 | 2014-07-10 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same |
CN105229147B (zh) | 2013-03-11 | 2020-08-11 | 丹尼斯科美国公司 | α-淀粉酶组合变体 |
MX2015014257A (es) * | 2013-04-10 | 2016-03-01 | Novozymes As | Proceso para la preparacion de azucares y jarabes. |
BR112015026972B1 (pt) | 2013-04-30 | 2023-05-02 | Novozymes A/S | Variantes de glucoamilase, composição, uso de um polipeptídeo, processo de produção de um produto de fermentação e processo de produção de um produto de xarope a partir de material contendo amido |
US9963690B2 (en) | 2013-04-30 | 2018-05-08 | Novozymes A/S | Glucoamylase variants and polynucleotides encoding same |
EP3004341B1 (en) | 2013-05-29 | 2017-08-30 | Danisco US Inc. | Novel metalloproteases |
US20160160202A1 (en) | 2013-05-29 | 2016-06-09 | Danisco Us Inc. | Novel metalloproteases |
JP6367930B2 (ja) | 2013-05-29 | 2018-08-01 | ダニスコ・ユーエス・インク | 新規メタロプロテアーゼ |
EP3110833B1 (en) | 2013-05-29 | 2020-01-08 | Danisco US Inc. | Novel metalloproteases |
ES2651106T3 (es) | 2013-06-26 | 2018-01-24 | Novozymes A/S | Proceso de fabricación de una composición de pienso |
HUE040545T2 (hu) | 2013-07-17 | 2019-03-28 | Novozymes As | Pullulanáz kimérák és az azokat kódoló polinukleotidok |
EP3063282B1 (en) | 2013-09-11 | 2020-03-25 | Novozymes A/S | Processes for producing fermentation products |
WO2015057517A1 (en) | 2013-10-17 | 2015-04-23 | Danisco Us Inc. | Use of hemicellulases to improve ethanol production |
EP3553173B1 (en) | 2013-12-13 | 2021-05-19 | Danisco US Inc. | Serine proteases of the bacillus gibsonii-clade |
ES2723948T3 (es) | 2013-12-13 | 2019-09-04 | Danisco Us Inc | Serina proteasas procedentes de especies de Bacillus |
US10005850B2 (en) | 2013-12-16 | 2018-06-26 | E I Du Pont De Nemours And Company | Use of poly alpha-1,3-glucan ethers as viscosity modifiers |
CN106029700B (zh) | 2013-12-18 | 2019-04-12 | 纳幕尔杜邦公司 | 阳离子聚α-1,3-葡聚糖醚 |
CN105829531A (zh) * | 2013-12-20 | 2016-08-03 | 诺维信公司 | α-淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸 |
DK3415624T3 (da) | 2014-01-22 | 2021-11-08 | Novozymes As | Pullulanasevarianter og polynukleotider, som koder for dem |
CN105992796A (zh) | 2014-02-14 | 2016-10-05 | 纳幕尔杜邦公司 | 用于粘度调节的聚-α-1,3-1,6-葡聚糖 |
JP2017515921A (ja) | 2014-03-11 | 2017-06-15 | イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニーE.I.Du Pont De Nemours And Company | 酸化されたポリα−1,3−グルカン |
WO2015143144A1 (en) | 2014-03-19 | 2015-09-24 | Novozymes A/S | Method for enhancing activity of an x143 polypeptide |
US20170096653A1 (en) | 2014-03-21 | 2017-04-06 | Danisco Us Inc. | Serine proteases of bacillus species |
US9714403B2 (en) | 2014-06-19 | 2017-07-25 | E I Du Pont De Nemours And Company | Compositions containing one or more poly alpha-1,3-glucan ether compounds |
EP3919599A1 (en) | 2014-06-19 | 2021-12-08 | Nutrition & Biosciences USA 4, Inc. | Compositions containing one or more poly alpha-1,3-glucan ether compounds |
US20170233710A1 (en) | 2014-10-17 | 2017-08-17 | Danisco Us Inc. | Serine proteases of bacillus species |
EP3209788B1 (en) | 2014-10-23 | 2019-06-05 | Novozymes A/S | Glucoamylase variants and polynucleotides encoding same |
EP3212662B1 (en) | 2014-10-27 | 2020-04-08 | Danisco US Inc. | Serine proteases |
WO2016069557A1 (en) | 2014-10-27 | 2016-05-06 | Danisco Us Inc. | Serine proteases of bacillus species |
EP3212783B1 (en) | 2014-10-27 | 2024-06-26 | Danisco US Inc. | Serine proteases |
EP3550017B1 (en) | 2014-10-27 | 2021-07-14 | Danisco US Inc. | Serine proteases |
EP3212781B1 (en) | 2014-10-27 | 2019-09-18 | Danisco US Inc. | Serine proteases |
WO2016106011A1 (en) | 2014-12-23 | 2016-06-30 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Enzymatically produced cellulose |
EP3872174B1 (en) | 2015-05-13 | 2023-03-01 | Danisco US Inc. | Aprl-clade protease variants and uses thereof |
WO2016201040A1 (en) | 2015-06-09 | 2016-12-15 | Danisco Us Inc. | Water-triggered enzyme suspension |
ES2962329T3 (es) | 2015-06-09 | 2024-03-18 | Danisco Us Inc | Encapsulados de estallido osmótico |
WO2016201069A1 (en) | 2015-06-09 | 2016-12-15 | Danisco Us Inc | Low-density enzyme-containing particles |
CN107849549B (zh) | 2015-06-17 | 2024-04-05 | 丹尼斯科美国公司 | 吉氏芽孢杆菌进化枝丝氨酸蛋白酶 |
WO2016205127A1 (en) | 2015-06-18 | 2016-12-22 | Novozymes A/S | Polypeptides having trehalase activity and the use thereof in process of producing fermentation products |
EP3371307A1 (en) | 2015-11-05 | 2018-09-12 | Danisco US Inc. | Paenibacillus and bacillus spp. mannanases |
WO2017079751A1 (en) | 2015-11-05 | 2017-05-11 | Danisco Us Inc | Paenibacillus sp. mannanases |
JP2019504932A (ja) | 2015-11-13 | 2019-02-21 | イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニーE.I.Du Pont De Nemours And Company | 洗濯ケアおよび織物ケアにおいて使用するためのグルカン繊維組成物 |
JP7045313B2 (ja) | 2015-11-13 | 2022-03-31 | ニュートリション・アンド・バイオサイエンシーズ・ユーエスエー・フォー,インコーポレイテッド | 洗濯ケアおよび織物ケアにおいて使用するためのグルカン繊維組成物 |
US10876074B2 (en) | 2015-11-13 | 2020-12-29 | Dupont Industrial Biosciences Usa, Llc | Glucan fiber compositions for use in laundry care and fabric care |
BR112018011755A2 (pt) | 2015-12-09 | 2018-12-04 | Danisco Us Inc | variantes combinatórias de alfa-amilase |
WO2017106676A1 (en) | 2015-12-18 | 2017-06-22 | Danisco Us Inc | Polypeptides with endoglucanase activity and uses thereof |
WO2017112540A1 (en) | 2015-12-22 | 2017-06-29 | Novozymes A/S | Processes for producing fermentation products |
DK179660B1 (en) | 2016-04-08 | 2019-03-13 | Novozymes A/S | Stabilized Alpha-Amylase Variants and use of the same |
EP3452585A1 (en) | 2016-05-03 | 2019-03-13 | Danisco US Inc. | Protease variants and uses thereof |
EP3241891B1 (en) | 2016-05-03 | 2019-04-03 | The Procter and Gamble Company | Automatic dishwashing detergent composition |
BR112018072586A2 (pt) | 2016-05-05 | 2019-02-19 | Danisco Us Inc | variantes de protease e usos das mesmas |
CN109477112A (zh) | 2016-05-31 | 2019-03-15 | 丹尼斯科美国公司 | 蛋白酶变体及其用途 |
BR112018075933A2 (pt) | 2016-06-17 | 2019-10-01 | Danisco Us Inc | variantes de protease e usos das mesmas |
CN106086048B (zh) * | 2016-08-16 | 2019-11-15 | 吉林大学 | 一种耐酸性高温α-淀粉酶及其基因、工程菌和制备方法 |
EP3535365A2 (en) | 2016-11-07 | 2019-09-11 | Danisco US Inc. | Laundry detergent composition |
WO2018098381A1 (en) | 2016-11-23 | 2018-05-31 | Novozymes A/S | Improved yeast for ethanol production |
WO2018118917A1 (en) | 2016-12-21 | 2018-06-28 | Danisco Us Inc. | Protease variants and uses thereof |
EP4212622A3 (en) | 2016-12-21 | 2023-11-29 | Danisco US Inc. | Bacillus gibsonii-clade serine proteases |
CN110699337B (zh) * | 2017-01-16 | 2023-02-17 | 广东溢多利生物科技股份有限公司 | 提高比活的α-淀粉酶突变体BasAmy-4及其编码基因和应用 |
ES2965826T3 (es) * | 2017-02-01 | 2024-04-17 | Procter & Gamble | Composiciones limpiadoras que comprenden variantes de amilasa |
EP3583210B1 (en) | 2017-03-15 | 2021-07-07 | Danisco US Inc. | Trypsin-like serine proteases and uses thereof |
US20200040283A1 (en) | 2017-03-31 | 2020-02-06 | Danisco Us Inc | Delayed release enzyme formulations for bleach-containing detergents |
US20210095268A1 (en) | 2017-03-31 | 2021-04-01 | Danisco Us Inc | Alpha-amylase combinatorial variants |
CN110730824A (zh) | 2017-06-02 | 2020-01-24 | 诺维信公司 | 用于乙醇生产的改善的酵母 |
MX2019014889A (es) | 2017-06-28 | 2020-02-13 | Novozymes As | Polipeptidos que tienen actividad trehalasa y polinucleotidos que los codifican. |
JP2020527339A (ja) | 2017-06-30 | 2020-09-10 | ダニスコ・ユーエス・インク | 低凝集の酵素含有粒子 |
BR112020002115A2 (pt) | 2017-08-08 | 2020-08-11 | Novozymes A/S | polipeptídeo variante de trealase, polinucleotídeo, construto de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, composição, formulação de caldo inteiro ou composição de cultura de células, método de produção de uma variante de trealase, e, processo de produção de um produto de fermentação |
RU2020111041A (ru) | 2017-08-18 | 2021-09-20 | ДАНИСКО ЮЭс ИНК | Варианты альфа-амилаз |
BR112020004476A2 (pt) | 2017-09-15 | 2020-09-08 | Novozymes A/S | processo para produção de um produto de fermentação, e, uso de uma combinação de enzimas |
BR112020007814A2 (pt) | 2017-10-23 | 2020-10-20 | Novozymes A/S | processos para reduzir e/ou prevenir um aumento nos níveis de ácido lático em um sistema de fermentação de biocombustível e para produção de um produto de fermentação a partir de um material contendo amido, e, uso de um polipeptídeo, ou uma composição enzimática |
EP3717643A1 (en) | 2017-11-29 | 2020-10-07 | Danisco US Inc. | Subtilisin variants having improved stability |
CA3086202A1 (en) | 2017-12-21 | 2019-06-27 | Danisco Us Inc. | Enzyme-containing, hot-melt granules comprising a thermotolerant desiccant |
CA3089135A1 (en) | 2018-01-29 | 2019-08-01 | Novozymes A/S | Microorganisms with improved nitrogen utilization for ethanol production |
US20200359656A1 (en) | 2018-02-08 | 2020-11-19 | Danisco Us Inc. | Thermally-resistant wax matrix particles for enzyme encapsulation |
AU2019222480A1 (en) | 2018-02-15 | 2020-10-08 | Microbiogen Pty. Ltd. | Improved yeast for ethanol production |
US20210198618A1 (en) | 2018-05-31 | 2021-07-01 | Novozymes A/S | Processes for enhancing yeast growth and productivity |
WO2019245705A1 (en) | 2018-06-19 | 2019-12-26 | Danisco Us Inc | Subtilisin variants |
US20210214703A1 (en) | 2018-06-19 | 2021-07-15 | Danisco Us Inc | Subtilisin variants |
EP3827088A1 (en) | 2018-07-25 | 2021-06-02 | Novozymes A/S | Enzyme-expressing yeast for ethanol production |
WO2020028443A1 (en) | 2018-07-31 | 2020-02-06 | Danisco Us Inc | Variant alpha-amylases having amino acid substitutions that lower the pka of the general acid |
US20210189295A1 (en) | 2018-08-30 | 2021-06-24 | Danisco Us Inc | Enzyme-containing granules |
CN113166682A (zh) | 2018-09-27 | 2021-07-23 | 丹尼斯科美国公司 | 用于医疗器械清洁的组合物 |
MX2021003955A (es) | 2018-10-08 | 2021-05-27 | Novozymes As | Levadura que expresa enzimas para la produccion de etanol. |
CA3116128A1 (en) | 2018-10-12 | 2020-04-16 | Danisco Us Inc | Alpha-amylases with mutations that improve stability in the presence of chelants |
US20230028935A1 (en) | 2018-11-28 | 2023-01-26 | Danisco Us Inc | Subtilisin variants having improved stability |
EP3918060A1 (en) | 2019-01-31 | 2021-12-08 | Novozymes A/S | Polypeptides having xylanase activity and use thereof for improving the nutritional quality of animal feed |
EP3947701A1 (en) | 2019-04-02 | 2022-02-09 | Novozymes A/S | Process for producing a fermentation product |
CN114174504A (zh) | 2019-05-24 | 2022-03-11 | 丹尼斯科美国公司 | 枯草杆菌蛋白酶变体和使用方法 |
EP3980517A1 (en) | 2019-06-06 | 2022-04-13 | Danisco US Inc. | Methods and compositions for cleaning |
EP4004029A1 (en) | 2019-07-26 | 2022-06-01 | Novozymes A/S | Microorganisms with improved nitrogen transport for ethanol production |
AR119596A1 (es) | 2019-08-05 | 2021-12-29 | Novozymes As | Mezclas de enzimas y procesos para producir un ingrediente alimenticio de alto contenido proteico a partir de un subproducto de la vinaza entera |
US20220307036A1 (en) | 2019-08-06 | 2022-09-29 | Novozymes A/S | Fusion proteins for improved enzyme expression |
CN110423737B (zh) * | 2019-09-10 | 2021-04-30 | 白银赛诺生物科技有限公司 | 来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌的耐热型α-淀粉酶及其应用 |
MX2022002834A (es) | 2019-09-16 | 2022-04-06 | Novozymes As | Polipeptidos con actividad beta-glucanasa y polinucleotidos que los codifican. |
WO2021080948A2 (en) | 2019-10-24 | 2021-04-29 | Danisco Us Inc | Variant maltopentaose/maltohexaose-forming alpha-amylases |
CN115175923A (zh) | 2019-12-10 | 2022-10-11 | 诺维信公司 | 用于改善的戊糖发酵的微生物 |
MX2022006438A (es) | 2019-12-16 | 2022-06-22 | Novozymes As | Procesos para obtener productos de fermentacion. |
WO2021163030A2 (en) | 2020-02-10 | 2021-08-19 | Novozymes A/S | Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same |
US20240034960A1 (en) | 2020-08-27 | 2024-02-01 | Danisco Us Inc | Enzymes and enzyme compositions for cleaning |
EP4237555A1 (en) | 2020-11-02 | 2023-09-06 | Novozymes A/S | Glucoamylase variants and polynucleotides encoding same |
US20240117275A1 (en) | 2021-01-29 | 2024-04-11 | Danisco Us Inc. | Compositions for cleaning and methods related thereto |
WO2022199418A1 (en) | 2021-03-26 | 2022-09-29 | Novozymes A/S | Detergent composition with reduced polymer content |
WO2022261003A1 (en) | 2021-06-07 | 2022-12-15 | Novozymes A/S | Engineered microorganism for improved ethanol fermentation |
EP4363565A1 (en) | 2021-06-30 | 2024-05-08 | Danisco US Inc. | Variant lipases and uses thereof |
WO2023034486A2 (en) | 2021-09-03 | 2023-03-09 | Danisco Us Inc. | Laundry compositions for cleaning |
WO2023039270A2 (en) | 2021-09-13 | 2023-03-16 | Danisco Us Inc. | Bioactive-containing granules |
WO2023114936A2 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Danisco Us Inc. | Subtilisin variants and methods of use |
CA3241094A1 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Jonathan LASSILA | Variant maltopentaose/maltohexaose-forming alpha-amylases |
WO2023114939A2 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Danisco Us Inc. | Subtilisin variants and methods of use |
WO2023114932A2 (en) | 2021-12-16 | 2023-06-22 | Danisco Us Inc. | Subtilisin variants and methods of use |
WO2023168234A1 (en) | 2022-03-01 | 2023-09-07 | Danisco Us Inc. | Enzymes and enzyme compositions for cleaning |
WO2023250301A1 (en) | 2022-06-21 | 2023-12-28 | Danisco Us Inc. | Methods and compositions for cleaning comprising a polypeptide having thermolysin activity |
WO2024050339A1 (en) | 2022-09-02 | 2024-03-07 | Danisco Us Inc. | Mannanase variants and methods of use |
WO2024050343A1 (en) | 2022-09-02 | 2024-03-07 | Danisco Us Inc. | Subtilisin variants and methods related thereto |
WO2024050346A1 (en) | 2022-09-02 | 2024-03-07 | Danisco Us Inc. | Detergent compositions and methods related thereto |
WO2024102698A1 (en) | 2022-11-09 | 2024-05-16 | Danisco Us Inc. | Subtilisin variants and methods of use |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH04500756A (ja) * | 1989-06-29 | 1992-02-13 | ジェネンコー インターナショナル インコーポレイテッド | 熱、酸及び/またはアルカリに高い安定性を有する細菌由来突然変異体α―アミラーゼ |
WO1995010603A1 (en) * | 1993-10-08 | 1995-04-20 | Novo Nordisk A/S | Amylase variants |
Family Cites Families (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3912590A (en) | 1973-01-03 | 1975-10-14 | Novo Industri As | Procedure for liquefying starch |
JPS57174089A (en) | 1981-04-20 | 1982-10-26 | Novo Industri As | Chain dividing enzyme product |
US4760025A (en) | 1984-05-29 | 1988-07-26 | Genencor, Inc. | Modified enzymes and methods for making same |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
DK122686D0 (da) | 1986-03-17 | 1986-03-17 | Novo Industri As | Fremstilling af proteiner |
US5234823A (en) | 1986-06-30 | 1993-08-10 | Novo Industri A/S | Chimeric enzymes |
DK311186D0 (da) | 1986-06-30 | 1986-06-30 | Novo Industri As | Enzymer |
ES2052565T3 (es) | 1986-07-09 | 1994-07-16 | Novo Nordisk As | Un procedimiento para licuar una suspension de almidon o granos amilaceos. |
DE3909096A1 (de) | 1989-03-20 | 1990-09-27 | Garabed Antranikian | Alpha-amylase |
KR100237148B1 (ko) | 1990-05-09 | 2000-01-15 | 한센 핀 베네드 | 엔도글루칸아제 효소를 함유하는 셀룰라제 제조물 |
ATE159757T1 (de) | 1990-12-21 | 1997-11-15 | Novo Nordisk As | Enzym-mutanten mit einer geringen variation der molekularladung über einen ph-bereich |
DK154292D0 (da) * | 1992-12-23 | 1992-12-23 | Novo Nordisk As | Nyt enzym |
ES2126743T5 (es) | 1993-02-11 | 2010-02-05 | Genencor International, Inc. | Alfa-amilasa oxidativamente estable. |
MX196038B (es) | 1994-03-29 | 2000-04-14 | Novo Nordisk As | Amilasa de bacillus alcalino. |
DE69534369T2 (de) * | 1994-06-17 | 2006-03-09 | Genencor International, Inc., Palo Alto | Von der alpha-amylase aus b. licheniformis abgeleitete amylolytische enzyme mit verbesserten eigenschaften |
US6093562A (en) * | 1996-02-05 | 2000-07-25 | Novo Nordisk A/S | Amylase variants |
AU4483496A (en) | 1995-02-03 | 1996-08-21 | Novo Nordisk A/S | A method of designing alpha-amylase mutants with predetermined properties |
US6440716B1 (en) * | 1995-02-03 | 2002-08-27 | Novozymes A/S | α-amylase mutants |
US5736499A (en) * | 1995-06-06 | 1998-04-07 | Genencor International, Inc. | Mutant A-amylase |
ATE267248T1 (de) | 1995-08-11 | 2004-06-15 | Novozymes As | Neuartige lipolytische enzyme |
AU2692897A (en) * | 1996-04-30 | 1997-11-19 | Novo Nordisk A/S | Alpha-amylase mutants |
US6887986B1 (en) * | 1998-11-16 | 2005-05-03 | Novozymes A/S | α-amylase variants |
US6410295B1 (en) * | 1999-03-30 | 2002-06-25 | Novozymes A/S | Alpha-amylase variants |
US20020155574A1 (en) * | 2000-08-01 | 2002-10-24 | Novozymes A/S | Alpha-amylase mutants with altered properties |
-
1997
- 1997-04-30 AU AU26928/97A patent/AU2692897A/en not_active Abandoned
- 1997-04-30 JP JP53837397A patent/JP4290763B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-04-30 ES ES97920604T patent/ES2432519T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-04-30 BR BRPI9708887-0B1A patent/BR9708887B1/pt active IP Right Grant
- 1997-04-30 EP EP97920604.2A patent/EP0904360B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-04-30 DK DK97920604.2T patent/DK0904360T3/da active
- 1997-04-30 WO PCT/DK1997/000197 patent/WO1997041213A1/en active Application Filing
- 1997-04-30 CN CNB971942978A patent/CN1246455C/zh not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-10-29 US US09/182,859 patent/US6143708A/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-09-28 US US09/672,459 patent/US6436888B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-06-28 US US10/186,042 patent/US6642044B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-08-20 US US10/644,187 patent/US20040048351A1/en not_active Abandoned
-
2004
- 2004-11-03 US US10/980,759 patent/US7625737B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-09-27 US US11/862,580 patent/US7960161B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-12-03 JP JP2008308503A patent/JP4580012B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2011
- 2011-05-04 US US13/100,407 patent/US8263382B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2012
- 2012-07-25 US US13/557,313 patent/US8513175B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-07-29 US US13/953,409 patent/US8999908B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2015
- 2015-03-04 US US14/638,666 patent/US9487769B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH04500756A (ja) * | 1989-06-29 | 1992-02-13 | ジェネンコー インターナショナル インコーポレイテッド | 熱、酸及び/またはアルカリに高い安定性を有する細菌由来突然変異体α―アミラーゼ |
WO1995010603A1 (en) * | 1993-10-08 | 1995-04-20 | Novo Nordisk A/S | Amylase variants |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017505129A (ja) * | 2014-02-07 | 2017-02-16 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | グルコースシロップ生産用組成物 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1217020A (zh) | 1999-05-19 |
US7625737B2 (en) | 2009-12-01 |
JP4290763B2 (ja) | 2009-07-08 |
JP4580012B2 (ja) | 2010-11-10 |
US20050118695A1 (en) | 2005-06-02 |
US20030171236A1 (en) | 2003-09-11 |
CN1246455C (zh) | 2006-03-22 |
US8513175B2 (en) | 2013-08-20 |
BR9708887A (pt) | 1999-08-03 |
US8999908B2 (en) | 2015-04-07 |
US20040048351A1 (en) | 2004-03-11 |
US9487769B2 (en) | 2016-11-08 |
US6143708A (en) | 2000-11-07 |
US20080083406A1 (en) | 2008-04-10 |
AU2692897A (en) | 1997-11-19 |
DK0904360T3 (en) | 2013-10-14 |
US20120282672A1 (en) | 2012-11-08 |
US8263382B2 (en) | 2012-09-11 |
EP0904360A1 (en) | 1999-03-31 |
EP0904360B1 (en) | 2013-07-31 |
US20140024083A1 (en) | 2014-01-23 |
US6642044B2 (en) | 2003-11-04 |
US20110207201A1 (en) | 2011-08-25 |
WO1997041213A1 (en) | 1997-11-06 |
US20150175986A1 (en) | 2015-06-25 |
BR9708887B1 (pt) | 2014-10-29 |
ES2432519T3 (es) | 2013-12-04 |
US7960161B2 (en) | 2011-06-14 |
JP2000508914A (ja) | 2000-07-18 |
US6436888B1 (en) | 2002-08-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4580012B2 (ja) | α−アミラーゼ変異体 | |
RU2231547C2 (ru) | Варианты альфа-амилазы | |
US10113157B2 (en) | Alpha-amylase variants |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090908 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20091207 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20091210 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100308 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100413 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100709 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100727 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100826 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130903 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |