BR112020004476A2 - processo para produção de um produto de fermentação, e, uso de uma combinação de enzimas - Google Patents

Abstract

A presente invenção se relaciona com um processo para melhoria da qualidade nutricional de grãos secos destilados (DGS) ou grãos secos destilados com solúveis (DDGS) produzidos como um coproduto de um processo de produção de produtos de fermentação, processos para produção de produtos de fermentação, bem como combinações de enzimas usadas nos processos.

Description

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PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO, E, USO DE UMA COMBINAÇÃO DE ENZIMAS ÁREA DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se relaciona com um processo para melhoria da qualidade nutricional de grãos secos destilados (DGS) ou grãos secos destilados com solúveis (DDGS) produzidos como um coproduto de um processo de produção de produtos de fermentação, processos para produção de produtos de fermentação, bem como combinações de enzimas usadas nos processos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Processos para produção de produtos de fermentação, tais como etanol, a partir de um material contendo amido ou lignocelulose são bem conhecidos na técnica. A preparação do material contendo amido tal como milho para utilização em tais processos de fermentação começa tipicamente com trituração do milho em um processo de moagem a seco ou moagem a úmido. Os processos de moagem a úmido envolvem fracionamento do milho em diferentes componentes onde somente a fração de amido entra no processo de fermentação. Os processos de trituração a seco envolvem trituração dos grãos de milho em farinha e mistura da farinha com água e enzimas. Geralmente são usados dois tipos diferentes de processos de trituração a seco. O processo o mais comumente usado, frequentemente referido como um “processo convencional”, inclui trituração do material contendo amido e depois liquefação de amido gelatinizado a uma elevada temperatura usando tipicamente uma alfa-amilase bacteriana, seguida por sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) levadas a cabo na presença de uma glucoamilase e um organismo de fermentação. Outro processo bem conhecido, frequentemente referido como um processo de “hidrólise de amido em bruto” (processo RSH), inclui trituração do material contendo amido e depois sacarificação e fermentação simultâneas de amido granular abaixo da

2 / 154 temperatura de gelatinização inicial tipicamente na presença de uma alfa- amilase fúngica ácida e uma glucoamilase.

[003] Em um processo para produção de etanol a partir de milho, após SFF ou o processo RSH, os produtos de fermentação líquidos são recuperados a partir do purê fermentado (frequentemente referido como “purê de cerveja”), por exemplo, por destilação, que separa o produto de fermentação desejado, por exemplo, etanol, a partir de outros líquidos e/ou sólidos. A fração restante é referida como “vinhaça inteira”. A vinhaça inteira contém tipicamente cerca de 10 a 20% de sólidos. A vinhaça inteira é separada em uma fração sólida e uma líquida, por exemplo, por centrifugação. A fração sólida separada é referida como “bolo úmido” (ou “grãos úmidos”) e a fração líquida separada é referida como “vinhaça fina”. O bolo úmido e a vinhaça fina contêm cerca de 35 e 7% de sólidos, respectivamente. O bolo úmido, com desidratação adicional opcional, é usado como um componente em ração animal ou é seco para proporcionar “Grãos Secos Destilados” (DDG) usados como um componente em ração animal. A vinhaça fina é tipicamente evaporada para proporcionar condensado do evaporador e xarope ou pode ser alternativamente reciclada para o tanque de pasta semifluida como “contracorrente”. O condensado do evaporador pode ser direcionado para um metanador antes de ser descarregado e/ou pode ser reciclado para o tanque de pasta semifluida como “água de cozimento”. O xarope pode ser combinado em DDG ou adicionado ao bolo úmido antes do ou durante o processo de secagem, que pode compreender um ou mais secadores em sequência, para produzir DDGS (Grão Seco Destilado com Solúveis). O xarope contém tipicamente cerca de 25% a 35% de sólidos. O óleo pode ser também extraído a partir da vinhaça fina e/ou xarope como um subproduto para uso na produção de biodiesel, como um aditivo ou produto de ração ou alimentar ou outros produtos biorrenováveis.

[004] Os grãos destilados com solúveis (DGS) e os grãos secos

3 / 154 destilados com solúveis (DDGS) são coprodutos da indústria de grãos até etanol, que são usados para ração animal. DGS e DDGS são ricos em fibras e, portanto, a mais elevada taxa de inclusão viável para animais monogástricos, tais como, por exemplo, aves domésticas e suínos, é menor do que para ruminantes tal como, por exemplo, gado. Enzimas glicoidrolase, tais como, por exemplo, endoxilanase, são adicionadas a combinações de ração para aumentar a digestibilidade de combinações de ração ricas em fibras. No entanto existem alguns desafios relacionados com a ação de enzimas adicionadas a combinações de ração; por exemplo, mistura homogênea das enzimas na combinação de ração, estabilidade ao calor da proteína de enzima durante a peletização da ração, estabilidade da proteína de enzima durante a passagem gástrica a baixo pH e tempo de residência relativamente curto nos intestinos de algumas espécies animais

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] A presente invenção ultrapassa os desafios acima por adição de uma xilanase ou uma combinação de enzimas compreendendo uma xilanase e/ou composição celulolítica a montante durante o processo de produção de produtos de fermentação, por exemplo durante a etapa de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF), onde existe mistura contínua de uma pasta semifluida de fluxo livre, a temperatura é estável (por exemplo, entre 30 a 35 °C), o pH é estável (por exemplo, entre cerca de pH 4 e pH 5) e o tempo de residência está tipicamente na gama de 54 a 80 horas.

[006] A presente invenção se relaciona mais particularmente com a adição de xilanase ou combinações de enzimas contendo xilanase durante o processo SSF para produzir um produto de DDGS, ou produto de DGS, com digestibilidade mais elevada para animais (por exemplo, animais monogástricos). Sem desejar estar limitado à teoria se acredita que, quando a fibra (por exemplo, milho) é solubilizada, o aprisionamento de nutrientes tais como proteínas, óleo e amido residual é reduzido, tornando assim estes

4 / 154 nutrientes mais acessíveis, e a fibra solubilizada pode ser fermentada pelo microbioma intestinal até produtos metabolizáveis tais como ácidos graxos. Além disso é possível que a fibra solubilizada tenha um efeito positivo na saúde intestinal por atuação como um substrato para flora intestinal benéfica.

[007] A presente invenção contempla o uso de xilanases sozinhas, bem como em combinações de enzimas compreendendo xilanase e pelo menos uma enzima de adição, tal como uma composição celulolítica, na sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas, para melhorar a qualidade do DDGS produzido a jusante em ambos os processos de produção de etanol convencionais e por hidrólise de amido em bruto (RSH). Em um aspecto, a presente invenção se relaciona com uma combinação de enzimas compreendendo uma xilanase. Em uma modalidade, a combinação de enzimas compreende uma xilanase e pelo menos uma enzima adicional. Em uma modalidade, a combinação de enzimas compreende adicionalmente uma composição celulolítica. Em uma modalidade, a composição celulolítica está presente na combinação, a razão da xilanase e composição celulolítica é de cerca de 5:95 a cerca de 95:5. Em uma modalidade, a razão da xilanase e da composição celulolítica na combinação é cerca de 10:90. Em uma modalidade, a razão da xilanase e da composição celulolítica na combinação é cerca de 20:80. Em uma modalidade, a razão da xilanase e da composição celulolítica na combinação é cerca de 50:50.

[008] Em uma modalidade, a combinação de enzimas compreende pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% de xilanase. Em uma modalidade, a combinação de enzimas compreende pelo menos 5%, pelo menos 10% de

5 / 154 xilanase, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% de composição celulolítica.

[009] Em uma modalidade, a xilanase é uma xilanase da família GH30. Em uma modalidade, a xilanase é uma xilanase da subfamília 8 de GH30 (“xilanase GH30_8”). Em uma modalidade, a xilanase é uma xilanase GH30_8 selecionada do grupo consistindo em: (i) a xilanase de Bacillus subtilis de SEQ ID NO: 1 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; (ii) a xilanase de Bacillus subtilis de SEQ ID NO: 2 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; (iii) a xilanase de Bacillus subtilis de SEQ ID NO: 3 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; (iv) a xilanase de Bacillus amyloliquefaciens de SEQ ID NO: 4 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; (v) a xilanase de Bacillus amyloliquefaciens de SEQ ID NO: 5 ou uma sua variante tendo pelo menos

6 / 154 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; (vi) a xilanase de Bacillus licheniformis de SEQ ID NO: 6 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; e (vii) a xilanase de Paenibacillus pabuli de SEQ ID NO: 2 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta.

[0010] Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I; (ii) uma celobioidrolase II; (iii) uma beta-glucosidase; e (iv) um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica.

[0011] Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou pelo menos três enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I; (ii) uma beta-glucosidase; e (iii) uma endoglucanase.

[0012] Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus; (ii) uma celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus; (iii) uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica de Penicillium emersonii.

[0013] Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende

7 / 154 pelo menos uma, pelo menos duas ou pelo menos três enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus; (ii) uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus; e (iii) uma endoglucanase de Trichoderma reesei.

[0014] Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende: (i) uma celobioidrolase I compreendendo os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 8 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 8; (ii) uma celobioidrolase II compreendendo os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 9 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 9; (iii) uma beta- glucosidase compreendendo os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 10 ou uma sua variante tendo pelo menos uma substituição selecionada do grupo consistindo em F100D, S283G, N456E e F512Y e pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 10; e/ou (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica compreendendo os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 11 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 11.

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[0015] Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende: (i) uma celobioidrolase I compreendendo os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 8 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 8; (ii) uma beta-glucosidase compreendendo os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 10 ou uma sua variante tendo pelo menos uma substituição selecionada do grupo consistindo em F100D, S283G, N456E e F512Y e pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 10; e opcionalmente (iii) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica compreendendo os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 11 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 11.

[0016] Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende adicionalmente uma endoglucanase.

[0017] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe selecionada do grupo consistindo em Aspergillus, Penicilium, Talaromyces e Trichoderma, opcionalmente em que: (i) a estirpe de Aspergillus é selecionada do grupo consistindo em Aspergillus aurantiacus, Aspergillus niger e Aspergillus oryzae; (ii) a estirpe de Penicilium é selecionada do grupo consistindo em Penicilium emersonii e Penicilium oxalicum; (iii) a estirpe de Talaromyces é selecionada do grupo consistindo

9 / 154 em Talaromyces aurantiacus e Talaromyces emersonii; e (iv) a estirpe de Trichoderma é Trichoderma reesei. Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende uma composição celulolítica de Trichoderma reesei.

[0018] Em outro aspecto, a presente invenção se relaciona com um processo de produção de um produto de fermentação, compreendendo as seguintes etapas: (a) sacarificação de um material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial com uma alfa- amilase, uma glucoamilase e uma xilanase ou uma combinação de enzimas compreendendo uma xilanase da presente invenção; (b) fermentação usando um organismo de fermentação; e (c) opcionalmente, recuperação de um coproduto. Em outro aspecto, a presente invenção se relaciona com um processo para produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo as etapas de: (a) liquefação de um material contendo amido com uma alfa-amilase; (b) sacarificação do material liquefeito obtido na etapa (a) com uma glucoamilase e uma xilanase ou uma combinação de enzimas compreendendo uma xilanase da presente invenção; c) fermentação usando um organismo fermentador; e (d) opcionalmente, recuperação de um coproduto. Em uma modalidade, a sacarificação e a fermentação são realizadas simultaneamente. Em uma modalidade, o material contendo amido compreende maís, milho, trigo, centeio, cevada, triticale, sorgo, switchgrass, milheto, milheto-pérola, painço. Em uma modalidade, o produto de fermentação é álcool, particularmente etanol. Em uma modalidade, o organismo fermentador é levedura, particularmente Saccharomyces sp., mais particularmente Saccharomyces cerevisiae.

[0019] Em outro aspecto, a presente invenção se relaciona com um processo para melhoria da qualidade nutricional de grãos secos destilados (DGS) ou grãos secos destilados com solúveis (DDGS) produzidos como um

10 / 154 coproduto de um processo de produção de produtos de fermentação, compreendendo o processo realização de uma processo para produção de um produto de fermentação da presente invenção e recuperação do produto de fermentação para produzir DGS ou DDGS como um coproduto, em que os DGS ou DDGS produzidos têm qualidade nutricional melhorada.

[0020] Em um aspecto, a presente invenção se relaciona com DGS ou DDGS produzidos usando um processo descrito aqui, em que os DGS/DDGS têm qualidade nutricional melhorada em comparação com a qualidade nutricional de DGS ou DDGS produzidos usando processos convencionais.

[0021] Em uma modalidade, a verdadeira energia metabolizável dos DGS ou DDGS é aumentada em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15% ou pelo menos 20%, em comparação com a TME de DGS ou DDGS produzidos quando uma combinação de enzimas da presente invenção não está presente durante a etapa de sacarificação, etapa de fermentação e/ou etapa de sacarificação e fermentação simultâneas de um processo para produção de um produto de fermentação da presente invenção. Em uma modalidade, o animal é um animal monogástrico.

[0022] Em uma modalidade, os DGS ou DDGS produzidos não são escurecidos após secagem em comparação com DGS ou DDGS produzidos quando uma combinação de enzimas da presente invenção não está presente durante a etapa de sacarificação, etapa de fermentação e/ou etapa de sacarificação e fermentação simultâneas de um processo da presente invenção.

[0023] Em outro aspecto, a presente invenção se relaciona com o uso de uma xilanase ou uma combinação de enzimas compreendendo uma xilanase da presente invenção para melhoria da qualidade nutricional de DGS ou DDGS produzidos como um coproduto de um processo de produção de produtos de fermentação, preferencialmente sem resultar em um escurecimento dos DDG ou DDGS.

11 / 154 Em outro aspecto, a presente invenção se relaciona com o uso de uma xilanase ou uma combinação de enzimas da presente invenção para solubilização de fibras, preferencialmente para solubilização de xilose e arabinose.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0024] A FIG. 1 mostra a solubilização da arabinose usando combinações de enzimas da presente invenção compreendendo diferentes razões de xilanase e uma composição celulolítica e, em particular, mostra solubilização significativamente aumentada da arabinose quando 10-100% da composição celulolítica na combinação de enzimas é substituída pela xilanase em comparação com a solubilização da arabinose pela composição celulolítica sozinha.

[0025] A FIG. 2 mostra a solubilização da xilose usando várias combinações de enzimas da presente invenção compreendendo diferentes razões de xilanase e uma composição celulolítica e, em particular, mostra solubilização significativamente aumentada da arabinose quando 10-100% da composição celulolítica na combinação de enzimas é substituída pela xilanase em comparação com a solubilização da arabinose pela composição celulolítica sozinha.

[0026] A FIG. 3 mostra a solubilização da arabinose em resposta a doses crescentes de várias combinações de enzimas compreendendo diferentes razões de xilanase e uma composição celulolítica.

[0027] A FIG. 4 mostra a solubilização da xilose em resposta a doses crescentes de várias combinações de enzimas compreendendo diferentes razões de xilanase e uma composição celulolítica.

[0028] A FIG. 5 mostra um efeito positivo em ensaios de ração sobre os valores de verdadeira energia metabolizável (TME) de grãos secos destilados com solúveis (DDGS) produzidos de acordo com um processo para melhoria da qualidade nutricional de DDGS da presente invenção.

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[0029] A FIG. 6 mostra os resultados de dados de HPLC demonstrando que as combinações de enzimas da presente invenção aumentam a quantidade de açúcares solubilizados, como evidenciado pelo pico de DP4+ aumentado. A FIG. 7 mostra os resultados de dados de HPLC demonstrando que as combinações de enzimas da presente invenção aumentam a quantidade de açúcares solubilizados, como evidenciado pelo pico de DP3 aumentado.

[0030] As FIG. 8, FIG. 9 e FIG. 10 mostram os resultados de dados de IC usando as combinações de enzimas da presente invenção em um processo de hidrólise de amido em bruto (RSH), demonstrando solubilização de açúcares (por exemplo, arabinose (FIG. 8), xilose (FIG. 9) e galactose (FIG. 10)) no mesmo nível que um processo de cozimento convencional. A FIG. 11 mostra os resultados de dados de LECO demonstrando que o uso de uma protease em combinação com as combinações de enzimas da presente invenção aumentou a solubilização de proteínas

[0031] As FIG. 12, FIG. 13 e FIG. 14 mostram que todas as combinações de enzimas da presente invenção que foram testadas resultaram em níveis significativamente mais elevados de xilose (FIG. 12), arabinose (FIG. 13) e galactose (FIG. 14) solubilizadas, em comparação com os controles.

[0032] A FIG. 15 mostra que as combinações de enzimas da presente invenção produziram maiores quantidades de etanol em comparação com o controle sem diferenças significativas entre a quantidade de etanol aumentada ao longo das diferentes combinações de enzimas, exceto que a megadosagem de uma combinação de enzimas produziu uma quantidade significativamente maior de etanol em comparação com as outras combinações de enzimas testadas. A FIG. 16 mostra uma comparação da cor de amostras de xarope produzidas de acordo com um processo da presente invenção usando diferentes

13 / 154 combinações de enzimas da presente invenção em comparação com controles (E-Sep e Excel). Em ordem do canto superior esquerdo para o canto inferior direito, as amostras mostradas são Excel (#1), E-Sep (#2), GH30:VD 10:90 (#3), GH30:VD 20:80 (#4), GH30:VD 50:50 (#5) e GH30:VD 200:800 (#6).

[0033] A FIG. 17 mostra amostras de DDGS produzidas de acordo com um processo da presente invenção usando diferentes doses de combinações de enzimas da presente invenção (#5 e #6 da FIG. 16) em comparação com controles (Excel e E-Sep (#1 e #2), respectivamente, da FIG. 16)).

[0034] A FIG. 18 mostra os valores de Cor L de Hunter de amostras de DDGS produzidas de acordo com um processo da presente invenção usando diferentes doses de combinações de enzimas da presente invenção em comparação com controles (Excel e E-Sep (#1 e #2) , respectivamente, da FIG. 16 e FIG. 17)).

[0035] A FIG. 19 mostra a percentagem de matéria seca presente em cada uma das amostras mostradas na FIG. 17 após secagem.

[0036] As FIG. 20, FIG. 21, FIG. 22, FIG. 23, FIG. 24, FIG. 25, FIG. 26, FIG. 27 e FIG. 28 são gráficos mostrando os resultados de HPLC das experiências no Exemplo 6, incluindo respectivamente dados para DP4+ (FIG. 20), DP3 (FIG. 21), DP2 (FIG. 22), Glucose (FIG. 23), Frutose (FIG. 24), Lactato (FIG. 25), Glicerol (FIG. 26), Acetato (FIG. 27) e Etanol (FIG. 28).

[0037] As FIG. 29, FIG. 30, FIG. 31 e FIG. 32 são gráficos mostrando os açúcares solubilizados totais e monoméricos usando várias combinações de enzimas de acordo com a presente invenção, incluindo por exemplo Arabinose (FIG. 29), Xilose (FIG. 30), Galactose (FIG. 31) e Glucose (FIG. 32).

[0038] As FIG. 33, FIG. 34, FIG. 35, FIG. 36 e FIG. 37 são gráficos mostrando a qualidade/teor nutricional melhorado de DDGS produzidos de

14 / 154 acordo com um processo da presente invenção, incluindo conteúdo de DDGS de Amido (FIG. 33), Proteína (FIG. 34), Gordura (FIG. 35), Fibra (detergente ácido) (FIG. 36) e Fibra (detergente neutro) (FIG. 37).

VISÃO GERAL DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0039] SEQ ID NO: 1 é a sequência de aminoácidos de uma xilanase GH30_8 madura de Bacillus subtilis.

[0040] SEQ ID NO: 2 é a sequência de aminoácidos de uma xilanase GH30 madura de Bacillus subtilis.

[0041] SEQ ID NO: 3 é a sequência de aminoácidos da xilanase GH30 madura de Bacillus subtilis.

[0042] SEQ ID NO: 4 é a sequência de aminoácidos da xilanase GH30 madura de Bacillus amyloliquefaciens.

[0043] SEQ ID NO: 5 é a sequência de aminoácidos da xilanase GH30 madura de Bacillus amyloliquefaciens HB-26.

[0044] SEQ ID NO: 6 é a sequência de aminoácidos da xilanase GH30 madura de Bacillus licheniformis.

[0045] SEQ ID NO: 7 é a sequência de aminoácidos da xilanase GH30 madura de Paenibacillus pabuli.

[0046] SEQ ID NO: 8 é a sequência de aminoácidos da celobioidrolase I de comprimento total de Aspergillus fumigatus.

[0047] SEQ ID NO: 9 é a sequência de aminoácidos da celobioidrolase II de comprimento total de Aspergillus fumigatus.

[0048] SEQ ID NO: 10 é a sequência de aminoácidos da beta- galactosidase de comprimento total de Aspergillus fumigatus.

[0049] SEQ ID NO: 11 é a sequência de aminoácidos do polipeptídeo GH61 de comprimento total de Penicillium emersonii.

[0050] SEQ ID NO: 12 é a sequência de aminoácidos da alfa-amilase de comprimento total de Bacillus stearothermophilus.

[0051] SEQ ID NO: 13 é a sequência de aminoácidos da xilanase

15 / 154 GH10 de comprimento total de Dictyogllomus thermophilum.

[0052] SEQ ID NO: 14 é a sequência de aminoácidos da xilanase GH11 de comprimento total de Dictyogllomus thermophilum.

[0053] SEQ ID NO: 15 é a sequência de aminoácidos da xilanase GH10 de comprimento total de Rasomsonia byssochlamydoides.

[0054] SEQ ID NO: 16 é a sequência de aminoácidos da xilanase GH10 de comprimento total de Talaromyces leycettanus.

[0055] SEQ ID NO: 17 é a sequência de aminoácidos da xilanase GH10 de comprimento total de Aspergillus fumigatus.

[0056] SEQ ID NO: 18 é a sequência de aminoácidos da endoglucanase de comprimento total de Talaromyces leycettanus.

[0057] SEQ ID NO: 19 é a sequência de aminoácidos da endoglucanase de comprimento total de Penicillium capsulatum.

[0058] SEQ ID NO: 20 é a sequência de aminoácidos da endoglucanase de comprimento total de Trichophaea saccata.

[0059] SEQ ID NO: 21 é a sequência de aminoácidos da endoglucanase GH45 de comprimento total de Sordaria fimicola.

[0060] SEQ ID NO: 22 é a sequência de aminoácidos da endoglucanase GH45 de comprimento total de Thielavia terrestris.

[0061] SEQ ID NO: 23 é a sequência de aminoácidos da glucoamilase de comprimento total de Penicillium oxalicum.

[0062] SEQ ID NO: 24 é a sequência de aminoácidos da protease de comprimento total de Pyrococcus furiosus.

[0063] SEQ ID NO: 25 é a sequência de aminoácidos da protease de comprimento total de Thermoascus aurantiacus.

[0064] SEQ ID NO: 26 é a sequência de aminoácidos da alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com ligante de glucoamilase e domínio de ligação ao amido (SBD) de Aspergillus niger tendo as seguintes substituições G128D + D143N.

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DEFINIÇÕES

[0065] Variante alélica: O termo “variante alélica” significa qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo lócus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. As mutações de genes podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

[0066] As Alfa-Amilases (alfa-1,4-glucana-4-glucanoidrolases, EC

3.2.1.1) são um grupo de enzimas que catalisam a hidrólise de amido e outros oligo e polissacarídeos 1,4-glucosídicos lineares e ramificados.

[0067] Animal: O termo “animal” se refere a todos os animais exceto humanos. Exemplos de animais são não ruminantes e ruminantes. Os animais ruminantes incluem, por exemplo, animais tais como ovelhas, cabras, gado, por exemplo, gado de corte, vacas e bezerros, cervo, iaque, camelo, lhama e canguru. Os animais não ruminantes incluem animais monogástricos, por exemplo, porcos ou suínos (incluindo, mas não se limitando a, leitões, porcos em fase de crescimento e porcas); aves domésticas tais como perus, patos e galinhas (incluindo mas não se limitando a frangos de corte, galinhas poedeiras); cavalos (incluindo mas não se limitando a de sangue quente, de sangue frio e sangues mistos), bezerros jovens; peixe (incluindo mas não se limitando a olho de boi, pirarucu, barbo, robalo, anchova, bagre pintado, dourado, caboz, tambaqui, carpa, bagre, catla, peixe-leite, truta-de-lago, ciclídeo, cobia, bacalhau, crappie, dourada, miraguaia, enguia, gobi, peixinho- dourado, gourami, garoupa, ciclídeo lobo, halibute, java, labeo, lai, peixe cobrinha, sarda, peixe-leite, sagro, peixe pulmonado que se enterra na lama, tainha, paco, mexirica listrada, peixe-rei, perca, peixe pike, peixe pompano, pardelha-dos-Alpes, salmão, peixe-gato gitante, sauger, robalo, dourada,

17 / 154 peixe-gato, sleeper, cabeça-de-cobra, pargo, falso-robalo, linguado, macua, esturjão, peixe-lua, ayu, tenca, terror, tilápia, truta, atum, pregado, coregono- branco, picão-verde e coregono); e crustáceos (incluindo mas não se limitando a camarões e pitus).

[0068] Ração animal: O termo “ração animal” se refere a qualquer composto, preparação ou mistura adequado para a, ou destinado à, ingestão por um animal. A ração animal para um animal monogástrico compreende tipicamente concentrados bem como vitaminas, minerais, enzimas, micróbio de alimentação direta, aminoácidos e/ou outros ingredientes de ração (tal como em uma pré-mistura) ao passo que a ração animal para ruminantes compreende geralmente forragem (incluindo fibra e silagem) e pode compreender adicionalmente concentrados bem como vitaminas, minerais, micróbio de alimentação direta de enzimas, aminoácido e/ou outros ingredientes de ração (tal como em uma pré-mistura).

[0069] Beta-glucosidase: O termo “beta-glucosidase” significa uma beta-D-glucosídeo glucoidrolase (E.C. 3.2.1.21) que catalisa a hidrólise de resíduos de beta-D-glucose não redutores terminais com a liberação de beta- D-glucose.

[0070] Para propósitos da presente invenção, a atividade de beta- glucosidase é determinada usando p-nitrofenil-beta-D-glucopiranosídeo como substrato de acordo com o procedimento de Venturi et al., 2002, Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophilum: production, purification and some biochemical properties, J. Basic Microbiol. 42: 55-66. Uma unidade de beta-glucosidase é definida como 1,0 µmole de ânion de p-nitrofenolato produzida por minuto a 25 ºC, pH 4,8 a partir de p- nitrofenil-beta-D-glucopiranosídeo a 1 mM como substrato em citrato de sódio a 50 mM contendo TWEEN® 20 (monolaurato de polioxietileno sorbitana) a 0,01 % .

[0071] Ganho de Peso Corporal: O termo “ganho de peso corporal”

18 / 154 significa um aumento no peso vivo de um animal durante um dado período de tempo, por exemplo, o aumento no peso do dia 1 ao dia 21.

[0072] cDNA: O termo “cDNA” significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula de mRNA, processada, madura, obtida a partir de uma célula eucariótica ou procariótica. O cDNA não tem sequências de íntron que possam estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de RNA primário, inicial é um precursor de mRNA que é processado através de uma série de etapas, incluindo processamento, antes de aparecer como mRNA processado maduro.

[0073] Celobioidrolase: O termo “celobioidrolase” significa uma 1,4- beta-D-glucana celobioidrolase (E.C. 3.2.1.91) que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glucosídicas em celulose, celo-oligossacarídeos ou qualquer polímero contendo glucose ligada em beta-1,4, liberando celobiose a partir das extremidades redutoras ou não redutoras da cadeia (Teeri, 1997, Crystalline cellulose degradation: New insight into the function of cellobiohydrolases, Trends in Biotechnology 15: 160-167; Teeri et al., 1998, Trichoderma reesei cellobiohydrolases: why so efficient on crystalline cellulose?, Biochem. Soc. Trans. 26: 173-178).

[0074] A atividade de celobioidrolase é determinada de acordo com os procedimentos descritos por Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47: 273- 279; van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters 149: 152-156; van Tilbeurgh e Claeyssens, 1985, FEBS Letters, 187: 283-288; e Tomme et al., 1988, Eur. J. Biochem. 170: 575-581. Na presente invenção, o método de Tomme et al. pode ser usado para se determinar a atividade de celobioidrolase.

[0075] Enzima celulolítica, composição celulolítica ou celulase: O termo “enzima celulolítica”, “composição celulolítica” ou “celulase” significa uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas que hidrolisam um material celulósico. Tais enzimas incluem endoglucanase(s), celobioidrolase(s), beta- glucosidase(s) ou suas combinações. As duas abordagens básicas para

19 / 154 medição da atividade celulolítica incluem: (1) medição da atividade celulolítica total e (2) medição das atividades celulolíticas individuais (endoglucanases, celobioidrolases e beta-glucosidases) como revisto em Zhang et al., Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies, 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481. A atividade celulolítica total é usualmente medida usando substratos insolúveis, incluindo papel de filtro Whatman №1, celulose microcristalina, celulose bacteriana, celulose de algas, algodão, lignocelulose pré-tratada, etc. O ensaio mais comum de atividade celulolítica total é o ensaio de papel de filtro usando papel de filtro Whatman №1 como o substrato. O ensaio foi estabelecido pela International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Ghose, 1987, Measurement of cellulase activities, Pure Appl. Chem. 59: 257-68).

[0076] A atividade de enzimas celulolíticas é determinada por medição do aumento na hidrólise de um material celulósico por enzima(s) celulolítica(s) sob as seguintes condições: 1-50 mg de proteína de enzima celulolítica/g de celulose em Palha de Milho Pré-Tratada (“PCS”) (ou outro material celulósico pré-tratado) durante 3-7 dias a uma temperatura adequada, por ex., 50 ºC, 55 ºC ou 60 ºC, em comparação com uma hidrólise de controle sem adição de proteína de enzima celulolítica. Condições típicas são reações de 1 mL, PCS lavada ou não lavada, sólidos insolúveis a 5%, acetato de sódio a 50 mM pH 5, MnSO4 a 1 mM, 50 °C, 55 °C ou 60 °C, 72 horas, análise de açúcares por coluna AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA).

[0077] Sequência codificante: O termo “sequência codificante” significa um polinucleotídeo que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de uma variante. As fronteiras da sequência codificante são geralmente determinadas por uma grelha de leitura aberta, que começa com um códon de iniciação tal como ATG, GTG, ou TTG e termina com um códon de terminação tal como TAA, TAG ou TGA. A sequência codificante

20 / 154 pode ser um DNA genômico, cDNA, DNA sintético ou uma sua combinação.

[0078] Sequências de controle: O termo “sequências de controle” significa sequências de ácido nucleico necessárias para expressão de um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa (isto é, do mesmo gene) ou estranha (isto é, de um gene diferente) em relação ao polinucleotídeo codificado a variante ou nativa ou estranha uma em relação à outra. Tais sequências de controle incluem, mas não estão limitadas a, um líder, sequência de poliadenilação, sequência do pró-peptídeo, promotor, sequência do peptídeo- sinal e terminador da transcrição. Em um mínimo, as sequências de controle incluem um promotor e sinais de paragem transcricional e translacional. As sequências de controle podem ser proporcionadas com ligantes para o propósito de introdução de locais de restrição específicos facilitando a ligação das sequências de controle à região codificante do polinucleotídeo codificando uma variante.

[0079] Endoglucanase: O termo “endoglucanase” significa uma endo- 1,4-(1,3;1,4)-beta-D-glucana 4-glucanoidrolase (E.C. 3.2.1.4) que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, derivados de celulose (tais como celulose de carboximetila e celulose de hidroxietila), liquenina, ligações beta-1,4 em beta-1,3 glucanas mistas tais como beta-D- glucanas ou xiloglucanas de cereais e outro material vegetal contendo componentes celulósicos.

[0080] A atividade de endoglucanase pode ser determinada por medição da redução na viscosidade do substrato ou aumento nas extremidades redutoras determinado por um teste de açúcares redutores (Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481). Para propósitos da presente invenção, a atividade de endoglucanase é determinada usando celulose de carboximetila (CMC) como substrato de acordo com o procedimento de Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59: 257-268, a pH 5, 40 °C.

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[0081] Expressão: O termo “expressão” inclui qualquer etapa envolvida na produção de uma variante incluindo, mas não se limitando a, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós- translacional e secreção.

[0082] Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo codificando uma variante e está operacionalmente ligada a sequências de controle que proporcionam a sua expressão.

[0083] Glicosídeo hidrolase da família 61: O termo “glicosídeo hidrolase da Família 61” ou “Família GH61” ou “GH61” significa um polipeptídeo da Família 61 de glicosídeo hidrolases de acordo com Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316 e Henrissat B., e Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696. As enzimas desta família foram originalmente classificadas como uma família de glicosídeo hidrolases com base na medição de atividade muito fraca de endo-1,4-beta-D-glucanase em um membro da família. A estrutura e modo de ação destas enzimas não são canônicos e não podem ser consideradas glicosidases verdadeiras. No entanto são mantidas na classificação CAZy com base na sua capacidade de intensificar a degradação de lignocelulose quando usadas em conjunto com uma celulase ou uma mistura de celulases.

[0084] Razão de Conversão de Ração: O termo “razão de conversão de ração” significa a quantidade de ração alimentada a um animal para aumentar o peso do animal em uma quantidade especificada. Uma razão de conversão de ração melhorada significa uma razão de conversão de ração mais baixa. Por “taxa de conversão de ração inferior” ou “taxa de conversão de ração melhorada” se entende que o uso de uma composição de aditivo de ração em ração resulta em uma quantidade menor de ração sendo requerida

22 / 154 para ser alimentada a um animal para aumentar o peso do animal em uma quantidade especificada em comparação com a quantidade de ração requerida para aumentar o peso do animal na mesma quantidade quando a ração não compreende a referida composição de aditivo de ração.

[0085] Eficiência de ração: O termo “eficiência de ração” significa a quantidade de ganho de peso por unidade de ração quando o animal é alimentado ad libitum ou uma quantidade especificada de alimento durante um período de tempo. Por “eficiência de ração aumentada” se entende que o uso de uma composição de aditivo de reação de acordo com a presente invenção em ração resulta em um ganho de peso aumentado por unidade de ingestão de ração em comparação com um animal alimentado sem que a referida composição de aditivo de ração esteja presente.

[0086] Fragmento: O termo “fragmento” significa um polipeptídeo com um ou mais (por exemplo, vários) aminoácidos ausentes do terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo maduro principal; em que o fragmento tem atividade de enzima. Em um aspecto, um fragmento contém pelo menos 85%, por exemplo, pelo menos 90% ou pelo menos 95% dos resíduos de aminoácidos do polipeptídeo maduro de uma enzima.

[0087] As glucoamilases (glucana 1,4-alfa-glucosidase, EC 3.2.1.3) são um grupo de enzimas que catalisam a hidrólise de resíduos de alfa-D- glucose ligados a terminal (1→4) sucessivamente de extremidades não redutoras das cadeias com liberação de beta-D-glucose.

[0088] Enzima hemicelulolítica ou hemicelulase: O termo “enzima hemicelulolítica” ou “hemicelulase” significa uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas que hidrolisam um material hemicelulósico. Ver, por exemplo, Shallom e Shoham, 2003, Microbial hemicellulases, Current Opinion In Microbiology 6 (3): 219-228. As hemicelulases são

23 / 154 componentes-chave na degradação de biomassa vegetal. Exemplos de hemicelulases incluem, mas não estão limitados a, uma acetilmanana esterase, uma acetilxilana esterase, uma arabinanase, uma arabinofuranosidase, uma ácido cumárico esterase, uma feruloíl esterase, uma galactosidase, uma glucuronidase, uma glucuronoíl esterase, uma mananase, uma manosidase, uma xilanase e uma xilosidase. Os substratos destas enzimas, as hemiceluloses, são um grupo heterogêneo de polissacarídeos ramificados e lineares que estão ligados através de ligações de hidrogênio às microfibrilas de celulose na parede celular vegetal, as reticulando em uma rede robusta. As hemiceluloses estão também covalentemente ligadas à lignina, formando em conjunto com a celulose uma estrutura altamente complexa. A estrutura variável e a organização das hemiceluloses exigem a ação conjunta de muitas enzimas para a sua degradação completa. Os módulos catalíticos de hemicelulases são glicosídeo hidrolases (GH) que hidrolisam ligações glicosídicas, ou carboidrato esterases (CE), que hidrolisam ligações de éster de grupos laterais de acetato ou ácido ferúlico. Esses módulos catalíticos, com base na homologia da sua sequência primária, podem ser atribuídos a famílias GH e CE marcadas por números. Algumas famílias, com dobramento similar global, podem ser adicionalmente agrupadas em clãs, marcados alfabeticamente (por exemplo, GH-A). Uma classificação informativa e atualizada destas e outras enzimas ativas em carboidratos está disponível na base de dados Carbohydrate-Active Enzymes (CAZy). As atividades de enzima hemicelulolítica podem ser medidas de acordo com Ghose e Bisaria, 1987, Pure & Appl. Chem 59: 1739-1752, a uma temperatura adequada, por exemplo, 50 °C, 55 °C ou 60 °C.

[0089] Célula hospedeira: O termo “célula hospedeira” significa qualquer tipo de célula que seja suscetível a transformação, transfecção, transdução ou similar com um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. O termo

24 / 154 “célula hospedeira” engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não seja idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação.

[0090] Isolado: O termo “isolado” significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância não ocorrendo naturalmente, (2) qualquer substância incluindo, mas não se limitando a, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que seja pelo menos parcialmente removida de um ou mais dos ou todos os constituintes ocorrendo naturalmente com os quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pela mão do homem em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada por aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes com os quais está naturalmente associada (por exemplo, múltiplas cópias de um gene codificando a substância; uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene codificando a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação.

[0091] Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” significa um polipeptídeo em sua forma final após tradução e quaisquer modificações pós-translacionais, tais como processamento N-terminal, truncação C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro de uma celobioidrolase I de A. fumigatus é os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 8 com base no programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), que prevê que os aminoácidos 1 a 26 de SEQ ID NO: 8 são um peptídeo-sinal. Em outro aspecto, o polipeptídeo maduro de uma celobioidrolase II de A. fumigatus é os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 9 com base no programa SignalP que prevê que os aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 9 são um peptídeo-sinal.

25 / 154 Em um outro aspeto, o polipeptídeo maduro de uma beta-glucosidase de A. fumigatus é os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 10 com base no programa SignalP que prevê que os aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 10 são um peptídeo-sinal. Em outro aspecto, o polipeptídeo maduro de um polipeptídeo GH61 de Penicillium sp. é os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 11 com base no programa SignalP que prevê que os aminoácidos 1 a 25 de SEQ ID NO: 11 são um peptídeo-sinal.

[0092] É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (isto é, com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo. É também conhecido na técnica que diferentes células hospedeiras processam polipeptídeos diferentemente e, assim, uma célula hospedeira expressando um polinucleotídeo pode produzir um polipeptídeo maduro diferente (por exemplo, tendo um aminoácido C- terminal e/ou N-terminal diferente) em comparação com outra célula hospedeira expressando o mesmo polinucleotídeo.

[0093] Sequência codificante do polipeptídeo maduro: O termo “sequência codificante do polipeptídeo maduro” significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro.

[0094] Mutante: O termo “mutante” significa um polinucleotídeo codificando uma variante.

[0095] Construto de ácido nucleico: O termo “construto de ácido nucleico” significa uma molécula de ácido nucleico, de fita simples ou dupla, que é isolada de um gene ocorrendo naturalmente ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de uma maneira que não existiria de outro modo na natureza ou que é sintética, que compreende uma ou mais sequências de controle.

[0096] Digestibilidade de Nutrientes: O termo “digestibilidade de nutrientes” significa a fração de um nutriente que desaparece do trato

26 / 154 gastrointestinal ou um segmento especificado do trato gastrointestinal, por exemplo, o intestino delgado. A digestibilidade de nutrientes pode ser medida como a diferença entre o que é administrado ao sujeito e o que sai nas fezes no sujeito ou entre o que é administrado ao sujeito e o que permanece no digerido em um segmento especificado do trato gastrointestinal, por exemplo, o íleo.

[0097] A digestibilidade de nutrientes como usada aqui pode ser medida pela diferença entre a ingestão de um nutriente e o nutriente excretado por meio da coleta total de excreções durante um período de tempo; ou com o uso de um marcador inerte que não é absorvido pelo animal, e permite que o investigador calculando a quantidade de nutriente que desapareceu no trato gastrointestinal inteiro ou um segmento do trato gastrointestinal. Um tal marcador inerte pode ser dióxido de titânio, óxido crômico ou cinza insolúvel em ácido. A digestibilidade pode ser expressa como uma percentagem do nutriente na ração ou como unidades de massa de nutriente digestível por unidades de massa de nutriente na ração. A digestibilidade de nutrientes como usada aqui engloba digestibilidade de amido, digestibilidade de gorduras, digestibilidade de proteínas e digestibilidade de aminoácidos.

[0098] Digestibilidade de energia como usada aqui significa a energia bruta da ração consumida menos a energia bruta das fezes ou a energia bruta da ração consumida menos a energia bruta do digerido restante em um segmento especificado do trato gastrointestinal do animal, por exemplo, o íleo.

[0099] Energia metabolizável como usada aqui se refere à energia metabolizável aparente e significa a energia bruta da ração consumida menos a energia bruta contida nas fezes, urina e produtos gasosos da digestão. A digestibilidade de energia e a energia metabolizável podem ser medidas como a diferença entre a ingestão de energia bruta e a energia bruta excretada nas fezes ou o digerido presente em segmento especificado do trato

27 / 154 gastrointestinal usando os mesmos métodos para medir a digestibilidade de nutrientes, com correções apropriadas quanto à excreção de nitrogênio para se calcular a energia metabolizável da ração.

[00100] Operacionalmente ligado: O termo “operacionalmente ligado” significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificante de um polinucleotídeo tal que a sequência de controle dirija a expressão da sequência codificante.

[00101] Percentagem de xilana solubilizada: O termo “percentagem de xilana solubilizada” significa a quantidade de xilose medida no sobrenadante após incubação com uma enzima em comparação com a quantidade total de xilose presente no substrato antes da incubação com a enzima. Para o propósito da presente invenção, a percentagem de xilana solubilizada pode ser calculada usando maís desamidado desengordurado (DFDSM) como substrato. O DFDSM é preparado de acordo com “Preparação de Maís Desamidado Desengordurado (DFDSM)” na seção experimental.

[00102] A percentagem de xilana solubilizada do maís desamidado desengordurado (DFDSM) pode ser determinada usando as condições de reação de 20 µg de enzima/g de DFDSM e incubação a 40 °C, pH 5 durante 2,5 horas como descrito no “Ensaio de solubilização de xilose” aqui. Assim, o termo “é realizado sob condições de reação 20 µg de variante de xilanase por grama de maís desamidado desengordurado (DFDSM) e incubação a 40 °C, pH 5 durante 2,5 horas” é para ser compreendido que a percentagem de xilana solubilizada é calculada como descrito no “Ensaio de solubilização de xilose” aqui.

[00103] Em uma modalidade mais detalhada, 2% (p/p) de suspensão de DFDSM foram preparados em acetato de sódio a 100 mM, CaCl2 a 5 mM, pH 5 e deixada a hidratar durante 30 min à temperatura ambiente sob agitação suave. Após hidratação, 200 µL de suspensão de substrato foram pipetados

28 / 154 em uma placa com 96 poços e misturados com 20 µL de solução de enzima para se obter uma concentração de enzima final de 20 PPM em relação ao substrato (20 µg de enzima/g de substrato). As misturas de enzima/substrato foram deixadas para hidrólise em 2,5 h a 40 °C sob agitação suave (500 RPM) em uma incubadora de placa. Após hidrólise enzimática, as placas de enzima/substrato foram centrifugadas durante 10 min a 3000 RPM e 50 µL de sobrenadante foram misturados com 100 µL de HCl a 1,6 M e transferidos para tubos de PCR de 300 µL e deixados para hidrólise ácida durante 40 min a 90 °C em uma máquina de PCR. As amostras foram neutralizadas com 125 µL de NaOH a 1,4 M após hidrólise ácida e carregadas no HPAE-PAD para análise de monossacarídeos.

[00104] Polipeptídeo tendo atividade intensificadora celulolítica: O termo “polipeptídeo tendo atividade intensificadora celulolítica” significa um polipeptídeo GH61 que catalisa a intensificação da hidrólise de um material celulósico por enzima tendo atividade celulolítica. Para propósitos da presente invenção, a atividade intensificadora celulolítica é determinada por medição do aumento nos açúcares redutores ou pelo aumento do total de celobiose e glucose a partir da hidrólise de um material celulósico por enzima celulolítica sob as seguintes condições: 1-50 mg de proteína total/g de celulose em PCS, em que a proteína total é compreendida por 50-99,5% p/p de proteína de enzima celulolítica e 0,5-50% p/p de proteína de um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica durante 1-7 dias a uma temperatura adequada, por exemplo, 50 °C, 55 °C ou 60 °C, e pH, por exemplo, 5,0 ou 5,5, em comparação com uma hidrólise de controle com igual carga de proteína total sem atividade intensificadora celulolítica (1-50 mg de proteína celulolítica/g de celulose em PCS). Em um aspecto, uma mistura de CELLUCLAST 1.5L (Novozymes A/S, Bagsværd, Dinamarca) na presença de 2-3% de peso de proteína total de beta-glucosidase de Aspergillus oryzae (recombinantemente produzida em Aspergillus oryzae de acordo com WO

29 / 154 02/095014) ou 2-3% de peso de proteína total de beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (recombinantemente produzida em Aspergillus oryzae como descrito em WO 2002/095014) de carga de proteína celulase é usada como a fonte da atividade celulolítica.

[00105] O polipeptídeo GH61 tendo atividade celulolítica intensificadora intensifica a hidrólise de um material celulósico catalisada por enzima tendo atividade celulolítica por redução da quantidade de enzima celulolítica requerida para alcançar o mesmo grau de hidrólise, preferencialmente pelo menos 1,01 vezes, por exemplo, pelo menos 1,05 vezes, pelo menos 1,10 vezes, pelo menos 1,25 vezes, pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes ou pelo menos 20 vezes.

[00106] Identidade de sequências: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro “identidade de sequências”.

[00107] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequências entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), por exemplo, versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacunas de 10, penalidade de extensão de lacunas de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle identificado “identidade mais longa” (obtido usando a opção –nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue: (Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento – Número Total de Lacunas no Alinhamento)

[00108] Para propósitos da presente invenção, a identidade de

30 / 154 sequências entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), por exemplo, versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacunas de 10, penalidade de extensão de lacunas de 0,5 e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). O resultado de Needle identificado “identidade mais longa” (obtido usando a opção –nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue: (Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento – Número Total de Lacunas no Alinhamento)

[00109] Variante: O termo “variante” significa um polipeptídeo tendo atividade de enzima ou atividade intensificadora de enzima compreendendo uma alteração, isto é, uma substituição, inserção e/ou deleção, em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Uma substituição significa reposicionamento do aminoácido ocupando uma posição por um aminoácido diferente; uma deleção significa remoção do aminoácido ocupando uma posição; e uma inserção significa adição de um aminoácido adjacente ao e imediatamente após o aminoácido ocupando uma posição.

[00110] Xilanase de tipo selvagem: O termo xilanase de “tipo selvagem” significa uma xilanase expressa por um microrganismo ocorrendo naturalmente, tal como uma bactéria, levedura ou fungo filamentoso encontrado na natureza.

[00111] Xilanase: O termo “xilanase” significa uma glucuronoarabinoxilana endo-1,4-beta-xilanase (E.C. 3.2.1.136) que catalisa a endo-hidrólise de ligações de 1,4-beta-D-xilosila em algumas glucuronoarabinoxilanas. A atividade de xilanase pode ser determinada com AZCL-glucuronoxilana a 0,2% como substrato em TRITON® X-100 a 0,01%

31 / 154 e fosfato de sódio a 200 mM, pH 6 a 37 °C. Uma unidade de atividade de xilanase é definida como 1,0 µmole de azurina produzida por minuto a 37 °C, pH 6 de AZCL-glucuronoxilana a 0,2% como substrato em fosfato de sódio a 200 mM, pH 6. Convenções para Designação de Variantes

[00112] Para propósitos da presente invenção, SEQ ID NO: 1 é usada para determinar o resíduo de aminoácido correspondente em outra xilanase. A sequência de aminoácidos de outra xilanase é alinhada com SEQ ID NO: 1 e, com base no alinhamento, o número de posição do aminoácido correspondendo a qualquer resíduo de aminoácido em SEQ ID NO: 1 é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), por exemplo, versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacunas de 10, penalidade de extensão de lacunas de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62).

[00113] A identificação do resíduo de aminoácido correspondente em outra xilanase pode ser determinada por um alinhamento de múltiplas sequências de polipeptídeos usando vários programas de computador incluindo, mas não se limitando a, MUSCLE (comparação de múltiplas sequências por expectativa de log; versão 3.5 ou posterior; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1794), MAFFT (versão 6.857 ou posterior; Katoh e Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh e Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh e Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900) e EMBOSS EMMA empregando ClustalW (1.83 ou posterior; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), usando seus respectivos

32 / 154 parâmetros de definição.

[00114] Quando a outra enzima divergiu do polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 tal que a comparação tradicional à base de sequências falhe em detectar a sua relação (Lindahl e Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615), outros algoritmos de comparação de sequências par a par podem ser usados. Pode ser alcançada maior sensibilidade na pesquisa baseada em sequências usando programas de pesquisa que utilizam representações probabilísticas de famílias (perfis) de polipeptídeos para pesquisar bases de dados. Por exemplo, o programa PSI-BLAST gera perfis através de um processo iterativo de pesquisa de bases de dados e é capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Pode ser alcançada ainda maior sensibilidade se a família ou superfamília para o polipeptídeo tiver um ou mais representantes nas bases de dados de estrutura de proteína. Programas tais como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin e Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizam informação a partir de uma variedade de fontes (PSI-BLAST, previsão de estrutura secundária, perfis de alinhamentos estruturais e potenciais de solvatação) como entrada para uma rede neural que prevê a dobragem estrutural para uma sequência de consulta. Similarmente, o método de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, pode ser usado para alinhar uma sequência de estrutura desconhecida com os modelos de superfamília presentes na base de dados SCOP. Estes alinhamentos podem por sua vez ser usados para gerar modelos de homologia para o polipeptídeo, e tais modelos podem ser avaliados quanto à precisão usando uma variedade de ferramentas desenvolvidas para esse propósito.

[00115] Para proteínas de estrutura conhecida estão disponíveis várias ferramentas e recursos para recuperar e gerar alinhamentos estruturais. Por exemplo, as superfamílias de proteínas SCOP foram estruturalmente alinhadas, e esses alinhamentos estão acessíveis e são descarregáveis. Duas ou

33 / 154 mais estruturas de proteína podem ser alinhadas usando uma variedade de algoritmos tais como a matriz de alinhamento de distância (Holm e Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) ou extensão combinatorial (Shindyalov e Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), e pode ser adicionalmente utilizada implementação destes algoritmos para consultar bases de dados de estruturas com uma estrutura de interesse de modo a se descobrirem possíveis homólogos estruturais (por exemplo, Holm e Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).

[00116] Na descrição das variantes da presente invenção, a nomenclatura descrita em baixo é adaptada para facilidade de referência. É empregue a abreviatura de aminoácidos de letra única ou três letras aceite pela IUPAC.

[00117] Substituições. Para uma substituição de aminoácidos é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, aminoácido substituído. Conformemente, a substituição de treonina na posição 226 por alanina é designada como “Thr226Ala” ou “T226A”. Mutações múltiplas são separadas por sinais de adição (“+”), por exemplo, “Gly205Arg + Ser411Phe” ou “G205R + S411F”, representando substituições nas posições 205 e 411 de glicina (G) por arginina (R) e serina (S) por fenilalanina (F), respectivamente.

[00118] Deleções. Para uma deleção de aminoácido é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, *. Conformemente, a deleção de glicina na posição 195 é designada como “Gly195*” ou “G195*”. Deleções múltiplas são separadas por sinais de adição (“+”), por exemplo, “Gly195* + Ser411*” ou “G195* + S411*”.

[00119] Inserções. Para uma inserção de aminoácido é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido. Conformemente, a inserção de lisina após glicina na posição 195 é designada “Gly195GlyLys” ou “G195GK”. Uma inserção de múltiplos aminoácidos é designada [Aminoácido original, posição,

34 / 154 aminoácido original, aminoácido inserido #1, aminoácido inserido #2; etc.]. Por exemplo, a inserção de lisina e alanina após glicina na posição 195 é indicada como “Gly195GlyLysAla” ou “G195GKA”.

[00120] Em tais casos, o(s) resíduo(s) de aminoácido(s) inserido(s) é(são) numerado(s) pela adição de letras minúsculas ao número de posição do resíduo de aminoácido precedendo o(s) resíduo(s) de aminoácido(s) inserido(s). No exemplo acima, a sequência seria assim: Genitor: Variante: 195 195 195a 195b G G-K-A

[00121] Alterações múltiplas. Variantes compreendendo múltiplas alterações são separadas por um sinal de mais (“+”), por exemplo, “Arg170Tyr + Gly195Glu” ou “R170Y + G195E” representando uma substituição de arginina e glicina nas posições 170 e 195 por tirosina e ácido glutâmico, respectivamente.

[00122] Diferentes alterações. Onde alterações diferentes podem ser introduzidas em uma posição, as alterações diferentes são separadas por uma vírgula, por exemplo, “Arg170Tyr,Glu” representa uma substituição de arginina na posição 170 por tirosina ou ácido glutâmico. Assim, “Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala” designa as seguintes variantes:

[00123] “Tyr167Gly + Arg170Gly”, “Tyr167Gly + Arg170Ala”, “Tyr167Ala + Arg170Gly” e “Tyr167Ala + Arg170Ala”.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[00124] A presente invenção se relaciona com um processo para melhoria da qualidade nutricional de grãos secos destilados (DDG) ou grãos secos destilados com solúveis (DDGS) produzidos como um coproduto de um processo de produção de produtos de fermentação, processos para produção de produtos de fermentação, bem como combinações de enzimas usadas nos processos.

[00125] O DDGS é tipicamente alimentado a gado porque o elevado

35 / 154 teor de fibra limita o valor nutricional para animais monogástricos (por exemplo, aves domésticas e suínos). Assim existe uma necessidade de uma solução que melhore especificamente o valor nutricional de DDGS para animais monogástricos. Por solubilização de parte da fibra, o valor nutricional para animais monogástricos pode ser aumentado. Um modo de solubilizar fibra é por adição de enzimas à combinação de ração, no entanto, o tempo de residência mais curto e condições in vivo menos do que ideais limitam a eficácia de enzimas adicionadas à ração.

[00126] O trabalho descrito aqui demonstra que a adição de uma xilanase ou combinação de enzimas compreendendo xilanase presentemente divulgada a montante durante o processo de produção de produtos de fermentação (por exemplo, durante a sacarificação e fermentação simultâneas) aumenta significativamente o grau de solubilização de fibras. Inesperadamente, como um benefício adicionado, a xilanase ou combinação de enzimas compreendendo xilanase presentemente divulgada aumenta o grau de solubilização de fibras sem resultar no escurecimento de DDGS durante o processo de secagem. I. COMBINAÇÕES DE ENZIMAS

[00127] A presente invenção contempla o uso de xilanases sozinhas, bem como em combinações de enzimas compreendendo xilanase e pelo menos uma enzima de adição, tal como uma composição celulolítica, na sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas, para melhorar a qualidade do DDGS produzido a jusante em ambos os processos de produção de etanol convencionais e por hidrólise de amido em bruto (RSH). Em um aspecto, a presente invenção se relaciona com xilanase ou combinações de enzimas compreendendo uma xilanase e/ou uma composição celulolítica para solubilização de fibra (por exemplo, fibra de milho, por exemplo, arabinose, xilose, etc.), por exemplo, durante a etapa de SSF (ou etapa de pré-sacarificação) de um processo de produção de produtos de

36 / 154 fermentação (por exemplo, etanol), preferencialmente sem resultar em escurecimento de DDG ou DDGS produzidos como um coproduto do processo de produção de produtos de fermentação. Quando a composição celulolítica é incluída na combinação, a razão da xilanase e da composição celulolítica pode ser otimizada para aumentar a solubilização de fibras de qualquer substrato particular (por exemplo, fibra de milho) e minimizar ou prevenir o escurecimento de DDG ou DDGS a jusante.

[00128] Em um aspecto, a presente invenção se relaciona com xilanase ou uma combinação de enzimas compreendendo uma xilanase. Em um aspecto, a presente invenção se relaciona com xilanase ou uma combinação de enzimas compreendendo uma xilanase e uma composição celulolítica, em que a razão da xilanase e composição celulolítica na combinação é de cerca de 5:95 a cerca de 95:5. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 10:90. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 15:85. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 20:80. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 25:75. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 30:70. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 35:65. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 40:60. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 45:55. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 50:50. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 55:45. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 60:40. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 65:35. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 70:30. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 75:25. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 80:20. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição celulolítica é 85:15. Em uma modalidade, a razão da xilanase e composição

37 / 154 celulolítica é 90:10. Xilanase

[00129] A presente invenção contempla o uso de qualquer xilanase que, quando opcionalmente combinada em conjunto com uma composição celulolítica em várias razões, é capaz de solubilizar a fibra (por exemplo, arabinose, xilose, etc.) em um processo de produção de produtos de fermentação, tais como especialmente etanol, preferencialmente sem resultando em um escurecimento dos DDGS após secagem.

[00130] Em uma modalidade, a xilanase é da ordem taxonômica Bacillales ou, preferencialmente, da família taxonômica Bacillaceae ou Paenibacillaceae ou, mais preferencialmente, do gênero taxonômico Bacillus ou Paenibacillus ou, ainda mais preferencialmente, da espécie taxonômica Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis ou Paenibacillus pabuli. Em uma modalidade, a xilanase tem pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 e é obtida ou obtenível a partir da ordem taxonômica Bacillales ou, preferencialmente, da família taxonômica Bacillaceae ou Paenibacillaceae ou, mais preferencialmente, do gênero taxonômico Bacillus ou Paenibacillus ou, ainda mais preferencialmente, da espécie taxonômica Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis ou Paenibacillus pabuli. Em uma modalidade, a xilanase é uma xilanase da subfamília 8 de GH30 (aqui referida como xilanases GH30_8).

[00131] A xilanase pode ser (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 1, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou

38 / 154 100%, que tem atividade de xilanase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da xilanase difere em até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, a xilanase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, é um fragmento de SEQ ID NO: 1 em que o fragmento tem atividade de xilanase ou compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e uma extensão N- e/ou C-terminal de até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos.

[00132] A xilanase pode ser (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 2, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que tem atividade de xilanase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da xilanase difere em até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, de SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, a xilanase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, é um fragmento de SEQ ID NO: 2 em que o fragmento tem atividade de xilanase ou compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e uma extensão N- e/ou C-terminal de até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos.

[00133] A xilanase pode ser (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 3, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que tem atividade de xilanase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da xilanase difere em até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, de SEQ ID NO: 3. Em uma modalidade, a xilanase

39 / 154 compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, é um fragmento de SEQ ID NO: 3 em que o fragmento tem atividade de xilanase ou compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e uma extensão N- e/ou C-terminal de até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos.

[00134] A xilanase pode ser (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 4, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que tem atividade de xilanase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da xilanase difere em até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, de SEQ ID NO: 4. Em uma modalidade, a xilanase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, é um fragmento de SEQ ID NO: 4 em que o fragmento tem atividade de xilanase ou compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 e uma extensão N- e/ou C-terminal de até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos.

[00135] A xilanase pode ser (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 5, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que tem atividade de xilanase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da xilanase difere em até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, de SEQ ID NO: 5. Em uma modalidade, a xilanase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, é um fragmento de SEQ ID NO: 5 em que o fragmento tem atividade de xilanase ou compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e uma

40 / 154 extensão N- e/ou C-terminal de até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos.

[00136] A xilanase pode ser (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 6, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que tem atividade de xilanase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da xilanase difere em até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, de SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, a xilanase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, é um fragmento de SEQ ID NO: 6 em que o fragmento tem atividade de xilanase ou compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 e uma extensão N- e/ou C-terminal de até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos.

[00137] A xilanase pode ser (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 7, por exemplo, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que tem atividade de xilanase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos da xilanase difere em até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, de SEQ ID NO: 7. Em uma modalidade, a xilanase compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, é um fragmento de SEQ ID NO: 7 em que o fragmento tem atividade de xilanase ou compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 e uma extensão N- e/ou C-terminal de até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos.

[00138] Outros exemplos de xilanases adequadas são os seguintes

41 / 154 números de acesso GENESEQP: BCM03690, BBY25441, BBD43833, AZG87760, BBW75090, BCM03682, BBW96675, BCM03671, ADJ35022, BBW83525, BCM03685, BBW88031, BCM03707, AZH70238, AZG87766, BBX36748, BCM03686, AZQ23477, BCM03677, BCM03691, BCM03681, BCM03676, BCM03688, AZG68558, ADJ35028, BCM03687, BBG80964, AZX66647, AZH70244, BCM03689, AZM95903, BBW79314, BBX47049, BCM03683, BCM03679, BBW95840, BBX52401, BBW92246, BBX42063 e AZG68552.

[00139] Outros exemplos de xilanases adequadas são os seguintes números de acesso Uniprot: A0A016QIT0, A0A024BEN2, A0A059N8P2, A0A060J1Q4, A0A060J3N3, A0A060MDP8, A0A063XEB2, A0A063Z3F5, A0A066ZQH2, A0A068QG80, A0A069DJA1, A0A074QA16, A0A076GH62, A0A076X095, A0A080UGI0, A0A081DRH7, A0A081L9P3, A0A085CCQ4, A0A086DRT4, A0A086SGC4, A0A086WWT9, A0A089J0T9, A0A089L7Q4, A0A089LS30, A0A089MA96, A0A089MMY5, A0A090ZY18, A0A093UG96, A0A097RET6, A0A097RT57, A0A0A0TJX0, A0A0A0TS05, A0A0A1STB1, A0A0A7GLZ8, A0A0A8C3V5, A0A0B0QGI0, A0A0B4S841, A0A0C2TMZ1, A0A0C5CYD2, A0A0D7XHL0, A0A0D7XPV8, A0A0D8JJW7, A0A0E1LNG3, A0A0E1P2T5, A0A0F5MCQ0, A0A0F5YUV2, A0A0G2M1V3, A0A0G2Z099, A0A0G3VDP8, A0A0H1RW51, A0A0H3DZC9, A0A0J1HNE5, A0A0J1I8S6, A0A0J5XBB3, A0A0J6E3H1, A0A0J6ENY2, A0A0J6MZ81, A0A0J6PTT5, A0A0K0HYL4, A0A0K6JZ62, A0A0K6L1E5, A0A0K6L5C0, A0A0K6LRC5, A0A0K6MBZ9, A0A0K9EI79, A0A0K9G2M8, A0A0L6C9N3, A0A0L7MT05, A0A0L7SGL4, A0A0M0HBT0, A0A0M2EI36, A0A0M2S6E2, A0A0M9X369, A0A0P0TKN9, A0A0P7GC51, A0A0Q3W7T1, A0A0Q4R8I7, A0A0Q7SDS0, A0A0R3K873, A0A0T6LD54, A0A0U3M226, A0A0U5Q000,

42 / 154 A0A0V8QN06, A0A0V8QPQ0, A0A0V8RCK0, A0A0W1Q0Y8, A0A0W7XI48, A0A0W8K830, A0A0X1TCR2, A0A0X8C7K8, A0A0X8DHN5, A0A0X8KDH2, A0A101YC92, A0A101YL97, A0A117SZP6, A0A124JQM2, A0A125UIF6, A0A127DQZ4, A0A132BP80, A0A132TGU4, A0A132TSQ5, A0A136AEB9, A0A142F586, A0A150L2Y6, A0A160EHD0, A0A164XMN2, A0A172HNW1, A0A172XIR5, A0A199NI63, A0A199WHT5, A0A1A0CC44, A0A1A0G7Q3, A0A1A5VV23, A0A1A5YLD9, A0A1A7LKF3, A0A1B2AW76, A0A1C3SIT4, A0A1C4AHG6, A0A1D9PK78, A0A1E4Y0F1, A0A1G9MAD1, A0A1J0BBP6, A0A1J0C7I7, A0A1J5WRC5, A0A1J6F1D5, A0A1K1TBA7, A0A1L3PT45, A0A1L3QYI6, A0A1L3SH52, A0A1L4DM20, A0A1L5LNU4, A0A1L6CEM3, A0A1L6ZLN8, A0A1L6ZTD9, A0A1M7SMM4, A0A1N6S500, A0A1N7B930, A0A1N7E7E0, A0A1R1E8G3, A0A1R1ESJ7, A0A1R1FQ77, A0A1R1GBK8, A0A1R1GT02, A0A1R1HH77, A0A1S2F2R2, A0A1U3ULV5, A7Z5A1, A8FDV2, B3KF38, D1MEP8, D3EH02, D4FXC2, E0RDU2, E1ACF9, E1UV03, E3E322, E8VJ45, F4E4B0, F4EKU6, G0IKW9, G4EVQ6, G4HGL4, G4P7F1, G7W2J1, H0FNN1, H1ACZ7, H2AJ54, H3K352, H6CPJ0, H6WCZ0, H8XMR3, I4XB64, J0X3V6, J7JVZ4, K2HJT3, K2P3H7, L0BLZ3, L0CY72, L8AKB2, M1KJT1, M1U2J5, M1XAU4, M2U9N8, N0DFI8, Q45070, Q6YK37, Q70K02, R9TYN3, S6FS40, S6FXS9, U1T362, U1ZC44, U2TM90, U4PL99, U5X5B8, V5MRU9, V7Q6M1, V9REY3, W4AZH7, W4BXI4, W4C6X9, W4D801, W4DEL3, W8ILG7 e W9TFT6.

[00140] Em uma modalidade, a xilanase compreende uma xilanase variante tendo uma ou mais substituições descritas no Pedido EP N.º

17177304.7 (incorporado aqui por referência na sua totalidade).

[00141] Em uma modalidade, a xilanase compreende uma xilanase variante tendo uma ou mais substituições descritas no Pedido de Patente

43 / 154 Internacional N.º PCT/EP2017/065336 (incorporado aqui por referência na sua totalidade).

[00142] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido no qual uma região de um polipeptídeo está fundida ao terminal N ou terminal C de uma região de outro polipeptídeo.

[00143] A xilanase pode ser um polipeptídeo de fusão ou um polipeptídeo de fusão clivável no qual outro polipeptídeo está fundido no terminal N ou no terminal C do polipeptídeo da presente invenção. Um polipeptídeo de fusão é produzido por fusão de um polinucleotídeo codificando outro polipeptídeo a um polinucleotídeo da presente invenção. Técnicas para produção de polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica e incluem ligação das sequências codificantes que codificam os polipeptídeos tal que fiquem em fase de leitura e que a expressão do polipeptídeo de fusão esteja sob o controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador. Polipeptídeos de fusão podem ser também construídos usando tecnologia de inteína na qual os polipeptídeos de fusão são criados pós-translacionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

[00144] Um polipeptídeo de fusão pode compreender adicionalmente um local de clivagem entre os dois polipeptídeos. Após secreção da proteína de fusão, o local é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de locais de clivagem incluem os, mas não estão limitados aos, locais divulgados em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

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[00145] A xilanase pode ser obtida a partir de microrganismos de qualquer gênero. Para propósitos da presente invenção, o termo “obtido a partir de” como usado aqui em combinação com uma dada fonte deverá significar que o genitor codificado por um polinucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma estirpe na qual o polinucleotídeo da fonte foi inserido. Em um aspecto, o genitor é secretado extracelularmente.

[00146] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo bacteriano Gram-positivo tal como um polipeptídeo de Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus ou Streptomyces tendo atividade de xilanase. Em uma modalidade, o polipeptídeo é de uma bactéria da classe Bacilli, tal como da ordem Bacillales ou, preferencialmente, da família taxonômica Bacillaceae ou Paenibacillaceae ou, mais preferencialmente, do gênero taxonômico Bacillus ou Paenibacillus ou, ainda mais preferencialmente, da espécie taxonômica Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis ou Paenibacillus pabuli.

[00147] Em um aspecto, a xilanase é uma xilanase de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ou Bacillus thuringiensis.

[00148] Em um aspecto preferencial, a xilanase é uma xilanase de Bacillus subtilis, por exemplo, a xilanase tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[00149] Será entendido que, para as espécies acima mencionadas, a invenção engloba tanto os estados perfeitos como imperfeitos, e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, independentemente do nome da espécie pelo qual sejam conhecidos. Os peritos na técnica

45 / 154 reconhecerão prontamente a identidade de equivalentes apropriados.

[00150] Estirpes destas espécies estão prontamente acessíveis ao público em um número de coleções de cultura, tal como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[00151] A xilanase pode ser identificada e obtida a partir de outras fontes incluindo microrganismos isolados da natureza (por exemplo, solo, adubos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente a partir de materiais naturais (por exemplo, solo, adubos, água, etc.) usando as sondas acima mencionadas. Técnicas para isolamento de microrganismos e DNA diretamente a partir de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. Um polinucleotídeo codificando um genitor pode ser depois obtido por rastreamento similar de uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA de outro microrganismo ou amostra de DNA misto. Uma vez detectado um polinucleotídeo codificando um genitor com a(s) sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado por utilização de técnicas que são conhecidas dos peritos na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

[00152] Em uma modalidade, a xilanase é uma xilanase GH30_8 de Bacillus. Xilanases GH30_8 exemplificativas de uso nas combinações de enzimas e processos da presente invenção incluem aquelas dos gêneros taxonômicos de Bacteroides, Cellvibrio, Clostridium, Cystobacter, Bacillus, Dickeya, Fibrobacter, Geobacillus, Meloidogyne, Micromonospora, Mucilaginibacter, Paenibacillus, Paludibacter, Radopholus, Ruminococcus, Serratia, Streptomyces, Verrucosispora, e Xanthomonas.

[00153] Em uma modalidade, a xilanase é uma xilanase GH30_8 selecionada do grupo consistindo em: (i) a xilanase de Bacillus subtilis de SEQ ID NO: 1 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%,

46 / 154 pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; (ii) a xilanase de Bacillus subtilis de SEQ ID NO: 2 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; (iii) a xilanase de Bacillus subtilis de SEQ ID NO: 3 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; (iv) a xilanase de Bacillus amyloliquefaciens de SEQ ID NO: 4 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; (v) a xilanase de Bacillus amyloliquefaciens de SEQ ID NO: 5 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; (vi) a xilanase de Bacillus licheniformis de SEQ ID NO: 6 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; e (vii) a xilanase de Paenibacillus pabuli de SEQ ID NO: 2 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo

47 / 154 menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta.

[00154] Em uma modalidade, a xilanase é uma xilanase GH30_8 de uma estirpe do gênero Clostridium, por exemplo: (i) uma xilanase de Clostridium acetobutylicum, tal como aquela divulgada como SEQ ID NO: 1 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta ou aquela divulgada como SEQ ID NO: 36 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta ou aquela divulgada como SEQ ID NO: 37 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; (ii) uma xilanase de Clostridium papyrosolvens, tal como aquela divulgada como SEQ ID NO: 2 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta ou aquela divulgada como SEQ ID NO: 17 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo

48 / 154 menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; (iii) uma xilanase de Clostridium thermocellum, tal como aquela divulgada como SEQ ID NO: 10 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; (iv) uma Clostridium saccharoperbutylacetonicum, tal como aquela divulgada como SEQ ID NO: 11 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta ou aquela divulgada como SEQ ID NO: 15 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta ou aquela divulgada como SEQ ID NO: 35 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; ou (v) uma xilanase de Clostridium sp. DL-VIII, tal como aquela divulgada como SEQ ID NO: 10 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta.

[00155] Em uma modalidade, a xilanase é uma xilanase GH30_8 de

49 / 154 uma estirpe do gênero Bacteroides, tal como uma xilanase de Bacteroides clarus, tal como aquela divulgada como SEQ ID NO: 29 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta.

[00156] Em uma modalidade, a xilanase é uma xilanase GH30_8 de uma estirpe do gênero Cellvibrio, tal como uma xilanase de Cellvibrio japonicas, tal como aquela divulgada como SEQ ID NO: 9 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta.

[00157] Em uma modalidade, a xilanase é uma xilanase GH30_8 de uma estirpe do gênero Cystobacter, tal como uma xilanase de Cystobacter fuscus, tal como aquela divulgada como SEQ ID NO: 7 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta.

[00158] Em uma modalidade, a xilanase é uma xilanase GH30_8 de uma estirpe do gênero Bacillus, por exemplo: (i) uma xilanase de Bacillus amyloliquefaciens, tal como aquela divulgada como SEQ ID NO: 25 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; (ii) uma xilanase de Bacillus atrophaeus, tal como aquela divulgada

50 / 154 como SEQ ID NO: 20 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; (iii) uma xilanase de Bacillus licheniformis, tal como aquela divulgada como SEQ ID NO: 24 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; (iv) uma Bacillus pumilus, tal como aquela divulgada como SEQ ID NO: 22 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta ou aquela divulgada como SEQ ID NO: 23 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; (v) uma xilanase de Bacillus stratosphericus, tal como aquela divulgada como SEQ ID NO: 21 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; (vi) uma xilanase de Bacillus subtilis, tal como aquela divulgada como SEQ ID NO: 5 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%,

51 / 154 pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; ou (vii) uma xilanase de Bacillus xiamenensis, tal como aquela divulgada como SEQ ID NO: 19 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta.

[00159] Em uma modalidade, a xilanase é uma xilanase GH30_8 de uma estirpe do gênero Dickeya, tal como uma xilanase de Dickeya chrysanthemi, tal como aquela divulgada como SEQ ID NO: 31 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta.

[00160] Em uma modalidade, a xilanase é uma xilanase GH30_8 de uma estirpe do gênero Fibrobacter, tal como uma xilanase de Fibrobacter succinogenes, tal como aquela divulgada como SEQ ID NO: 26 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta.

[00161] Em uma modalidade, a xilanase é uma xilanase GH30_8 de uma estirpe do gênero Geobacillus, tal como uma xilanase de Geobacillus sp., tal como aquela divulgada como SEQ ID NO: 16 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos

52 / 154 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta.

[00162] Em uma modalidade, a xilanase é uma xilanase GH30_8 de uma estirpe do gênero Meloidogyne, tal como uma xilanase de Meloidogyne incognita, tal como aquela divulgada como SEQ ID NO: 32 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta.

[00163] Em uma modalidade, a xilanase é uma xilanase GH30_8 de uma estirpe do gênero Micromonospora, tal como (i) uma xilanase de Micromonospora lupini str., tal como aquela divulgada como SEQ ID NO: 18 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; ou (ii) uma xilanase de Micromonospora sp., tal como aquela divulgada como SEQ ID NO: 28 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta.

[00164] Em uma modalidade, a xilanase é uma xilanase GH30_8 de uma estirpe do gênero Mucilaginibacter, tal como uma xilanase de Mucilaginibacter paludis, tal como aquela divulgada como SEQ ID NO: 4 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo

53 / 154 menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta ou aquela divulgada como SEQ ID NO: 30 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta.

[00165] Em uma modalidade, a xilanase é uma xilanase GH30_8 de uma estirpe do gênero Paenibacillus, tal como uma xilanase de Paenibacillus sp., tal como aquela divulgada como SEQ ID NO: 13 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta.

[00166] Em uma modalidade, a xilanase é uma xilanase GH30_8 de uma estirpe do gênero Paludibacter, tal como uma xilanase de Paludibacter propionicigenes, tal como aquela divulgada como SEQ ID NO: 3 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta.

[00167] Em uma modalidade, a xilanase é uma xilanase GH30_8 de uma estirpe do gênero Radopholus, tal como uma xilanase de Radopholus similis, tal como aquela divulgada como SEQ ID NO: 33 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta.

[00168] Em uma modalidade, a xilanase é uma xilanase GH30_8 de

54 / 154 uma estirpe do gênero Ruminococcus, tal como uma xilanase de Ruminococcus sp., tal como aquela divulgada como SEQ ID NO: 12 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta.

[00169] Em uma modalidade, a xilanase é uma xilanase GH30_8 de uma estirpe do gênero Serratia, tal como uma xilanase de Serratia sp. E-15, tal como aquela divulgada como SEQ ID NO: 6 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta.

[00170] Em uma modalidade, a xilanase é uma xilanase GH30_8 de uma estirpe do gênero Streptomyces, tal como uma xilanase de Streptomyces bingchenggensis, tal como aquela divulgada como SEQ ID NO: 14 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta.

[00171] Em uma modalidade, a xilanase é uma xilanase GH30_8 de uma estirpe do gênero Verrucosispora, tal como uma xilanase de Verrucosispora marie, tal como aquela divulgada como SEQ ID NO: 27 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos

55 / 154 com esta.

[00172] Em uma modalidade, a xilanase é uma xilanase GH30_8 de uma estirpe do gênero Xanthomonas, tal como uma xilanase de Xanthomonas campestris, tal como aquela divulgada como SEQ ID NO: 8 em US2016/040203 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta.

[00173] Em uma modalidade, a xilanase não é uma xilanase GH10. Em uma modalidade, a xilanase não é uma xilanase GH11.

[00174] Em uma modalidade, a xilanase, por exemplo, xilanase GH30, tal como especialmente xilanase GH30_8, por exemplo de SEQ NOs: 1-7, ou suas variantes, é doseado na pré-sacarificação, sacarificação e/ou sacarificação e fermentação simultâneas em uma concentração de entre 0,0001-1 mg de EP (Proteína de Enzima)/g de DS, por exemplo, 0,0005-0,5 mg de EP/g de DS, tal como 0,001-0,1 mg de EP/g de DS. Composição Celulolítica

[00175] A presente invenção contempla o uso de qualquer composição celulolítica que, quando combinada com uma xilanase em várias razões, é capaz de solubilizar a fibra (por exemplo, arabinose, xilose, etc.) em um processo de produção de produtos de fermentação, tais como especialmente etanol, sem resultando em um escurecimento dos DDGS após secagem. A composição celulolítica usada em uma combinação de enzimas ou processo da invenção para produção de produtos de fermentação pode ser derivada de qualquer microrganismo. Como usado aqui, “derivada de qualquer microrganismo” significa que a composição celulolítica compreende uma ou mais enzimas que foram expressas no microrganismo. Por exemplo, uma composição celulolítica derivada de uma estirpe de Trichoderma reesei

56 / 154 significa que a composição celulolítica compreende uma ou mais enzimas que foram expressas em Trichoderma reesei.

[00176] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus aurantiacus, Aspergillus niger ou Aspergillus oryzae.

[00177] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Chrysosporium, tal como uma estirpe de Chrysosporium lucknowense.

[00178] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Humicola, tal como uma estirpe de Humicola insolens.

[00179] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Penicilium, tal como uma estirpe de Penicilium emersonii ou Penicilium oxalicum.

[00180] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Talaromyces, tal como uma estirpe de Talaromyces aurantiacus ou Talaromyces emersonii.

[00181] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Trichoderma, tal como uma estirpe de Trichoderma reesei.

[00182] Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Trichoderma reesei. Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica de Trichoderma reesei compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I; (ii) uma celobioidrolase II; (iii) uma beta-glucosidase; e (iv) um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica. Em outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Trichoderma reesei compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus; (ii) uma celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus;

57 / 154 (iii) uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica de Penicillium emersonii.

[00183] Em outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Trichoderma reesei compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou pelo menos três enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I; (ii) uma beta-glucosidase; e (iii) uma endoglucanase. Em outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Trichoderma reesei compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou pelo menos três enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus; (ii) uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus; e (iii) uma endoglucanase de Trichoderma reesei.

[00184] Ainda em outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Trichoderma reesei compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I compreendendo os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 8 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 8; (ii) uma celobioidrolase II compreendendo os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 9 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 9; (iii) uma beta-glucosidase compreendendo os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 10 ou uma sua variante tendo pelo menos uma substituição selecionada do grupo consistindo em F100D, S283G, N456E e F512Y e pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos

58 / 154 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 10; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica compreendendo os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 11 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 11.

[00185] Em uma modalidade, a composição celulolítica de Trichoderma reesei compreende adicionalmente uma endoglucanase.

[00186] Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Aspergillus aurantiacus. Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica de Aspergillus aurantiacus compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I; (ii) uma celobioidrolase II; (iii) uma beta-glucosidase; e (iv) um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica. Em outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Aspergillus aurantiacus compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus; (ii) uma celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus; (iii) uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica de Penicillium emersonii.

[00187] Ainda em outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Aspergillus aurantiacus compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do

59 / 154 grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I compreendendo os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 8 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 8; (ii) uma celobioidrolase II compreendendo os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 9 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 9; (iii) uma beta-glucosidase compreendendo os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 10 ou uma sua variante tendo pelo menos uma substituição selecionada do grupo consistindo em F100D, S283G, N456E e F512Y e pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 10; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica compreendendo os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 11 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 11.

[00188] Em uma modalidade, a composição celulolítica de Aspergillus aurantiacus compreende adicionalmente uma endoglucanase.

[00189] Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Aspergillus niger. Em uma modalidade

60 / 154 preferencial, a composição celulolítica de Aspergillus niger compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I; (ii) uma celobioidrolase II; (iii) uma beta-glucosidase; e (iv) um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica. Em outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Aspergillus niger compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus; (ii) uma celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus; (iii) uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica de Penicillium emersonii.

[00190] Ainda em outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Aspergillus niger compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I compreendendo os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 8 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 8; (ii) uma celobioidrolase II compreendendo os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 9 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 9; (iii) uma beta-glucosidase compreendendo os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 10 ou uma sua variante tendo pelo menos uma substituição selecionada do grupo consistindo em F100D, S283G, N456E e F512Y e pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos

61 / 154 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 10; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica compreendendo os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 11 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 11.

[00191] Em uma modalidade, a composição celulolítica de Aspergillus niger compreende adicionalmente uma endoglucanase.

[00192] Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Aspergillus oryzae. Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica de Aspergillus oryzae compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I; (ii) uma celobioidrolase II; (iii) uma beta-glucosidase; e (iv) um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica. Em outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Aspergillus oryzae compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus; (ii) uma celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus; (iii) uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica de Penicillium emersonii.

[00193] Ainda em outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Aspergillus oryzae compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I compreendendo os aminoácidos 27

62 / 154 a 532 de SEQ ID NO: 8 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 8; (ii) uma celobioidrolase II compreendendo os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 9 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 9; (iii) uma beta-glucosidase compreendendo os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 10 ou uma sua variante tendo pelo menos uma substituição selecionada do grupo consistindo em F100D, S283G, N456E e F512Y e pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 10; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica compreendendo os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 11 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 11.

[00194] Em uma modalidade, a composição celulolítica de Aspergillus oryzae compreende adicionalmente uma endoglucanase.

[00195] Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Penicilium emersonii. Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica de Penicilium emersonii compreende

63 / 154 pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I; (ii) uma celobioidrolase II; (iii) uma beta-glucosidase; e (iv) um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica. Em outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Penicilium emersonii compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus; (ii) uma celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus; (iii) uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica de Penicillium emersonii.

[00196] Ainda em outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Penicilium emersonii compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I compreendendo os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 8 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 8; (ii) uma celobioidrolase II compreendendo os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 9 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 9; (iii) uma beta-glucosidase compreendendo os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 10 ou uma sua variante tendo pelo menos uma substituição selecionada do grupo consistindo em F100D, S283G, N456E e F512Y e pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%,

64 / 154 pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 10; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica compreendendo os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 11 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 11.

[00197] Em uma modalidade, a composição celulolítica de Penicilium emersonii compreende adicionalmente uma endoglucanase.

[00198] Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Penicilium oxalicum. Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica de Penicilium oxalicum compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I; (ii) uma celobioidrolase II; (iii) uma beta-glucosidase; e (iv) um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica. Em outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Penicilium oxalicum compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus; (ii) uma celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus; (iii) uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica de Penicillium emersonii.

[00199] Ainda em outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Penicilium oxalicum compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I compreendendo os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 8 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo

65 / 154 menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 8; (ii) uma celobioidrolase II compreendendo os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 9 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 9; (iii) uma beta-glucosidase compreendendo os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 10 ou uma sua variante tendo pelo menos uma substituição selecionada do grupo consistindo em F100D, S283G, N456E e F512Y e pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 10; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica compreendendo os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 11 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 11.

[00200] Em uma modalidade, a composição celulolítica de Penicilium oxalicum compreende adicionalmente uma endoglucanase.

[00201] Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Talaromyces aurantiacus. Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica de Talaromyces aurantiacus compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo

66 / 154 menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I; (ii) uma celobioidrolase II; (iii) uma beta-glucosidase; e (iv) um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica. Em outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Talaromyces aurantiacus compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus; (ii) uma celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus; (iii) uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica de Penicillium emersonii.

[00202] Ainda em outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Talaromyces aurantiacus compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I compreendendo os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 8 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 8; (ii) uma celobioidrolase II compreendendo os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 9 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 9; (iii) uma beta-glucosidase compreendendo os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 10 ou uma sua variante tendo pelo menos uma substituição selecionada do grupo consistindo em F100D, S283G, N456E e F512Y e pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%,

67 / 154 pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 10; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica compreendendo os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 11 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 11.

[00203] Em uma modalidade, a composição celulolítica de Talaromyces aurantiacus compreende adicionalmente uma endoglucanase.

[00204] Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Talaromyces emersonii. Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica de Talaromyces emersonii compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I; (ii) uma celobioidrolase II; (iii) uma beta-glucosidase; e (iv) um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica. Em outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Talaromyces emersonii compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus; (ii) uma celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus; (iii) uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica de Penicillium emersonii.

[00205] Ainda em outra modalidade preferencial, a composição celulolítica de Talaromyces emersonii compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I compreendendo os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 8 ou uma sua variante tendo pelo

68 / 154 menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 8; (ii) uma celobioidrolase II compreendendo os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 9 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 9; (iii) uma beta-glucosidase compreendendo os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 10 ou uma sua variante tendo pelo menos uma substituição selecionada do grupo consistindo em F100D, S283G, N456E e F512Y e pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 10; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica compreendendo os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 11 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 11.

[00206] Em uma modalidade, a composição celulolítica de Talaromyces emersonii compreende adicionalmente uma endoglucanase.

[00207] A composição celulolítica pode compreender adicionalmente múltiplas atividades enzimáticas, tais como uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo consistindo em acetilxilana esterase, acilglicerol lipase, amilase, alfa-amilase, beta-amilase, arabinofuranosidase,

69 / 154 celobioidrolases, celulase, feruloil esterase, galactanase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, beta-glucanase, beta-glucosidase, glucana 1,4-a- glucosidase, glucana 1,4-alfa-maltoidrolase, glucana 1,4-a-glucosidase, glucana 1,4-alfa-maltoidrolase, lisofosfolipase, lisozima, alfa-manosidase, beta-manosidase (mananase), fitase, fosfolipase A1, fosfolipase A2, fosfolipase D, protease, pululanase, pectinesterase, triacilglicerol lipase, xilanase, beta-xilosidase ou qualquer sua combinação.

[00208] Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende um ou mais agentes de formulação como divulgado aqui, preferencialmente um ou mais dos compostos selecionados da lista consistindo em glicerol, etilenoglicol, 1,2-propilenoglicol ou 1,3-propilenoglicol, cloreto de sódio, benzoato de sódio, sorbato de potássio, sulfato de sódio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, tiossulfato de sódio, carbonato de cálcio, citrato de sódio, dextrina, glucose, sacarose, sorbitol, lactose, amido, caulim e celulose.

[00209] Em uma modalidade, a composição celulolítica, por exemplo, derivada de uma estirpe de Aspergillus, Penicilium, Talaromyces ou Trichoderma, tal como uma composição celulolítica de Trichoderma reesei, é doseada na pré-sacarificação, sacarificação e/ou sacarificação e fermentação simultâneas em uma concentração de 0,0001-3 mg de EP/g de DS, preferencialmente 0,0005-2 mg de EP/g de DS, preferencialmente 0,001-1 mg/g de DS, mais preferencial de 0,005-0,5 mg de EP/g de DS, ainda mais preferencial 0,01-0,1 mg de EP/g de DS. II. PROCESSOS PARA PRODUÇÃO DE PRODUTOS DE

FERMENTAÇÃO

[00210] A invenção se relaciona também com processos para produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido usando um organismo fermentador, em que uma xilanase ou uma combinação de enzimas compreendendo uma xilanase e opcionalmente uma composição celulolítica (por exemplo, derivada de Trichoderma reesei) é adicionada antes e/ou

70 / 154 durante a fermentação. Os peritos na técnica apreciarão que qualquer uma das xilanases ou combinações de enzimas descritas na Seção I acima, ou de outro modo descritas aqui, pode ser usada nos processos da invenção, incluindo nos processos da Seção II. Processos para produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido não gelatinizado

[00211] Em um aspecto, a invenção se relaciona com processos para produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido sem gelatinização (isto é, sem cozimento) do material contendo amido (frequentemente referido como um processo de “hidrólise de amido em bruto”), em que uma xilanase ou combinação de enzimas compreendendo uma xilanase e uma composição celulolítica (por exemplo, derivada de Trichoderma reesei) presentemente divulgadas são adicionadas. O produto de fermentação, tal como etanol, pode ser produzido sem liquefação da pasta semifluida aquosa contendo o material contendo amido e água. Em uma modalidade, um processo da invenção inclui sacarificação de material contendo amido (por exemplo, moído), por exemplo, amido granular, abaixo da temperatura de gelatinização inicial, preferencialmente na presença de alfa- amilase e/ou enzima(s) geradora(s) de fonte de carboidratos para produzir açúcares que podem ser fermentados no produto de fermentação por um organismo fermentador adequado. Em esta modalidade, o produto de fermentação desejado, por exemplo, etanol, é produzido a partir de grãos de cereais não gelatinizados (isto é, não cozidos), preferencialmente moídos, tais como milho.

[00212] Conformemente, em um aspecto, a invenção se relaciona com processos para produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo sacarificação e fermentação simultâneas do material contendo amido usando uma enzima geradora de fonte de carboidratos e um organismo fermentador a uma temperatura abaixo da

71 / 154 temperatura de gelatinização inicial do referido material contendo amido na presença de uma xilanase ou uma combinação de enzimas da invenção. Xilanases e combinações de enzimas exemplificativas de uso nos processos são descritas na Seção I acima intitulada “Combinações de Enzimas”. A sacarificação e a fermentação podem ser também separadas. Assim, em outro aspecto, a invenção se relaciona com processos de produção de produtos de fermentação, compreendendo as seguintes etapas: (i) sacarificação de um material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial usando uma enzima geradora de fonte de carboidratos, por exemplo, uma glucoamilase; e (ii) fermentação usando um organismo de fermentação; em que as etapas (i) e/ou (ii) são levados a cabo usando pelo menos uma glucoamilase e pelo menos uma xilanase ou combinação de enzimas da invenção. Em uma modalidade, um coproduto do processo é recuperado. O coproduto pode ter qualidade nutricional melhorada em comparação com um coproduto produzido por um processo similar onde a xilanase ou combinação de enzimas compreendendo xilanase não está presente ou não é adicionada à pré-sacarificação, sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas. Em uma modalidade, o coproduto é DDG ou DDGS. Em uma modalidade, os DDG ou DDGS têm TME aumentada, por exemplo, para animais monogástricos, em comparação com DDG ou DDGS produzidos por um processo similar onde a xilanase ou combinação de enzimas compreendendo xilanase não está presente ou não é adicionada à pré-sacarificação, sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas.

[00213] Em uma modalidade, a xilanase ou pelo menos uma combinação de enzimas da presente invenção é adicionada durante a etapa de sacarificação (i). Em uma modalidade, a xilanase ou pelo menos uma combinação de enzimas da presente invenção é adicionada durante a etapa de

72 / 154 fermentação (ii).

[00214] Em uma modalidade, uma alfa amilase, em particular, uma alfa-amilase fúngica, é também adicionada na etapa (i). As etapas (i) e (ii) podem ser realizados simultaneamente. Em uma modalidade, a xilanase ou pelo menos uma combinação de enzimas da presente invenção é adicionada durante a sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). Em uma modalidade, o organismo fermentador é levedura e a xilanase ou pelo menos uma combinação de enzimas é adicionada durante a propagação da levedura. Processos para produção de produtos de fermentação a partir de material contendo amido gelatinizado

[00215] Em um aspecto, a invenção se relaciona com processos para produção de produtos de fermentação, especialmente etanol, a partir de material contendo amido, processo esse que inclui uma etapa de liquefação e etapas de sacarificação e fermentação sequencialmente ou simultaneamente realizadas. Consequentemente, a invenção se relaciona com um processo para produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo as etapas de: (a) liquefação de material contendo amido na presença de uma alfa-amilase para formar um purê liquefeito; (b) sacarificação do purê liquefeito usando uma enzima geradora de fonte de carboidratos para produzir um açúcar fermentável; e (c) fermentação do açúcar usando um organismo fermentador sob condições adequadas para produzir o produto de fermentação; em que uma xilanase ou pelo menos uma combinação de enzimas da presente invenção é adicionada antes do ou durante a etapa (ii). Em uma modalidade, um coproduto do processo é recuperado. O coproduto pode ter qualidade nutricional melhorada em comparação com um coproduto produzido por um processo similar onde a xilanase ou combinação de enzimas compreendendo xilanase não está presente ou não é adicionada à pré-

73 / 154 sacarificação, sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas. Em uma modalidade, o coproduto é DDG ou DDGS. Em uma modalidade, os DDG ou DDGS têm TME aumentada, por exemplo, para animais monogástricos, em comparação com DDG ou DDGS produzidos por um processo similar onde a xilanase ou combinação de enzimas compreendendo xilanase não está presente ou não é adicionada à pré- sacarificação, sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas.

[00216] A pasta semifluida é aquecida até acima da temperatura de gelatinização e uma variante de alfa-amilase pode ser adicionada para iniciar a liquefação (diluição). A pasta semifluida pode em uma modalidade ser cozida a jato para gelatinizar adicionalmente a pasta semifluida antes de ser sujeita a alfa-amilase na etapa (a). A liquefação pode em uma modalidade ser levada a cabo como um processo de pasta semifluida a quente em três etapas. A pasta semifluida é aquecida até entre 60-95 °C, preferencialmente, entre 70- 90 °C, tal como preferencialmente entre 80-85 °C a um pH de 4-6, em particular a um pH de 4,5-5,5, e variante de alfa-amilase, opcionalmente em conjunto com uma protease, uma enzima geradora de fonte de carboidratos, tal como uma glucoamilase, uma fosfolipase, uma fitase e/ou pululanase, são adicionadas para iniciar a liquefação (diluição). O processo de liquefação é usualmente levado a cabo a um pH de 4-6, em particular a um pH de 4,5 a 5,5. A etapa de sacarificação (b) pode ser levado a cabo usando condições bem conhecidas na técnica. Por exemplo, um passo de sacarificação total pode durar até de cerca de 24 a cerca de 72 horas, no entanto, é comum fazer somente uma pré-sacarificação de tipicamente 40-90 minutos a uma temperatura entre 30-65 °C, tipicamente cerca de 60 °C, seguida por sacarificação completa durante a fermentação em um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (processo SSF). A sacarificação é tipicamente levada a cabo a uma temperatura de 20 a 75 °C, em particular, 40

74 / 154 a 70 °C, tipicamente em torno de 60 °C, e a um pH entre 4 e 5, normalmente a cerca de pH 4,5. O processo mais amplamente usado para produzir um produto de fermentação, especialmente etanol, é um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF), no qual não existe uma fase de retenção para a sacarificação, significando que um organismo fermentador, tal como levedura, e enzima(s), podem ser adicionados em conjunto. A SSF pode ser tipicamente levada a cabo a uma temperatura de 25 °C a 40 °C, tal como de 28 °C a 35 °C, tal como de 30 °C a 34 °C, preferencialmente em torno de cerca de 32 °C. Em uma modalidade, a fermentação dura durante 6 a 120 horas, em particular 24 a 96 horas. Materiais Contendo Amido

[00217] Qualquer material de partida contendo amido adequado pode ser usado em um processo da presente invenção. O material de partida é geralmente selecionado com base no produto de fermentação desejado. Exemplos de materiais de partida contendo amido, adequados para uso nos processos da presente invenção, incluem cevada, feijões, mandioca, cereais, milho, milo, ervilhas, batatas, arroz, centeio, sagu, sorgo, batatas-doces, tapioca, trigo e grãos inteiros ou qualquer sua mistura. O material contendo amido pode ser também um tipo ceroso ou não ceroso de milho e cevada. Em uma modalidade preferencial, o material contendo amido é milho. Em uma modalidade preferencial, o material contendo amido é trigo. Produtos de Fermentação

[00218] O termo “produto de fermentação” significa um produto produzido por um método ou processo incluindo fermentação usando um organismo fermentador. Os produtos de fermentação incluem álcoois (por exemplo, etanol, metanol, butanol); ácidos orgânicos (por exemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacônico, ácido láctico, ácido succínico, ácido glucônico); cetonas (por exemplo, acetona); aminoácidos (por exemplo, ácido glutâmico); gases (por exemplo, H2 e CO2); antibióticos (por exemplo,

75 / 154 penicilina e tetraciclina); enzimas; vitaminas (por exemplo, riboflavina, B12, beta-caroteno); e hormônios. Em uma modalidade preferencial, o produto de fermentação é etanol, por exemplo, etanol combustível; etanol potável, isto é, bebidas alcoólicas potáveis; ou etanol industrial ou produtos usados na indústria do álcool consumível (por exemplo, cerveja e vinho), indústria dos lacticínios (por exemplo, produtos lácteos fermentados), indústria das peles e indústria do tabaco. Tipos de cerveja preferenciais compreendem ales, stouts, porters, lagers, bitters, licores de malte, happoushu, cerveja com muito álcool, cerveja com pouco álcool, cerveja baixa em calorias ou cerveja sem álcool. Em uma modalidade, o produto de fermentação é etanol. Organismos Fermentadores

[00219] O termo “organismo fermentador” se refere a qualquer organismo, incluindo organismos bacterianos e fúngicos, tais como levedura e fungos filamentosos, adequado para produção de um produto de fermentação desejado. Os organismos fermentadores adequados são capazes de fermentar, isto é, converter, açúcares fermentáveis, tais como arabinose, frutose, glucose, maltose, manose ou xilose, diretamente ou indiretamente no produto de fermentação desejado.

[00220] Exemplos de organismos fermentadores incluem organismos fúngicos tais como levedura. Leveduras preferenciais incluem estirpes de Saccharomyces, em particular Saccharomyces cerevisiae ou Saccharomyces uvarum; estirpes de Pichia, em particular Pichia stipitis tal como Pichia stipitis CBS 5773 ou Pichia pastoris; estirpes de Candida, em particular Candida arabinofermentans, Candida boidinii, Candida diddensii, Candida shehatae, Candida sonorensis, Candida tropicalis ou Candida utilis. Outros organismos fermentadores incluem estirpes de Hansenula, em particular Hansenula anomala ou Hansenula polymorpha; estirpes de Kluyveromyces, em particular Kluyveromyces fragilis ou Kluyveromyces marxianus; e estirpes de Schizosaccharomyces, em particular Schizosaccharomyces pombe.

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[00221] Em uma modalidade, o organismo fermentador é um organismo fermentador de açúcares C6, tal como uma estirpe de, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae.

[00222] Em uma modalidade, o organismo fermentador é um organismo fermentador de açúcares C5, tal como uma estirpe de, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae. Fermentação

[00223] As condições de fermentação são determinadas com base, por exemplo, no tipo de material vegetal, nos açúcares fermentáveis disponíveis, no(s) organismo(s) fermentador(es) e/ou no produto de fermentação desejado. Um perito na técnica pode facilmente determinar condições de fermentação adequadas. A fermentação pode ser levada a cabo em condições convencionalmente usadas. Processos de fermentação preferenciais são processos anaeróbicos.

[00224] Por exemplo, as fermentações podem ser levadas a cabo a temperaturas tão elevadas como 75 °C, por exemplo, entre 40-70 °C, tal como entre 50-60 °C. No entanto são também conhecidas bactérias com uma temperatura ótima significativamente mais baixa até em torno da temperatura ambiente (em torno de 20 °C). Exemplos de organismos fermentadores adequados podem ser encontrados na seção “Organismos Fermentadores” acima.

[00225] Para produção de etanol usado levedura, a fermentação pode continuar durante 24 a 96 horas, em particular durante 35 a 60 horas. Em uma modalidade, a fermentação é levada a cabo a uma temperatura entre 20 e 40 °C, preferencialmente 26 a 34 °C, em particular em torno de 32 °C. Em uma modalidade, o pH é de pH 3 a 6, preferencialmente em torno de pH 4 a 5. Recuperação de Produtos de Fermentação

[00226] Subsequente à fermentação ou SSF, o produto de fermentação pode ser separado do meio de fermentação. A pasta semifluida pode ser

77 / 154 destilada para se extrair o produto de fermentação desejado (por exemplo, etanol). Alternativamente, o produto de fermentação desejado pode ser extraído do meio de fermentação por técnicas de microfiltração ou filtração com membranas. O produto de fermentação pode ser também recuperado por separação ou outro método bem conhecido na técnica. Tipicamente, o produto de fermentação, por exemplo, etanol, com uma pureza de até, por exemplo, cerca de 96 por cento por vol. de etanol é obtido.

[00227] Assim, em uma modalidade, o método da invenção compreende adicionalmente destilação para se obter o produto de fermentação, por exemplo, etanol. A fermentação e a destilação podem ser levadas a cabo simultaneamente e/ou separadamente/sequencialmente; opcionalmente seguidas por um ou mais etapas do processo para refinamento adicional do produto de fermentação.

[00228] Após a completação do processo de destilação, o material restante é considerado a vinhaça inteira. Como usado aqui, o termo “vinhaça inteira” inclui o material que permanece no final do processo de destilação após recuperação do produto de fermentação, por exemplo, etanol. O produto de fermentação pode ser opcionalmente recuperado por qualquer método conhecido na técnica. Separação (Desidratação) de Vinhaça Inteira em Vinhaça Fina e Bolo Úmido

[00229] Em uma modalidade, a vinhaça inteira é separada ou dividida em uma fase sólida e líquida por um ou mais métodos para separação da vinhaça fina do bolo úmido.

[00230] A separação de vinhaça inteira em vinhaça fina e bolo úmido de modo a se remover uma porção significativa do líquido/água pode ser feita usando qualquer técnica de separação adequada, incluindo centrifugação, compressão e filtração. Em uma modalidade preferencial, a separação/desidratação é levada a cabo por centrifugação. Centrífugas preferenciais na indústria são centrífugas tipo decantadoras, preferencialmente

78 / 154 centrífugas tipo decantadoras de elevada velocidade. Um exemplo de uma centrífuga adequada é a séria de cones íngremes NX 400 da Alfa Laval que é uma decantadora de elevado desempenho. Em outra modalidade preferencial, a separação é levada a cabo usando outro equipamento de separação convencional tal como uma prensa de filtração de placa/grelha, prensas de filtro de correia, prensas de parafuso, espessadores de gravidade e andares ou equipamento similar. Processamento de Vinhaça Fina

[00231] A vinhaça fina é o termo usado para o sobrenadante da centrifugação da vinhaça inteira. Tipicamente, a vinhaça fina contém 4-6 por cento de sólidos secos (DS) (maioritariamente proteínas, fibra solúvel, fibras finas e componentes da parede celular) e tem uma temperatura de cerca de 60- 90 graus centígrados. A corrente de vinhaça fina pode ser condensada por evaporação para proporcionar duas correntes de processo incluindo: (i) uma corrente de condensado do evaporador compreendendo água condensada removida a partir da vinhaça fina durante a evaporação e (ii) uma corrente de xarope, compreendendo uma corrente mais concentrada dos sólidos dissolvidos e não dissolvidos não voláteis, tais como açúcares não fermentáveis e óleo, permanecendo presentes a partir da vinhaça fina como o resultado da remoção da água evaporada. Opcionalmente, o óleo pode ser removido a partir da vinhaça fina ou pode ser removido como uma etapa intermediária ao processo de evaporação, que é tipicamente levado a cabo usando uma série de várias fases de evaporação. O xarope e/ou o xarope sem óleo podem ser introduzidos em um secador em conjunto com os grãos úmidos (da etapa de separação da vinhaça inteira) para proporcionar um produto referido como grão seco destilado com solúveis, que pode ser também usado como ração animal.

[00232] Em uma modalidade, o xarope e/ou o xarope sem óleo são pulverizados em um ou mais secadores para combinar o xarope e/ou o xarope

79 / 154 sem óleo com a vinhaça inteira para produzir grão seco destilado com solúveis.

[00233] Entre 5-90% em vol., tal como entre 10-80%, tal como entre 15-70%, tal como entre 20-60%, da vinhaça fina (por exemplo, opcionalmente hidrolisada) pode ser reciclado (como contracorrente) para a etapa (a). A vinhaça fina reciclada (isto é, contracorrente) pode constituir de cerca de 1-70% em vol., preferencialmente 15-60% em vol., especialmente de cerca de 30 a 50% em vol. da pasta semifluida formada na etapa (a).

[00234] Em uma modalidade, o processo compreende adicionalmente reciclagem de pelo menos uma porção da corrente de vinhaça fina para a pasta semifluida, opcionalmente após o óleo ter sido extraído a partir da corrente de vinhaça fina. Secagem de Bolo Úmido e Produção de Grãos Secos Destilados e Grãos Secos Destilados com Solúveis

[00235] Após o bolo úmido, contendo cerca de 25-40% em peso, preferencialmente 30-38% em peso, de sólidos secos, ter sido separado da vinhaça fina (por exemplo, desidratado) pode ser seco em um secador de tambor, secador pulverizador, secador de anel, secador de leito fluido ou similar para produzir “Grãos Secos Destilados” (DDG). O DDG é um ingrediente de ração valioso para animais, tais como gado, aves domésticas e peixes. É preferencial proporcionar DDG com um teor de menos do que cerca de 10-12% em peso de umidade para evitar bolor e desagregação microbiana e aumentar a vida útil. Adicionalmente, o elevado teor de umidade também torna mais caro transportar o DDG. O bolo úmido é preferencialmente seco sob condições que não desnaturam as proteínas no bolo úmido. O bolo úmido pode ser combinado com xarope separado da vinhaça fina e seco em DDG com Solúveis (DDGS). Produtos intermediários parcialmente secos, tal como são por vezes referidos como grãos destilados úmidos modificados, podem ser produzidos por secagem parcial do bolo úmido, opcionalmente com a adição

80 / 154 de xarope antes do, durante o ou após o processo de secagem III. PROCESSOS PARA MELHORIA DA QUALIDADE NUTRICIONAL

DE DDG OU DDGS

[00236] Em outro aspecto, a presente invenção se relaciona com um processo para melhoria da qualidade nutricional de grãos secos destilados (DGS) ou grãos secos destilados com solúveis (DDGS) produzidos como um coproduto de um processo de produção de produtos de fermentação, processos para produção de produtos de fermentação.

[00237] Em uma modalidade, um processo para melhoria da qualidade nutricional de DGS ou DDGS produzidos como coproduto de um processo de produção de fermentação compreende realização de um processo para produção de um produto de fermentação descrito acima na Seção II (por exemplo, um processo RSH ou um processo de cozimento convencional incluindo uma etapa de liquefação) ou Exemplos aqui e recuperação do produto de fermentação para produzir DGS ou DDGS como um coproduto, em que os DGS ou DDGS produzidos têm qualidade nutricional melhorada. A etapa de recuperação do produto de fermentação para produzir DGS ou DDGS como o coproduto pode incluir qualquer um ou combinação das etapas descritas acima de recuperação de produto(s) de fermentação, por exemplo por destilação, para produzir vinhaça inteira, separação da vinhaça inteira em bolo úmido e vinhaça fina, processamento de vinhaça fina, secagem de bolo úmido e produção de DDG ou DDGS, etc.

[00238] Como usado aqui, “qualidade nutricional melhorada” significa um aumento na verdadeira energia metabolizável (TME) dos DDG ou DDGS em pelo menos 5% em comparação com os DDG ou DDGS produzidos em um processo de produção de produtos de fermentação (por exemplo, um processo RSH ou processo de cozimento convencional, incluindo uma etapa de liquefação como apresentado na Seção II ou nos Exemplos aqui) no qual uma xilanase ou combinação de enzimas presentemente divulgada não foi

81 / 154 adicionada durante a pré-sacarificação, sacarificação, fermentação e/ou sacarificação e fermentação simultâneas.

[00239] Em uma modalidade, as combinações de enzimas e processos da presente invenção aumentam a TME dos DDG ou DDGS em pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 11%, pelo menos 12%, pelo menos 13%, pelo menos 14%, pelo menos 15%, pelo menos 16%, pelo menos 17%, pelo menos 18%, pelo menos 19%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 26%, pelo menos 27%, pelo menos 28%, pelo menos 29% ou pelo menos 30% em comparação com DDG ou DDGS produzidos em um processo de produção de produtos de fermentação (por exemplo, um processo RSH ou processo de cozimento convencional, incluindo uma etapa de liquefação como apresentado na Seção II ou nos Exemplos aqui) no qual uma xilanase ou combinação de enzimas presentemente divulgada não foi adicionada durante a pré-sacarificação, sacarificação, fermentação e/ou sacarificação e fermentação simultâneas.

[00240] Em uma modalidade, a xilanase ou combinações de enzimas e processos da presente invenção melhoram a qualidade nutricional dos DDG ou DDGS sem resultar em um escurecimento dos DDG ou DDGS após secagem. Os peritos na técnica apreciarão que a extensão do escurecimento dos DDG ou DDGS após secagem após adição de uma xilanase ou uma combinação de enzimas da presente invenção durante um processo de produção de produtos de fermentação (por exemplo, durante SSF enquanto se produz etanol usando um substrato de purê de milho) pode ser prontamente avaliada, por exemplo, por medição da cor de DDG ou DDGS usando a escala de Cor de Hunter (ver Exemplos aqui). Enzimas

[00241] A(s) enzima(s) e polipeptídeos descritos em baixo são para serem usados em uma “quantidade eficaz” em combinações ou processos da

82 / 154 presente invenção. O texto em baixo deve ser lido no contexto da divulgação de enzimas na seção “Definições” acima. Composições Celulolíticas Usadas em uma Combinação de Enzimas ou Processo e Método da Invenção

[00242] A composição celulolítica usada em um processo da invenção para produção de produtos de fermentação pode ser derivada de qualquer microrganismo. Como usado aqui, “derivada de qualquer microrganismo” significa que a composição celulolítica compreende uma ou mais enzimas que foram expressas no microrganismo. Por exemplo, uma composição celulolítica derivada de uma estirpe de Trichoderma reesei significa que a composição celulolítica compreende uma ou mais enzimas que foram expressas em Trichoderma reesei.

[00243] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus aurantiacus, Aspergillus niger ou Aspergillus oryzae.

[00244] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Chrysosporium, tal como uma estirpe de Chrysosporium lucknowense.

[00245] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Humicola, tal como uma estirpe de Humicola insolens.

[00246] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Penicilium, tal como uma estirpe de Penicilium emersonii ou Penicilium oxalicum.

[00247] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Talaromyces, tal como uma estirpe de Talaromyces aurantiacus ou Talaromyces emersonii.

[00248] Em uma modalidade, a composição celulolítica é derivada de uma estirpe de Trichoderma, tal como uma estirpe de Trichoderma reesei.

[00249] Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica é

83 / 154 derivada de uma estirpe de Trichoderma reesei.

[00250] A composição celulolítica pode compreender um ou mais dos seguintes polipeptídeos, incluindo enzimas: polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica, beta-glucosidase, CBHI, CBHII ou uma mistura de dois, três ou quatro das mesmas.

[00251] Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica compreendendo uma beta-glucosidase tem um valor de carga de ED50 Relativo de menos do que 1,00, preferencialmente menos do que 0,80, tal como preferencialmente menos do que 0,60, tal como entre 0,1-0,9, tal como entre 0,2-0,8, tal como 0,30-0,70.

[00252] A composição celulolítica pode compreender alguma hemicelulase, tal como, por exemplo, xilanase e/ou beta-xilosidase. A hemicelulase pode vir do organismo produtor de composição celulolítica ou de outras fontes, por exemplo, a hemicelulase pode ser estranha ao organismo produtor de composição celulolítica, tal como, por exemplo, Trichoderma reesei.

[00253] Em uma modalidade preferencial, o teor de hemicelulase na composição celulolítica constitui menos do que 10% em peso tal como menos do que 5% em peso da composição celulolítica.

[00254] Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende uma beta-glucosidase.

[00255] Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica e uma beta-glucosidase.

[00256] Em outra modalidade, a composição celulolítica compreende uma beta-glucosidase e uma CBH.

[00257] Em outra modalidade, a composição celulolítica compreende um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica, uma beta- glucosidase e uma CBHI.

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[00258] Em outra modalidade, a composição celulolítica compreende uma beta-glucosidase e uma CBHI.

[00259] Em outra modalidade, a composição celulolítica compreende um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica, uma beta- glucosidase, uma CBHI e uma CBHII.

[00260] Em outra modalidade, a composição celulolítica compreende uma beta-glucosidase, uma CBHI e uma CBHII.

[00261] A composição celulolítica pode compreender adicionalmente uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma celulase, um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica, uma esterase, uma expansina, uma lacase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma swolenina.

[00262] Em uma modalidade, a celulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistindo em uma endoglucanase, uma celobioidrolase e uma beta-glucosidase.

[00263] Em uma modalidade, a endoglucanase é uma endoglucanase I.

[00264] Em uma modalidade, a endoglucanase é uma endoglucanase II. Beta-Glucosidase

[00265] A composição celulolítica usada de acordo com a invenção pode em uma modalidade compreender uma ou mais beta-glucosidase. A beta-glucosidase pode em uma modalidade ser uma derivada de uma estirpe do gênero Aspergillus, tal como Aspergillus oryzae, tal como aquela divulgada em WO 2002/095014 ou a proteína de fusão tendo atividade de beta-glucosidase divulgada em WO 2008/057637, ou Aspergillus fumigatus, tal como uma divulgada em WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 10 aqui ou uma variante de beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus, tal como uma divulgada em WO 2012/044915 ou pedido PCT copendente PCT/US11/054185 (ou pedido provisório dos EUA # 61/388,997), tal como

85 / 154 uma com as seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y.

[00266] Em outra modalidade, a beta-glucosidase é derivada de uma estirpe do gênero Penicillium, tal como uma estirpe de Penicillium brasilianum divulgada em WO 2007/019442, ou uma estirpe do gênero Trichoderma, tal como uma estirpe de Trichoderma reesei.

[00267] Em uma modalidade, a beta-glucosidase é uma beta- glucosidase de Aspergillus fumigatus ou seu homólogo selecionado do grupo consistindo em: (i)uma beta-glucosidase compreendendo o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 10; (ii) uma beta-glucosidase compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, por exemplo, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 10 aqui; (iii) uma beta-glucosidase codificada por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 70%, por exemplo, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 em WO 2013/148993; e (iv) uma beta-glucosidase codificada por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de pelo menos elevada estringência, por exemplo, condições de muito elevada estringência, com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 em WO 2013/148993 ou o seu complemento de comprimento total.

[00268] Em uma modalidade, a beta-glucosidase é uma variante compreendendo uma substituição em uma ou mais (várias) posições correspondendo às posições 100, 283, 456 e 512 do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 10 aqui, em que a variante tem atividade de beta-glucosidase.

[00269] Em uma modalidade, a beta-glucosidase genitora da variante é

86 / 154 (a) um polipeptídeo compreendendo o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 10 aqui; (b) um polipeptídeo tendo pelo menos 80% de identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 10 aqui; (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de elevada ou muito elevada estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 em WO 2013/148993, (ii) a sequência de cDNA contida na sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 em WO 2013/148993 ou (iii) a fita complementar de comprimento total de (i) ou (ii); (d) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 80 % de identidade com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 5 em WO 2013/148993 ou a sua sequência de cDNA; ou (e) um fragmento do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 10 aqui, que tem atividade beta-glucosidase.

[00270] Em uma modalidade, a variante de beta-glucosidase tem pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos da beta- glucosidase genitora.

[00271] Em uma modalidade, a variante tem pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 10 aqui.

[00272] Em uma modalidade, a beta-glucosidase é de uma estirpe de

87 / 154 Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus fumigatus, tal como uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 10 aqui), que compreende uma ou mais substituições selecionadas do grupo consistindo de L89M, G91L, F100D, I140V, I186V, S283G, N456E e F512Y; tal como uma sua variante com as seguintes substituições: - F100D + S283G + N456E + F512Y; - L89M + G91L + I186V + I140V; - I186V + L89M + G91L + I140V + F100D + S283G + N456E + F512Y.

[00273] Em uma modalidade, o número de substituições é entre 1 e 4, tal como 1, 2, 3 ou 4 substituições.

[00274] Em uma modalidade, a variante compreende uma substituição em uma posição correspondendo à posição 100, uma substituição em uma posição correspondendo à posição 283, uma substituição em uma posição correspondendo à posição 456 e/ou uma substituição em uma posição correspondendo à posição 512.

[00275] Em uma modalidade preferencial, a variante de beta- glucosidase compreende as seguintes substituições: Phe100Asp, Ser283Gly, Asn456Glu, Phe512Tyr em SEQ ID NO: 10 aqui.

[00276] Em uma modalidade preferencial, a beta-glucosidase tem um valor de carga de ED50 Relativo de menos do que 1,00, preferencialmente menos do que 0,80, tal como preferencialmente menos do que 0,60, tal como entre 0,1-0,9, tal como entre 0,2-0,8, tal como 0,30-0,70. Polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica

[00277] A composição celulolítica usada de acordo com a invenção pode em uma modalidade compreender um ou mais polipeptídeos GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica. Em uma modalidade, a composição de enzimas compreende um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica, tal como um derivado do gênero Thermoascus, tal

88 / 154 como uma estirpe de Thermoascus aurantiacus, tal como aquele descrito em WO 2005/074656 como SEQ ID NO: 2; ou um derivado do gênero Thielavia, tal como uma estirpe de Thielavia terrestris, tal como aquele descrita em WO 2005/074647 como SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8; ou um derivado de uma estirpe de Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus fumigatus, tal como aquele descrito em WO 2010/138754 como SEQ ID NO: 2; ou um derivado de uma estirpe derivada de Penicillium, tal como uma estirpe de Penicillium emersonii, tal como aquele divulgado em WO 2011/041397 como SEQ ID NO: 11 aqui.

[00278] Em uma modalidade, o polipeptídeo GH61 de Penicillium sp. tendo atividade intensificadora celulolítica ou um seu homólogo é selecionado do grupo consistindo em: (i) um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica compreendendo o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 11 aqui; (ii) um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, por exemplo, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 11 aqui; (iii) um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica codificado por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 70%, por exemplo, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 7 em WO 2013/148993; e (iv) um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de pelo menos elevada estringência, por exemplo, condições de muito elevada estringência, com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID

89 / 154 NO: 7 em WO 2013/148993 ou o seu complemento de comprimento total. Celobioidrolase I

[00279] A composição celulolítica usada de acordo com a invenção pode em uma modalidade compreender uma ou mais CBH I (celobioidrolase I). Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende uma celobioidrolase I (CBHI), tal como uma derivada de uma estirpe do gênero Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus fumigatus, tal como a CBHI Cel7A divulgada em SEQ ID NO: 6 em WO 2011/057140 ou SEQ ID NO: 8 aqui, ou uma estirpe do gênero Trichoderma, tal como uma estirpe de Trichoderma reesei.

[00280] Em uma modalidade, a celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus ou um seu homólogo é selecionado do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I compreendendo o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8 aqui; (ii) uma celobioidrolase I compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, por exemplo, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 8 aqui; (iii) uma celobioidrolase I codificada por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 70%, por exemplo, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 em WO 2013/148993; e (iv) uma celobioidrolase I codificada por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de pelo menos elevada estringência, por exemplo, condições de muito elevada estringência, com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 em WO 2013/148993 ou o seu complemento de comprimento total. Celobioidrolase II

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[00281] A composição celulolítica usada de acordo com a invenção pode em uma modalidade compreender uma ou mais CBH II (celobioidrolase II). Em uma modalidade, a celobioidrolase II (CBH II), tal como uma derivada de uma estirpe do gênero de Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus fumigatus, tal como aquela em SEQ ID NO: 9 aqui ou uma estirpe do gênero Trichoderma, tal como Trichoderma reesei, ou uma estirpe do gênero Thielavia, tal como uma estirpe de Thielavia terrestris, tal como celobioidrolase II CEL6A de Thielavia terrestris.

[00282] Em uma modalidade, a celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus ou um seu homólogo é selecionado do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase II compreendendo o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 9 aqui; (ii) uma celobioidrolase II compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70%, por exemplo, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequências com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 9 aqui; (iii) uma celobioidrolase II codificada por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 70%, por exemplo, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequências com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 em WO 2013/148993; e (iv) uma celobioidrolase II codificada por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de pelo menos elevada estringência, por exemplo, condições de muito elevada estringência, com a sequência codificante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 em WO 2013/148993 ou o seu complemento de comprimento total. Composições Celulolíticas

[00283] Como mencionado acima, a composição celulolítica pode compreender um número de polipeptídeos diferentes, tais como enzimas.

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[00284] Em uma modalidade, a composição celulolítica compreende uma composição celulolítica de Trichoderma reesei, compreendendo adicionalmente o polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica de Thermoascus aurantiacus (WO 2005/074656) e proteína de fusão de beta-glucosidase de Aspergillus oryzae (WO 2008/057637).

[00285] Em outra modalidade, a composição celulolítica compreende uma composição celulolítica de Trichoderma reesei, compreendendo adicionalmente um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica de Thermoascus aurantiacus (SEQ ID NO: 2 em WO 2005/074656) e beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 2 de WO 2005/047499).

[00286] Em outra modalidade, a composição celulolítica compreende uma composição celulolítica de Trichoderma reesei, compreendendo adicionalmente o polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica de Penicillium emersonii divulgado em WO 2011/041397, beta- glucosidase de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 2 de WO 2005/047499) ou uma sua variante com as seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y.

[00287] A composição de enzimas da presente invenção pode estar em qualquer forma adequada para uso, tal como, por exemplo, um caldo de fermentação em bruto com ou sem células removidas, um lisado de células com ou sem detritos celulares, uma composição de enzimas semipurificada ou purificada ou uma célula hospedeira, por exemplo, célula hospedeira de Trichoderma, como uma fonte das enzimas.

[00288] A composição de enzimas pode ser um pó ou granulado seco, um granulado sem formação de poeira, um líquido, um líquido estabilizado, ou uma enzima protegida estabilizada. As composições de enzimas líquidas podem, por exemplo, ser estabilizadas por adição de estabilizantes tais como um açúcar, um álcool de açúcar ou outro poliol e/ou ácido láctico ou outro

92 / 154 ácido orgânico de acordo com processos estabelecidos.

[00289] Em uma modalidade preferencial, a composição celulolítica compreendendo uma beta-glucosidase tem um valor de carga de ED50 Relativo de menos do que 1,00, preferencialmente menos do que 0,80, tal como preferencialmente menos do que 0,60, tal como entre 0,1-0,9, tal como entre 0,2-0,8, tal como 0,30-0,70.

[00290] Em uma modalidade, a composição de enzimas celulolíticas é doseada (isto é, durante a etapa de sacarificação na etapa ii) e/ou fermentação na etapa iii) ou SSF) de 0,0001-3 mg de EP/g de DS, preferencialmente 0,0005-2 mg de PE/g de DS, preferencialmente 0,001-1 mg/g de DS, mais preferencial de 0,005-0,5 mg de EP/g de DS, ainda mais preferencial 0,01-0,1 mg de EP/g de DS. Alfa-Amilase Presente e/ou Adicionada Durante a Liquefação

[00291] De acordo com a invenção, uma alfa-amilase está presente e/ou é adicionada na liquefação opcionalmente em conjunto com outras enzimas tais como uma hemicelulase, uma endoglucanase, uma protease, uma enzima geradora de fonte de carboidratos, tal como uma glucoamilase, uma fosfolipase, uma fitase e/ou pululanase.

[00292] A alfa-amilase adicionada durante a etapa de liquefação i) pode ser qualquer alfa-amilase. São preferenciais alfa-amilases, tais como especialmente alfa-amilases de Bacillus, tais como alfa-amilases de Bacillus stearothermophilus, que são estáveis à temperatura usada durante a liquefação. Alfa-Amilase Bacteriana

[00293] O termo “alfa-amilase bacteriana” significa qualquer alfa- amilase bacteriana classificada sob EC 3.2.1.1. Uma alfa-amilase bacteriana usada de acordo com a invenção pode, por exemplo, ser derivada de uma estirpe do gênero Bacillus, que é por vezes também referido como o gênero Geobacillus. Em uma modalidade, a alfa-amilase de Bacillus é derivada de

93 / 154 uma estirpe de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus sp. TS-23 ou Bacillus subtilis, mas pode ser também derivada a partir de outra Bacillus sp.

[00294] Exemplos específicos de alfa-amilases bacterianas incluem a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus de SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 12 aqui, a alfa-amilase de Bacillus amyloliquefaciens de SEQ ID NO: 5 em WO 99/19467 e a alfa-amilase de Bacillus licheniformis de SEQ ID NO: 4 em WO 99/19467 e a alfa-amilase de Bacillus sp. TS-23 divulgada como SEQ ID NO: 1 em WO 2009/061380 (todas as sequências são deste modo incorporadas por referência).

[00295] Em uma modalidade, a alfa-amilase bacteriana pode ser uma enzima tendo um grau de identidade de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% com qualquer uma das sequências mostradas em SEQ ID NOS: 3, 4 ou 5, respectivamente, em WO 99/19467 e SEQ ID NO: 1 em WO 2009/061380.

[00296] Em uma modalidade, a alfa-amilase pode ser uma enzima tendo um grau de identidade de pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% com qualquer uma das sequências mostradas em SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 12 aqui.

[00297] Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase é derivada de Bacillus stearothermophilus. A alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus pode ser um tipo selvagem maduro ou uma sua variante madura. As alfa- amilases maduras de Bacillus stearothermophilus, ou sua variante, podem ser naturalmente truncadas durante a produção recombinante. Por exemplo, a alfa-amilase madura de Bacillus stearothermophilus pode ser truncada no

94 / 154 terminal C tal que tenha em torno de 491 aminoácidos em comprimento (em comparação com SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 12 aqui), tal como de 480-495 aminoácidos em comprimento.

[00298] A alfa-amilase de Bacillus pode ser também uma variante e/ou híbrido. Exemplos de uma tal variante podem ser encontrados em qualquer uma de WO 96/23873, WO 96/23874, WO 97/41213, WO 99/19467, WO 00/60059, WO 02/10355 e WO2009/061380 (todos os documentos são deste modo incorporados por referência). Variantes de alfa-amilase específicas são divulgadas nas Patentes dos E.U.A. N.os 6,093,562, 6,187,576, 6,297,038 e 7,713,723 (deste modo incorporadas por referência) e incluem variantes de alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus (frequentemente referidas como alfa-amilase BSG) tendo uma deleção de um ou dois aminoácidos em qualquer uma das posições R179, G180, I181 e/ou G182, preferencialmente a deleção dupla divulgada em WO 96/23873 – ver, por exemplo, página 20, linhas 1-10 (deste modo incorporada por referência), correspondendo preferencialmente à deleção das posições I181 e G182 em comparação com a sequência de aminoácidos da alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus apresentada em SEQ ID NO: 3 divulgada em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 12 aqui ou à deleção dos aminoácidos R179 e G180 usando SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 12 aqui. São ainda mais preferenciais alfa- amilases de Bacillus, especialmente alfa-amilases de Bacillus stearothermophilus (BSG), que têm pelo uma ou duas deleções de aminoácidos correspondendo às posições R179, G180, I181 e G182, preferencialmente que têm uma deleção dupla correspondendo a R179 e G180 ou, preferencialmente, uma deleção das posições 181 e 182 (denotada I181* + G182*) e, opcionalmente, compreendem adicionalmente uma substituição N193F (denotada I181* + G182* + N193F) em comparação com a sequência de aminoácidos de alfa-amilase BSG de tipo selvagem apresentada em SEQ ID NO: 3 divulgada em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 12 aqui. A alfa-

95 / 154 amilase bacteriana pode ter também uma substituição em uma posição correspondendo a S239 na alfa-amilase de Bacillus licheniformis mostrada em SEQ ID NO: 4 em WO 99/19467 ou uma variante S242 na alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus de SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 12 aqui.

[00299] Em uma modalidade, a variante é uma variante S242A, E ou Q, preferencialmente uma variante S242Q ou A, da alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus (usando SEQ ID NO: 12 aqui para numeração).

[00300] Em uma modalidade, a variante é uma variante da posição E188, preferencialmente uma variante E188P da alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus (usando SEQ ID NO: 12 aqui para numeração).

[00301] Outra variante contemplada é a variante de Bacillus sp. TS-23 divulgada em WO2009/061380, especialmente variantes definidas na reivindicação 1 de WO2009/061380 (deste modo incorporada por referência). Alfa-Amilases Híbridas Bacterianas

[00302] A alfa-amilase bacteriana pode ser também uma alfa-amilase bacteriana híbrida, por exemplo, uma alfa-amilase compreendendo 445 resíduos de aminoácidos C-terminais da alfa-amilase de Bacillus licheniformis (mostrada em SEQ ID NO: 4 de WO 99/19467) e os 37 resíduos de aminoácidos N-terminais da alfa-amilase derivada de Bacillus amyloliquefaciens (mostrada em SEQ ID NO: 5 de WO 99/19467). Em uma modalidade preferencial, este híbrido tem uma ou mais das, especialmente todas as, seguintes substituições:

[00303] G48A + T49I + G107A + H156Y + A181T + N190F + I201F + A209V + Q264S (usando a numeração de Bacillus licheniformis em SEQ ID NO: 4 de WO 99/19467). São também preferenciais variantes tendo uma ou mais das seguintes mutações (ou mutações correspondentes em outras alfa- amilases de Bacillus): H154Y, A181T, N190F, A209V e Q264S e/ou a deleção de dois resíduos entre as posições 176 e 179, preferencialmente a

96 / 154 deleção de E178 e G179 (usando SEQ ID NO: 5 de WO 99/19467 para numeração da posição).

[00304] Em uma modalidade, a alfa-amilase bacteriana é a parte madura da alfa-amilase quimérica divulgada em Richardson et al., 2002, The Journal of Biological Chemistry 277 (29): 267501-26507, referida como BD5088 ou uma sua variante. Esta alfa-amilase é a mesma que aquela mostrada em SEQ ID NO: 2 em WO 2007134207. A sequência da enzima madura começa após o aminoácido “Met” inicial na posição 1. Alfa-Amilase Termoestável

[00305] De acordo com a invenção, a alfa-amilase é opcionalmente usada em combinação com uma hemicelulase, preferencialmente xilanase, tendo um Ponto de Fusão (DSC) acima de 80 °C. Opcionalmente, uma endoglucanase tendo um Ponto de Fusão (DSC) acima de 70 °C, tal como acima de 75 ºC, em particular acima de 80 ºC, pode ser incluída. A alfa- amilase termoestável, tal como uma alfa-amilase bacteriana, é preferencialmente derivada de Bacillus stearothermophilus ou Bacillus sp. TS-23. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85°C, CaCl2 a 0,12 mM de pelo menos 10. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85°C, CaCl2 a 0,12 mM, de pelo menos 15. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85°C, CaCl2 a 0,12 mM, de pelo menos 20. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85°C, CaCl2 a 0,12 mM, de pelo menos 25. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85°C, CaCl2 a 0,12 mM, de pelo menos 30. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85°C, CaCl2 a 0,12 mM, de pelo menos 40. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85°C, CaCl2 a 0,12 mM, de pelo menos 50. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85°C, CaCl2 a 0,12 mM, de pelo menos 60. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 a 0,12

97 / 154 mM, entre 10-70. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 a 0,12 mM, entre 15-70. Em uma modalidade, a alfa- amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 a 0,12 mM, entre 20-70. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 a 0,12 mM, entre 25-70. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 a 0,12 mM, entre 30-70. Em uma modalidade, a alfa- amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 a 0,12 mM, entre 40-70. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 a 0,12 mM, entre 50-70. Em uma modalidade, a alfa-amilase tem um T½ (min) a pH 4,5, 85 °C, CaCl2 a 0,12 mM, entre 60-70.

[00306] Em uma modalidade, a alfa-amilase é uma alfa-amilase bacteriana, preferencialmente derivada do gênero Bacillus, especialmente uma estirpe de Bacillus stearothermophilus, em particular a Bacillus stearothermophilus como divulgada em WO 99/19467 como SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 12 aqui com um ou dois aminoácidos deletados nas posições R179, G180, I181 e/ou G182, em particular com R179 e G180 deletadas ou com I181 e G182 deletadas, com mutações na lista de mutações em baixo. Em modalidades preferenciais, as alfa-amilases de Bacillus stearothermophilus têm deleção dupla I181 + G182 e substituição opcional N193F, opcionalmente compreendendo adicionalmente mutações selecionadas da lista em baixo: - V59A+Q89R+G112D+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S; - V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S; - V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+D269E+ D281N; - V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+I270L; - V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+H274K; - V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+Y276F; - V59A+E129V+R157Y+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+H274K; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+D281N; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+G416V; - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S;

98 / 154 - V59A+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T; - A91L+M96I+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - E129V+K177L+R179E; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+Y276F+L427M; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284T; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S+N376*+I377*; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S; - E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S+M284T; - E129V+K177L+R179E+S242Q; - E129V+K177L+R179V+K220P+N224L+S242Q+Q254S; - K220P+N224L+S242Q+Q254S; - M284V; - V59A+Q89R+ E129V+ K177L+ R179E+ Q254S+ M284V.

[00307] Em uma modalidade, a alfa-amilase é selecionada do grupo de variantes de alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus: - I181*+G182*; - I181*+G182*+N193F; preferencialmente - I181*+G182*+E129V+K177L+R179E; - I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E; - 181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+ K220P+N224L+Q254S; - I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+ M284V; e -I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+ N224L+S242Q+ Q254S (usando SEQ ID NO: 12 aqui para numeração).

[00308] Em uma modalidade preferencial, a alfa-amilase bacteriana, tal como alfa-amilase de Bacillus, tal como alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais

99 / 154 preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 12 aqui.

[00309] Em uma modalidade preferencial, a variante de alfa-amilase bacteriana, tal como variante de alfa-amilase de Bacillus, tal como variante de alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 12 aqui.

[00310] Deve ser entendido que quando se faz referência a alfa- amilases de Bacillus stearothermophilus e suas variantes elas são normalmente produzidas naturalmente na forma truncada. Em particular, a truncação pode ser tal que a alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus mostrada em SEQ ID NO: 3 em WO 99/19467 ou SEQ ID NO: 12 aqui, ou suas variantes, seja truncada no terminal C e tenha tipicamente em torno de 491 aminoácidos em comprimento, tal como de 480-495 aminoácidos em comprimento. Hemicelulase Termoestável Presente e/ou Adicionada Durante a Liquefação

[00311] De acordo com a invenção, uma hemicelulase opcional, preferencialmente xilanase, tendo um Ponto de Fusão (DSC) acima de 80 °C está presente e/ou é adicionada à etapa de liquefação i) em combinação com uma alfa-amilase, tal como uma alfa-amilase bacteriana (descrita acima).

[00312] A termoestabilidade de uma hemicelulase, preferencialmente

100 / 154 xilanase, pode ser determinada como descrito na seção “Materiais & Métodos” sob “Determinação de Td por Calorimetria Diferencial de Varrimento para Endoglucanases e Hemicelulases”.

[00313] Em uma modalidade, a hemicelulase, em particular xilanase, especialmente xilanase GH10 ou GH11, tem um Ponto de Fusão (DSC) acima de 82 °C, tal como acima de 84 °C, tal como acima de 86 °C, tal como acima de 88 °C, tal como acima de 90 °C, tal como acima de 92 °C, tal como acima de 94 °C, tal como acima de 96 °C, tal como acima de 98 °C, tal como acima de 100 ºC, tal como entre 80 °C e 110 °C, tal como entre 82 °C e 110 °C, tal como entre 84 °C e 110 °C.

[00314] Em uma modalidade preferencial, a hemicelulase, em particular xilanase, especialmente xilanase GH10, tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 13 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Dictyoglomus, tal como uma estirpe de Dictyogllomus thermophilum.

[00315] Em uma modalidade preferencial, a hemicelulase, em particular xilanase, especialmente xilanase GH11, tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais

101 / 154 preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 14 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Dictyoglomus, tal como uma estirpe de Dictyogllomus thermophilum.

[00316] Em uma modalidade preferencial, a hemicelulase, em particular xilanase, especialmente xilanase GH10, tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 15 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Rasamsonia, tal como uma estirpe de Rasomsonia byssochlamydoides.

[00317] Em uma modalidade preferencial, a hemicelulase, em particular xilanase, especialmente xilanase GH10, tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 16 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Talaromyces, tal como uma estirpe de Talaromyces leycettanus.

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[00318] Em uma modalidade preferencial, a hemicelulase, em particular xilanase, especialmente xilanase GH10, tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 17 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Aspergillus, tal como uma estirpe de Aspergillus fumigatus. Endoglucanase Termoestável Presente e/ou Adicionada Durante a Liquefação

[00319] De acordo com a invenção, uma endoglucanase (“E”) opcional tendo um Ponto de Fusão (DSC) acima de 70 °C, tal como entre 70 °C e 95 °C, pode estar presente e/ou ser adicionada na etapa de liquefação i) em combinação com uma alfa-amilase, tal como uma alfa-amilase bacteriana termoestável, e uma hemicelulase opcional, preferencialmente xilanase, tendo um Ponto de Fusão (DSC) acima de 80 °C. A termoestabilidade de uma endoglucanase pode ser determinada como descrito na seção “Materiais & Métodos” de WO 2017/112540 (incorporada aqui por referência na sua totalidade) sob o cabeçalho “Determinação de Td por Calorimetria Diferencial de Varrimento para Endoglucanases e Hemicelulases”.

[00320] Em uma modalidade, a endoglucanase tem um Ponto de Fusão (DSC) acima de 72 °C, tal como acima de 74 °C, tal como acima de 76 °C, tal como acima de 78 °C, tal como acima de 80 °C, tal como acima de 82 °C, tal como acima de 84 °C, tal como acima de 86 °C, tal como acima de 88 °C, tal como entre 70 °C e 95 °C, tal como entre 76 °C e 94 °C, tal como entre 78 °C

103 / 154 e 93 °C, tal como entre 80 °C e 92 °C, tal como entre 82 °C e 91 °C, tal como entre 84 °C e 90 °C.

[00321] Em uma modalidade preferencial, a endogluconase usada em um processo da invenção ou compreendida em uma composição da invenção é uma endoglucanase da Família de Glicosídeo Hidrolases 5 ou endoglucanase GH5 (ver a base de dados CAZy na webpage “www.cazy.org”).

[00322] Em uma modalidade, a endoglucanase GH5 é da família EG II, tal como a endoglucanase de Talaromyces leycettanus mostrada em SEQ ID NO: 18 aqui; endoglucanase de Penicillium capsulatum mostrada em SEQ ID NO: 19 aqui e endoglucanase de Trichophaea saccata mostrada em SEQ ID NO: 20 aqui.

[00323] Em uma modalidade, a endoglucanase é uma endoglucanase da família GH45. Em uma modalidade, a endoglucanase GH45 é da família EG V, tal como a Sordaria fimicola mostrada em SEQ ID NO: 21 aqui ou a endoglucanase de Thielavia terrestris mostrada em SEQ ID NO: 22 aqui.

[00324] Em uma modalidade, a endoglucanase tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94%, e ainda o mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 18 aqui. Em uma modalidade, a endoglucanase é derivada de uma estirpe do gênero Talaromyces, tal como uma estirpe de Talaromyces leycettanus.

[00325] Em uma modalidade, a endoglucanase tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade,

104 / 154 preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94%, e ainda o mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 19 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Penicillium, tal como uma estirpe de Penicillium capsulatum.

[00326] Em uma modalidade, a endoglucanase tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94%, e ainda o mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 20 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Trichophaea, tal como uma estirpe de Trichophaea saccata.

[00327] Em uma modalidade, a endoglucanase tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94%, e ainda o mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 21 aqui,

105 / 154 preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Sordaria, tal como uma estirpe de Sordaria fimicola.

[00328] Em uma modalidade, a endoglucanase tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94%, e ainda o mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 22 aqui, preferencialmente derivada de uma estirpe do gênero Thielavia, tal como uma estirpe de Thielavia terrestris.

[00329] Em uma modalidade, a endoglucanase é adicionada na etapa de liquefação i) a uma dose de 1-10.000 µg de EP (Proteína de Enzima)/g de DS, tal como 10-1.000 µg de EP/g de DS. Enzima Geradora de Fonte de Carboidratos Presente e/ou Adicionada Durante a Liquefação

[00330] De acordo com a invenção, uma enzima geradora de fonte de carboidratos opcional, em particular uma glucoamilase, preferencialmente uma glucoamilase termoestável, pode estar presente e/ou ser adicionada na liquefação em conjunto com uma alfa-amilase e hemicelulase opcional, preferencialmente xilanase, tendo um Ponto de Fusão (DSC) acima de 80 °C, e uma endoglucanase opcional tendo um Ponto de Fusão (DSC) acima de 70 °C e uma pululanase opcional e/ou fitase opcional.

[00331] O termo “enzima geradora de fonte de carboidratos” inclui quaisquer enzimas gerando açúcares fermentáveis. Uma enzima geradora de fonte de carboidratos é capaz de produzir um carboidrato que pode ser usado como uma fonte de energia pelo(s) organismo(s) fermentador(es) em questão,

106 / 154 por exemplo, quando usada em um processo da invenção para produção de um produto de fermentação, tal como etanol. Os carboidratos gerados podem ser convertidos diretamente ou indiretamente no produto de fermentação desejado, preferencialmente etanol. De acordo com a invenção pode ser usada uma mistura de enzimas geradoras de fontes de carboidratos. Exemplos específicos incluem glucoamilase (sendo geradoras de glucose), beta-amilase e amilase maltogênica (sendo geradora de maltose).

[00332] Em uma modalidade preferencial, a enzima geradora de fonte de carboidratos é termoestável. A enzima geradora de fontes de carboidratos, em particular glucoamilase termoestável, pode ser adicionada em conjunto com a ou separadamente da alfa-amilase e protease termoestável.

[00333] Em uma modalidade específica e preferencial, a enzima geradora de fonte de carboidratos é uma glucoamilase termoestável, preferencialmente de origem fúngica, preferencialmente de um fungo filamentoso, tal como de uma estirpe do gênero Penicillium, especialmente uma estirpe de Penicillium oxalicum, em particular a glucoamilase de Penicillium oxalicum divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 (que é deste modo incorporada por referência) e mostrada em SEQ ID NO: 23 aqui.

[00334] Em uma modalidade, a glucoamilase termoestável tem pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade com o polipeptídeo maduro mostrado em SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 ou SEQ ID NOs: 23 aqui.

[00335] Em uma modalidade, a enzima geradora de fonte de

107 / 154 carboidratos, em particular glucoamilase termoestável, é a glucoamilase de Penicillium oxalicum mostrada em SEQ ID NO: 23 aqui.

[00336] Em uma modalidade preferencial, a enzima geradora de fonte de carboidratos é uma variante da glucoamilase de Penicillium oxalicum divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/127802 e mostrada em SEQ ID NO: 23 aqui, tendo uma substituição K79V (referida como “PE001”) (usando a sequência madura mostrada em SEQ ID NO: 14 para numeração). A variante de glucoamilase K79V tem sensibilidade reduzida à degradação por protease em relação ao genitor como divulgado em WO 2013/036526 (que é deste modo incorporada por referência).

[00337] Variantes de glucoamilase de Penicillium oxalicum contempladas são divulgadas em WO 2013/053801 (que é deste modo incorporada por referência).

[00338] Em uma modalidade, estas variantes têm uma sensibilidade reduzida à degradação da protease.

[00339] Em uma modalidade, estas variantes têm termoestabilidade melhorada em comparação com o genitor.

[00340] Mais especificamente, em uma modalidade, a glucoamilase tem uma substituição K79V (usando SEQ ID NO: 23 aqui para numeração), correspondendo à variante PE001, e compreende adicionalmente pelo menos uma das seguintes substituições ou combinação de substituições: T65A; Q327F; E501V; Y504T; Y504*; T65A + Q327F; T65A + E501V; T65A + Y504T; T65A + Y504*; Q327F + E501V; Q327F + Y504T; Q327F + Y504*; E501V + Y504T; E501V + Y504*; T65A + Q327F + E501V; T65A + Q327F + Y504T; T65A + E501V + Y504T; Q327F + E501V + Y504T; T65A + Q327F + Y504*; T65A + E501V + Y504*; Q327F + E501V + Y504*; T65A + Q327F + E501V + Y504T; T65A + Q327F + E501V + Y504*; E501V + Y504T; T65A + K161S; T65A + Q405T; T65A + Q327W; T65A + Q327F; T65A + Q327Y; P11F + T65A + Q327F;

108 / 154

R1K + D3W + K5Q + G7V + N8S + T10K + P11S + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; R1E + D3N + P4G + G6R + G7A + N8A + T10D+ P11D + T65A + Q327F; P11F + T65A + Q327W; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; T65A + Q327F + E501V + Y504T; T65A + S105P + Q327W; T65A + S105P + Q327F; T65A + Q327W + S364P; T65A + Q327F + S364P; T65A + S103N + Q327F; P2N + P4S + P11F + K34Y + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + D445N + V447S; P2N + P4S + P11F + T65A + I172V + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + N502*; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + N502T + P563S + K571E; P2N + P4S + P11F + R31S + K33V + T65A + Q327F + N564D + K571S; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S377T; P2N + P4S + P11F + T65A + V325T+ Q327W; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + D445N + V447S + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + I172V + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S377T + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + D26N + K34Y + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + I375A + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + K218A + K221D + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + S103N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + T10D + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + F12Y + T65A + Q327F + E501V + Y504T; K5A + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + T10E + E18N + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + T10E + E18N + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + T568N; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + K524T + G526A; P2N + P4S + P11F + K34Y + T65A + Q327F + D445N + V447S + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + R31S + K33V + T65A + Q327F + D445N + V447S + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + D26N + K34Y + T65A + Q327F + E501V +

109 / 154 Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + F80* + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + K112S + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + T516P + K524T + G526A; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + N502T + Y504*; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + S103N + Q327F + E501V + Y504T; K5A + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T + T516P + K524T + G526A; P2N + P4S + P11F + T65A + V79A + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + V79G + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + V79I + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + V79L + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + V79S + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + L72V + Q327F + E501V + Y504T; S255N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + E74N +Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + G220N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Y245N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q253N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + D279N + Q327F + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S359N + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + D370N + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + V460S + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + V460T + P468T + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + T463N + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + S465N + E501V + Y504T; ou P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + T477N + E501V + Y504T.

[00341] Em uma modalidade preferencial, a variante de glucoamilase de Penicillium oxalicum tem uma substituição K79V usando SEQ ID NO: 23 aqui para numeração (variante PE001) e compreende adicionalmente uma das seguintes mutações:

110 / 154 P11F + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F; P11F + D26C + K33C + T65A + Q327F; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T; P2N + P4S + P11F + T65A + Q327F + E501V + Y504T; ou P11F + T65A + Q327W + E501V + Y504T.

[00342] Em uma modalidade preferencial, a variante de glucoamilase, tal como variante de glucoamilase de Penicillium oxalicum, tem pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 23 aqui.

[00343] A enzima geradora de fonte de carboidratos, em particular glucoamilase, pode ser adicionada em quantidades de 0,1-100 microgramas de EP/g de DS, tais como 0,5-50 microgramas de EP/g de DS, tais como 1-25 microgramas de EP/g de DS, tais como 2-12 microgramas de EP/g de DS. Pululanase Presente e/ou Adicionada Durante a Liquefação

[00344] Opcionalmente, uma pululanase pode estar presente e/ou ser adicionada durante a etapa de liquefação i) em conjunto com uma alfa- amilase e uma hemicelulase opcional, preferencialmente xilanase, tendo um ponto de fusão (DSC) acima de 80 °C. Como mencionado acima, uma protease, uma enzima geradora de fonte de carboidratos, preferencialmente uma glucoamilase termoestável, podem estar também opcionalmente presentes e/ou ser adicionadas durante a etapa de liquefação i).

[00345] A pululanase pode estar presente e/ou ser adicionada durante a

111 / 154 etapa i) de liquefação e/ou etapa ii) de sacarificação ou sacarificação e fermentação simultâneas (SSF).

[00346] As pululanases (E.C. 3.2.1.41, pululana 6-glucanoidrolases), são enzimas desramificadoras caracterizadas pela sua capacidade de hidrolisarem as ligações alfa-1,6-glicosídicas, por exemplo, na amilopectina e pululana.

[00347] As pululanases contempladas de acordo com a presente invenção incluem as pululanases de Bacillus amyloderamificans divulgadas na Patente dos E.U.A. N.º 4,560,651 (deste modo incorporada como referência), a pululanase divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 01/151620 (deste modo incorporada como referência), a Bacillus deramificans divulgada como SEQ ID NO: 4 em WO 01/151620 (deste modo incorporada como referência) e a pululanase de Bacillus acidopullulyticus divulgada como SEQ ID NO: 6 em WO 01/151620 (deste modo incorporada como referência) e também descrita em FEMS Mic. Let. (1994), 115, 97-106.

[00348] Pululanases adicionais contempladas de acordo com a presente invenção incluem as pululanases de Pyrococcus woesei, especificamente de Pyrococcus woesei DSM N.º 3773 divulgada em WO 92/02614.

[00349] Em uma modalidade, a pululanase é uma pululanase da família GH57. Em uma modalidade, a pululanase inclui um domínio X47 como divulgado em WO 2011/087836 (que é deste modo incorporado por referência). Mais especificamente, a pululanase pode ser derivada de uma estirpe do gênero Thermococcus, incluindo Thermococcus litoralis e Thermococcus hydrothermalis, tal como a pululanase de Thermococcus hydrothermalis mostrada em WO 2011/087836 truncada no local X4 após o domínio X47. A pululanase pode ser também um híbrido das pululanases de Thermococcus litoralis e Thermococcus hydrothermalis ou uma enzima híbrida de T. hydrothermalis/T. litoralis com o local de truncagem X4 divulgado em WO 2011/087836 (que é deste modo incorporada por

112 / 154 referência).

[00350] Em outra modalidade, a pululanase é uma compreendendo um domínio X46 divulgado em WO 2011/076123 (Novozymes).

[00351] A pululanase pode de acordo com a invenção ser adicionada em uma quantidade eficaz que inclui a quantidade preferencial de cerca de 0,0001-10 mg de proteína de enzima por grama de DS, preferencialmente 0,0001-0.10 mg de proteína de enzima por grama de DS, mais preferencialmente 0,0001-0,010 mg de proteína de enzima por grama de DS. A atividade de pululanase pode ser determinada como NPUN. Um Ensaio para a determinação de NPUN é descrito na seção “Materiais & Métodos” em baixo.

[00352] Produtos de pululanase comercialmente disponíveis adequados incluem PROMOZYME 400L, PROMOZYME™ D2 (Novozymes A/S, Dinamarca), OPTIMAX L-300 (Genencor Int., EUA) e AMANO 8 (Amano, Japão). Fitase Presente e/ou Adicionada Durante a Liquefação

[00353] Opcionalmente, uma fitase pode estar presente e/ou ser adicionada na liquefação em combinação com uma alfa-amilase e hemicelulase opcional, preferencialmente xilanase, tendo um ponto de fusão (DSC) acima de 80 °C.

[00354] Uma fitase usada de acordo com a invenção pode ser qualquer enzima capaz de efetuar a liberação de fosfato inorgânico a partir de ácido fítico (hexacifosfato de mio-inositol) ou de qualquer seu sal (fitatos). As fitases podem ser classificadas de acordo com sua especificidade na etapa de hidrólise inicial, viz. de acordo com o qual o grupo éster de fosfato é hidrolisado em primeiro lugar. A fitase a ser usada na invenção pode ter qualquer especificidade, por exemplo, ser uma 3-fitase (EC 3.1.3.8), uma 6- fitase (EC 3.1.3.26) ou um 5-fitase (sem número EC). Em uma modalidade, a fitase tem uma temperatura ótima acima de 50 ºC, tal como na

113 / 154 gama de 50-90 ºC.

[00355] A fitase pode ser derivada de plantas ou microrganismos, tais como bactérias ou fungos, por exemplo, levedura ou fungos filamentosos.

[00356] Uma fitase vegetal pode ser de farelo de trigo, maís, soja ou pólen de lírio. Fitases vegetais adequadas são descritas em Thomlinson et al., Biochemistry, 1 (1962), 166-171; Barrientos et al., Plant. Physiol., 106 (1994), 1489-1495; WO 98/05785; WO 98/20139.

[00357] Uma fita bacteriana pode ser do gênero Bacillus, Citrobacter, Hafnia , Pseudomonas, Buttiauxella ou Escherichia, especificamente as espécies Bacillus subtilis, Citrobacter braakii, Citrobacter freundii, Hafnia alvei, Buttiauxella gaviniae, Buttiauxella agrestis, Buttiauxella noackies e E. coli. Fitases bacterianas adequadas são descritas em Paver e Jagannathan, 1982, Journal of Bacteriology 151: 1102-1108; Cosgrove, 1970, Australian Journal of Biological Sciences 23: 1207-1220; Greiner et al, Arch. Biochem. Biophys., 303, 107-113, 1993; WO 1997/33976; WO 1997/48812, WO 1998/06856, WO 1998/028408, WO 2004/085638, WO 2006/037327, WO 2006/038062, WO 2006/063588, WO 2008/092901, WO 2008/116878 e WO 2010/034835.

[00358] Uma fitase de levedura pode ser derivada do gênero Saccharomyces ou Schwanniomyces, especificamente as espécies Saccharomyces cerevisiae ou Schwanniomyces occidentalis. A última enzima foi descrita como uma Fitase de levedura adequada são descritas em Nayini et al., 1984, Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 17: 24-26; Wodzinski et al., Adv. Appl. Microbiol., 42, 263-303; AU-A-24840/95;

[00359] As fitases de fungos filamentosos podem ser derivados do filo fúngico de Ascomycota (ascomicetos) ou do filo Basidiomycota, por exemplo, o gênero Aspergillus, Thermomyces (também chamado Humicola), Myceliophthora, Manascus, Penicillium, Peniophora, Agrocybe, Paxillus ou Trametes, especificamente a espécie Aspergillus terreus, Aspergillus niger,

114 / 154 Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus ficuum, Aspergillus fumigatus, Aspergillus oryzae, T. lanuginosus (também conhecida como H. lanuginosa), Myceliophthora thermophila, Peniophora lycii, Agrocybe pediades, Manascus anka, Paxillus involtus ou Trametes pubescens. Fitases fúngicas adequadas são descritas em Yamada et al., 1986, Agric. Biol. Chem. 322: 1275-1282; Piddington et al., 1993, Gene 133: 55-62; EP 684,313; EP 0 420 358; EP 0 684 313; WO 1998/28408; WO 1998/28409; JP 7-67635; WO 1998/44125; WO 1997/38096; WO 1998/13480.

[00360] Em uma modalidade preferencial, a fitase é derivada de Buttiauxella, tal como Buttiauxella gaviniae, Buttiauxella agrestis ou Buttiauxella noackies, tal como aquelas divulgadas em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 6, respectivamente, em WO 2008/092901 (deste modo incorporada por referência).

[00361] Em uma modalidade preferencial, a fitase é derivada de Citrobacter, tal como Citrobacter braakii, tal como aquela divulgada em WO 2006/037328 (deste modo incorporada por referência).

[00362] Fitases modificadas ou variantes de fitase são obteníveis por métodos conhecidos na técnica, em particular pelos métodos descritos em EP 897010; EP 897985; WO 99/49022; WO 99/48330, WO 2003/066847, WO 2007/112739, WO 2009/129489 e WO 2010/034835.

[00363] Produtos contendo fitase comercialmente disponíveis incluem BIO-FEED PHYTASE™, PHYTASE NOVO™ CT ou L (todos a partir da Novozymes), LIQMAX (DuPont) ou RONOZYME™ NP, RONOZYME® HiPhos, RONOZYME® P5000 (CT), NATUPHOS™ NG 5000 (a partir da DSM). Enzima Geradora de Fonte de Carboidratos presente e/ou adicionada durante a Sacarificação e/ou a Fermentação.

[00364] De acordo com a invenção, uma enzima geradora de fonte de carboidratos, preferencialmente uma glucoamilase, está presente e/ou é

115 / 154 adicionada durante a sacarificação e/ou fermentação.

[00365] Em uma modalidade preferencial, a enzima geradora de fonte de carboidratos é uma glucoamilase, de origem fúngica, preferencialmente de uma estirpe de Aspergillus, preferencialmente A. niger, A. awamori ou A. oryzae; ou uma estirpe de Trichoderma, preferencialmente T. reesei; ou uma estirpe de Talaromyces, preferencialmente T. emersonii. Glucoamilase

[00366] De acordo com a invenção, a glucoamilase presente e/ou adicionada na sacarificação e/ou fermentação pode ser derivada de qualquer fonte adequada, por exemplo, derivada de um microrganismo ou uma planta.

[00367] As glucoamilases preferenciais são de origem fúngica ou bacteriana, selecionadas do grupo consistindo em glucoamilases de Aspergillus, em particular glucoamilases G1 ou G2 de Aspergillus niger (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102), ou suas variantes, tais como aquelas divulgadas em WO 92/00381, WO 00/04136 e WO 01/04273 (a partir da Novozymes, Dinamarca); a glucoamilase de A. awamori divulgada em WO 84/02921, glucoamilase de Aspergillus oryzae (Agric. Biol. Chem. (1991), 55 (4), p. 941-949) ou suas variantes ou fragmentos. Outras variantes de glucoamilases de Aspergillus incluem variantes com estabilidade térmica intensificada: G137A e G139A (Chen et al. (1996), Prot. Eng. 9, 499-505); D257E e D293E/Q (Chen et al. (1995), Prot. Eng. 8, 575-582); N182 (Chen et al. (1994), Biochem. J. 301, 275-281); ligações de dissulfeto, A246C (Fierobe et al. (1996), Biochemistry, 35, 8698-8704); e introdução de resíduos de Pro na posição A435 e S436 (Li et al. (1997), Protein Eng. 10, 1199- 1204).

[00368] Outras glucoamilases incluem glucoamilase de Athelia rolfsii (previamente denotada Corticium rolfsii) (ver patente dos EUA n.º 4,727,026 e (Nagasaka et al. (1998) “Purification and properties of the raw-starch- degrading glucoamylases from Corticium rolfsii”, Appl Microbiol Biotechnol

116 / 154 50: 323-330), glucoamilases de Talaromyces, em particular derivadas de Talaromyces emersonii (WO 99/28448), Talaromyces leycettanus (patente dos EUA n.º Re. 32,153), Talaromyces duponti, Talaromyces thermophilus (patente dos EUA n.º 4,587,215). Em uma modalidade preferencial, a glucoamilase usada durante a sacarificação e/ou a fermentação é a glucoamilase de Talaromyces emersonii divulgada em WO 99/28448.

[00369] Glucoamilases bacterianas contempladas incluem glucoamilases do gênero Clostridium, em particular C. thermoamylolyticum (EP 135,138) e C. thermohydrosulfuricum (WO 86/01831).

[00370] Glucoamilases fúngicas contempladas incluem Trametes cingulata, Pachykytospora papyracea; e Leucopaxillus giganteus, todas divulgadas em WO 2006/069289; ou Peniophora rufomarginata divulgada em WO2007/124285; ou uma sua mistura. São também contempladas glucoamilases híbridas de acordo com a invenção. Exemplos incluem as glucoamilases híbridas divulgadas em WO 2005/045018. Exemplos específicos incluem a glucoamilase híbrida divulgada nas Tabelas 1 e 4 do Exemplo 1 (híbridos esses que são deste modo incorporados por referência).

[00371] Em uma modalidade, a glucoamilase é derivada de uma estirpe do gênero Pycnoporus, em particular uma estirpe de Pycnoporus como descrita em WO 2011/066576 (SEQ ID NOs 2, 4 ou 6) ou de uma estirpe do gênero Gloephyllum, em particular uma estirpe de Gloephyllum como descrita em WO 2011/068803 (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ou 16) ou uma estirpe do gênero Nigrofomes, em particular uma estirpe de Nigrofomes sp. divulgada em WO 2012/064351 (SEQ ID NO: 2) (todas as referências deste modo incorporadas por referência). São também contempladas glucoamilases que exibem uma elevada identidade com qualquer uma das glucoamilases acima mencionadas, isto é, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, tal como

117 / 154 100% de identidade com qualquer uma das partes maduras das sequências de enzimas mencionadas acima.

[00372] As glucoamilases podem em uma modalidade ser adicionadas à sacarificação e/ou fermentação em uma quantidade de 0,0001-20 AGU/g de DS, preferencialmente 0,001-10 AGU/g de DS, especialmente entre 0,01-5 AGU/g de DS, tal como 0,1-2 AGU/g de DS.

[00373] Composições compreendendo glucoamilase comercialmente disponíveis incluem AMG 200L; AMG 300 L; SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L, SPIRIZYME™ PLUS, SPIRIZYME™ FUEL, SPIRIZYME™ B4U, SPIRIZYME™ ULTRA, SPIRIZYME™ EXCEL, SPIRIZYME™ ACHIEVE e AMG™ E (a partir da Novozymes A/S); OPTIDEX™ 300, GC480, GC417 (a partir da Genencor Int.); AMIGASE™ e AMIGASE™ PLUS (a partir da DSM); G-ZYME™ G900, G-ZYME™ e G990 ZR (a partir da Danisco US). Amilase Maltogênica

[00374] A enzima geradora de fonte de carboidratos presente e/ou adicionada durante a sacarificação e/ou fermentação pode ser também uma alfa-amilase maltogênica. Uma “alfa-amilase maltogênica” (glucana 1,4-alfa- maltoidrolase, E.C. 3.2.1.133) é capaz de hidrolisar amilose e amilopectina em maltose na configuração alfa. Uma amilase maltogênica da estirpe de Bacillus stearothermophilus NCIB 11837 está comercialmente disponível a partir da Novozymes A/S. Alfa-amilases maltogênicas são descritas nas Patentes dos EUA nos. 4,598,048, 4,604,355 e 6,162,628, que são deste modo incorporadas por referência. A amilase maltogênica pode em uma modalidade ser adicionada em uma quantidade de 0,05-5 mg de proteína total/grama de DS ou 0,05-5 MANU/g de DS. Protease Presente e/ou Adicionada Durante a Liquefação

[00375] Em uma modalidade da invenção, uma protease opcional, tal como uma protease termoestável, pode estar presente e/ou ser adicionada em

118 / 154 liquefação em conjunto com uma alfa-amilase, tal como uma alfa-amilase termoestável, e uma hemicelulase, preferencialmente xilanase, tendo um ponto de fusão (DSC) acima de 80 °C e, opcionalmente, uma endoglucanase, uma enzima geradora de fonte de carboidratos, em particular uma glucoamilase, opcionalmente uma pululanase e/ou opcionalmente uma fitase.

[00376] As proteases são classificadas com base no seu mecanismo catalítico nos seguintes grupos: Serina proteases (S), Cisteína proteases (C), Proteases aspárticas (A), Metaloproteases (M) e Proteases desconhecidas, ou ainda não classificadas (U), ver Handbook of Proteolytic Enzymes, A.J. Barrett, N.D. Rawlings, J.F. Woessner (eds), Academic Press (1998), em particular a parte da introdução geral.

[00377] Em uma modalidade preferencial, a protease termoestável usada de acordo com a invenção é uma “metaloprotease” definida como uma protease pertencendo a EC 3.4.24 (metaloendopeptidases); preferencialmente EC 3.4.24.39 (metaloproteinases ácidas).

[00378] Para se determinar se uma dada protease é uma metaloprotease ou não é feita referência ao Handbook of Proteolytic Enzymes acima e aos princípios indicados nele. Tal determinação pode ser levada a cabo para todos os tipos de proteases, sejam proteases ocorrendo naturalmente ou de tipo selvagem; ou proteases geneticamente manipuladas ou sintéticas.

[00379] A atividade de protease pode ser medida usando qualquer ensaio adequado, no qual um substrato é empregue, que inclua ligações de peptídeos relevantes para a especificidade da protease em questão. O pH do ensaio e a temperatura do ensaio devem ser do mesmo modo adaptados para a protease em questão. Exemplos de valores de pH do ensaio são pH 6, 7, 8, 9, 10 ou 11. Exemplos de temperaturas do ensaio são 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 ou 80°C.

[00380] Exemplos de substratos de proteases são caseína, tal como Caseína Reticulada com Azurina (AZCL-caseína). Dois ensaios de protease

119 / 154 são descritos em baixo na seção “Materiais & Métodos” de WO 2017/112540 (incorporada aqui por referência), dos quais o assim chamado “Ensaio de AZCL-Caseína” é o ensaio preferencial.

[00381] Em uma modalidade, a protease termoestável tem pelo menos 20%, tal como pelo menos 30%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 100%, da atividade de protease da variante JTP196 (Exemplo 2 de WO 2017/112540) ou Protease Pfu (SEQ ID NO: 24 aqui) determinada pelo ensaio de AZCL-caseína descrito na seção “Materiais & Métodos” em WO 2017/112540.

[00382] Não existem nenhumas limitações quanto à origem da protease termoestável usada em um processo ou composição da invenção desde que ela cumpra com as propriedades de termoestabilidade definidas em baixo.

[00383] Em uma modalidade, a protease é de origem fúngica.

[00384] Em uma modalidade preferencial, a protease termoestável é uma variante de uma metaloprotease como definida acima. Em uma modalidade, a protease termoestável usada em um processo ou composição da invenção é de origem fúngica, tal como uma metaloprotease fúngica, tal como uma metaloprotease fúngica derivada de uma estirpe do gênero Thermoascus, preferencialmente uma estirpe de Thermoascus aurantiacus, especialmente Thermoascus aurantiacus CGMCC N.º 0670 (classificada como EC

3.4.24.39).

[00385] Em uma modalidade, a protease termoestável é uma variante da parte madura da metaloprotease mostrada em SEQ ID NO: 2 divulgada em WO 2003/048353 ou da parte madura de SEQ ID NO: 1 em WO 2010/008841 e mostrada como SEQ ID NO: 25 aqui adicionalmente com mutações selecionadas da lista em baixo: - S5*+D79L+S87P+A112P+D142L;

120 / 154

- D79L+S87P+A112P+T124V+D142L; - S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L; - N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L; - T46R+D79L+S87P+T116V+D142L; - D79L+P81R+S87P+A112P+D142L; - A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L; - D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L; - D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L; - D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L; - D79L+S87P+A112P+D142L; - D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L; - S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L; - D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L; - A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L; - D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L; - D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C; - S36P+D79L+S87P+A112P+D142L; - A37P+D79L+S87P+A112P+D142L; - S49P+D79L+S87P+A112P+D142L; - S50P+D79L+S87P+A112P+D142L; - D79L+S87P+D104P+A112P+D142L; - D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L; - S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L; - D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L; - S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L; - D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L; - D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L; - Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L; - Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L;

121 / 154 - A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+ D142L; - A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L; - A27K+D79L+Y82F+ D104P+A112P+A126V+D142L; - A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L; - A27K+D79L+S87P+A112P+D142L; - D79L + S87P + D142L.

[00386] Em uma modalidade preferencial, a protease termoestável é uma variante da metaloprotease divulgada como a parte madura de SEQ ID NO: 2 divulgada em WO 2003/048353 ou a parte madura de SEQ ID NO: 1 em WO 2010/008841 ou SEQ ID NO: 25 aqui com as seguintes mutações: D79L+S87P+A112P+D142L; D79L+S87P+D142L; ou A27K+ D79L+ Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L.

[00387] Em uma modalidade, a variante de protease tem pelo menos 75% de identidade, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, ainda mais preferencialmente pelo menos 93%, o mais preferencialmente pelo menos 94% e, ainda o mais preferencialmente, pelo menos 95%, tal como mesmo pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, mas menos do que 100%, de identidade com a parte madura do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 divulgada em WO 2003/048353 ou a parte madura de SEQ ID NO: 1 em WO 2010/008841 ou SEQ ID NO: 25 aqui.

[00388] A protease termoestável pode ser também derivada de qualquer bactéria desde que a protease tenha as propriedades de termoestabilidade definidas de acordo com a invenção.

122 / 154

[00389] Em uma modalidade, a protease termoestável é derivada de uma estirpe da bactéria Pyrococcus, tal como uma estirpe de Pyrococcus furiosus (protease pfu).

[00390] Em uma modalidade, a protease é uma mostrada como SEQ ID NO: 1 na patente dos EUA N.º 6,358,726-B1 (Takara Shuzo Company) e SEQ ID NO: 24 aqui.

[00391] Em uma modalidade, a protease termoestável é uma divulgada em SEQ ID NO: 24 aqui ou uma protease tendo pelo menos 80% de identidade, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 96%, tal como pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99% de identidade com SEQ ID NO: 1 na patente dos EUA n.º 6,358,726-B1 ou SEQ ID NO: 24 aqui. A protease de Pyrococcus furiosus pode ser adquirida a partir da Takara Bio, Japão.

[00392] A protease de Pyrococcus furiosus é uma protease termoestável de acordo com a invenção. Foi descoberto que o produto comercial protease de Pyrococcus furiosus (Pfu S) (ver Exemplo 5 de) tinha uma termoestabilidade de 110% (80 °C/70 °C) e 103% (90 °C/70 °C) a pH 4,5 determinada como descrito no Exemplo 2 de WO 2017/112540.

[00393] Em uma modalidade, a protease termoestável tem um valor de termoestabilidade de mais do que 20% determinada como Atividade Relativa a 80 ºC/70 ºC determinada como descrito no Exemplo 2.

[00394] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade de mais do que 30%, mais do que 40%, mais do que 50%, mais do que 60%, mais do que 70%, mais do que 80%, mais do que 90%, mais do que 100%, tal como mais do que 105%, tal como mais do que 110%, tal como mais do que 115%, tal como mais do que 120% determinada como Atividade Relativa a 80 ºC/70 ºC.

[00395] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade de

123 / 154 entre 20 e 50%, tal como entre 20 e 40%, tal como 20 e 30% determinada como Atividade Relativa a 80 ºC/70 ºC.

[00396] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade entre 50 e 115%, tal como entre 50 e 70%, tal como entre 50 e 60%, tal como entre 100 e 120%, tal como entre 105 e 115% determinada como Atividade Relativa a 80 ºC/70 ºC.

[00397] Em uma modalidade, a protease tem um valor de termoestabilidade de mais do que 10% determinada como Atividade Relativa a 85 ºC/70 ºC determinada como descrito no Exemplo 2 de WO 2017/112540.

[00398] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade de mais do que 10%, tal como mais do que 12%, mais do que 14%, mais do que 16%, mais do que 18%, mais do que 20%, mais do que 30%, mais do que 40%, mais do que 50%, mais do que 60%, mais do que 70%, mais do que 80%, mais do que 90%, mais do que 100%, mais do que 110% determinada como Atividade Relativa a 85 ºC/70 ºC.

[00399] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade de entre 10 e 50%, tal como entre 10 e 30%, tal como entre 10 e 25% determinada como Atividade Relativa a 85 ºC/70 ºC.

[00400] Em uma modalidade, a protease tem mais do que 20%, mais do que 30%, mais do que 40%, mais do que 50%, mais do que 60%, mais do que 70%, mais do que 80%, mais do que 90% determinada como Atividade Relativa a 80 ºC; e/ou

[00401] Em uma modalidade, a protease tem mais do que 20%, mais do que 30%, mais do que 40%, mais do que 50%, mais do que 60%, mais do que 70%, mais do que 80%, mais do que 90% determinada como Atividade Relativa a 84 ºC.

[00402] A determinação da “Atividade Relativa” e “Atividade Restante” é feita como descrito no Exemplo 2 de WO 2017/112540.

[00403] Em uma modalidade, a protease pode ter uma

124 / 154 termoestabilidade para acima de 90, tal como acima de 100 a 85 °C como determinada usando o teste de Zeína-BCA como divulgado no Exemplo 3 de WO 2017/112540.

[00404] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade acima de 60%, tal como acima de 90%, tal como acima de 100%, tal como acima de 110% a 85 ºC como determinada usando o ensaio de Zeína-BCA.

[00405] Em uma modalidade, a protease tem uma termoestabilidade entre 60-120, tal como entre 70-120%, tal como entre 80-120%, tal como entre 90-120%, tal como entre 100-120%, tal como 110-120% a 85 ºC como determinada usando o ensaio de Zeína-BCA.

[00406] Em uma modalidade, a protease termoestável tem pelo menos 20%, tal como pelo menos 30%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, tal como pelo menos 70%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, tal como pelo menos 100% da atividade da variante de protease JTP196 ou Protease Pfu determinada pelo ensaio de AZCL-caseína descrito na seção “Materiais & Métodos” de WO 2017/112540. IV. Aspectos Adicionais da Invenção

[00407] Em um aspecto adicional da invenção se relaciona com o uso de uma xilanase (por exemplo, xilanase GH30_8) ou uma combinação de enzimas da presente invenção para melhoria da qualidade nutricional de grãos secos destilados (DGS) ou grãos secos destilados com solúveis (DDGS) produzidos como um coproduto de um processo de produção de produtos de fermentação da presente invenção, preferencialmente sem resultar em um escurecimento dos DDG ou DDGS.

[00408] Uma combinação de enzimas divulgada na Seção I aqui pode ser usada desta maneira. Em várias modalidades deste aspecto, uma enzima adicional, tal como uma enzima ou composição de enzimas descrita sob a seção “Enzimas”, pode ser usada em combinação em conjunto com uma

125 / 154 combinação de enzimas da presente invenção.

[00409] Em uma modalidade, a xilanase ou combinação de enzimas é usada para melhorar a qualidade nutricional de DGS ou DDGS por aumento da TME dos DDG ou DDGS quando administrados a um animal (por exemplo, não ruminante, por exemplo, monogástrico, por exemplo, aves domésticas ou suínos, etc.) em pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 11%, pelo menos 12%, pelo menos 13%, pelo menos 14%, pelo menos 15%, pelo menos 16%, pelo menos 17%, pelo menos 18%, pelo menos 19% ou pelo menos 20% em comparação com a TME dos DDG ou DDGS produzidos como um coproduto quando uma xilanase ou uma combinação de enzimas da presente invenção não está presente durante a(s) etapa(s) de sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas de um processo de produção de produtos de fermentação usado para produzir DDG ou DDGS o coproduto. Em uma modalidade, a xilanase ou combinação de enzimas é usada para melhorar a qualidade nutricional de DGS ou DDGS por aumento da TME dos DDG ou DDGS em um animal (por exemplo, não ruminante, por exemplo, monogástrico, por exemplo, aves domésticas ou suínos, etc.) em pelo menos 21%, pelo menos 22%, pelo menos 23%, pelo menos 24%, pelo menos 25%, pelo menos 26%, pelo menos 27%, pelo menos 28%, pelo menos 29%, pelo menos 30%, pelo menos 31%, pelo menos 32%, pelo menos 33%, pelo menos 44%, pelo menos 45%, pelo menos 46%, pelo menos 47%, pelo menos 48%, pelo menos 49% ou pelo menos 50% em comparação com a TME dos DDG ou DDGS produzidos como um coproduto quando xilanase ou uma combinação de enzimas da presente invenção não está presente durante a(s) etapa(s) de sacarificação, fermentação ou sacarificação e fermentação simultâneas de um processo de produção de produtos de fermentação usado para produzir o coproduto de DDG ou DDGS.

[00410] Ainda em um aspecto adicional da invenção se relaciona com

126 / 154 o uso de uma enzima ou uma combinação de enzimas da presente invenção para aumento da solubilização da fibra presente em um purê de fermentação durante um processo de produção de produtos de fermentação da presente invenção, preferencialmente sem resultar em um escurecimento dos DDG ou DDGS. Em uma modalidade, a xilanase ou combinação de enzimas é usada para aumentar a solubilização de fibras durante a produção de álcool (por exemplo, etanol) a partir de um material contendo amido. Em uma modalidade, a xilanase ou combinação de enzimas é usada para aumentar a solubilização da fibra de milho em um processo de produção de etanol, como um processo RSH ou cozimento convencional incluindo uma etapa de liquefação. Em uma modalidade, a combinação de enzimas é usada para aumentar a solubilização de arabinose. Em uma modalidade, a combinação de enzimas é usada para aumentar a solubilização de xilose.

[00411] Uma xilanase ou combinação de enzimas divulgada na Seção I aqui pode ser usada desta maneira. Em várias modalidades deste aspecto, uma enzima adicional, tal como uma enzima ou composição de enzimas descrita sob a seção “Enzimas”, pode ser usada em combinação em conjunto com uma combinação de enzimas da presente invenção.

[00412] Em uma modalidade, a xilanase ou combinação de enzimas é usada para aumentar a solubilização da fibra (por exemplo, arabinose, xilose, etc.) contatada com a combinação de enzimas em pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 11%, pelo menos 12%, pelo menos 13%, pelo menos 14%, pelo menos 15%, pelo menos 16%, pelo menos 17%, pelo menos 18%, pelo menos 19% ou pelo menos 20% em comparação com a solubilização da fibra não contatada com uma xilanase ou uma combinação de enzimas da presente invenção.

[00413] Em uma modalidade, a xilanase ou combinação de enzimas é usada para aumentar a solubilização da fibra (por exemplo, arabinose, xilose,

127 / 154 etc.) contatada com a combinação de enzimas em pelo menos 21%, pelo menos 22%, pelo menos 23%, pelo menos 24%, pelo menos 25%, pelo menos 26%, pelo menos 27%, pelo menos 28%, pelo menos 29%, pelo menos 30%, pelo menos 31%, pelo menos 32%, pelo menos 33%, pelo menos 44%, pelo menos 45%, pelo menos 46%, pelo menos 47%, pelo menos 48%, pelo menos 49% ou pelo menos 50% em comparação com fibra não contatada com a xilanase ou combinação de enzimas.

[00414] A invenção é adicionalmente resumida pelos seguintes parágrafos:

1. Um processo de produção de um produto de fermentação, compreendendo as seguintes etapas: (a) sacarificação de um material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial com uma alfa- amilase, uma glucoamilase e uma xilanase ou uma combinação de enzimas compreendendo a xilanase; (b) fermentação usando um organismo de fermentação para produzir o produto de fermentação; e (c) opcionalmente, recuperação de um coproduto.

[00415] 2. Um processo para produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido compreendendo as etapas de: (a) liquefação de um material contendo amido com uma alfa-amilase; (b) sacarificação do material liquefeito obtido na etapa (a) com uma glucoamilase e uma xilanase ou combinação de enzimas compreendendo a xilanase; (c) fermentação usando um organismo fermentador; e (d) opcionalmente, recuperação de um coproduto.

[00416] 3. O processo dos parágrafos 1 ou 2, em que a sacarificação e a fermentação são realizadas simultaneamente.

128 / 154

[00417] 4. O processo qualquer um dos parágrafos 1 a 3, em que o material contendo amido compreende maís, milho, trigo, centeio, cevada, triticale, sorgo, switchgrass, milheto, milheto-pérola, painço.

[00418] 5. O processo de qualquer um dos parágrafos 1 a 4, em que o produto de fermentação é álcool, particularmente etanol.

[00419] 6. O processo de qualquer um dos parágrafos 1 a 5, em que o coproduto é grãos secos destilados (DDG) ou grãos secos destilados com solúveis (DDGS).

[00420] 7. O processo de qualquer um dos parágrafos 1 a 6, em que os DDG ou DDGS têm uma qualidade nutricional melhorada em comparação com DDG ou DDGS recuperados como um coproduto de um processo para produção de um produto de fermentação no qual a xilanase ou combinação de enzimas compreendendo a xilanase não está presente ou é adicionada.

[00421] 8. O processo do parágrafo 7, em que os DDG ou DDGS têm teor de gordura aumentado.

[00422] 9. O processo de qualquer um dos parágrafos 1 a 8, em que a verdadeira energia metabolizável dos DGS ou DDGS é aumentada em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15% ou pelo menos 20%, em comparação com a TME de DGS ou DDGS produzidos quando uma xilanase ou combinação de enzimas compreendendo uma xilanase não está presente durante a etapa de sacarificação, etapa de fermentação e/ou etapa de sacarificação e fermentação simultâneas do processo.

[00423] 10. O processo de acordo com o parágrafo 9, em que a TME é para um animal monogástrico.

[00424] 11. O processo de acordo com os parágrafos 9 ou 10, em que os DGS ou DDGS produzidos não são escurecidos após secagem em comparação com DGS ou DDGS produzidos quando uma combinação de enzimas de qualquer um dos parágrafos 1 a 9 não está presente durante a

129 / 154 etapa de sacarificação, etapa de fermentação e/ou etapa de sacarificação e fermentação simultâneas de um processo de acordo com qualquer um dos parágrafos 10 a 16.

[00425] 12. O processo de qualquer um dos parágrafos 1 a 11, em que o organismo fermentador é levedura, particularmente Saccharomyces sp., mais particularmente Saccharomyces cerevisiae.

[00426] 13. O processo de qualquer um dos parágrafos 1 a 12, em que a combinação de enzimas compreende uma composição celulolítica.

[00427] 14. O processo de qualquer um dos parágrafos 1 a 13, em que a composição celulolítica está presente na combinação em uma razão de xilanase e composição celulolítica de cerca de 5:95 a cerca de 95:5, tal como de 5:95, 10:90, 20:80, 50:50, 80:20, 90:10 e 95:5.

[00428] 15. O processo de qualquer um dos parágrafos 1 a 14, em que a xilanase é uma xilanase da família GH30.

[00429] 16. O processo de qualquer um dos parágrafos 1 a 15, em que a xilanase é uma xilanase GH30_8.

[00430] 17. O processo de qualquer um dos parágrafos 1 a 16, em que a xilanase é uma xilanase GH30_8 selecionada do grupo consistindo em: (i) a xilanase de Bacillus subtilis de SEQ ID NO: 1 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; (ii) a xilanase de Bacillus subtilis de SEQ ID NO: 2 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; (iii) a xilanase de Bacillus subtilis de SEQ ID NO: 3 ou uma

130 / 154 sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; (iv) a xilanase de Bacillus amyloliquefaciens de SEQ ID NO: 4 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; (v) a xilanase de Bacillus amyloliquefaciens de SEQ ID NO: 5 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; (vi) a xilanase de Bacillus licheniformis de SEQ ID NO: 6 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; e (vii) a xilanase de Paenibacillus pabuli de SEQ ID NO: 2 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta.

[00431] 18. O processo de qualquer um dos parágrafos 1 a 17, em que a composição celulolítica compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I;

131 / 154 (ii) uma celobioidrolase II; (iii) uma beta-glucosidase; e (iv) um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica.

[00432] 19. O processo de qualquer um dos parágrafos 1 a 18, em que a composição celulolítica compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus; (ii) uma celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus; (iii) uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica de Penicillium emersonii.

[00433] 20. O processo de qualquer um dos parágrafos 1 a 19, em que a composição celulolítica compreende: (i) uma celobioidrolase I compreendendo os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 8 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 8; (ii) uma celobioidrolase II compreendendo os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 9 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 9; (iii) uma beta-glucosidase compreendendo os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 10 ou uma sua variante tendo pelo menos uma

132 / 154 substituição selecionada do grupo consistindo em F100D, S283G, N456E e F512Y e pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 10; e/ou (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica compreendendo os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 11 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 11.

[00434] 21. O processo de qualquer um dos parágrafos 1 a 20, em que a composição celulolítica compreende adicionalmente uma endoglucanase.

[00435] 22. O processo de qualquer um dos parágrafos 1 a 21, em que a composição celulolítica é derivada de uma estirpe selecionada do grupo consistindo em Aspergillus, Penicilium, Talaromyces e Trichoderma, opcionalmente em que: (i) a estirpe de Aspergillus é selecionada do grupo consistindo em Aspergillus aurantiacus, Aspergillus niger e Aspergillus oryzae; (ii) a estirpe de Penicilium é selecionada do grupo consistindo em Penicilium emersonii e Penicilium oxalicum; (iii) a estirpe de Talaromyces é selecionada do grupo consistindo em Talaromyces aurantiacus e Talaromyces emersonii; e (iv) a estirpe de Trichoderma é Trichoderma reesei.

[00436] 23. O processo de qualquer um dos parágrafos 1 a 13, em que a composição celulolítica compreende uma composição celulolítica de Trichoderma reesei.

[00437] 24. Uso de uma combinação de enzimas de acordo com

133 / 154 qualquer um dos parágrafos 1 a 23 para melhoria da qualidade nutricional de DGS ou DDGS produzidos como um coproduto do processo de produção de produtos de fermentação de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 23, preferencialmente sem resultar em um escurecimento dos DDG ou DDGS.

[00438] 25. Uso de uma combinação de enzimas de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 23 para solubilização de fibra, preferencialmente para solubilização de xilose e arabinose.

[00439] A invenção descrita e reivindicada aqui não é para estar limitada no escopo pelas modalidades específicas aqui divulgadas, uma vez que estas modalidades se destinam como ilustrações dos vários aspectos da invenção. Quaisquer modalidades equivalentes se destinam a estar dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção adicionalmente àquelas mostradas e descritas aqui se tornarão aparentes aos peritos na técnica a partir da descrição anterior. Tais modificações se destinam também a estar dentro do escopo das reivindicações anexas. Em caso de conflito, a presente divulgação incluindo definições prevalecerá. Várias referências são citadas aqui, as divulgações das quais são incorporadas aqui por referência em suas totalidades. A presente invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como limitando o escopo da invenção. Materiais & Métodos

[00440] Alfa-Amilase 369 (AA369): Alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus com as mutações: I181* + G182* + N193F + V59A + Q89R + E129V + K177L + R179E + Q254S + M284V (SEQ ID NO: 12 aqui) truncada até 491 aminoácidos.

[00441] Composição celulolítica A: Composição celulolítica derivada de Trichoderma reesei compreendendo: CBH1 de Aspergillus fumigatus Cel7A divulgada como SEQ ID NO: 6 em WO2011/057140 e SEQ ID NO: 8 aqui; CBH II de Aspergillus fumigatus divulgada como SEQ ID NO: 18 em

134 / 154 WO 2011/057140 e como SEQ ID NO: 9 aqui; variante de beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 2 em WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 10 aqui) variante F100D, S283G, N456E, F512Y) divulgada em WO 2012/044915 ou pedido PCT copendente PCT/US11/054185; e polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica derivada de uma estirpe de Penicillium emersonii (SEQ ID NO: 2 em WO 2011/041397 ou SEQ ID NO: 11 aqui).

[00442] Composição celulolítica B: Composição celulolítica derivada de Trichoderma reesei compreendendo: CBH1 de Aspergillus fumigatus Cel7A divulgada como SEQ ID NO: 6 em WO2011/057140 e SEQ ID NO: 8 aqui; e beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 2 em WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 10 aqui) variante F100D, S283G, N456E, F512Y) divulgada em WO 2012/044915 ou pedido PCT copendente PCT/US11/054185).

[00443] E-SEP: Combinação compreendendo xilanase GH10 transgênica expressando e uma estirpe de celulose de Trichoderma reesei expressando arabinofuranosidase GH62.

[00444] Glucoamilase SA (GSA): Combinação compreendendo glucoamilase de Talaromyces emersonii divulgada como SEQ ID NO: 34 em WO99/28448, glucoamilase de Trametes cingulata divulgada como SEQ ID NO: 2 em WO 06/69289 e alfa-amilase de Rhizomucor pusillus com ligante de glucoamilase e domínio de ligação ao amido (SBD) de Aspergillus niger, divulgada em SEQ ID NO: 26 aqui tendo as seguintes substituições G128D + D143N (a razão de atividades de AGU:AGU:FAU-F é cerca de 20:5:1).

[00445] Protease Pfu: Protease derivada de Pyrococcus furiosus mostrada em SEQ ID NO: 13 aqui.

[00446] Xilanase: Xilanase GH30_8 derivada de Bacillus subtilis tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[00447] Levedura: ETHANOL RED™ disponível a partir da Red

135 / 154 Star/Lesaffre, EUA. Protocolo de HPLC

[00448] O Protocolo de HPLC na Tabela 1 em baixo foi usado nos Exemplos 2, 4, 5 e 6. Tabela 1 - Protocolo de HPLC Sistema de HPLC: • série 1100/1200 da Agilent com software Chemstation. • Desgaseificador • Bomba Quaternária • Autoamostrador • Compartimento de Coluna c/ Aquecedor • Detector de Índice de Refração (RI) Coluna: • Coluna de Exclusão Iônica Bio-Rad HPX- 87H 300 mm x 7,8 mm, parte #125-0140 • Cartucho de proteção Bio-Rad cátion H, parte #125-0129, Retentor parte #125-0131 Método: • fase móvel de H2SO4 a 5 µM • Caudal: 0,6 mL/min • Temperatura da coluna: 65 °C • Temperatura do detector de RI: 55 °C Gradiente de Eluente

[00449] O Gradiente de Eluente na Tabela 2 em baixo foi usado nos Exemplos 2, 4, 5 e 6. Tabela 2. Gradiente de Eluente # Eluente A Água B NaOH a 0,2 M C Acetato de Na a 1 M D Água Ensaio de solubilização de xilose

[00450] A atividade de uma variante de xilanase na direção de Maís desamidado desengordurado (DFDSM) é medida por Cromatografia de Troca Aniônica de Elevado Desempenho com Detecção Amperométrica Pulsada (HPAE-PAD). 2% (p/p) de suspensão de DFDSM são preparados em acetato de sódio a 100 mM, CaCl2 a 5 mM, pH 5 e deixados a hidratar durante 30 minutos à temperatura ambiente

136 / 154 sob agitação suave. Após hidratação, 200 µL de suspensão de substrato foram pipetados em uma placa com 96 poços e misturados com 20 µL de solução de enzima para se obter uma concentração de enzima final de 20 PPM em relação ao substrato (20 µg de enzima/g de substrato). As misturas de enzima/substrato são deixadas para hidrólise em 2,5 horas a 40 °C sob agitação suave (500 RPM) em uma incubadora de placa (Biosan PST-100 HL). Após hidrólise enzimática, as placas de enzima/substrato são centrifugadas durante 10 minutos a 3000 RPM e 50 µL de sobrenadante (hidrolisado) são misturados com 100 µL de HCl a 1,6 M e transferidos para tubos de PCR de 300 µL e deixados para hidrólise ácida durante 40 minutos a 90 °C em uma máquina de PCR. O propósito da hidrólise ácida é converter polissacarídeos solúveis, liberados pela variante de xilanase, em monossacarídeos, que podem ser quantificados usando HPAE-PAD. As amostras são neutralizadas com 125 µL de NAOH a 1,4 M após hidrólise ácida e montadas no HPAE- PAD para análise de monossacarídeo (xilose, arabinose e glucose) (Dionex ICS-3000 usando uma coluna CarboPac PA1). Curvas de calibração apropriadas são feitas usando soluções de estoque de monossacarídeos que são sujeitas ao mesmo procedimento de hidrólise ácida que as amostras. A percentagem de xilose solubilizada é calculada de acordo com a equação: em que [xilose] denota a concentração de xilose no sobrenadante medida por HPAE-PAD, V o volume da amostra, MW, o peso molecular da xilose interna em arabino-xilana (132 g/mol), Xxyl, a fração de xilose em DFDSM (0,102) e Msub, a massa de DFDSM na amostra.

EXEMPLOS Exemplo 1

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[00451] O Exemplo 1 demonstra a eficácia de combinações de enzimas da presente invenção compreendendo diferentes razões de Xilanase e Composição Celulolítica A, como listadas na seção Materiais & Métodos.

[00452] Aproximadamente 5 mg de purê de milho por tubo foram adicionados. O purê foi obtido a partir de uma instalação de etanol comercial e havia sido liquefeito com uma combinação de AA369 e Protease Pfu. Levedura Ethanol Red hidratada suspensa, GSA (0,6 AGU/g de sólidos secos), e combinações de enzimas da presente invenção ou água, foram doseadas subsequentemente. A dose total de cada combinação de enzimas total foi 100 µg/g de sólidos secos.

[00453] Após dosagem, os tubos foram tapados com rolhas tendo um pequeno orifício, perfurados com um alfinete, e submetidos a vórtex antes de serem colocados em um banho de água a 32 °C para sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). Os tubos foram submetidos a vórtex durante a manhã e a tarde durante a fermentação. Após fermentação ao longo de três noites, os tubos foram agitados 5 min. a 3000 RPM, e os sobrenadantes foram filtrados através de filtros de seringa de 0,45 µm.

[00454] A hidrólise ácida foi feita em tubos de microcentrífuga com tampas de rosca. 600 µL de amostra e 200 µL de HCl a 5 N foram adicionados e foram colocados em um bloco de aquecimento a 95 °C durante 40 min. Após resfriamento foram neutralizados com 200 µL de NaOH (NaOH a 50% p/p, diluído 4X vol/vol). O propósito da hidrólise ácida foi hidrolisar oligossacarídeos em monossacarídeos, para capturar todos os açúcares solubilizados pelos ensaios analíticos subsequentes. As amostras hidrolisadas foram diluídas 100X em um Hamilton antes de serem analisadas em um sistema Dionex ICS-3000 HPAEC-PAD com uma coluna CarboPac PA1. Os dados foram analisados com o pacote de software do SAS Institute. As FIG. 1 e FIG. 2 mostram solubilização de arabinose e xilose, respectivamente, usando uma combinação de enzimas da presente invenção compreendendo

138 / 154 várias razões da xilanase e da composição celulolítica. As FIG. 1 e FIG. 2 mostram solubilização significativamente aumentada de arabinose e xilose quando 10-100% da composição celulolítica na combinação de enzimas é substituída pela xilanase em comparação com a solubilização de arabinose e xilose pela composição celulolítica sozinha. Notavelmente, não existe diferença detectável entre a solubilização de arabinose e xilose obtida com as diferentes combinações contendo xilanase, indicando que as combinações de enzimas da presente invenção são eficazes na solubilização de arabinose e xilose ao longo de uma ampla gama de razões entre xilanase e composição celulolítica presente na combinação. Exemplo 2

[00455] Curvas de resposta à dose foram obtidas usando três combinações de enzimas diferentes da presente invenção, por exemplo combinações de Xilanase e/ou Composição Celulolítica A. Os dados demonstram que graus mais elevados de solubilização de arabinose e xilose poderiam ser alcançados quando a composição celulolítica foi incluída na combinação e que o desempenho da combinação poderia ser otimizado por ajuste da razão de xilanase:composição celulolítica.

[00456] Após 5 g de purê por tubo foram doseados pelo robô de manuseamento de purê “Glamdring” LEAP. Diluições de levedura hidratada suspensa, GSA e combinação de enzimas da presente invenção foram doseadas no manuseador de líquidos Biomek. Fermentações SSF foram operadas ao longo de três noites (64-72 horas) a 32 °C. Purê da Red Trail Energy (RTE) foi usado.

[00457] Após dosagem, os tubos foram tapados com rolhas com um pequeno orifício, perfurados com um alfinete, e submetidos a vórtex antes de serem colocados em um banho de água a 32 °C. Os tubos foram submetidos a vórtex durante a manhã e a tarde durante a fermentação. Após fermentação ao longo de três noites, os tubos foram agitados 5 min. a 3000 RPM, e os

139 / 154 sobrenadantes foram filtrados através de filtros Spin-X de 0,2 µm.

[00458] O etanol, açúcares, glicerol e ácidos foram medidos usando o protocolo de HPLC da Tabela 1 acima na seção “Materiais & Métodos”.

[00459] A hidrólise ácida foi feita em tubos de microcentrífuga com tampas de rosca. 300 µL de amostra e 100 µL de HCl a 5 N foram adicionados e foram colocados em um bloco de aquecimento a 95 °C durante 40 min. Após resfriamento foram neutralizados com 100 µL de NaOH (NaOH a 50% p/p, diluído 4X vol/vol). O propósito da hidrólise ácida foi hidrolisar oligossacarídeos em monossacarídeos, para capturar todos os açúcares solubilizados pelos ensaios analíticos subsequentes.

[00460] As amostras hidrolisadas e neutralizadas foram diluídas 100X em um Hamilton antes de HPAEC-PAD. Um sistema Dionex ICS-3000 com uma coluna CarboPac PA1 foi usado. O gradiente de eluente mostrado na Tabela 2 acima na seção “Materiais & Métodos” foi aplicado.

[00461] A temperatura da coluna foi 30 °C. Volume de amostra 5 µL. Forma de ondas de PAD “Gold, Carbo, Quad”.

[00462] As FIG. 3 e FIG. 4 mostram a solubilização de arabinose e xilose, respectivamente, em resposta a doses crescentes das combinações de enzimas da presente invenção. O padrão foi similar para solubilização de arabinose e xilose. Com a xilanase pura (100%) foi obtida solubilização máxima a uma dose de 10 µg de EP/g de DS, onde a curva essencialmente se achata. Para uma combinação compreendendo 50% de xilanase e 50% de composição celulolítica pôde ser obtida uma conversão mais elevada e foi essencialmente obtida solubilização máxima a uma dose de 40 µg de EP total/g de DS. Para uma combinação compreendendo 10% de xilanase e 90% de composição celulolítica, possivelmente uma solubilização máxima mais elevada foi possível para doses de 80 µg de EP total/g de DS e acima. Estes dados mostram que a xilanase sozinha é eficaz na solubilização de arabinose e xilose e que a solubilização pode ser intensificada quando se inclui uma

140 / 154 composição celulolítica e ajusta a razão de xilanase:composição celulolítica. Exemplo 3

[00463] Este exemplo mostra que DDGS produzidos com adição de uma combinação de enzimas da presente invenção compreendendo uma razão 20:80 de Xilanase: Composição Celulolítica A aumentou a verdadeira energia metabolizável em um ensaio de ração animal.

[00464] O material de DDGS produzido na instalação piloto foi usado para um ensaio de ração animal. O ensaio de ração foi conduzido na University of Georgia com galos não cecectomizados como um ensaio de TME (verdadeira energia metabolizável) de 48 horas. Os resultados relatados são TMEn (corrigida quanto ao nitrogênio) em uma base de sólidos secos. Controles somente com GSA foram incluídos como a linha de base. 100 ou 1000 µg de proteína de enzima por g de sólidos secos foram adicionados da combinação de enzimas da presente invenção. O aumento de TME estimado foi 12% (17% para uma “megadose”).

[00465] Cinco fermentadores da instalação piloto foram cheios com 8 kg de purê cada um. O purê foi obtido a partir de uma instalação de etanol comercial e liquefeito usando uma combinação de AA369 e Protease Pfu e hidroaquecedor. Antes da transferência para os fermentadores, todo o purê foi misturado bem em um tanque de mistura de 50 kg, o pH foi checado (5,07), e 50 ppm de ureia e 3 ppm de penicilina foram adicionados.

[00466] O material de ração de DDGS foi preparado como se segue. O purê foi transferido para baldes de plástico colocados em uma balança e transferido para os fermentadores a partir daqui. A temperatura foi estabilizada a ou abaixo de 32 °C antes de enzimas e levedura hidratada terem sido adicionadas. O aquecimento foi feito por adição de vapor à camisa, e a temperatura foi elevada até cerca de 42 °C antes de ter sido estabilizada. A temperatura durante SSF teve de ser mantida pelo calor de fricção a partir dos agitadores, porque o permutador de calor por água quente para as camisas

141 / 154 estava fora de serviço na instalação piloto. Portanto, as temperaturas estavam baixas (~24-28 °C) durante os primeiros dias e, eventualmente, as velocidades do agitador foram aumentadas até 600 RPM para se manter 32 °C. Antes da coleta, a temperatura foi aumentada até 95 °C durante 40 min. por injeção de vapor, e o arejamento foi definido a 3 L/min. para separar por evaporação o etanol. A agitação foi definida a 200 RPM. Depois foi usado resfriamento com água para levar as temperaturas até abaixo de 50 °C antes de os fermentadores terem sido esvaziados. O material foi transferido para assadeiras antiaderentes de 9 x 13” e colocado em um forno ventilado a 50 °C. Após secagem no forno, o material levemente úmido foi triturado em um processador alimentar antes de ser colocado em um liofilizador e triturado novamente após liofilização. Todo o material foi dividido em um separador de amostras de 8 vias no edifício de granulação. As amostras foram enviadas para o Centro-Oeste para análise aproximada.

[00467] Tomando médias dos tratamentos, as melhorias na Tabela 3 em baixo são estimadas. Isto excede o objetivo definido de aumento de 5% por uma ampla margem. Os dados para TMEn por peso seco foram analisados em software estatístico JMP. Uma vez que existiu uma elevada variação de lote para lote dos DDGS preparados (em relação à variação entre as oito aves individuais que foram alimentadas com o mesmo lote), um modelo ANOVA de uma via foi ajustado com os cinco lotes de DDGS sendo a variável explicativa; em vez de aninhar lote sob tipo de tratamento. Tabela 3 Tratamento Média Aumento Controle 3358 0% 100 µg 3758 12% 1000 µg 3917 17% Tabela 4 RSquadrado 0,9327 Ajuste de RSquadrado 0,925 Raiz do Erro Quadrático Médio 73,587 Média de Resposta 3630,1 Observações (ou Soma de Pesos) 40

142 / 154 Tabela 5 - Testes de Efeito Fonte Nparm DF Soma de Quadrados Razão F Prob > F Lote 4 4 2626463,8 121,2568 <0,0001* Tabela 6 - Teste de Comparação Múltipla HSD de Tukey α= 0,050 Q= 2,87506 Nível Média Mínima Quadrada 1000 µg A 3917 100 µg 1 A 3830 100 µg 2 B 3686 Controle 1 C 3524 Controle 2 D 3193 Os níveis não conectados pela mesma letra são significativamente diferentes.

[00468] É visto a partir da Tabela 6 acima que o controle #1 é significativamente diferente do controle #2, e 100 µg do lote #1 são significativamente diferentes de 100 µg do lote #2. Consequentemente, a variação de lote para lote foi muito elevada.

[00469] Apesar da elevada variação de lote para lote, no entanto, a FIG. 5 mostra que os tratamentos enzimáticos tiveram um efeito positivo nos valores de TME, pois a ordem dos lotes é tal que os dois controles tiveram a TME mais baixa e a “megadose” de 1000 µg teve a TME mais elevada. Exemplo 4

[00470] O Exemplo 4 demonstra que, quando adicionada a um SSF de amido em bruto, uma combinação de enzimas exemplificativa da presente invenção compreendendo uma razão 50:50 de Xilanase:Composição Celulolítica A solubilizou quantidades similares de fibra em comparação com testes prévios usando a combinação de enzimas em purê de um processo de cozimento convencional. Materiais • Farinha de milho triturada fina (isenta de IP) • Estoque de lactrol, 1 g/L • Estoque de ureia, 200 g/L • Produto de enzima amilase, BPX10.5c • Levedura em Creme

143 / 154 Equipamento • Analisador de Umidade • Misturador/Pá • Proveta (para mistura da pasta semifluida de milho) • medidor de pH • Pipetas/Pontas • Pipeta Serológica, 100 mL com tampa cortada (uma serra é usada para cortar a ponta tal que a pasta semifluida de milho possa ser aliquotada) • Garrafas Wheaton de 125 mL e rolhas com orifícios perfurados • Agitador Aquecido • Banho de água • Frascos com defletores (250 mL) • frascos/tampas de HPLC • filtros de seringa de 0,2 u • Frasco volumétrico (10 mL) para diluição de enzimas Procedimento

[00471] Usando farinha triturada fina e água, uma pasta visando 34,5% de sólidos secos (DS) foi preparada. Usando o Analisador de Umidade, os sólidos secos da farinha de milho foram determinados como sendo 84,54%. A pasta semifluida de milho foi suplementada com 1000 ppm de ureia e 3 ppm de Lactrol. A pasta semifluida foi ajustada até pH 4,5 com H2SO4 a 40%, deixada a misturar durante cerca de uma hora e depois ajustada novamente até pH 4,5.

[00472] Aproximadamente 70 g de purê de milho foram aliquotados em garrafas Wheaton de 125 mL pré-pesadas usando a pipeta serológica com ponta cortada. As garrafas foram cobertas com rolhas tendo orifícios perfurados. O peso do purê para cada garrafa foi registrado. Pasta semifluida

144 / 154 de milho foi adicionada a um frasco com defletores (~5 g de pasta semifluida de milho/tratamento) para tratamentos de propagação. O tamanho dos frascos de propagação foi escolhido com base no volume de pasta semifluida requerido para tratamentos, o frasco é tipicamente 5x o volume da pasta semifluida. Somente uma propagação foi feita para o ensaio.

[00473] As dosagens de enzima foram baseadas no peso da pasta semifluida de milho em cada garrafa. A água foi doseada em cada amostra de fermentação tal que a correção de volume leve todos os frascos na experiência até à mesma percentagem total de sólidos, tornando as concentrações de etanol diretamente comparáveis entre tratamentos. As doses de enzima na Tabela 7 foram adicionadas. Tabela 7 BPX10.5c VD GH30_8 MGProt III AGU/g de DS µg de EP/g de DS µg de EP/g de DS mPROT(B)/g de DS 0,25 0 0 0 0,25 50 50 0 0,25 50 50 25

[00474] Levedura em creme MBLA855 (como descrita em WO2017/087330) foi usada. A propagação foi operada durante 6 horas a 32 °C se agitando a 150 rpm. A propagação foi usada para dosear as fermentações. Um purê de fermentação foi doseado tal que a propagação constituísse 5% do purê de fermentação total. Para fermentações, o teste de temperatura típico de 90 ˚F pode ser encontrado na Tabela 8. Tabela 8 Tempo (horas) Temp (°F)Temp (°C)Tempo & Dia 0 a 16 90 32,2 Segunda 4 - Terça 8 16 a 24 88 31,1 Terça 8 - Terça 4 24 a 48 87 30,6 Terça 4 - Quarta 4 48 a 88 86 30 Quarta 4 - Sexta 8

[00475] Após dosagem, as fermentações foram doseadas e colocadas no banho de água. A água no banho estava ao mesmo nível que o purê nas garrafas para minimizar a evaporação. Todas as garrafas foram agitadas duas vezes por dia; manhã e tarde.

[00476] As amostras foram preparadas para HPLC como se segue. 5

145 / 154 mL de amostra foram transferidos para um tubo e centrifugados durante 10 min. a 3000 g, depois filtrados através de um filtro de seringa de 0,2 μm. 1 mL de amostra foi transferido para um frasco de HPLC e 20 μL de H2SO4 a 40% foram adicionados. Os frascos foram subsequentemente submetidos a vórtex. As amostras foram armazenadas a 4 °C. Para analisar as amostras, o protocolo de HPLC da Tabela 1 acima na seção “Materiais & Métodos” foi usado.

[00477] O método quantifica analitos usando padrões de calibração para dextrinas (DP4+), maltotriose, maltose, glucose, frutose, ácido acético, ácido láctico, glicerol e etanol. É usada uma calibração de 4 pontos incluindo a origem. Foi usado o método Fuel de 18 minutos.

[00478] O ensaio de solubilização foi operado como se segue. A hidrólise ácida foi feita em tubos de microcentrífuga com tampas de rosca. 180 µL de amostra e 60 µL de HCl a 5 N foram adicionados e foram colocados em um bloco de aquecimento em agitação a 95 °C durante 40 min. Após resfriamento foram neutralizados com 60 µL de NaOH (NaOH a 50% p/p, diluído 4X vol/vol). O propósito da hidrólise ácida foi hidrolisar oligossacarídeos em monossacarídeos, para capturar todos os açúcares solubilizados pelos ensaios analíticos subsequentes.

[00479] As amostras foram diluídas 100X em um Hamilton antes de HPAEC-PAD. Um sistema Dionex ICS-3000 com uma coluna CarboPac PA1 foi usado.

[00480] O gradiente de eluente mostrado na Tabela 2 acima na seção “Materiais & Métodos” foi aplicado.

[00481] A temperatura da coluna foi 30 °C. Volume de amostra 5 µL. Forma de ondas de PAD “Gold, Carbo, Quad”. Resultados

[00482] Os dados de HPLC mostraram que a combinação de enzimas da presente invenção aumentou a quantidade de açúcares solubilizados, como

146 / 154 evidenciado pelos picos de DP4+ (FIG. 6) e DP3 (FIG. 7) aumentados.

[00483] Os dados de IC mostraram solubilização de açúcares (por exemplo, arabinose (FIG. 8), xilose (FIG. 9) e galactose (FIG. 10)) ao mesmo nível que para um processo de cozimento convencional.

[00484] Os dados de LECO mostraram que a protease aumentou a solubilização de proteínas (FIG. 11). Exemplo 5

[00485] Foram levadas a cabo fermentações SSF com purê de milho comercial, liquefeito com uma combinação de AA369 e Protease Pfu. Após fermentação, o processo interno foi simulado, produzindo xarope e DDGS a partir da vinhaça. Levedura Ethanol Red e 0,6 AGU/g de DS de GSA foram usadas em conjunto com as adições de enzima/combinação mostradas na Tabela 9. Tabela 9 Amostras Enzimas adicionadas Controles nenhumas hemicelulases e celulases foram adicionadas.

100 µg de EP/g de DS de E-SEP Combinação de estirpes de celulase de Trichoderma reesei expressando xilanase GH10 e arabinofuranosidase GH-62 100 µg de EP/g de DS de Combinação de Enzimas Combinação de enzimas compreendendo 10:90 1 Xilanase: Composição Celulolítica A 100 µg de EP/g de DS de Combinação de Enzimas Combinação de enzimas compreendendo 20:80 2 Xilanase: Composição Celulolítica A 100 µg de EP/g de DS de Combinação de Enzimas Combinação de enzimas compreendendo 50:50 3 Xilanase: Composição Celulolítica A 1000 µg de EP/g de DS de Combinação de Combinação de enzimas compreendendo 20:80 Enzimas 2 (Megadose) Xilanase: Composição Celulolítica A

[00486] Existiram níveis significativamente mais elevados de xilose (FIG. 12), arabinose (FIG. 13) e galactose (FIG. 14) solubilizadas obtidos usando todas as combinações de enzimas testadas da presente invenção em comparação com os controles e amostras de E-SEP. Não existiu, no entanto, nenhuma diferença significativa entre as combinações compreendendo diferentes razões de xilanase:composição celulolítica. Mesmo a megadose não foi significativamente mais elevada na solubilização de açúcares do que xilanase a 10%.

147 / 154

[00487] As amostras tratadas com E-SEP produziram os DDGS mais escuros. Inesperadamente, as combinações de enzimas da presente invenção, a todas as doses testadas, incluindo a megadose, não mostraram escurecimento de DDGS versus o controle.

[00488] A FIG. 15 demonstra que as combinações de enzimas da presente invenção produziram maiores quantidades de etanol que o controle sem diferenças significativas entre as combinações de xilanase:enzima celulolítica a 10%, 20% ou 50%. A megadose de 1.000 µg da combinação de enzimas da presente invenção teve etanol significativamente mais elevado do que todos os outros tratamentos.

[00489] Os sólidos totais de cada tratamento foram medidos em uma balança de umidade (120 ºC) após a vinhaça fina ter sido evaporada até xarope. As amostras foram guardadas para se comparar a cor do xarope como um indicador da cor dos DDGS finais.

[00490] Todos os xaropes acima tinham em torno de 37-39% de DS. Como esperado, o tratamento com E-SEP contendo xilanase GH10 e arabinofuranosidase GH-62 foi o mais escuro devido aos açúcares monoméricos gerados (FIG. 16). Inesperadamente, não foram observadas nenhumas diferenças significativas nas três combinações de enzimas da presente invenção e tinham cor similar ao controle de Excel (FIG. 16).

[00491] A megadose pareceu aumentar ligeiramente a cor do xarope (FIG. 16).

[00492] Após análises do xarope, o xarope e o bolo úmido foram combinados e deixados a repousar às temperaturas de refrigeração alguns dias para permitir migração uniforme da umidade.

[00493] Cada tratamento foi depois seco a 95 ºC durante aproximadamente 2 horas até 90-95% de DS terem sido alcançados nos DDGS (FIG. 17). A cor de DDGS foi medida em um rastreador de cor da Hunter Lab.

148 / 154

[00494] Como esperado, o tratamento com E-SEP produziu DDGS mais escuros. Surpreendentemente, as combinações de enzimas da presente invenção e a megadose da combinação de enzimas da presente invenção não mostraram nenhum escurecimento de DDGS em comparação com o controle de Excel sugerindo o problema de escurecimento da cor de DDGS sendo resolvido (FIG. 18). No entanto, como visto acima, o tratamento com E-SEP foi seco um pouco mais (~1-2%) em comparação com os outros tratamentos (FIG. 19). Materiais e Métodos

[00495] O liquefato em esta experiência foi material vegetal recebido a partir de uma instalação de etanol comercial. O liquefato foi obtido usando AA369 e Protease Pfu em um purê de milho contendo 35,76% de DS.

[00496] Aproximadamente 5,5 L de purê de uma instalação de etanol comercial (35% de DS) foram usados em esta experiência. Após a adição de 34 ppm de ureia e 3 ppm de penicilina, ~300 g de purê foram aliquotados em frascos de fermentação de 800 mL (rolhas de rosca laranjas) x 3 réplicas para cada tratamento x6 (18 frascos totais em fermentação).

[00497] A levedura foi preparada por aquecimento de 100 mL de água da torneira até 32 °C, adição de 5,5 g de levedura e incubação a 32 °C durante 30 minutos.

[00498] As enzimas de SSF foram doseadas de acordo com a Tabela 9 acima. Finalmente, 3 mL de levedura foram adicionados a cada frasco e depois todos os frascos foram totalmente misturados. Os sólidos foram ajustados visando 34% de DS e o pH foi ajustado até 5,0.

[00499] Os frascos foram depois transferidos para um agitador de ar e incubados a 32 ºC durante 66 horas.

[00500] Vinhaça inteira que havia sido previamente liquefeita e fermentada (~15% de DS) é destilada durante 30-40 minutos a 88 °C no roto- vap para se remover o etanol e um pouco de água. A vinhaça inteira é fixada

149 / 154 usando um balão de fundo redondo de 1 ou 2 L como visto em baixo e baixada no banho de água com rotação constante a 85 rpm.

[00501] A vinhaça final foi gerada por passagem de vinhaça inteira (~18-19% de DS) ao longo de peneira de 879 µm empilhada no topo de uma peneira de 355 µm, usando uma espátula. Os pesos foram coletados para se determinar a percentagem de vinhaça inteira acabando em bolo úmido (>355 µm) ou vinhaça fina (<355 µm). Isto será informação importante para se correlacionar com o processo de instalação de um cliente. Os dados para equilíbrio de massas foram coletados para se determinar a percentagem de sólidos acabando em bolo úmido (>355 µm) ou vinhaça fina (<355 µm).

[00502] A vinhaça fina foi depois adicionada de volta ao roto-vap para criar xaropes de cada tratamento a cerca de 35-40% de DS.

[00503] As amostras foram coletadas após 66 horas para testar a % de etanol em HPLC. A pct. de rendimento foi medida usando o protocolo de HPLC na Tabela 1 acima na seção “Materiais & Métodos”.

[00504] As amostras para HPLC foram também avaliadas quanto aos açúcares solubilizados; tanto monoméricos como incluídos em oligômeros. Isto foi feito por hidrólise ácida de oligômeros em monômeros, seguida por ensaios para os açúcares monoméricos.

[00505] 600 µL de amostra (sobrenadante filtrado; as amostras que foram operadas em HPLC) e 200 µL de HCl a 5 N foram adicionados aos tubos de microcentrífuga com tampas de rosca.

[00506] Estes foram submetidos ao vórtex e incubados a 95 °C durante 40 min. em um aquecedor e agitador em bloco de alumínio. Após resfriamento no refrigerador, 200 µL de NaOH (NaOH a 50%, diluído 4X v/v) foram adicionados para neutralizar as amostras, que foram agora diluídas 1,67X v/v pelos HCl e NaOH adicionados. As amostras foram filtradas através de unidades de filtração de microcentrífuga Spin-X de 0,2 µm para se remover qualquer precipitado. As amostras foram subsequentemente diluídas

150 / 154 100X no Hamilton (10 µL de amostra mais 990 µL de água). A diluição final das amostras foi consequentemente 167X.

[00507] As amostras acima foram analisadas por HPAEC-PAD, de modo a se obter um perfil de açúcares mais detalhado. Um sistema Dionex ICS-3000 com uma coluna CarboPac PA1 foi usado.

[00508] O gradiente de eluente mostrado na Tabela 2 acima na seção “Materiais & Métodos” foi aplicado.

[00509] A temperatura da coluna foi 30 °C. Volume de amostra 5 µL. Forma de ondas de PAD “Gold, Carbo, Quad”. Exemplo 6

[00510] O Exemplo 6 demonstra o perfil nutricional melhorado de DDGS produzidos de acordo com a presente invenção usando uma combinação de enzimas compreendendo Xilanase e Composição Celulolítica B.

[00511] Duas vezes quatro reatores laboratoriais IKA (LR-2.ST the Allrounder) foram operados com combinações de Composição Celulolítica B e Xilanase foram adicionadas. Uma dose de xilanase relevante para a aplicação, baixa foi testada.

[00512] Quatro reatores laboratoriais IKA foram operados em cada bloco. Cada reator foi cheio com 2100 g de purê, para um rendimento estimado de 260 g de DDGS por reator. O purê foi obtido a partir de uma instalação de etanol comercial e foi liquefeito com uma combinação de AA369 e Protease Pfu e hidroaquecedor.

[00513] 20 kg de purê foram adicionados a um balde, e um agitador IKA azul foi equipado para misturar o conteúdo. O pH foi registrado e foi verificado que estava acima de 4,5 (sem contaminação). Os sólidos secos foram medidos e registrados (dados não mostrados).

[00514] Ureia e penicilina foram adicionadas de acordo com o purê de acordo com a Tabela 10 em baixo.

151 / 154 Tabela 10 Agente Quantidade Dose de ureia 50 ppm Concentração de estoque de ureia 200 g/L Volume de estoque de ureia 5,425 mL Dose de penicilina 3 ppm Concentração de estoque de penicilina 1 g/L Volume de estoque de penicilina 65,1 mL

[00515] Um de cada vez, os quatro reatores foram colocados em uma balança, e 2100 g de purê foram transferidos com um jarro.

[00516] Os reatores foram equipados com agitação (50 RPM) e os banhos de água foram definidos a 32 °C. As temperaturas dentro dos reatores foram verificadas após equilíbrio. Diluições de enzimas e levedura hidratada foram doseadas para cada bloco de acordo com os dados mostrados na Tabela 11 e Tabela 12 em baixo. Tabela 11 – Bloco 1 Bloco 1 Composição # Descrição GSA Celulolítica B Xilanase Levedura (mL) 1 Elevada 417 724 1391 25 2 Alcançar 417 724 25 5 Controle 417 25 6 Atualizada 417 724 139 25 Total 1666 2172 1530 100 Tabela 12 – Bloco 2 Bloco 2 Composição Celulolítica Descrição GSA B Xilanase Levedura (mL) Alcançar 417 724 25 Elevada 417 724 1391 25 Atualizada 417 724 139 25 Controle 417 25 Total 1666 2172 1530 100

[00517] A SSF foi operada durante três dias.

[00518] Uma amostra de 5 g foi retirada de cada reator para trabalho analítico. Depois, as entradas do banho de água foram desconectadas nos reatores, e as temperaturas do banho de água foram definidas a 95 °C. Quando todos os banhos de água haviam alcançado 95 °C, as entradas foram reconectadas, e os reatores foram aquecidos durante uma hora, para simular a

152 / 154 destilação e operações internas em uma instalação. Após isso, os banhos de água foram desligados, e os reatores deixados a agitar durante outra hora. O conteúdo dos reatores foi depois vertido em duas assadeiras de 9 x 13” por reator e foi usado um raspador de borracha para limpar tudo para fora dos reatores. As assadeiras foram colocadas em um forno a 35 °C durante a noite. Depois, as amostras foram misturadas bem, congeladas e liofilizadas. Os pesos e sólidos finais dos materiais foram registrados.

[00519] As amostras de 5 g retiradas acima foram centrifugadas durante 5 min. a 5300 RPM, e os sobrenadantes foram filtrados com filtros de seringa de 0,2 µm. Os sobrenadantes filtrados foram submetidos à HPLC “como tal” e também usados para hidrólise ácida seguida por HPAEC-PAD (IC), para hidrolisar oligossacarídeos em monossacarídeos, de modo de quantificar todos os açúcares solubilizados. A hidrólise ácida foi levada a cabo como se segue. 300 µL de amostra e 100 µL de HCl a 5 N foram adicionados a tubos de microcentrífuga com rolhas de rosca. Os tubos foram submetidos a vórtex e colocados em um bloco de aquecimento a 95 °C durante 40 min. Após resfriamento foram neutralizados com 125 µL de NaOH (NaOH a 50% p/p, diluído 5X vol/vol) e submetidos a vórtex. As amostras foram diluídas 20X em um diluidor Hamilton Microlab 600 antes de HPAEC-PAD (diluição total 35X). As amostras não hidrolisadas foram também diluídas 35X e submetidas para IC. Um sistema Dionex ICS-3000 com uma coluna CarboPac PA1 foi usado. O seguinte gradiente de eluente mostrado na Tabela 2 acima foi aplicado.

[00520] A temperatura da coluna foi 30 °C. Volume de amostra 5 µL. Forma de ondas de PAD “Gold, Carbo, Quad”. Cada lote de reator foi dividido para cinco pássaros, com 5/32 indo para cada um. Isto deve dar 38,6 g por pássaro, e 7/32, ou 54,0 g, restando para trabalho analítico. As amostras foram marcadas como mostrado na Tabela 13 em baixo.

153 / 154 Tabela 13 Descrição Tratamento Pássaro Bloco Reator 1-5 1 5 Controle A 6-10 2 6 1-5 1 2 Alcançar B 6-10 2 1 1-5 1 6 Atualizada C 6-10 2 5 1-5 1 1 Elevada D 6-10 2 2

[00521] As amostras foram divididas em um separador de duas vias em oito frações, de 31 ± 3 g cada uma. Cinco das oito frações foram transferidas para sacos ziplock. Depois, mais material foi adicionado aos sacos com uma espátula, enchendo até 38,7 g por saco (5/32 do peso total). Todo o material restante foi usado para amostras analíticas Resultados

[00522] Os pesos registrados para o conteúdo vertido para fora dos reatores são mostrados na Tabela 14 em baixo. O reator 1 do bloco 1 não foi pesado imediatamente e existiu evaporação substancial assim que o conteúdo quente foi vertido para as assadeiras. Consequentemente, o primeiro reator é provavelmente similar aos outros. Tabela 14 Bloco Reator Tratamento Cerveja (g) Acabado (g) 1 Elevada 1729 250 4 Alcançar 1768 254 1 5 Controle 1768 254 6 Atualizada 1759 249 1 Alcançar 1732 247 4 Elevada 1740 250 2 5 Atualizada 1756 250 6 Controle 1757 255

[00523] Os resultados de HPLC são mostrados na Tabela 15 em baixo e nas FIGS. 20-28. Tabela 15 Bloco Tratamento DP4+ DP3 DP2 Gluc Fru Lactato Glicerol Acetato EtOH Elevada 1,317 0,095 0,168 0,072 0,123 0,206 1,789 0,184 13,944 Alcançar 0,854 0,079 0,152 0,064 0,124 0,185 1,759 0,169 13,975 1 Controle 0,772 0,107 0,182 0,060 0,127 0,181 1,751 0,163 13,939 Atualizada 1,283 0,090 0,158 0,063 0,122 0,183 1,753 0,167 13,963

154 / 154 Alcançar 0,874 0,065 0,153 0,074 0,199 0,170 1,787 0,111 13,848 Elevada 1,331 0,075 0,155 0,068 0,142 0,169 1,741 0,112 13,834 2 Atualizada 1,289 0,070 0,154 0,070 0,144 0,165 1,754 0,112 13,840 Controle 0,789 0,100 0,184 0,065 0,178 0,168 1,765 0,112 13,836

[00524] Os resultados de HPLC são muito consistentes.

[00525] Para IC, amostras foram operadas “como tal” para se obterem concentrações de açúcares monoméricos e após a hidrólise com HCl usual para se obterem concentrações de açúcares solubilizados totais, como mostrado na Tabela 16 em baixo e nas FIGS. 29-32. Tabela 16 Bloco HCl Descrição Arabinose Xilose Galactose Glucose Controle 0,08 0,02 0,33 0,40 Alcançar 0,11 0,02 0,33 0,46 Não Atualizada 0,14 0,02 0,33 0,46 Elevada 0,14 0,02 0,33 0,53 1 Controle 0,80 0,58 0,70 2,96 Alcançar 0,98 0,78 0,74 2,62 Sim Atualizada 2,16 1,78 0,79 2,62 Elevada 2,34 1,96 0,81 2,75 Controle 0,07 0,00 0,32 0,45 Alcançar 0,10 0,03 0,33 0,55 Não Atualizada 0,12 0,02 0,32 0,55 Elevada 0,12 0,01 0,32 0,51 2 Controle 0,73 0,52 0,66 2,74 Alcançar 0,97 0,76 0,72 2,63 Sim Atualizada 1,98 1,67 0,75 2,50 Elevada 2,16 1,84 0,78 2,58

[00526] Os resultados mostrados na Tabela 16 e FIGS. 29-32 são consistentes e mostram aumentos na arabinose e xilose solubilizadas totais quando a xilanase foi adicionada. Existe muito pouca diferença entre “Atualizada” com 3 µg de xilanase e “Elevada” com 30 µg de xilanase. As concentrações de arabinose e xilose monoméricas são muito baixas. Para galactose e glucose, não existe nenhuma tendência clara. Consequentemente, as enzimas não parecem afetar as concentrações de galactose e glucose residual.

[00527] Os resultados mostrando a qualidade e/ou teor nutricional dos DDGS melhorados são mostrados nas FIGS. 33-37 e, em particular, mostram uma tendência clara mostrando que os DDGS têm gordura medida mais elevada.

[00528] As tendências para fibra ADF e NDF são, no entanto, menos claras e mostram variação entre os duplicados.

Claims (25)

REIVINDICAÇÕES

1. Processo de produção de um produto de fermentação, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (a) sacarificação de um material contendo amido a uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização inicial com uma alfa- amilase, uma glucoamilase e uma xilanase ou uma combinação de enzimas compreendendo a xilanase; (b) fermentação usando um organismo de fermentação para produzir o produto de fermentação; e (c) opcionalmente, recuperação de um coproduto.

2. Processo para produção de um produto de fermentação a partir de material contendo amido, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) liquefação de um material contendo amido com uma alfa-amilase; (b) sacarificação do material liquefeito obtido na etapa (a) com uma glucoamilase e uma xilanase ou combinação de enzimas compreendendo a xilanase; (c) fermentação usando um organismo fermentador; e (d) opcionalmente, recuperação de um coproduto.

3. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a sacarificação e a fermentação são realizadas simultaneamente.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que que o material contendo amido compreende maís, milho, trigo, centeio, cevada, triticale, sorgo, switchgrass, milheto, milheto-pérola, painço.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o produto de fermentação é álcool,

particularmente etanol.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que o coproduto é grãos secos destilados (DDG) ou grãos secos destilados com solúveis (DDGS).

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que os DDG ou DDGS têm uma qualidade nutricional melhorada em comparação com DDG ou DDGS recuperados como um coproduto de um processo para produção de um produto de fermentação no qual a xilanase ou combinação de enzimas compreendendo a xilanase não está presente ou é adicionada.

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que os DDG ou DDGS têm um teor de gordura aumentado.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a verdadeira energia metabolizável dos DGS ou DDGS é aumentada em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15% ou pelo menos 20%, em comparação com a TME de DGS ou DDGS produzidos quando uma xilanase ou combinação de enzimas compreendendo uma xilanase não está presente durante a etapa de sacarificação, etapa de fermentação e/ou etapa de sacarificação e fermentação simultâneas do processo.

10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a TME é para um animal monogástrico.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que os DGS ou DDGS produzidos não são escurecidos após secagem em comparação com DGS ou DDGS produzidos quando uma combinação de enzimas, como definida em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, não está presente durante a etapa de sacarificação, etapa de fermentação e/ou etapa de sacarificação e fermentação simultâneas de um processo, como definido em qualquer uma das reivindicações 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o organismo fermentador é levedura, particularmente Saccharomyces sp., mais particularmente Saccharomyces cerevisiae.

13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que a combinação de enzimas compreende adicionalmente uma composição celulolítica.

14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que a composição celulolítica está presente na combinação em uma razão de xilanase e composição celulolítica de cerca de 5:95 a cerca de 95:5, tal como de 5:95, 10:90, 20:80, 50:50, 80:20, 90:10 e 95:5.

15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a xilanase é uma xilanase da família GH30.

16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que a xilanase é uma xilanase GH30_8.

17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que a xilanase é uma xilanase GH30_8 selecionada do grupo consistindo em: (i) a xilanase de Bacillus subtilis de SEQ ID NO: 1 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; (ii) a xilanase de Bacillus subtilis de SEQ ID NO: 2 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; (iii) a xilanase de Bacillus subtilis de SEQ ID NO: 3 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; (iv) a xilanase de Bacillus amyloliquefaciens de SEQ ID NO: 4 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; (v) a xilanase de Bacillus amyloliquefaciens de SEQ ID NO: 5 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; (vi) a xilanase de Bacillus licheniformis de SEQ ID NO: 6 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta; e (vii) a xilanase de Paenibacillus pabuli de SEQ ID NO: 2 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências de aminoácidos com esta.

18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que a composição celulolítica compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I; (ii) uma celobioidrolase II; (iii) uma beta-glucosidase; e (iv) um polipeptídeo GH61 tendo atividade intensificadora celulolítica.

19. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que a composição celulolítica compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro enzimas selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma celobioidrolase I de Aspergillus fumigatus; (ii) uma celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus; (iii) uma beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus; e (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica de Penicillium emersonii.

20. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que a composição celulolítica compreende: (i) uma celobioidrolase I compreendendo os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 8 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 27 a 532 de SEQ ID NO: 8;

(ii) uma celobioidrolase II compreendendo os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 9 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 454 de SEQ ID NO: 9; (iii) uma beta-glucosidase compreendendo os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 10 ou uma sua variante tendo pelo menos uma substituição selecionada do grupo consistindo em F100D, S283G, N456E e F512Y e pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 20 a 863 de SEQ ID NO: 10; e/ou (iv) um polipeptídeo GH61A tendo atividade intensificadora celulolítica compreendendo os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 11 ou uma sua variante tendo pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequências com os aminoácidos 26 a 253 de SEQ ID NO: 11.

21. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que a composição celulolítica compreende adicionalmente uma endoglucanase.

22. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que a composição celulolítica é derivada de uma estirpe selecionada do grupo consistindo em Aspergillus, Penicilium,

Talaromyces e Trichoderma, opcionalmente em que: (i) a estirpe de Aspergillus é selecionada do grupo consistindo em Aspergillus aurantiacus, Aspergillus niger e Aspergillus oryzae; (ii) a estirpe de Penicilium é selecionada do grupo consistindo em Penicilium emersonii e Penicilium oxalicum; (iii) a estirpe de Talaromyces é selecionada do grupo consistindo em Talaromyces aurantiacus e Talaromyces emersonii; e (iv) a estirpe de Trichoderma é Trichoderma reesei.

23. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que a composição celulolítica compreende uma composição celulolítica de Trichoderma reesei.

24. Uso de uma combinação de enzimas, como definida em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23, caracterizado pelo fato de ser para melhoria da qualidade nutricional de DGS ou DDGS produzidos como um coproduto do processo de produção de produtos de fermentação, como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23, preferencialmente sem resultar em um escurecimento dos DDG ou DDGS.

25. Uso de uma combinação de enzimas, como definida em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23, caracterizado pelo fato de ser para solubilização de fibra, preferencialmente para solubilização de xilose e arabinose.