CN104334738B - 生产发酵产物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生产发酵产物的方法，包括使用α‑淀粉酶将含淀粉材料液化；在糖源生成酶和纤维素分解组合物的存在下使用发酵生物体进行预糖化和/或糖化和发酵。本发明还涉及将全酒糟脱水的方法。

Description

生产发酵产物的方法
对序列表的引用
本申请包含计算机可读形式的序列表，其并入本文以作参考。
技术领域
本发明涉及使用发酵生物体从含淀粉材料生产发酵产物的方法。本发明还涉及将全酒糟(whole stillage)脱水的方法。
背景技术
如今，大量难以合成生产的商业产品由发酵生物体生产。这样的产品包括醇(例如丁醇、乙醇、甲醇、1,3-丙二醇)；有机酸(例如乙酸、柠檬酸、葡糖酸盐、葡糖酸、衣康酸、乳酸、琥珀酸、2,5-二酮-D-葡糖酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H2和CO2)以及更复杂的化合物，包括，例如抗生素(如青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素、B12、β-胡萝卜素)以及激素。发酵也常用于可消费醇类(例如啤酒和葡萄酒)、乳制品(例如在酸奶和奶酪的生产中)、皮革以及烟草工业。大量通过降解含淀粉材料提供糖类进行发酵，以生产发酵产物(如乙醇)的工艺在领域内是已知的。然而，由这种含淀粉材料进行发酵产物(如乙醇)的生产仍然过于昂贵。因此，需要提供可增加发酵产物的产率并由此降低生产成本的方法。本发明的目的是提供改进的生产发酵产物的方法。
发明内容
本发明涉及通过使用发酵生物体从含淀粉材料生产发酵产物的方法。
在第一方面，本发明涉及生产发酵产物的方法，包括：
(a)使用α-淀粉酶将含淀粉材料液化；
任选地，在步骤(b)之前对液化的材料进行预糖化；
(b)将液化的材料糖化；
(c)使用发酵生物体进行发酵；
其中，在该任选的预糖化步骤、糖化步骤(b)和/或发酵步骤(c)、或同步糖化和发酵过程中存在或加入糖源生成酶和/或纤维素分解组合物。
纤维素分解组合物可来源于里氏木霉(Trichoderma reesei)、特异腐质霉(Humicola insolens)或Chrysosporium lucknowense。纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。在优选的实施方式中，纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶，其相对ED50装载值(Relative ED50loading value)小于1.00，优选小于0.80，如优选为小于0.60，如0.1-0.9之间，如0.2-0.8之间，如0.30-0.70。相对ED50装载值相对烟曲霉(Aspergillus fumigatus)β-葡糖苷酶(示于本文中SEQ ID NO:6)的ED50而测定。实施例3描述了如何测定β-葡糖苷酶的相对ED50装载值。
纤维素分解组合物可包含一些半纤维素酶，例如木聚糖酶和/或β-木糖苷酶。半纤维素酶可来自纤维素分解组合物的制造生物或来自其它来源，例如半纤维素酶可对于纤维素分解组合物的制造生物(例如里氏木霉)是外来的。在优选的实施方式中，纤维素分解组合物中的半纤维素酶含量低于纤维素分解组合物的10wt.％，如低于5wt.％。
在实施方式中，糖源生成酶(优选为葡糖淀粉酶)以及纤维素分解组合物在同步或相继的糖化和发酵之前的预糖化步骤中加入。
糖源生成酶，如葡糖淀粉酶，优选为包含α-淀粉酶的副活性(side-activity)的葡糖淀粉酶，例如，来自微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)的具有黑曲霉(Aspergillusniger)葡糖淀粉酶接头和淀粉结合域(SBD)的α-淀粉酶热稳定变体(本文中SEQ ID NO:11)。特别考虑的葡糖淀粉酶和α-淀粉酶描述于下文“酶”部分以及实施例中。
在优选的实施方式中，纤维素分解组合物包含示于本文SEQ ID NO:6的烟曲霉β-葡糖苷酶的β-葡糖苷酶变体，其包含选自L89M、G91L、F100D、I140V、I186V、S283G、N456E和F512Y的一个或多个取代。在优选的实施方式中，烟曲霉β-葡糖苷酶为具有任何以下取代的变体：
-F100D+S283G+N456E+F512Y；
-L89M+G91L+I186V+I140V；
-I186V+L89M+G91L+I140V+F100D+S283G+N456E+F512Y(使用SEQ ID NO:6进行编号)。
在优选的实施方式中，纤维素分解组合物来源于里氏木霉，并进一步包括以下中的一种或多种：
(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I，优选为本文中SEQ ID NO:2所示者；
(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II，优选为本文中SEQ ID NO:4所示者；
(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶变体，其具有下列取代：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用本文中SEQ ID NO:6进行编号)。
在本发明方法的又一实施方式中，在预糖化、同步或相继的糖化和发酵过程中存在或加入海藻糖酶。如实施例5所示，葡糖淀粉酶、纤维素分解组合物和海藻糖酶的结合增加了乙醇产量。
此外，还发现本发明的方法导致后端(在回收发酵产物如乙醇之后)的益处。在发酵之后，可通过将发酵材料分离成例如乙醇的液体部分(即发酵产物)以及固体部分(即全酒糟)，优选通过蒸馏，来回收发酵产物。回收发酵产物后，可将固体部分(即全酒糟)脱水，并通过例如离心而分离为固相(即湿滤饼)和液相(稀酒糟，Thin Stillage)。如实施例6所示，得到改进的脱水。
在一个实施方式中，本发明的生产发酵产物的方法包括：
(a)使用α-淀粉酶将含淀粉材料液化；
(b)使用糖源生成酶将液化的材料糖化；
(c)使用发酵生物体在纤维素分解组合物的存在下进行发酵，该纤维素分解组合物还包括选自以下的一种或多种多肽：
-具有纤维素分解增强活性的GH61多肽；
-β-葡糖苷酶；
-纤维二糖水解酶I；
-纤维二糖水解酶II；
或其两种、三种或四种的混合物。在优选实施方式中，纤维素分解组合物的剂量为0.01-0.1mg EP/g DS。
海藻糖酶可以以5-1,000μg/g DS的量存在或加入，例如7-500μg/g DS，例如10-250μg/g DS。
在第二方面，本发明涉及生产发酵产物的方法，包括：
(a)使用糖源生成酶和纤维素分解组合物将液化的材料糖化；
(b)使用发酵生物体进行发酵。
纤维素分解组合物可来源于里氏木霉、特异腐质霉或Chrysosporiumlucknowense。纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。在优选的实施方式中，纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶，其相对ED50装载值小于1.00，优选小于0.80，例如优选小于0.60，例如0.1-0.9之间，例如0.2-0.8之间，例如0.30-0.70。
纤维素分解组合物可包含一些半纤维素酶，例如木聚糖酶和/或β-木糖苷酶。然而，在优选的实施方式中，纤维素分解组合物中的半纤维素酶含量低于纤维素分解组合物的10wt.％，如低于5wt.％。
在优选的实施方式中，纤维素分解组合物包含示于本文SEQ ID NO:6的烟曲霉β-葡糖苷酶的β-葡糖苷酶变体，其包含选自L89M、G91L、F100D、I140V、I186V、S283G、N456E和F512Y的一个或多个取代。在优选的实施方式中，烟曲霉β-葡糖苷酶为具有任何以下取代的变体：
-F100D+S283G+N456E+F512Y；
-L89M+G91L+I186V+I140V；
-I186V+L89M+G91L+I140V+F100D+S283G+N456E+F512Y(使用SEQ ID NO:6进行编号)。
在优选的实施方式中，纤维素分解组合物来源于里氏木霉，并进一步包括以下中的一种或多种：
(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I，优选为本文中SEQ ID NO:2所示者；
(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II，优选为本文中SEQ ID NO:4所示者；
(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶变体，其具有下列取代：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用本文中SEQ ID NO:6进行编号)。
在一个实施方式中，生产发酵产物的方法包括：
(i)使用糖源生成酶在低于初始糊化温度的温度下将含淀粉材料糖化；和
(ii)使用发酵生物体在纤维素分解组合物的存在下进行发酵，该纤维素分解组合物还包括一种或多种选自以下的多肽：
-具有纤维素分解增强活性的GH61多肽；
-β-葡糖苷酶；
-纤维二糖水解酶I；
-纤维二糖水解酶II；
或其两种、三种或四种的混合物。
在优选实施方式中，纤维分解组合物的剂量为0.0001-3mg EP/g DS，优选为0.0005-2mg EP/g DS，优选为0.001-1mg/g DS，更优选为0.005-0.5mg EP/g DS，且甚至更优选为0.01-0.1mg EP/g DS。
在第三方面，本发明涉及将源自本发明方法的全酒糟脱水的方法。将全酒糟脱水的方法包括：
(a)使用α-淀粉酶将含淀粉材料液化；
任选地，在步骤(b)之前对液化的材料进行预糖化；
(b)将液化的材料糖化；
(c)使用发酵生物体进行发酵；
(d)将发酵材料分离成发酵产物和全酒糟；
(e)对全酒糟进行脱水；
其中，在该任选的预糖化步骤、糖化步骤(b)和/或发酵步骤(c)、或同步糖化和发酵过程中存在或加入糖源生成酶和/或纤维素分解组合物。
在实施方式中，通过蒸馏或另一公知的方式从发酵材料中回收发酵产物。
在实施方式中，将脱水的全酒糟分离成液体部分(稀酒糟)和固体部分(湿滤饼)，固体部分被干燥并通常用于动物饲料。
在本发明的脱水方法中使用的酶是关联本发明的生产发酵产物的方法所公开的那些。另外，也可以考虑直接添加纤维素分解组合物至全酒糟，以获得改进的脱水。因此，在一方面，本发明涉及将全酒糟脱水的方法，包括以下步骤：
i)将全酒糟用根据本发明方法限定的纤维素分解组合物进行处理；
ii)将该材料分离成固体部分和液体部分。
定义
酶
纤维素分解酶、纤维素分解组合物或纤维素酶：术语“纤维素分解酶”、“纤维素分解组合物”或“纤维素酶”是指一种或多种(例如几种)水解纤维素材料的酶。此类酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶或其组合。测定纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测定总纤维素分解活性，和(2)测定单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如在Zhang等,Outlook for cellulase improvement:Screening and selection strategies,2006,Biotechnology Advances 24:452-481中所综述的。总纤维素分解活性通常使用不溶性底物进行测定，底物包括Whatman№1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、经预处理的木质纤维素等。最常见的总纤维素分解活性测定为使用Whatman№1滤纸作为底物的滤纸测定法。该测定法是由InternationalUnion of Pure and Applied Chemistry(IUPAC)(Ghose,1987,Measurement ofcellulase activities,Pure Appl.Chem.59:257-68)确立的。
纤维素分解酶的活性通过测量在下述条件中由纤维素分解酶进行的纤维素材料水解的增加来确定：1-50mg的纤维素分解酶蛋白/克的预处理玉米秸秆(“PCS”)(或其它经预处理的纤维素材料)中的纤维素，在合适的温度例如50℃、55℃或60℃下进行3-7日，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比较。典型条件为1mL反应液，经洗涤或未洗涤的PCS，5％不溶性固形物，50mM乙酸钠pH 5，1mM MnSO4，50℃、55℃或60℃，72小时，通过HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)进行糖分析。
家族61糖苷水解酶：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”是指根据Henrissat B.,1991,A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities,Biochem.J.280:309-316和Henrissat B.,and Bairoch A.,1996,Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases,Biochem.J.316:695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。基于对一个家族成员的非常弱的内切-1,4-β-D葡聚糖酶活性的测量，该家族中的酶起初被归类为糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用模式是非经典的，且它们无法视为真正的(bona fide)糖苷酶。然而，基于其在与纤维素酶或纤维素酶的混合物一同使用时增强木素纤维素分解的能力，将它们保留在CAZy分类中。
具有纤维素分解增强活性的多肽：术语“具有纤维素分解增强活性的多肽”意指催化具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解增强的GH61多肽。就本发明而言，通过测量在下述条件下由纤维素分解酶水解纤维素材料而导致的还原糖增加或纤维二糖与葡萄糖的总量增加来测定纤维素分解增强活性：1-50mg总蛋白/g PCS中的纤维素，其中总蛋白包含50-99.5％w/w的纤维素分解酶蛋白，及0.5-50％w/w的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的蛋白质，在合适的温度(例如50℃、55℃或60℃)和pH(例如5.0或5.5)下，历时1-7天，与用等量的总蛋白加载量而无纤维素分解增强活性(1-50mg纤维素分解蛋白/g PCS中的纤维素)所进行的对照水解相比。在一个方面，使用在总蛋白重量的2-3％的米曲霉(Aspergillus oryzae)β-葡糖苷酶(根据WO 02/095014在米曲霉中重组产生)或者总蛋白质量的2-3％的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO 2002/095014所述在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白加载量存在下的1.5L(Novozymes A/S,Denmark)的混合物作为纤维素分解活性的来源。
具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过降低达到相同水解水平所需的纤维素分解酶的量来增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解，优选降低至少1.01倍，例如至少1.05倍，至少1.10倍，至少1.25倍，至少1.5倍，至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少10倍，或至少20倍。
β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原性的β-D-葡萄糖残基的水解，伴随β-D-葡萄糖的释放。
对本发明而言，β-葡糖苷酶活性使用对硝基苯-β-D-吡喃葡糖苷作为底物，根据Venturi等,2002,Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilumvar.coprophilum:production,purification and some biochemical properties,J.Basic Microbiol.42:55-66的步骤进行测定。一个单位的β-葡糖苷酶被定义为在25℃，pH 4.8下，在包含0.01％20(聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯)的50mM柠檬酸钠中由作为底物的1mM对硝基苯β-D-吡喃葡萄糖苷，每分钟产生1.0μmol的对硝基苯酚阴离子。
纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维寡糖或任何包含β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从链的还原或非还原末端释放纤维二糖(Teeri,1997,Crystalline cellulose degradation:New insight into the function ofcellobiohydrolases,Trends in Biotechnology 15:160-167；Teeri等,1998,Trichoderma reesei cellobiohydrolases:why so efficient on crystallinecellulose？,Biochem.Soc.Trans.26:173-178)。
纤维二糖水解酶的活性根据Lever等,1972,Anal.Biochem.47:273-279；vanTilbeurgh等,1982,FEBS Letters,149:152-156；van Tilbeurgh and Claeyssens,1985,FEBS Letters,187:283-288；及Tomme等,1988,Eur.J.Biochem.170:575-581中描述的步骤进行测定。在本发明中，Tomme等的方法可用于确定纤维二糖水解酶活性。
内切葡聚糖酶:术语“内切葡聚糖酶”意指内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉中的1,4-β-D-糖苷键和混合的β-1,3葡聚糖例如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纤维素组分的其它植物材料中的β-1,4键的内水解(endohydrolysis)。
内切葡聚糖酶活性可通过测量底物粘度的减少或由还原糖测定法(Zhang等，2006,BiotechnologyAdvances 24:452-481)确定的还原端增加来确定。就本发明而言，根据Ghose,1987,Pure and App1.Chem.59:257-268的步骤，在pH5，40℃使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来测定内切葡聚糖酶活性。
半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指一种或多种(例如几种)水解半纤维素材料的酶。参见，例如Shallom,D.and Shoham,Y.Microbial hemicellulases.Current Opinion In Microbiology,2003,6(3):219-228)。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键组分。半纤维素酶的实例包括，但不限于，乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。这些酶的底物，即半纤维素，是支化和直链多糖的混杂集团，这些多糖通过氢键键合于植物细胞壁中的纤维素微纤维，将其交联为一个强大的网络。半纤维素亦共价地附于木质素，与纤维素一同形成高度复杂的结构。半纤维素的可变的结构和组织形式需要许多酶的协同作用使其完全降解。半纤维素酶的催化模块为水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或水解乙酸或阿魏酸侧基的酯连接的糖酯酶(CE)。这些催化模块，基于其一级序列的同源性，可指派为GH和CE家族。一些具有总体上类似的折叠的家族可进一步归类为宗族(clans)，以字母标记(例如，GH-A)。最具信息性和最新的这些和其它糖活性酶的分类可在Carbohydrate-Active Enzymes(CAZy)数据库获得。半纤维素分解酶活性可根据Ghose andBisaria,1987,Pure&AppI.Chem.59:1739-1752，在合适的温度(例如50℃、55℃或60℃)和pH(例如5.0或5.5)下进行测量。
α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.1)为一组酶，其催化淀粉及其它直链和支链的1,4-糖苷寡糖和多糖的水解。
葡糖淀粉酶(葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶，EC 3.2.1.3)为一组酶，其催化从链的非还原性末端连续地水解末端(1→4)-连接的α-D-葡萄糖残基，伴随β-D-葡萄糖的释放。
其它定义：
等位变体(Allelic variant)：术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多(例如几种)的可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
cDNA：术语“cDNA”意指能够通过反转录从得自真核或原核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少可能存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤加工包括剪接，然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。
纤维素材料：术语“纤维素材料”意指任何包含纤维素的材料。生物质的初生细胞壁中的主要多糖是纤维素，其次最丰富的是半纤维素，而第三是果胶。次生细胞壁在细胞停止生长后产生，其同样含有多糖并通过共价交联至半纤维素的聚合木质素而加强。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并且因此是直链β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，处于具有系列取代基的复杂分支结构。尽管通常是多形的，存在于植物组织中的纤维素主要是平行葡聚糖链的不溶晶体基质。半纤维素通常与纤维素以及其它半纤维素以氢键相连，其帮助稳定细胞壁基质。
纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴，或树的叶、枝和木材。纤维素材料可以是，但不限于，农业残余物、草本材料(包括能量作物)、城市固体废物、纸浆与造纸厂残余物、废纸和木材(包括林业残余物)(参见，例如，Wiselogel等，1995，在Handbook onBioethanol(Charles E.Wyman编)，pp.105-118,Taylor&Francis,Washington D.C.；Wyman,1994,Bioresource Technology 50:3-16；Lynd,1990,Applied Biochemistry andBiotechnology 24/25:695-719；Mosier等.,1999,Recent Progress in Bioconversionof Lignocellulosics,在Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,T.Scheper,managing editor,Volume 65,pp.23-40,Springer-Verlag,New York)。在本文中应理解的是，纤维素可以是木素纤维素的形式，一种在混合基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。在优选的方面，纤维素材料是任何生物质材料。在另一个优选的方面，纤维素材料是木素纤维素，其包含纤维素、半纤维素和木质素。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开放阅读框决定，开放阅读框以起始密码子如ATG、GTG或TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG或TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
片段：术语“片段”是指从成熟的多肽主体的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如数个)氨基酸的多肽；其中片段具有酶活性。在一方面，片段含有至少85％，例如至少90％，或至少95％的酶的成熟多肽的氨基酸残基。
高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和50％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2％SDS在65℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和25％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2％SDS在50℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，该修饰为例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一个方面，基于预测SEQ ID NO:2的氨基酸1至26为信号肽的SignalP程序(Nielsen等，1997,ProteinEngineering 10:1-6)，烟曲霉纤维二糖水解酶I的成熟多肽为SEQ ID NO:2的氨基酸27至532。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:4的氨基酸1至19为信号肽的SignalP程序，烟曲霉纤维二糖水解酶II的成熟多肽为SEQ ID NO:4的氨基酸20至454。在另一方面，基于预测SEQID NO:6的氨基酸1至19为信号肽的SignalP程序，烟曲霉β-葡糖苷酶的成熟多肽为SEQ IDNO:6的氨基酸20至863。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:8的氨基酸1至25为信号肽的SignalP程序，青霉属物种(Penicillium sp.)GH61多肽的成熟多肽为SEQ ID NO:8的氨基酸26至253。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:10的氨基酸1至17为信号肽的SignalP程序，烟曲霉木聚糖酶I的成熟多肽为SEQ ID NO:10的氨基酸18至364。在另一方面，基于预测SEQID NO:18的氨基酸1至17为信号肽的SignalP程序，里氏木霉纤维二糖水解酶I的成熟多肽为SEQ ID NO:18的氨基酸18至514。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:20的氨基酸1至18为信号肽的SignalP程序，里氏木霉纤维二糖水解酶II的成熟多肽为SEQ ID NO:20的氨基酸19至471。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:22的氨基酸1至19为信号肽的SignalP程序，里氏木霉β-葡糖苷酶的成熟多肽为SEQ ID NO:22的氨基酸20至744。
在本领域中已知宿主细胞可产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即具有不同的C端和/或N端氨基酸)的混合物。
成熟多肽编码序列:术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，基于预测本文中SEQ ID NO:1的核苷酸1至78编码信号肽的SignaIP程序(Nielsen等,1997，见上)，烟曲霉纤维二糖水解酶I的成熟多肽编码序列为本文中SEQID NO:1的核苷酸79至1596，或其cDNA序列。在另一个方面，基于预测本文中SEQ ID NO:3的核苷酸1至57编码信号肽的SignaIP程序，烟曲霉纤维二糖水解酶II的成熟多肽编码序列为本文中SEQ ID NO:3的核苷酸58至1700，或其cDNA序列。在另一个方面，基于预测本文中SEQID NO:5的核苷酸1至57编码信号肽的SignaIP程序，烟曲霉β-葡糖苷酶的成熟多肽编码序列为本文中SEQ ID NO:5的核苷酸58至2580，或其cDNA序列。在另一个方面，基于预测本文中SEQ ID NO:7的核苷酸1至75编码信号肽的SignaIP程序，青霉属物种GH61多肽的成熟多肽编码序列为本文中SEQ ID NO:7的核苷酸76至832，或其cDNA序列。
中等严格条件：术语“中等严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和35％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2％SDS在55℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
中-高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于长度至少100个核苷酸的探针，在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml已剪切并且变性的鲑精DNA和35％的甲酰胺中，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交12至24小时。使用2X SSC、0.2％SDS在60℃将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
亲本酶：术语“亲本”意指对其进行改变以产生变体的酶。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体。
预处理的玉米秸秆：术语“PCS”或“预处理的玉米秸秆”意指通过用热和稀硫酸处理、碱预处理或中性预处理的源自玉米秸秆的纤维素材料。
序列同一性：通过参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,TrendsGenet.16:276-277)，优选5.0.0版或更新版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)确定。使用的参数为空位开放罚分(gap open penalty)10、空位扩展罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longest identity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并如下计算：
(相同残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)。
就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等，2000,见上文)，优选5.0.0版或更新版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needlemanand Wunsch,1970，见上文)确定。使用的参数为空位开放罚分10，空位扩展罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得))作为百分比同一性，并如下计算：
(相同脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中的空位总数)。
子序列：术语“子序列”意指从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(例如几个)核苷酸的多核苷酸；其中子序列编码具有酶活性的片段。在一个方面，子序列含有至少85％，例如至少90％或至少95％的酶的成熟多肽编码序列的核苷酸。
变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如几个)位置包含改变，即取代、插入和/或缺失的具有酶或酶增强活性的多肽。取代意指将占据某位置的氨基酸用不同的氨基酸替代；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而插入意指在邻接并紧接着占据某位置的氨基酸之后添加氨基酸。
野生型酶：术语“野生型”酶意指由天然存在的微生物(例如在自然界中发现的细菌、酵母或丝状真菌)表达的酶。
附图说明
图1示出了当在发酵过程中使用四种不同的纤维素分解组合物(即纤维素酶A、B、C和D)连同葡糖淀粉酶时的乙醇产量的比较。
图2示出了具有不同浓度的野生型烟曲霉家族GH3Aβ-葡糖苷酶、变体L89M+G91L+F100D+I140V+I186V+S283G+N456E+F512Y、变体L89M+G91L+I140V+I186V和变体F100D+S283G+N456E+F512Y的里氏木霉纤维素分解组合物的净葡萄糖产量。
图3：设置1稀酒糟质量和湿滤饼％DS模型。稀酒糟质量vs纤维素分解组合物剂量的增加趋势表明，在纤维素酶处理中增加的水转移至稀酒糟。
图4：设置2稀酒糟质量和湿滤饼％DS模型。稀酒糟质量vs剂量的增加趋势表明，在纤维素分解组合物处理中增加的水转移至稀酒糟，其效应饱和(effect saturation)约100微克/gDS。
具体实施方式
本发明涉及在预糖化、同步或相继的糖化和发酵过程中使用纤维素分解组合物从糊化和未糊化的含淀粉材料生产发酵产物的方法。本发明还涉及将源自本发明方法的全酒糟脱水的方法。
本发明人已经发现，当开发用于水解木质纤维素原料的纤维素分解组合物在预糖化、和/或同步糖化和发酵过程中以显著低于用于水解木质纤维素原料(例如预处理的玉米秸秆)的纤维素剂量3-10毫克EP/g的浓度连同葡糖淀粉酶应用于液化的玉米醪(即液化的含淀粉材料)时，有显著增加的乙醇产量。
本发明人还发现，在预糖化、和/或同步糖化和发酵中存在或加入海藻糖酶使得乙醇产量增加。
本发明的方法也导致后端益处。已发现当进行本发明的工艺或方法、或通过将纤维素分解组合物直接加至全酒糟时，可取得改进的全酒糟脱水。此外，当在预糖化、糖化和/或发酵例如同步糖化和发酵(SSF)过程中添加蛋白酶(例如源自黄嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的蛋白酶(SEQ ID NO:13))连同糖源生成酶和纤维素分解组合物时，可由全酒糟获得改善的油提取。
由糊化的含淀粉材料生产发酵产物的方法
在该方面，本发明涉及生产发酵产物的方法，包括：
(a)使用α-淀粉酶将含淀粉材料液化；
任选地，在步骤(b)之前对液化的材料进行预糖化；
(b)将液化的材料糖化；
(c)使用发酵生物体进行发酵；
其中，在该任选的预糖化步骤、糖化步骤(b)和/或发酵步骤(c)、或同步糖化和发酵过程中存在或加入糖源生成酶和/或纤维素分解组合物。
纤维素分解组合物可来源于里氏木霉、特异腐质霉或Chrysosporiumlucknowense。纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。在优选的实施方式中，纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶，其相对ED50装载值小于1.00，优选小于0.80，例如优选小于0.60，例如0.1-0.9之间，例如0.2-0.8之间，例如0.30-0.70。
纤维素分解组合物可包含一些半纤维素酶，例如木聚糖酶和/或β-木糖苷酶。半纤维素酶可来自纤维素分解组合物的制造生物体，或其它来源，即，半纤维素酶可对于纤维素分解组合物的制造生物(例如里氏木霉)是外来的。
在优选的实施方式中，纤维素分解组合物中的半纤维素酶含量低于纤维素分解组合物的10wt.％，如低于5wt.％。
在实施方式中，糖源生成酶(优选为葡糖淀粉酶)以及纤维素分解组合物在同步或相继的糖化和发酵之前进行的预糖化步骤中加入。
在优选的实施方式中，糖源生成酶为葡糖淀粉酶，优选为葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的组合。
合适的糖源生成酶(优选为葡糖淀粉酶)和α-淀粉酶的实例在下文“糖源生成酶(糖化酶)”部分和“α-淀粉酶”部分及实施例中公开。
糖源生成酶，优选为葡糖淀粉酶，优选地为包含α-淀粉酶的副活性的葡糖淀粉酶，例如来自微小根毛霉的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合域(SBD)的α-淀粉酶热稳定变体(本文中SEQ ID NO:11)。
在具体的实施方式中，糖源生成酶为以下物质的混合物，源自公开于WO 99/28448的埃莫森踝节菌(Talaromyces emersonii)或本文中SEQ ID NO:9的葡糖淀粉酶、公开为WO06/69289中的SEQ ID NO:2或本文中SEQ ID NO:10的瓣环栓菌(Trametes cingulata)葡糖淀粉酶，以及公开为WO 2006/069290中表5中的V039或本文中的SEQ ID NO:11的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶。组分之间的比值可优选为约65:15:1。
在实施方式中，α-淀粉酶为具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合域(SBD)的微小根毛霉α-淀粉酶(本文中SEQ ID NO:11)，其进一步包括至少一个以下取代或取代的组合：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192RV410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C(使用SEQID NO:11编号)。
在实施方式中，糖源生成酶和/或纤维素分解组合物在糖化步骤(b)和/或发酵步骤(c)之前进行的预糖化过程中加入。糖源生成酶和纤维素分解组合物也可以在同步糖化和发酵(SSF)之前进行的预糖化过程中加入。
在实施方式中，本发明的方法包括：
(a)使用α-淀粉酶将含淀粉材料液化；
使用糖源生成酶和纤维素分解组合物对液化的材料进行预糖化；
(b)糖化；
(c)使用发酵生物体进行发酵；
其中，糖化步骤(b)和发酵步骤(c)同步或相继地进行。
在实施方式中，本发明的方法包括：
(a)使用α-淀粉酶将含淀粉材料液化；
使用糖源生成酶对液化的材料进行预糖化；
(b)在纤维素分解组合物的存在下进行糖化；
(c)使用发酵生物体进行发酵；
其中，糖化步骤(b)和发酵步骤(c)同步或相继地进行。
在本发明方法的实施方式中，预糖化如下进行：在40-75℃的温度下，例如50-70℃，优选60℃；pH 4-6，优选为5；时间为30-360分钟，例如60-420分钟，例如大约150-180分钟。
在本发明的实施方式中，糖源生成酶和/或纤维素分解组合物在糖化步骤(b)和/或发酵步骤(c)或在同步糖化和发酵(SSF)过程中加入。
在实施方式中，本发明方法包括：
(a)使用α-淀粉酶将含淀粉材料液化；
(b)在糖源淀粉酶和纤维素分解组合物的存在下将液化的材料糖化；
(c)使用发酵微生物进行发酵；
其中糖化步骤(b)和发酵步骤(c)同步或相继地进行。
在实施方式中，纤维素分解组合物中的半纤维素酶含量低于纤维素分解组合物的10wt.％，如低于5wt.％。
在优选实施方式中，β-葡糖苷酶为示于本文中SEQ ID NO:6的烟曲霉β-葡糖苷酶的变体，其进一步包括一个或多个选自L89M、G91L、F100D、I140V、I186V、S283G、N456E和F512Y的取代。在优选实施方式中，烟曲霉β-葡糖苷酶为具有任何如下取代的SEQ ID NO:6的变体：
-F100D+S283G+N456E+F512Y；
-L89M+G91L+I186V+I140V；
-I186V+L89M+G91L+I140V+F100D+S283G+N456E+F512Y(使用SEQ ID NO:6进行编号)。
在优选的实施方式中，纤维素分解组合物源自里氏木霉，并且还包含以下的一种或多种：
(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I，优选为本文中SEQ ID NO:2所示者；
(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II，优选为本文中SEQ ID NO:4所示者；
(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶变体，其具有下列取代：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用本文中SEQ ID NO:6进行编号)。
在本发明方法的又一实施方式中，在预糖化、糖化、和/或同步或相继的糖化和发酵过程中存在或加入海藻糖酶。如实施例5所示，纤维素分解组合物和海藻糖酶的结合增加了乙醇产量。
此外，还发现本发明的方法导致后端(在回收发酵产物如乙醇之后)的益处。在发酵之后，可通过将发酵材料分离成例如乙醇的液体部分(即发酵产物)以及固体部分(即全酒糟)，优选通过蒸馏，来回收发酵产物。回收发酵产物后，可将固体部分(即全酒糟)脱水，并通过例如离心而分离为固相(即湿滤饼)和液相(稀酒糟)。如实施例6所示，得到改进的脱水。
在一个实施方式中，本发明涉及生产发酵产物的方法，包括：
(a)使用α-淀粉酶将含淀粉材料液化；
(b)使用糖源生成酶将液化的材料糖化；
(c)使用发酵生物体在纤维素分解组合物的存在下进行发酵，该纤维素分解组合物还包括选自以下的一种或多种多肽：
-具有纤维素分解增强活性的GH61多肽；
-β-葡糖苷酶；
-纤维二糖水解酶I；
-纤维二糖水解酶II；
或其两种、三种或四种的混合物。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物源自里氏木霉菌株、特异腐质霉菌株和/或Chrysosporium lucknowense菌株。在一个实施方式中，纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶，优选来源于曲霉属菌株的酶，例如源于米曲霉，例如在WO 2002/095014中公开的酶，或在WO 2008/057637中公开的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或源于烟曲霉，例如在WO 2005/047499中公开的或本文中SEQ ID NO:6的酶，或在WO 2012/044915或共同未决的PCT申请号PCT/US11/054185(Novozymes)中公开的烟曲霉β-葡糖苷酶变体，例如具有下列取代的烟曲霉β-葡糖苷酶变体：F100D、S283G、N456E、F512Y；或源于青霉属菌株，如在WO 2007/019442中公开的Penicillium brasilianum菌株，或源于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，例如源自嗜热子囊菌(Thermoascus)属的一种，例如黄嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)菌株，例如在WO2005/074656中描述为SEQ ID NO:2的那种；或源自梭孢壳(Thielavia)属的一种，例如土生梭孢霉(Thielavia terrestris)菌株，例如在WO2005/074647中描述为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的那种；或源自曲霉属菌株的一种，例如烟曲霉菌株，例如在WO 2010/138754中描述为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的那种；或源自青霉属菌株的一种，例如Penicillium emersonii菌株，例如在WO 2011/041397公开的或本文中SEQ ID NO:8的那种。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物包含纤维二糖水解酶I(CBH I)，例如源自曲霉属菌株的一种，例如烟曲霉菌株，例如在WO2011/057140中的SEQ ID NO:6或本文中的SEQ ID NO:2公开的Cel7aCBHI，或木霉属的菌株，例如里氏木霉菌株。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物包含纤维二糖水解酶II(CBH II)，例如源自曲霉属菌株的一种，例如烟曲霉菌株或本文中的SEQ ID NO:4；或木霉属的菌株，例如里氏木霉，或梭孢壳属的菌株，例如土生梭孢霉菌株，例如来自土生梭孢霉的纤维二糖水解酶IICEL6A。在一个实施方式中，纤维素分解组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和β-葡糖苷酶。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物含有β-葡糖苷酶和CBH。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶和CBH I。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶和CBH I。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、CBH I和CBH II。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶、CBH I和CBH II。
在优选实施方式中，β-葡糖苷酶的相对ED50装载值为小于1.00，优选小于0.80，例如优选小于0.60，例如0.1-0.9之间，例如0.2-0.8之间，例如0.30-0.70。在一个实施方式中，纤维素分解组合物为里氏木霉纤维素分解组合物，其进一步包含具有纤维素分解增强活性的黄嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2)以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物为里氏木霉纤维素分解组合物，其进一步包含具有纤维素分解增强活性的黄嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ IDNO:2)以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2)或本文中的SEQ ID NO:6。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物为里氏木霉纤维素分解组合物，其进一步包含在WO 2011/041397中公开的具有纤维素分解增强活性的Penicillium emersoniiGH61A多肽以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO2005/047499的SEQ ID NO:2)或本文中的SEQ ID NO:6或其具有下列取代F100D、S283G、N456E、F512Y的变体。
在优选实施方式中，本发明涉及生产发酵产物的方法，包括：
(a)使用α-淀粉酶将含淀粉材料液化；
(b)使用糖源生成酶将液化的材料糖化；
(c)使用发酵生物体在纤维素分解组合物的存在下进行发酵，该纤维素分解组合物包括以下组分中的一种或多种：
(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I，优选为本文中SEQ ID NO:2所示者；
(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II，优选为本文中SEQ ID NO:4所示者；
(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶，优选为本文中SEQ ID NO:6所示者；或其变体，例如具有以下取代的一种：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用本文中SEQ ID NO:6进行编号)；和
(iv)具有纤维素分解增强活性的青霉物种GH61多肽，优选为本文中SEQ ID NO:8所示者；或其同源物。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物的剂量为0.0001-3mg EP/g DS，优选为0.0005-2mg EP/g DS，优选为0.001-1mg/g DS，更优选为0.005-0.5mg EP/g DS，甚至更优选为0.01-0.1mg EP/g DS。
淀粉作为不溶于水的微小颗粒形成于植物细胞中。当置于冷水中时，淀粉颗粒可吸收少量液体并膨胀。在高至约50℃至75℃的温度下，膨胀可为可逆的。然而，在更高温度下开始称为“糊化”的不可逆膨胀。待加工的粒状淀粉可为高度精制的淀粉品质，优选至少90％，至少95％，至少97％或至少99.5％纯，或者其可为更加粗制的含淀粉材料，包括包含非淀粉部分(如胚残余物和纤维)的(例如，经磨制的)全谷粒。例如全谷粒的原材料可通过例如磨制而减小粒度，以打开其结构并允许进一步的加工。根据本发明优选两种方法：湿磨和干磨。在干磨中，将整粒磨碎并使用。湿磨给出胚和粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)的良好分离，并常常用于使用淀粉水解物生产例如糖浆的场合。干磨和湿磨在淀粉加工领域都是众所周知的，并且可用于本发明的方法中。在一个实施方式中，粒度减小至约0.05-3.0mm之间，优选为0.1-0.5mm，或使得至少30％，优选至少50％，更优选至少70％，甚至更加优选至少90％的含淀粉材料可穿过具有0.05-3.0mm筛网，优选0.1-0.5mm筛网的筛。
液化在α-淀粉酶，优选为细菌α-淀粉酶和/或酸性真菌α-淀粉酶的存在下进行。在一个实施方式中，在液化过程中还存在植酸酶(phytase)。
在液化过程中，长链淀粉由α-淀粉酶降解为更短的支链和直链单元(麦芽糖糊精)。液化过程可作为三步热浆过程来进行。将浆料加热至60-95℃(例如70-90℃)，并添加α-淀粉酶以起始液化(稀化)。
在一个实施方式中，浆料可在95-140℃，例如105-125℃喷射蒸煮约1-15分钟，例如约3-10分钟，特别是约5分钟。然后将浆料冷却至60-95℃，并添加更多的α-淀粉酶以获得最终水解(次级液化)。喷射蒸煮过程在pH 4.5-6.5进行，通常在pH 5-6进行。α-淀粉酶可单剂量加入，例如在喷射蒸煮之前加入。
液化过程在70-95℃之间，例如80-90℃，例如约85℃下进行约10分钟至5小时，通常为1-2小时。pH为4和7之间，例如5.5和6.2之间。为确保这些条件下的最佳酶稳定性，可选择性地加入钙(以提供1-60ppm游离钙离子，例如约40ppm游离钙离子)。这样处理后，液化的淀粉通常具有“葡萄糖当量”(DE)10-15。
通常，液化和液化条件在领域内是已知的。
α-淀粉酶的实例在下文“α-淀粉酶”部分中公开。
糖化可使用糖源生成酶，特别是葡糖淀粉酶或β-淀粉酶，及任选的脱支酶如异淀粉酶或普鲁兰酶，使用本领域公知的条件进行。举例而言，完全的糖化步骤可持续约24至约72小时。然而，常见的是在30-65℃，通常在约60℃的温度下进行通常为40-90分钟的预糖化，然后在发酵过程中在同步糖化和发酵(SSF)中进行完全糖化。糖化通常在20-75℃，例如25-65℃和40-70℃，通常约60℃的温度，在约pH 4至5，通常在约pH 4.5下进行。
在本发明方法的一个实施方式中，纤维素分解组合物(在本发明方法的上下文中提及的)在预糖化过程中加入。在优选实施方式中，预糖化步骤之后是SSF步骤。在本发明的一个实施方式中，纤维素分解组合物在预糖化步骤中加入，其中预糖化步骤在40-75℃，例如50-70℃，优选为60℃的温度下进行；在pH 4-6之间，优选为5时进行；时长为30-360分钟，例如60-420分钟，例如150-180分钟。
糖化和发酵步骤可同步或相继进行。在一个实施方式中，糖化和发酵同时进行(称为“SSF”)。糖化没有保持阶段，意味着发酵生物体(例如酵母)与酶一起加入。SSF通常在温度为20-40℃，例如26-34℃，优选约32℃；发酵生物体为酵母，例如酵母(Saccharomyces)属的菌株，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株时进行，特别是在发酵产物为乙醇如此进行。
其它发酵产物可在本领域技术人员熟知的适用于所考虑的发酵生物体的条件和温度下进行。
发酵产物可通过本领域中公知的方法例如通过蒸馏进行回收。糖源生成酶包括葡糖淀粉酶的实例于下文的“酶”部分中公开。
在具体的实施方式中，本发明的方法在将含淀粉材料转化为糖/糊精之前还包括以下步骤：
(x)降低含淀粉材料的粒度；和
(y)形成包含含淀粉材料和水的浆料。
减小含淀粉材料的粒度的方法为本领域技术人员所熟知。在一个实施方式中，研磨含淀粉材料以减小粒度。
含水浆料可含有10-55wt.％干固形物(DS)，优选25-45wt.％干固形物(DS)，更优选为30-40wt.％干固形物(DS)的含淀粉材料。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物和/或糖源生成酶例如葡糖淀粉酶在根据本发明方法的预糖化、发酵或SSF过程中结合蛋白酶加入。这提供了增加的乙醇产量。这也在该工艺后端提供益处，例如改善油提取。具体考虑的是包括下列组分中的一种或多种的纤维素分解组合物的组合：
(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；
(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；
(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；和
(iv)具有纤维素分解增强活性的青霉物种GH61多肽；或其同源物，
以及源自黄嗜热子囊菌CGMCC No.0670(归类为EC 3.4.24.39)(在下文“蛋白酶”部分中公开)的蛋白酶，以及与本文中SEQ ID NO:13至少60％等同，例如至少70％，例如至少80％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％等同的酶。
由未糊化的含淀粉材料生产发酵产物的方法
本发明还涉及不经含淀粉材料的糊化从含淀粉材料生产发酵产物的方法(通常被称为“未经蒸煮”或“生淀粉水解”方法)。
更具体地，在此方面，本发明涉及生产发酵产物的方法，其包括以下步骤：
(i)在低于初始糊化温度的温度下使用糖源生成酶糖化含淀粉材料；和
(ii)使用发酵生物体在纤维素分解组合物的存在下进行发酵，其中纤维素分解组合物包含选自以下的一种或多种多肽：
-具有纤维素分解增强活性的GH61多肽；
-β-葡糖苷酶；
-纤维二糖水解酶I；
-纤维二糖水解酶II；
或其两种、三种或四种的混合物。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物源自里氏木霉、特异腐质霉或Chrysosporium lucknowense。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶，优选来源于曲霉属菌株的酶，例如源于米曲霉，例如在WO 2002/095014中公开的酶，或在WO 2008/057637中公开的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或源于烟曲霉，例如在WO 2005/047499中公开的或本文中SEQ ID NO:6的酶，或在WO 2012/044915或共同未决的PCT申请PCT/US11/054185(Novozymes)中公开的烟曲霉β-葡糖苷酶变体，例如具有下列取代的烟曲霉β-葡糖苷酶变体：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用本文中的SEQ ID NO:6进行编号)；或源于青霉属菌株，如在WO 2007/019442中公开的Penicillium brasilianum菌株，或源于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，例如源自嗜热子囊菌属的一种，例如黄嗜热子囊菌菌株，例如在WO 2005/074656中描述为SEQ ID NO:2的那种；或源自梭孢壳属的一种，例如土生梭孢霉菌株，例如在WO 2005/074647中描述为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的那种；或源自曲霉属菌株的一种，例如烟曲霉菌株，例如在WO 2010/138754中描述为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的那种；或源自青霉属菌株的一种，例如Penicillium emersonii菌株，例如在WO 2011/041397公开的或本文中SEQ ID NO:8的那种。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物包含纤维二糖水解酶I(CBH I)，例如源自曲霉属菌株的一种，例如烟曲霉菌株，例如在WO2011/057140中的SEQ ID NO:6或本文中的SEQ ID NO:2公开的Cel7aCBHI，或木霉属的菌株，例如里氏木霉菌株。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物包含纤维二糖水解酶II(CBH II)，例如源自曲霉属菌株的一种，例如烟曲霉菌株或本文中的SEQ ID NO:4；或木霉属的菌株，例如里氏木霉，或梭孢壳属的菌株，例如土生梭孢霉菌株，例如来自土生梭孢霉的纤维二糖水解酶IICEL6A。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和β-葡糖苷酶。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物含有β-葡糖苷酶和CBH。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶和CBH I。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶和CBH I。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、CBH I和CBH II。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶、CBH I和CBH II。
在优选实施方式中，β-葡糖苷酶的相对ED50装载值为小于1.00，优选小于0.80，例如优选小于0.60，例如0.1-0.9之间，例如0.2-0.8之间，例如0.30-0.70。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物为里氏木霉纤维素分解组合物，其进一步包含具有纤维素分解增强活性的黄嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ IDNO:2)以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物为里氏木霉纤维素分解组合物，其进一步包含具有纤维素分解增强活性的黄嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ IDNO:2)以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2)或本文中的SEQ ID NO:6。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物为里氏木霉纤维素分解组合物，其进一步包含在WO 2011/041397中或本文中SEQ ID NO:8公开的具有纤维素分解增强活性的Penicillium emersonii GH61A多肽以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ IDNO:2)或本文中的SEQ ID NO:6或具有下列取代F100D、S283G、N456E、F512Y的变体。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物包含以下组分中的一种或多种：
(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；
(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；
(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；和
(iv)具有纤维素分解增强活性的青霉物种GH61多肽；或其同源物。
在一个实施方式中，纤维分解组合物的剂量为0.0001-3mg EP/g DS，优选为0.0005-2mg EP/g DS，优选为0.001-1mg/g DS，更优选为0.005-0.5mg EP/g DS，甚至更优选为0.01-0.1mg EP/g DS。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物在本发明方法的发酵过程中结合蛋白酶加入。这在该工艺后端提供益处，例如改善油提取。具体考虑的是包括下列组分中的一种或多种的纤维素分解组合物的组合：
(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；
(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；
(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；和
(iv)具有纤维素分解增强活性的青霉物种GH61多肽；或其同源物，以及源自黄嗜热子囊菌CGMCC No.0670(归类为EC 3.4.24.39)(在下文“蛋白酶”部分中公开)的蛋白酶，以及与本文中SEQ ID NO:13至少60％等同，例如至少70％，例如至少80％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％等同的酶。
因此，本发明的此方面涉及生产发酵产物的方法，包括将含淀粉材料用α-淀粉酶和糖源生成酶特别是葡糖淀粉酶处理；在低于含淀粉材料的初始糊化温度的温度下并在单一步骤中，在如上文所述和在“纤维素分解酶”部分定义的纤维素分解酶的存在下，使用发酵生物体进行发酵。
术语“初始糊化温度”意指淀粉开始糊化的最低温度。一般而言，在水中加热的淀粉在约50℃至75℃之间开始糊化；确切的糊化温度取决于具体的淀粉，并可容易地由本领域技术人员确定。因此，初始糊化温度可根据植物物种、植物物种的特定品种以及生长条件而改变。给定含淀粉材料的初始糊化温度可确定为使用由Gorinstein and Lii,1992,44(12):461-466描述的方法当5％的淀粉颗粒丧失双折射时的温度。
本发明的方法可进一步包括例如通过蒸馏回收发酵产物。
含淀粉材料可以是浆料，例如粒状淀粉，可准备具有10-55wt.％的干固形物(DS)，优选为25-45wt.％的干固形物(DS)，更优选为30-40wt.％的干固形物(DS)的含淀粉材料。浆料可含有水和/或工艺水(process water)，如酒糟(逆流(backset))、洗涤水、蒸发器冷凝物或馏出物、来自蒸馏的侧线汽提器水(side-stripper water)或来自其它发酵产物设备的工艺水。因为该方法在初始糊化温度以下进行，因此不发生显著的粘度增加，如果需要，可使用高水平的酒糟。在一个实施方式中，含水浆料包括约1至约70vol.％，优选为15-60vol.％，特别是约30至50vol.％的水和/或工艺水，如酒糟(逆流)、洗涤水、蒸发器冷凝物或馏出物、来自蒸馏的侧线汽提器水或来自其他发酵产物设备的工艺水，或其组合等等。
可通过降低粒度来制备含淀粉材料，例如通过干磨或湿磨至0.05-3.0mm，优选0.1-0.5mm，或使得至少30％，优选至少50％，更优选至少70％，甚至更优选至少90％的含淀粉材料可穿过具有0.05-3.0mm筛网，优选0.1-0.5mm筛网的筛。
在经过本发明方法处理后，含淀粉材料中至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％的干固形物被转化为可溶的淀粉水解物。
本发明此方面的方法在低于初始糊化温度的温度下进行，例如，在25-40℃范围的温度下，例如25-40℃，29-35℃，30-34℃，例如约32℃。本领域技术人员能容易地确定合适的工艺条件。
本发明方法可在pH 3-7进行，例如3.5至6，或4至5。
在一个实施方式中，进行发酵使得糖水平(如葡萄糖水平)保持在低水平，例如低于6wt.％，低于约3wt.％，低于约2wt.％，低于约1wt.％，低于约0.5wt.％，低于0.25％wt.％或低于约0.1wt.％。这种低水平的糖可通过简单地采用调节量的酶和发酵生物体实现。本领域技术人员可容易地确定要使用的酶和发酵生物体的剂量/量。所使用的酶和发酵生物体的量也可选择为保持发酵液中低浓度的麦芽糖。例如，麦芽糖水平可保持在低于约0.5wt.％，例如低于约0.2wt.％。
本发明的脱水方法
通过首先将含淀粉材料降解为可发酵的糖(通常是通过液化和糖化含淀粉材料)，然后使用发酵生物体将可发酵的糖直接或间接地转化为期望的发酵产物来生产发酵产物如乙醇。随后例如通过蒸馏从发酵材料(通常称为“啤酒醪”(beer mash))回收发酵产物，从(其它)液体和/或固体中分离期望的发酵产物。剩余的部分，称为“全酒糟”经脱水并分离为固相和液相(例如通过离心)。固相称为“湿滤饼”(或“湿谷粒”)，而液相(上清液)称为“稀酒糟”。将脱水的湿滤饼干燥，以提供在动物饲料中作为营养物质的“干酒糟”(DistillersDried Grains，DDG)。通常将稀酒糟蒸发以提供冷凝物和糖浆，或亦可作为“逆流”直接循环至浆液槽中。冷凝物可在排放前送往甲烷转化器(methanator)，或可再循环至浆液槽中。糖浆主要由极限糊精和不可发酵的糖组成，可将其混入DDG中或在干燥前加入湿滤饼，以生产DDGS(含可溶物的干酒糟)。
根据本发明，本发明的工艺或方法导致改进的脱水。因为湿滤饼的干燥需要较少能量，因此可节省能量。
实施例6表明，当实施本发明的生产发酵产物的方法时，得到改善的脱水。
因此，在一个方面，本发明涉及将全酒糟脱水的方法，包括：
(a)使用α-淀粉酶将含淀粉材料液化；
任选地，在步骤(b)之前对液化的材料进行预糖化；
(b)将液化的材料糖化；
(c)使用发酵生物体进行发酵；
(d)将发酵的材料分离为发酵产物和全酒糟；
(e)对全酒糟进行脱水；
其中，在该任选的预糖化步骤、糖化步骤(b)和/或发酵步骤(c)、或同步糖化和发酵过程中存在或加入糖源生成酶和/或纤维素分解组合物。
纤维素分解组合物优选以1-500，例如10-400，例如25-300，例如50-200微克/g DS的量加入。
在一个实施方式中，通过蒸馏从发酵材料中回收发酵产物。
在一个实施方式中，蛋白酶与糖源生成酶和纤维素分解组合物一起加入，蛋白酶为例如源自黄嗜热子囊菌的蛋白酶，或与本文中的SEQ ID NO:13至少60％等同，例如至少70％，例如至少80％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％等同的蛋白酶。
另外，也可以考虑直接添加纤维素分解组合物至全酒糟，以获得改进的脱水。因此，在一方面，本发明涉及将全酒糟脱水的方法，包括以下步骤：
i)将全酒糟用根据本发明方法限定的纤维素分解组合物进行处理；
ii)将该材料分离成固体部分和液体部分。
考虑使用的酶是关联本发明的生产发酵产物的方法并在下文“酶”部分中公开的那些。
含淀粉材料
任何合适的含淀粉起始材料可用于本发明的方法中。起始材料通常基于所期望的发酵产物进行选择。适用于本发明方法的含淀粉起始材料的实例包括大麦、菜豆(bean)、木薯、谷类、玉米、买罗高粱(milo)、豌豆、土豆、稻、黑麦、西米、高粱、甘薯、木薯粉、小麦和全谷粒，或其任何混合物。含淀粉材料也可为蜡质和非蜡质类型的玉米和大麦。在优选的实施方式中，含淀粉材料是玉米。在优选的实施方式中，含淀粉材料是小麦。
发酵产物
术语“发酵产物”意指使用发酵生物体通过包括发酵的方法或工艺而生成的产物。发酵产物包括醇类(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、琥珀酸、葡糖酸)；酮类(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)；抗生素(例如，青霉属和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)以及激素。在优选的实施方式中，发酵产物是乙醇，例如，燃料乙醇；饮用乙醇(即，可饮用的中性酒)；或工业乙醇或用于消费醇类工业(例如啤酒和葡萄酒)、乳制品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革和烟草工业的产物。优选的啤酒类型包括爱尔啤酒(ale)、烈性啤酒(stout)、钵尔透黑啤酒(porters)、陈贮啤酒(lagers)、苦味酒(bitters)、麦芽酒(malt liquors)、发泡酒(happoushu)、高醇啤酒(high-alcohol beer)、低醇啤酒(low-alcohol beer)、低热量啤酒(low-caloriebeer)或清淡啤酒(light beer)。在优选的实施方式中，发酵产物为乙醇。
发酵生物体
术语“发酵生物体”指任何适于产生所期望的发酵产物的生物体，包括细菌和真菌生物，例如酵母和丝状真菌。根据本发明的合适的发酵生物体能够将可发酵的糖(如阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖或木糖)直接或间接发酵(即转化)为所期望的发酵产物。
发酵生物体的实例包括真菌生物，如酵母。优选的酵母包括酵母属的菌株，特别是酿酒酵母或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)；毕赤酵母属(Pichia)的菌株，尤其是树干毕赤酵母(Pichia stipitis)，如树干毕赤酵母CBS 5773或巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)；假丝酵母属(Candida)的菌株，特别是阿糖发酵假丝酵母(Candidaarabinofermentans)、博伊丁氏假丝酵母(Candida boidinii)、迪丹氏假丝酵母(Candidadiddensii)、秀哈塔假丝酵母(Candida shehatae)、Candida sonorensis、热带假丝酵母(Candida tropicalis)或产朊假丝酵母(Candida utilis)。其它发酵生物体包括汉逊酵母属(Hansenula)的菌株，特别是异常汉逊酵母(Hansenula anomala)或多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)；克鲁维酵母(Kluyveromyces)的菌株，特别是脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)或马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)；以及裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的菌株，特别是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)。
优选的细菌发酵生物体包括埃希氏杆菌属(Escherichia)的菌株，特别是大肠杆菌(Escherichia coli)，发酵单胞菌属(Zymomonas)的菌株，特别是运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)，发酵细菌属(Zymobacter)的菌株，特别是棕榈发酵细菌(Zymobactor palmae)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)的菌株，特别是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)，明串珠菌属(Leuconostoc)的菌株，特别是肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，梭菌属(Clostridium)的菌株，特别是酪酸梭菌(Clostridium butyricum)，肠杆菌属(Enterobacter)的菌株，特别是产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，以及热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)的菌株，特别是热厌氧杆菌BG1L1(Appl.Microbiol.Biotech.77:61-86)、乙醇热厌氧杆菌(Thermoanarobacter ethanolicus)，Thermoanaerobacter mathranii或Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum。还设想的是乳杆菌属(Lactobacillus)的菌株，谷氨酸棒状杆菌R(Corynebacterium glutamicum R)，热葡糖苷酶芽孢杆菌(Bacillus thermoglucosidaisus)和热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)。
在一个实施方式中，发酵生物体为C6糖发酵生物体，例如，酿酒酵母的菌株。
在一个实施方式中，发酵生物体为C5糖发酵生物体，例如，酿酒酵母的菌株。
在一个实施方式中，将发酵生物体添加至发酵培养基中，从而使得每mL发酵培养基中活的发酵生物体(如酵母)的计数在105-1012，优选107-1010的范围内，特别是约5x107。
对于乙醇发酵，酵母是优选的发酵生物体。优选的是酵母属的菌株，特别是酿酒酵母物种的菌株，优选对高水平的乙醇(即，高至例如约10、12、15或20vol.％或更高的乙醇)具有耐性的菌株。
在一个实施方式中，利用C5的酵母为在WO 2004/085627中公开的酿酒酵母菌株。
在一个实施方式中，发酵生物体为在WO 2010/074577(Nedalco)中涉及的C5真核微生物细胞。
在一个实施方式中，发酵生物体为可直接异构化木糖至在US2008/0014620中公开的木糖的经转化的C5真核细胞。
在一个实施方式中，发酵生物体为在WO 2009/109633中公开的C5糖发酵细胞。
可市购的酵母包括LNF SA-1，LNF BG-1，LNF PE-2和LNF CAT-1(可得自LNFBrazil)，RED STARTM和ETHANOL REDTM酵母(可得自Fermentis/Lesaffre，USA)，FALI(可得自Fleischmann’s Yeast，USA)，SUPERSTART和THERMOSACCTM新鲜酵母(可得自EthanolTechnology，WI，USA)，BIOFERM AFT和XR(可得自NABC-North American BioproductsCorporation，GA，USA)，GERT STRAND(可得自Gert Strand AB，Sweden)和FERMIOL(可得自DSM Specialties)。
根据本发明，能够由可发酵的糖生产期望的发酵产物的发酵生物体优选在准确的条件下以特定的生长速率生长。当将发酵生物体导入/添加入发酵培养基时，接种的发酵生物体经过许多阶段。起初，生长并未发生。该期间称为“迟滞期”，且可看作适应期。在下一个称为“指数期”的阶段，生长速率逐渐增加。在一段最大生长的时间之后，生长速率停止，且发酵生物体进入“稳定期”。又一段时间后发酵生物体进入“死亡期”，其间活细胞数减少。
发酵
发酵条件基于例如，植物材料的种类、可用的可发酵糖类、发酵生物体和/或期望的发酵产物来确定。本领域技术人员可容易地确定合适的发酵条件。根据本发明发酵可在通常使用的条件下进行。优选的发酵方法为厌氧方法。
例如，发酵可在高达75℃，例如40-70℃之间，例如50-60℃之间的温度下进行。然而，亦已知最适温度显著较低，低至大约室温(约20℃)的细菌。合适的发酵生物体的实例可见于上文的“发酵生物体”部分。
对于使用酵母产生乙醇，发酵可持续24至96小时，特别是35至60小时。在一个实施方式中，发酵在20至40℃之间，优选26至34℃，特别是约32℃的温度下进行。在一个实施方式中，pH为pH 3至6，优选约pH 4至5。
其它发酵产物可在本领域技术人员已知适于所考虑的发酵生物体的温度下进行发酵。
发酵通常在pH 3至7的范围内进行，优选pH 3.5至6，如约pH 5。发酵通常持续6-96小时。
本发明的方法可作为分批或连续的过程进行。发酵可在超滤系统中进行，其中在固体、水和发酵生物的存在下保持渗余物(retentate)的再循环，而其中渗透物为含有所期望的发酵产物的液体。同样考虑的是在具有超滤膜的连续膜反应器中进行的方法/工艺，其中在固体、水和发酵生物的存在下保持渗余物的再循环，而其中渗透物为含有发酵产物的液体。
在发酵后，可从发酵浆料中分离发酵生物体并再循环。
发酵培养基
短语“发酵培养基”(“Fermentation media”或“fermentation medium”)指进行发酵的环境，其包括发酵底物，即由发酵生物体代谢的糖源。
发酵培养基可包含供发酵生物体的其它营养物和生长刺激剂。营养物和发酵刺激剂广泛用于发酵领域，且包括氮源，如氨；维生素和矿物质，或其组合。
回收
在发酵之后，可自发酵培养基中分离发酵产物。可蒸馏发酵培养基以提取期望的发酵产物，或可通过微滤或膜过滤技术自发酵培养基中提取期望的发酵产物。或者，可通过气提(stripping)回收发酵产物。回收技术在本领域为众所周知的。
酶
下文所描述的酶和多肽在本发明方法的“有效量”下使用。下文应结合上文“定义”部分中的酶公开内容的上下文来阅读。
本发明的工艺和方法中使用的纤维素分解组合物
本发明的生产发酵产物的方法中使用的纤维素分解组合物可源自任何微生物。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物源自木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株；腐质霉属的菌株，例如特异腐质霉的菌株，和/或金孢子菌属(Chrysosporium)的菌株，例如Chrysosporium lucknowense的菌株。
在优选实施方式中，纤维素分解组合物源自里氏木霉的菌株。
纤维素分解组合物可包含以下多肽中的一种或多种，包括酶：具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、CBH I和CBH II，或其两种、三种或四种的混合物。
在优选实施方式中，含有β-葡糖苷酶的纤维素分解组合物的相对ED50装载值小于1.00，优选小于0.80，例如优选小于0.60，例如在0.1-0.9之间，例如在0.2-0.8之间，例如0.30-0.70。
纤维素分解组合物可包含一些半纤维素酶，例如木聚糖酶和/或β-木糖苷酶。半纤维素酶可来自纤维素分解组合物的制造生物体，或其它来源，例如半纤维素酶可对于纤维素分解组合物的制造生物(例如里氏木霉)是外来的。
在优选的实施方式中，纤维素分解组合物中的半纤维素酶含量低于纤维素分解组合物的10wt.％，如低于5wt.％。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和β-葡糖苷酶。
在另一个实施方式中，纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶和CBH。
在另一个实施方式中，纤维素分解组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶和CBH I。
在另一个实施方式中，纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶和CBH I。
在另一个实施方式中，纤维素分解组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、CBH I和CBH II。
在另一个实施方式中，纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶、CBH I和CBH II。
纤维素分解组合物可进一步包含一种或多种选自下列物质的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、酯酶、扩展蛋白(expansin)、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素(swollenin)。
在一个实施方式中，纤维素酶为选自内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶的一种或多种酶。
在一个实施方式中，内切葡聚糖酶为内切葡聚糖酶I。
在一个实施方式中，内切葡聚糖酶为内切葡聚糖酶II。
β-葡糖苷酶
根据本发明使用的纤维素分解组合物在一个实施方式中可包含一种或多种β-葡糖苷酶。β-葡糖苷酶在一个实施方式中可以是来源于曲霉属菌株的酶，例如源于米曲霉，例如在WO 2002/095014中公开的酶，或在WO 2008/057637中公开的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或源于烟曲霉，例如在WO 2005/047499中公开的或本文中SEQ ID NO:6的酶，或烟曲霉β-葡糖苷酶变体，例如在WO 2012/044915或共同未决的PCT申请PCT/US11/054185(或US临时申请#61/388,997)中公开的烟曲霉β-葡糖苷酶变体，例如具有下列取代的烟曲霉β-葡糖苷酶变体：F100D、S283G、N456E、F512Y。
在另一个实施方式中，β-葡糖苷酶源自青霉属的菌株，例如在WO2007/019442中公开的Penicillium brasilianum菌株，或木霉属的菌株，例如里氏木霉菌株。
在一个实施方式中，β-葡糖苷酶为选自下列的烟曲霉β-葡糖苷酶或其同源物：
(i)包含SEQ ID NO:6的成熟多肽的β-葡糖苷酶；
(ii)包含与本文中SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少70％同一性，例如75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列的β-葡糖苷酶；
(iii)由包含与本文中SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少70％同一性，例如75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的核苷酸序列的多核苷酸所编码的β-葡糖苷酶；和
(iv)由在至少高严格条件下，例如极高严格条件下与本文中SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或其全长互补物杂交的多核苷酸所编码的β-葡糖苷酶。
在一个实施方式中，β-葡糖苷酶是在与本文中SEQ ID NO:6的成熟多肽的位置100、283、456和512对应的一个或更多(几个)位置上包含取代的变体，其中变体具有β-葡糖苷酶活性。
在一个实施方式中，变体的亲本β-葡糖苷酶为(a)包含本文中SEQ ID NO:6的成熟多肽的多肽；(b)与本文中SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少80％序列同一性的多肽；(c)由在高严格条件或极高严格条件下与以下物质杂交的多核苷酸所编码的多肽：(i)本文中SEQID NO:5的成熟多肽编码序列，(ii)包含在本文中SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(d)由与本文中SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80％同一性的多核苷酸所编码的多肽；或(e)本文中SEQ IDNO:6的成熟多肽的片段，其具有β-葡糖苷酶活性。
在一个实施方式中，β-葡糖苷酶变体与亲本β-葡糖苷酶的氨基酸序列具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的序列同一性。
在一个实施方式中，变体与本文中SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的序列同一性。
在一个实施方式中，β-葡糖苷酶来自曲霉属菌株，例如烟曲霉菌株，例如烟曲霉β-葡糖苷酶(本文中SEQ ID NO:6)，其包括一个或多个选自L89M、G91L、F100D、I140V、I186V、S283G、N456E和F512Y的取代；例如其具有以下取代的变体：
-F100D+S283G+N456E+F512Y；
-L89M+G91L+I186V+I140V；
-I186V+L89M+G91L+I140V+F100D+S283G+N456E+F512Y。
在一个实施方式中，取代的数量为1至4之间，例如1、2、3或4个取代。
在一个实施方式中，变体包含在与位置100对应的位置上的取代，与位置283对应的位置上的取代，与位置456对应的位置上的取代，和/或与位置512对应的位置上的取代。
在优选的实施方式中，β-葡糖苷酶变体在本文SEQ ID NO:6中包含以下取代：Phe100Asp、Ser283Gly、Asn456Glu、Phe512Tyr。
在优选的实施方式中，β-葡糖苷酶的相对ED50装载值小于1.00，优选小于0.80，例如优选小于0.60，例如0.1-0.9之间，例如0.2-0.8之间，例如0.30-0.70。
具有纤维素分解增强活性的GH61多肽
根据本发明使用的纤维素分解组合物在一个实施方式中可包含一种或多种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。在一个实施方式中，酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，例如源自嗜热子囊菌属的一种，例如黄嗜热子囊菌菌株，例如在WO 2005/074656中描述为SEQ ID NO:2的那种；或源自梭孢壳属的一种，例如土生梭孢霉菌株，例如在WO 2005/074647中描述为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的那种；或源自曲霉属菌株的一种，例如烟曲霉菌株，例如在WO2010/138754中描述为SEQ ID NO:2的那种；或源自青霉属菌株的一种，例如Penicillium emersonii菌株，例如在WO 2011/041397公开的或本文中SEQID NO:8的那种。
在一个实施方式中，具有纤维素分解增强活性的青霉物种GH61多肽或其同源物选自：
(i)包含本文中SEQ ID NO:8的成熟多肽的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽；
(ii)包含与本文中SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少70％，例如75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽；
(iii)由包含与本文中SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列的多核苷酸所编码的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽；和
(iv)由在至少高严格条件下例如极高严格条件下与本文中SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列或其全长互补物杂交的多核苷酸所编码的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。
纤维二糖水解酶I
根据本发明使用的纤维素分解组合物在一个实施方式中可包含一种或多种CBH I(纤维二糖水解酶I)。在一个实施方式中，纤维素分解组合物包含纤维二糖水解酶I(CBHI)，例如源自曲霉属菌株的一种，例如烟曲霉菌株，例如在WO 2011/057140中的SEQ ID NO:6或本文中的SEQ ID NO:2公开的Cel7A CBHI，或木霉属的菌株，例如里氏木霉菌株。
在一个实施方式中，烟曲霉纤维二糖水解酶I或其同源物选自：
(i)包含本文中SEQ ID NO:2的成熟多肽的纤维二糖水解酶I；
(ii)包含与本文中SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％，例如75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的纤维二糖水解酶I；
(iii)由包含与本文中SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶I；和
(iv)由在至少高严格条件下例如极高严格条件下与本文中SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补物杂交的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶I。
纤维二糖水解酶II
根据本发明使用的纤维素分解组合物在一个实施方式中可包含一种或多种CBHII(纤维二糖水解酶II)。在一个实施方式中，纤维二糖水解酶II(CBH II)，例如源自曲霉属菌株的一种，例如烟曲霉菌株，例如本文中SEQ ID NO:4的那种，或木霉属的菌株，例如里氏木霉，或梭孢壳属的菌株，例如土生梭孢霉，例如来自土生梭孢霉的纤维二糖水解酶IICEL6A。
在一个实施方式中，烟曲霉纤维二糖水解酶II或其同源物选自：
(i)包含本文中SEQ ID NO:4的成熟多肽的纤维二糖水解酶II；
(ii)包含与本文中SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少70％，例如75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的纤维二糖水解酶II；
(iii)由包含与本文中SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶II；和
(iv)由在至少高严格条件下例如极高严格条件下与本文中SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列或其全长互补物杂交的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶II。
纤维素分解组合物
如上所述，纤维素分解组合物可包含若干不同的多肽，例如酶。
在一个实施方式中，纤维素分解组合物包含里氏木霉纤维素分解组合物，其进一步包含具有纤维素分解增强活性的黄嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656)和米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)。
在另一个实施方式中，纤维素分解组合物包含里氏木霉纤维素分解组合物，其进一步包含具有纤维素分解增强活性的黄嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQID NO:2)和烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2)。
在另一个实施方式中，纤维素分解组合物包含里氏木霉纤维素分解组合物，其进一步包含公开于WO 2011/041397中的具有纤维素分解增强活性的Penicillium emersoniiGH61A多肽、烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2)或其具有下列取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y。
本发明的酶组合物作为酶的来源可以为适合使用的任何形式，例如，经细胞去除或不经细胞去除的粗发酵液、有或无细胞碎片的细胞裂解物、半纯化或纯化的酶组合物或宿主细胞例如木霉属宿主细胞。
酶组合物可以为干粉或颗粒、无粉尘颗粒(non-dusting granulate)、液体、稳定化的液体或稳定化的受保护的酶。液体酶组合物可以，例如，根据确立的工艺通过添加稳定剂例如糖、糖醇或其它多元醇和/或乳酸或其它有机酸而稳定化。
在优选的实施方式中，包含β-葡糖苷酶的纤维素分解组合物的相对ED50装载值小于1.00，优选小于0.80，例如优选小于0.60，例如0.1-0.9之间，例如0.2-0.8之间，例如0.30-0.70。
α-淀粉酶
根据本发明，可使用任何α-淀粉酶，如来源于真菌、细菌或植物的α-淀粉酶。在优选实施方式中，α-淀粉酶为酸性α-淀粉酶，例如，酸性真菌α-淀粉酶或酸性细菌α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”意指α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)，当以有效量添加时，其在pH 3至7，优选在pH 3.5至6，或更优选在pH 4-5的范围内具有最佳活性。
细菌α-淀粉酶
用于本发明的α-淀粉酶可为细菌α-淀粉酶，例如源自芽孢杆菌(Bacillus)。在优选实施方式中，芽孢杆菌α-淀粉酶源自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)或枯草杆菌(Bacillus subtilis)的菌株，但也可源自其他芽孢杆菌属菌株。
α-淀粉酶的具体实例包括WO 99/19467中的SEQ ID NO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶、WO 99/19467中的SEQ ID NO:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶和WO 99/19467中的SEQ IDNO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(所有序列通过引用并入本文)。在一个实施方式中，α-淀粉酶可以是与WO 99/19467中SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示序列的任一者分别具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性程度的酶。
芽孢杆菌α-淀粉酶也可为变体和/或杂合体，特别是WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059和WO 02/10355(所有文件通过引用并入本文)中任一者记载的变体和/或杂合体。具体的α-淀粉酶变体公开于美国专利号6,093,562，6,187,576和6,297,038(通过引用并入本文)，并包括在位置R179到G182具有一个或两个氨基酸缺失的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体，优选WO 96/23873公开的双缺失-参见，例如，第20页第1-10行(通过引用并入本文)，优选与WO 99/19467公开的SEQ IDNO:3所列的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列相比对应于Δ(181-182)，或使用WO99/19467中的SEQ ID NO:3的编号方式缺失氨基酸R179和G180(所述文献通过引用并入本文)。甚至更优选的是芽孢杆菌属α-淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其与WO99/19467公开的SEQ ID NO:3所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比具有对应于Δ(181-182)的双缺失，且进一步包括N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。
细菌杂合体α-淀粉酶
α-淀粉酶可为杂合体α-淀粉酶，例如，包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(示于WO 99/19467的SEQ ID NO:4)的445个C-末端氨基酸残基，以及源自解淀粉芽孢杆菌的α淀粉酶(示于WO 99/19467的SEQ ID NO:5)的37个N-末端氨基酸残基，并具有下列取代中的一个或多个，特别是全部的α-淀粉酶：G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:4中地衣芽孢杆菌编号方式)。也优选具有一个或多个下述突变的变体(或在其它芽孢杆菌属α-淀粉酶中的对应突变)：H154Y，A181T，N190F，A209V和Q264S和/或位置176和179之间两个残基的缺失，优选E178和G179的缺失(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:5用于位置编号)
在一个实施方式中，细菌α-淀粉酶以0.0005-5KNU每g DS(干固形物)，优选0.001-1KNU每g DS，例如大约0.050KNU每g DS的剂量添加。
真菌α-淀粉酶
真菌α-淀粉酶包括源自曲霉属菌株的α-淀粉酶，如川地曲霉(Aspergilluskawachii)、黑曲霉和米曲霉α-淀粉酶。
优选的酸性真菌α-淀粉酶是显示出与WO 96/23874的SEQ ID NO:10的氨基酸序列的成熟部分具有高同一性，即至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或甚至100％的同一性的α-淀粉酶。
另一优选的酸性α-淀粉酶源自黑曲霉的菌株。在一个优选实施方式中，酸性真菌α-淀粉酶为黑曲霉α-淀粉酶，其作为“AMYA_ASPNG”以原始登录号P56271公开于Swiss-prot/TeEMBL数据库中，并描述于WO 89/01969(实施例3，通过引用并入本文)。源自黑曲霉的商业上可得到的酸性真菌α-淀粉酶为SP288(可由NovozymesA/S,Denmark得到)。
其它野生型α-淀粉酶包括源自多孔菌属(Meripilus)和根毛霉属(Rhizomucor)的菌株，优选巨多孔菌(Meripilus giganteus)或微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)(WO2004/055178，其通过引用并入本文)的菌株的那些α-淀粉酶。
在一个优选实施方式中，α-淀粉酶源自川地曲霉(Kaneko等,1996,J.Ferment.Bioeng.81:292-298,“Molecular-cloning and determination of thenucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable alpha-amylase fromAspergillus kawachii”；且进一步为EMBL:#AB008370)。
真菌α-淀粉酶也可为包括淀粉结合域(SBD)和α-淀粉酶催化域的野生型酶或其变体。
真菌杂合体α-淀粉酶
在优选实施方式中，真菌酸性α-淀粉酶为杂合体α-淀粉酶。真菌杂合体α-淀粉酶的实例包括WO 2005/003311或美国专利申请公开号2005/0054071(Novozymes)和WO 2006/069290(Novozymes)中公开的那些，所述文件通过引用并入本文。杂合体α-淀粉酶可包含α-淀粉酶催化域(CD)和糖结合域/模块(CBM)，如淀粉结合域(SBD)，以及任选的接头。
杂合体α-淀粉酶的实例包括WO 2006/069290实施例中的表1-5中公开的那些，包括具有催化域JA118和罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)SBD的变体(WO 2006/069290中的SEQID NO:100)，具有罗耳阿太菌AMG接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(WO 2006/069290中的SEQ ID NO:101)，具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(其作为美国申请号11/316,535中氨基酸序列SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:96的组合公开于表5)，或WO 2006/069290中表5中作为V039和本文中SEQ ID NO:11的α-淀粉酶，和具有罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的巨多孔菌α-淀粉酶(WO 2006/069290中的SEQ ID NO:102)。其它杂合体α-淀粉酶列于美国申请号11/316,535和WO 2006/069290(通过引用并入本文)实施例4中表3、4、5和6中。
在优选的实施方式中，α-淀粉酶为微小根毛霉α-淀粉酶。在一个实施方式中，α-淀粉酶为进一步含有接头和糖结合模块的杂合体。在一个实施方式中，微小根毛霉α-淀粉酶具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD，其在WO 2006/069290的表5中作为V039或本文的SEQ IDNO:11公开。特别考虑的为公开于WO 2013/006756的微小根毛霉α-淀粉酶变体(通过引用并入本文)。
微小根毛霉α-淀粉酶变体可为在对应于SEQ ID NO:11的成熟多肽的位置128、143、141、192、20、76、123、136、142、165、219、224、265、383和410的一个或多个位置上包含取代的α-淀粉酶变体，其中变体具有α-淀粉酶活性。
在一个实施方式中，变体α-淀粉酶与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％，但小于100％的序列同一性。
在一个实施方式中，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％和/或至少99％的序列同一性。
在优选的实施方式中，α-淀粉酶变体含有至少下列取代中的至少一个或取代的组合：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192R V410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C(使用SEQ ID NO:11进行编号)。
杂合体α-淀粉酶的其它实例包括美国专利申请公开号2005/0054071中公开的那些，包括第15页表3公开的那些，如具有川地曲霉接头和淀粉结合域的黑曲霉α-淀粉酶。
其它α-淀粉酶与任何上面提及的α-淀粉酶显示高序列同一性程度，即，与上述公开的成熟酶序列显示至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或甚至100％同一性。
根据本发明，酸性α-淀粉酶可以以0.001至10AFAU/g DS，优选0.01至5AFAU/g DS，特别是0.3至2AFAU/g DS或0.001至1FAU-F/g DS，优选0.01至1FAU-F/g DS的量添加。
商业性α-淀粉酶产品
优选的包含α-淀粉酶的商业组合物包括MYCOLASETM(DSM)，BANTM，TERMAMYLTMSC，FUNGAMYLTM，LIQUOZYMETMX，LIQUOZYMETMSC和SANTMSUPER，SANTMEXTRA L(Novozymes A/S)和CLARASETML-40,000，DEX-LOTM，SPEZYMETMFRED，SPEZYMETMAA，SPEZYMETMALPHA，SPEZYMETMDELTA AA，GC358，GC980，SPEZYMETMCL和SPEZYMETM RSL(Danisco A/S)，以及称作SP288的来自黑曲霉的酸性真菌α-淀粉酶(可得自Novozymes A/S，Denmark)。
糖源生成酶(糖化酶)
术语“糖源生成酶”包括葡糖淀粉酶(葡萄糖生成者)，β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(均为麦芽糖生成者)以及α-葡糖苷酶、异淀粉酶和普鲁兰酶。糖源生成酶能够产生碳水化合物，其可由所述发酵生物用作能量源，例如，当用于本发明的产生发酵产物如乙醇的方法时。所产生的碳水化合物可直接或间接转化为期望的发酵产物，优选乙醇。根据本发明，可使用糖源生成酶的混合物。混合物包括包含至少葡糖淀粉酶和α-淀粉酶(特别是酸性淀粉酶，甚至更优选酸性真菌α-淀粉酶)的混合物。
在本发明的优选实施方式中，葡糖淀粉酶活性(AGU)和酸性真菌α-淀粉酶活性(FAU-F)之间的比例(即AGU每FAU-F)可为0.1至100AGU/FAU-F，特别是2-50AGU/FAU-F，如10-40AGU/FAU-F的范围，特别是当进行一步发酵(生淀粉水解-RSH)时，即当糖化和发酵同时进行(即无液化步骤)时。
在常规的淀粉至乙醇的方法(即包括液化步骤)中，所述比例可优选如EP 140410中所定义，特别是当糖化和发酵同时进行时。
葡糖淀粉酶
葡糖淀粉酶可源自任何合适的来源，例如源自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，选自下组：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等,1984,EMBO J.3(5):1097-1102)，或其变体，如WO 92/00381、WO 00/04136和WO01/04273(来自Novozymes,Denmark)中公开的那些；WO 84/02921中公开的泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(Hata等,1991,Agric.Biol.Chem.55(4):941-949)，或它们的变体或片段。其它曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等,1996,Prot.Eng.9:499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等,1995,Prot.Eng.8:575-582)；N182(Chen等,1994,Biochem.J.301:275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等,1996,Biochemistry 35:8698-8704)；以及在A435和S436位置导入Pro残基(Li等,1997,Protein Eng.10:1199-1204)。
其它的葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(之前表示为罗耳伏革菌(Corticiumrolfsii))葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026和Nagasaka等,1998,Appl.Microbiol.Biotechnol.50:323-330)，踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是源自杜邦踝节菌(Talaromyces duponti)、埃莫森踝节菌(Talaromyces emersonii)(WO99/28448)、Talaromyces leycettanus(美国专利号Re.32,153)、嗜热踝节菌(Talaromycesthermophilus)(美国专利号4,587,215)。
细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP135138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO86/01831)，均在WO 2006/069289中公开的瓣环栓菌(Trametes cingulata)、纸质大纹饰孢菌(Pachykytospora papyracea)和大白桩菇(Leucopaxillus giganteus)，或WO2007/124285或PCT/US2007/066618中公开的红边隔孢伏革菌(Peniophora rufomarginata)的葡糖淀粉酶；或其混合物。杂合体葡糖淀粉酶可用于本发明。杂合体葡糖淀粉酶的实例在WO2005/045018中公开。具体实例包括实施例1的表1和4中公开的杂合体葡糖淀粉酶(该杂合体通过引用并入本文)。
所述葡糖淀粉酶可与任何上面提及的葡糖淀粉酶显示高序列同一性程度，即，与上面提及的成熟酶序列显示至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或甚至100％的同一性。
商业上可得到的葡糖淀粉酶组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SANTMSUPER，SANTMEXTRA L，SPIRIZYMETMPLUS，SPIRIZYMETMFUEL，SPIRIZYMETMB4U，SPIRIZYME ULTRA，SPIRIZYMETMEXCEL和AMGTME(来自Novozymes A/S,Denmark)；OPTIDEXTM300，GC480TM和GC147TM(来自Genencor Int.,USA)；AMIGASETM和AMIGASETMPLUS(来自DSM)；G-ZYMETMG900,G-ZYMETM和G990ZR(来自Genencor Int.)。
葡糖淀粉酶可以以0.02-20AGU/g DS，优选0.1-10AGU/g DS，特别是1-5AGU/g DS，例如0.1-2AGU/g DS，例如0.5AGU/g DS的量，或以0.0001-20AGU/g DS，优选0.001-10AGU/gDS，特别是0.01-5AGU/g DS，例如0.1-2AGU/g DS的量添加。
β-淀粉酶
β-淀粉酶(E.C 3.2.1.2)为传统上给予外作用的(exo-acting)产麦芽糖淀粉酶的名称，其催化直链淀粉、支链淀粉以及相关的葡萄糖聚合物中1,4-α-葡糖苷键的水解。自非还原的链末端以逐步的方式连续移除麦芽糖单元直至分子降解，或者，在支链淀粉的情况下，直至到达分枝点。释放的麦芽糖具有β异头物构象，由此得到β-淀粉酶的名称。
已经从多种植物和微生物中分离了β-淀粉酶(Fogarty and Kelly,1979,Progress in Industrial Microbiology 15:112-115)。这些β-淀粉酶的特征在于具有40℃到65℃的最适温度以及4.5到7的最适pH。来自大麦的商业上可得到的β-淀粉酶为来自Novozymes A/S,Denmark的NOVOZYMTM WBA和来自Genencor Int.,USA的SPEZYMETMBBA1500。
产麦芽糖淀粉酶
淀粉酶也可为产麦芽糖α-淀粉酶(葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶，EC 3.2.1.133)，其催化将直链淀粉和支链淀粉水解成α构象的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB11837的产麦芽糖淀粉酶商业上可由Novozymes A/S得到。产麦芽糖的α-淀粉酶描述于美国专利号4,598,048，4,604,355和6,162,628，其通过引用并入本文。
产麦芽糖淀粉酶可以0.05-5mg总蛋白/克DS或0.05-5MANU/g DS的量添加。
植酸酶
任何植酸酶可用于本发明的方法中。植酸酶是通过特异性水解肌醇和磷之间的酯键而降解植酸盐和/或植酸的酶。植酸酶活性取决于许多成分中磷和离子的可获得性。在一些实施方式中，植酸酶能够从肌醇六磷酸(例如植酸)释放至少一个无机磷酸。植酸酶可根据其对于植酸分子上起始水解处的磷酸酯基团的具体位置的偏好进行分组(例如3-植酸酶(EC 3.1.3.8)或6-植酸酶(EC 3.1.3.26))。植酸酶的实例是肌醇-六磷酸-3-磷酸水解酶(myo-inositol-hexakiphosphate-3-phosphohydrolase)。
植酸酶可从微生物如真菌和细菌生物获得。举例而言，植酸酶可从丝状真菌如曲霉属(例如无花果曲霉(A.ficuum)，烟曲霉，黑曲霉和土曲霉(A.terreus))，支胞属(Cladospirum)，毛霉属(Mucor)(例如梨形毛霉(Mucor piriformis))，毁丝霉属(Myceliophthora)(例如嗜热毁丝霉(M.thermophila))，青霉属(例如P.hordei(ATCCNo.22053)，桧状青霉(P.piceum)(ATCC No.10519)，或短密青霉(P.brevi-compactum)(ATCC No.48944))，踝节菌属(例如嗜热踝节菌)，嗜热霉属(Thermomyces)(WO 99/49740)和木霉属菌种(Trichoderma spp.)(例如里氏木霉)获得。
在一个实施方式中，植酸降解酶从酵母(例如Arxula adeninivorans、异常毕赤酵母(Pichia anomala)、西方许望酵母(Schwanniomyces occidentalis))，革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌、克雷伯氏菌属菌种(Klebsiella spp.)、假单胞菌属菌种(Pseudomonasspp.))，和革兰氏阳性细菌(例如芽孢杆菌属菌种如枯草芽孢杆菌)获得。
植酸酶亦可从柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterbacter)或隔孢伏革菌属(Peniophora)获得。
在一个实施方式中，植酸酶来源于布丘氏菌属菌种(Buttiauxiella spp.)如乡间布丘氏菌(B.agrestis)、B.brennerae、B.ferragutiase、B.gaviniae、B.izardii、B.noackiae和B.warmboldiae。在一些实施方式中，植酸酶是WO 2006/043178或美国申请号11/714,487中公开的植酸酶。
在一个优选实施方式中，植酸酶与美国申请号12/263,886的SEQ ID NO:31中所示的氨基酸序列具有至少75％，至少80％，至少85％，至少88％，至少90％，至少93％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％和至少99％的序列同一性。
商业上可获得的植酸酶为NATUPHOS(BASF)，RONOZYME P(Novozymes A/S)，PHZYME(Danisco A/S,Diversa)和FINASE(AB Enzymes)。用于确定微生物植酸酶活性的方法和植酸酶单位的定义公开于Engelen等,1994,Journal of AOAC International 77:760-764。所述植酸酶可为野生型植酸酶，其活性变体或活性片段。
普鲁兰酶
任何普鲁兰酶可用于本发明的方法。在一个实施方式中，所述普鲁兰酶为GH57普鲁兰酶，例如从热球菌属(Thermococcus)，包括热球菌属菌种AM4，热球菌属菌种HJ21，Thermococcus barophilus，Thermococcus gammatolerans，Thermococcushydrothermalis，Thermococcus kodakarensis，Thermococcus litoralis和Thermococcusonnurineus的菌株；或从火球菌属(Pyrococcus)，如深海火球菌(Pyrococcus abyssi)和激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的菌株获得的普鲁兰酶。
蛋白酶
蛋白酶可在上述涉及的包括液化步骤(即，其中含淀粉材料经糊化)的方法中的预糖化、糖化、发酵、同步糖化和发酵过程中添加。蛋白酶也可在上述涉及的生淀粉工艺(即，其中含淀粉材料未经糊化)中的发酵过程中添加。蛋白酶可为任何蛋白酶。在一个优选实施方式中，所述蛋白酶为微生物来源的酸性蛋白酶，优选真菌或细菌来源的。酸性真菌蛋白酶是优选的，但也可使用其它蛋白酶。
合适的蛋白酶包括微生物蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶为酸性蛋白酶，即，特征为能够在pH7以下的酸性条件下水解蛋白质的蛋白酶。
酸性真菌蛋白酶可来源于曲霉属、假丝酵母属、革盖菌属(Coriolus)、内座壳属(Endothia)、虫霉属(Enthomophtra)、耙齿菌属(Irpex)、毛霉属(Mucor)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)、丝核菌属(Sclerotium)和球拟酵母属(Torulopsis)。具体而言，所述蛋白酶可来源于棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(WO 95/02044)，泡盛曲霉(Hayashida等,1977,Agric.Biol.Chem.42(5),927-933)，黑曲霉(参见，例如，Koaze等,1964,Agr.Biol.Chem.Japan 28:216)，斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)(参见，例如Yoshida,1954,J.Agr.Chem.Soc.Japan 28:66)或米曲霉，如pepA蛋白酶，以及来自米黑毛霉(Mucor miehei)或微小毛霉(Mucor pusillus)的酸性蛋白酶。
蛋白酶可为中性或碱性蛋白酶，如来源于芽孢杆菌属菌株的蛋白酶。具体蛋白酶来源于解淀粉芽孢杆菌，且具有在Swissprot可作为登录号P06832得到的序列。蛋白酶可与在Swissprot数据库作为登录号P06832公开的氨基酸序列具有至少90％序列同一性，如至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或特别是至少99％同一性。
蛋白酶可与WO 2003/048353中作为SEQ ID NO:1或本文SEQ ID NO:13公开的氨基酸序列具有至少60％，例如至少70％，例如至少80％，例如至少90％序列同一性，如至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或特别是至少99％同一性。
蛋白酶可为选自下组的木瓜蛋白酶样蛋白酶，如EC 3.4.22.*(半胱氨酸蛋白酶)内的蛋白酶，如EC 3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC 3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、EC 3.4.22.7(萝藦蛋白酶(asclepain))、EC 3.4.22.14(猕猴桃蛋白酶(actinidain))、EC 3.4.22.15(组织蛋白酶L)、EC3.4.22.25(甘氨酰内肽酶)和EC 3.4.22.30(番木瓜蛋白酶(caricain))。
在一个实施方式中，蛋白酶是来源于曲霉属如米曲霉的菌株的蛋白酶制备物。在另一个实施方式中，蛋白酶来源于根毛霉属，优选曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的菌株。在另一个实施方式中，蛋白酶为蛋白酶制备物，优选来源于曲霉属(如米曲霉)的菌株的蛋白水解制备物以及来源于根毛霉属(优选曼赫根毛霉)的菌株的蛋白酶的混合物。
天冬氨酸蛋白酶描述于，例如Handbook of Proteolytic Enzymes,Edited byA.J.Barrett,N.D.Rawlings和J.F.Woessner,Academic Press,San Diego,1998,Chapter270。天冬氨酸蛋白酶的实例包括，例如Berka等,1990,Gene 96:313；Berka等,1993,Gene125:195-198；和Gomi等,1993,Biosci.Biotech.Biochem.57:1095-1100中公开的那些，其通过引用并入本文。
蛋白酶亦可为金属蛋白酶，其定义为选自下组的蛋白酶：
(a)属于EC 3.4.24(金属内肽酶)；优选EC 3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)的蛋白酶；
(b)上述手册中属于M组的金属蛋白酶；
(c)尚未分配至宗族(clan)(命名：宗族MX)，或属于宗族MA，MB，MC，MD，ME，MF，MG，MH之一(如上述手册第989-991页定义)的金属蛋白酶；
(d)其它家族的金属蛋白酶(如上述手册第1448-1452页定义)；
(e)具有HEXXH基序的金属蛋白酶；
(f)具有HEFTH基序的金属蛋白酶；
(g)属于家族M3，M26，M27，M32，M34，M35，M36，M41，M43，或M47之一(如上述手册第1448-1452页定义)的金属蛋白酶；
(h)属于M28E家族的金属蛋白酶；和
(i)属于家族M35的金属蛋白酶(如上述手册第1492-1495页定义)。
在其它具体实施方式中，金属蛋白酶是其中对肽键的亲核攻击通过由二价金属阳离子活化的水分子介导的水解酶。二价阳离子的实例是锌、钴或锰离子。金属离子的位置可由氨基酸配体固定。配体的数量可为五个、四个、三个、两个、一个或零个。在一个具体实施方式中，该数量为两个或三个，优选三个。
对于本发明的方法中使用的金属蛋白酶的来源并无限制。在一个实施方式中，该金属蛋白酶归类为EC 3.4.24，优选EC 3.4.24.39。在一个实施方式中，所述金属蛋白酶是酸稳定性金属蛋白酶，例如真菌酸稳定性金属蛋白酶，如来源于嗜热子囊菌属的菌株，优选黄嗜热子囊菌的菌株，特别是黄嗜热子囊菌CGMCC No.0670的金属蛋白酶(归类为EC3.4.24.39)。在另一个实施方式中，所述金属蛋白酶来源于曲霉属的菌株，优选米曲霉的菌株。
在一个实施方式中，金属蛋白酶与WO 2010/008841的SEQ ID NO:1或本文中SEQID NO:13(黄嗜热子囊菌金属蛋白酶)的氨基酸-178至177，-159至177，或优选氨基酸1至177(成熟多肽)具有至少60％，例如至少70％，例如至少80％，至少82％，至少85％，至少90％，至少95％，至少97％，例如99％的序列同一性程度，并具有金属蛋白酶活性。在具体实施方式中，金属蛋白酶由与上面提及的SEQ ID NO:1或本文中SEQ ID NO:13具有同一性程度的氨基酸序列组成。
所述黄嗜热子囊菌金属蛋白酶是适用于本发明的方法的金属蛋白酶的优选实例。另一种金属蛋白酶来源于米曲霉，并包含WO 2003/048353中公开的SEQ ID NO:11的序列，或其氨基酸-23-353；-23-374；-23-397；1-353；1-374；1-397；177-353；177-374；或177-397，和WO 2003/048353中公开的SEQ ID NO:10。
另一种适用于本发明的方法的金属蛋白酶是包含WO 2010/008841的SEQ ID NO:5的米曲霉金属蛋白酶，或下述金属蛋白酶：其为分离的多肽，与SEQ ID NO:5具有至少约80％，至少82％，至少85％，至少90％，至少95％，或至少97％的同一性程度，并具有金属蛋白酶活性。在具体实施方式中，所述金属蛋白酶由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成。
在一个具体实施方式中，金属蛋白酶具有与黄嗜热子囊菌或米曲霉金属蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸-178至177，-159至177，或+1至177相差四十个、三十五个、三十个、二十五个、二十个、或十五个氨基酸的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，金属蛋白酶具有与这些金属蛋白酶的氨基酸序列的氨基酸-178至177，-159至177，或+1至177相差十个、九个、八个、七个、六个或五个氨基酸，例如四个、三个、两个或一个氨基酸的氨基酸序列。
在具体实施方式中，所述金属蛋白酶a)包含如下或b)由如下组成：
i)WO 2010/008841的SEQ ID NO:1的氨基酸-178至177，-159至177，或+1至177的氨基酸序列；
ii)WO 2010/008841的SEQ ID NO:3的氨基酸-23-353，-23-374，-23-397，1-353，1-374，1-397，177-353，177-374，或177-397的氨基酸序列；
iii)WO 2010/008841的SEQ ID NO:5的氨基酸序列；或
i)，ii)，和iii)序列的具有蛋白酶活性的等位变体或片段。
WO 2010/008841的SEQ ID NO:1的氨基酸-178至177，-159至177，或+1至177，或WO2010/008841的SEQ ID NO:3的氨基酸-23-353，-23-374，-23-397，1-353，1-374，1-397，177-353，177-374，或177-397的片段是从这些氨基酸序列的氨基和/或羧基端缺失一个或多个氨基酸的多肽。在一个实施方式中，片段含有至少75个氨基酸残基，或至少100个氨基酸残基，或至少125个氨基酸残基，或至少150个氨基酸残基，或至少160个氨基酸残基，或至少165个氨基酸残基，或至少170个氨基酸残基，或至少175个氨基酸残基。
在另一个实施方式中，所述金属蛋白酶与另一种蛋白酶如真菌蛋白酶，优选酸性真菌蛋白酶组合。
商业上可得到的产品包括ESPERASETM，FLAVOURZYMETM，NOVOZYMTM FM2.0L，和iZyme BA(可从Novozymes A/S，Denmark获得)和GC106TM和来自Genencor International,Inc.,USA的SPEZYMETM FAN。
蛋白酶可以以0.0001-1mg酶蛋白/g DS，优选0.001至0.1mg酶蛋白/g DS的量存在。或者，蛋白酶可以0.0001至1LAPU/g DS，优选0.001至0.1LAPU/g DS和/或0.0001至1mAU-RH/g DS，优选0.001至0.1mAU-RH/g DS的量存在。
海藻糖酶
海藻糖酶为将海藻糖降解为其单元单糖(即葡萄糖)的酶。根据本发明，海藻糖酶可为一种单一的海藻糖酶，或两种或更多种任意来源(例如植物、哺乳动物或微生物来源，如细菌或真菌来源)的海藻糖酶的组合。在一个实施方式中，海藻糖酶为哺乳动物来源，例如猪海藻糖酶。在一个优选的实施方式中，海藻糖酶为真菌来源，优选为酵母来源。在一个实施方式中，海藻糖酶来源于酵母属菌株，例如酿酒酵母菌株。在一个优选的实施方式中，海藻糖酶来源于木霉属菌株，例如里氏木霉的菌株，例如本文中SEQ ID NO:12公开的海藻糖酶。
海藻糖酶被划分在EC 3.2.1.28(α,α-海藻糖酶)和EC 3.2.1.93(α,α-磷酸海藻糖酶)。EC分类是基于国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会(IUBMB)的推荐。EC分类的描述可在互联网上找到，例如，在“http://www.expasy.org/enzyme/”。海藻糖酶为催化以下反应的酶：
EC 3.2.1.28:
α,α-海藻糖+H2O＝2D-葡萄糖；
EC 3.2.1.93:
α,α-海藻糖-6-磷酸+H2O<＝>D-葡萄糖+D-葡萄糖6-磷酸；
这两种酶分类在本发明的上下文中都被称为“海藻糖酶”。在一个优选的实施方式中，海藻糖酶分类为EC 3.2.1.28。在另一个实施方式中，海藻糖酶分类为EC 3.2.1.93。在一个实施方式中，海藻糖酶为中性海藻糖酶。在另一个实施方式中，海藻糖酶为酸性海藻糖酶。
中性海藻糖酶的实例包括，但不限于，来自酿酒酵母(Londesborouh等(1984)Characterization of two trehalases from baker’s yeast”Biochem J219,511-518)；Mucor roxii(Dewerchin等(1984),”trehalase activity and cyclic AMP contentduring early development of Mucor rouxii spores”,J.Bacteriol.158,575-579)；布拉克须霉(Phycomyces blakesleeanus)(Thevelein等(1983),“Glucose-inducedtrehalase activation and trehalose mobilization during early germination ofPhycomyces blakesleeanus spores”J.Gen Microbiol.129,719-726)；尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporium)(Amaral等(1996),“Comparative study of two海藻糖酶activities from Fusarium oxysporium var Linii”Can.J Microbiol.41,1057-1062)的海藻糖酶。
中性海藻糖酶的实例包括，但不限于，来自酿酒酵母(Parvaeh等(1996)Purification and biochemical characterization of the ATH1gene product,vacuolar acid trehalase from Saccharomyces cerevisae”FEBS Lett.391,273-278)；粗糙脉孢菌(Neorospora crassa)(Hecker等(1973),“Location of trehalase in theascospores of Neurospora:Relation to ascospore dormancy and germination”.J.Bacteriol.115,592-599)；金色毛壳(Chaetomium aureum)(Sumida等(1989),“Purification and some properties of trehalase from Chaetomium aureum MS-27.J.Ferment.Bioeng.67,83-86)；构巢曲霉(Aspergillus nidulans)(d’Enfert等(1997),“Molecular characterization of the Aspergillus nidulanstreA geneencoding an acid trehalase required for growth on trehalose.Mol.Microbiol.24,203-216)；灰腐质霉(Humicola grisea)(Zimmermann等(1990).”Purification andproperties of an extracellular conidial trehalase from Humicola griseavar.thermoidea”,Biochim.Acta 1036,41-46)；灰腐质霉(Cardello等(1994),“Acytosolic trehalase from the thermophilhilic fungus Humicola griseavar.thermoidea’,Microbiology UK 140,1671-1677)；Scytalidium thermophilum(Kadowaki等(1996),“Characterization of the trehalose system from thethermophilic fungus Scytalidium thermophilum”Biochim.Biophys.Acta 1291,199-205)；和尖孢镰孢菌(Amaral等(1996),“Comparative study of two trehalaseactivities from Fusarium oxysporium var Linii”Can.J Microbiol.41,1057-1062)的海藻糖酶。
也已知来自大豆的海藻糖酶(Aeschbachet等(1999)”Purification of thetrehalase GmTRE1from soybean nodules and cloning of its cDNA”,Plant Physiol119,489-496)。
海藻糖酶也存在于哺乳动物的小肠和肾脏。
商业可得的海藻糖酶包括可从SIGMA,USA(产品#A8778)获得的猪海藻糖酶。
在预糖化或糖化和/或发酵中，海藻糖酶可以以任何有效剂量与纤维素分解组合物一起加入或存在，其包括，但不限于1-500Sigma单位/升发酵培养基，优选10-100Sigma单位/升发酵培养基。
材料和方法
纤维素酶A：源自里氏木霉的纤维素分解组合物(CELLUCLASTTM1.5L,Novozymes)。
纤维素酶B：源自里氏木霉的纤维素分解组合物，其包含源自黄嗜热子囊菌菌株的具有纤维素分解增强活性的GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2)；米曲霉β-葡糖苷酶(WO 2008/057637中公开的融合蛋白)；和棘孢曲霉木聚糖酶(公开于WO 94/21785的SEQ ID NO:5(称为Xyl II))。
纤维素酶C：源自里氏木霉的纤维素分解组合物，其包含具有纤维素分解增强活性的黄嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2)、烟曲霉β-葡糖苷酶(WO2005/047499的SEQ ID NO:2或本文中的SEQ ID NO:6)。
纤维素酶D：源自里氏木霉的纤维素分解组合物，其包含源自Penicilliumemersonii菌株的具有纤维素分解增强活性的GH61A多肽(WO 2011/041397中的SEQ ID NO:2或本文中的SEQ ID NO:8)、烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2或本文中的SEQ ID NO:6)变体F100D、S283G、N456E、F512Y(公开于WO 2012/044915或共同未决的PCT申请PCT/US11/054185)；在WO2011/057140中的SEQ ID NO:6和本文中的SEQ ID NO:2公开的烟曲霉Cel7A CBH1，以及公开为WO 2011/057140中的SEQ ID NO:18和本文中的SEQ IDNO:4的烟曲霉CBH II。
葡糖淀粉酶E：在WO 99/28448或本文中SEQ ID NO:9公开的源自埃莫森踝节菌的葡糖淀粉酶，公开为WO 06/69289中的SEQ ID NO:2或本文中的SEQ ID NO:10的瓣环栓菌葡糖淀粉酶，以及公开为WO 2006/069290中表5中的V039或本文中的SEQ ID NO:11的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(成分之间比例为约65:15:1)。
葡糖淀粉酶E2：在WO 99/28448或本文中SEQ ID NO:9公开的源自埃莫森踝节菌的葡糖淀粉酶，公开为WO 06/69289中的SEQ ID NO:2或本文中的SEQ ID NO:10的瓣环栓菌葡糖淀粉酶，以及公开为WO 2006/069290中表5中的V039或本文中的SEQ ID NO:11的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD且具有下列突变的微小根毛霉α-淀粉酶变体(AA PE96)：G128D+D143N(使用SEQ ID NO:11进行编号)(成分之间比例为约25:6:1)。
来自里氏木霉的海藻糖酶示于本文中SEQ ID NO:12。
酵母：ETHANOL RED(Fermentis)。
方法
葡糖淀粉酶活性(AGU)
葡糖淀粉酶活性可以以葡糖淀粉酶单位(AGU)测量。
Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在37℃，pH 4.3，底物：23.2mM麦芽糖，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间5分钟的标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量。
可使用自动分析仪系统。将变旋酶(mutarotase)添加到葡萄糖脱氢酶试剂中，使得存在的任何α-D-葡萄糖转化为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶特异性地与β-D-葡萄糖在上述反应中反应，形成NADH，其使用光度计在340nm处测定作为起始葡萄糖浓度的量度。
<u>AMG温育：</u>
底物： 麦芽糖23.2mM
缓冲液： 乙酸盐0.1M
pH： 4.30±0.05
温育温度： 37℃±1
反应时间： 5分钟
酶工作范围： 0.5-4.0AGU/mL
<u>颜色反应：</u>
GlucDH： 430U/L
变旋酶： 9U/L
NAD： 0.21mM
缓冲液： 磷酸盐0.12M；0.15M NaCl
pH： 7.60±0.05
温育温度： 37℃±1
反应时间： 5分钟
波长： 340nm
更具体描述此分析方法的文件夹(EB-SM-0131.02/01)可向Novozymes A/S,Denmark要求而获得，该文件包括在本文中作为参考。
酸性α-淀粉酶活性
FAU-F的测定
FAU(F)真菌α-淀粉酶单位(Fungamyl)是相对于已声明强度的酶标样测量的。测定底物为4,6-亚乙基(G7)-对硝基苯(G1)-α,D-麦芽庚糖苷(亚乙基-G7-PNP)。
反应条件
更具体描述此标准方法的文件夹(EB-SM-0216.02)可向Novozymes A/S,Denmark要求而获得，该文件包括在本文中作为参考。
AFAU的测定
酸性α-淀粉酶活性可以以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)测量，其相对于酶标准物来确定。一AFAU定义为在下面提及的标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。
酸性α-淀粉酶，其为内切-α-淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)水解淀粉分子内部区域中的α-1,4-糖苷键以形成具有不同链长的糊精和寡糖。与碘形成的颜色的强度与淀粉浓度成正比。使用反向比色法(reverse colorimetry)在规定的分析条件下测定淀粉浓度的降低作为淀粉酶活性。
蓝色/紫色 t＝23秒 脱色
标准条件/反应条件：
底物：可溶性淀粉，大约 0.17g/L
缓冲液：柠檬酸盐，大约 0.03M
更具体描述此分析方法的文件夹(EB-SM-0259.02/01)可向Novozymes A/S,Denmark要求而获得，该文件包括在本文中作为参考。
α-淀粉酶活性(KNU)
可使用马铃薯淀粉作为底物测定淀粉分解活性。这种方法基于改性的马铃薯淀粉通过酶的分解，通过将淀粉/酶溶液的样品与碘溶液混合来跟踪该反应。起初，形成黑蓝色，但是在淀粉分解过程中蓝色变浅并逐渐变成红褐色，将其与有色玻璃(colored glass)标准比较。
1个Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件下(即在37℃+/-0.05；0.0003M Ca2+；和pH 5.6)将5260mg淀粉干物质Merck Amylum solubile糊精化的酶量。
更详细描述这种分析方法的文件(EB-SM-0009.02/01)可向NovozymesA/S，Denmark要求而获得，该文件包括在本文中作为参考。
蛋白酶活性(AU)
蛋白酶活性可以通过使用变性的血红蛋白作为底物进行测定。在用于测定蛋白酶活性的Anson-Hemoglobin法中，将变性的血红蛋白消化，并将未消化的血红蛋白用三氯乙酸(TCA)沉淀。使用酚试剂确定TCA可溶产物的量，酚试剂遇到酪氨酸和色氨酸产生蓝色。
一个Anson单位(AU)定义为在标准条件下(即，25℃，pH 7.5和10分钟反应时间)以使得每分钟释放的TCA可溶产物量与一毫当量的酪氨酸遇到酚试剂给出相同的颜色的起始速率消化血红蛋白。
更详细描述这种分析方法的文件夹AF 4/5可向NovozymesA/S，Denmark要求而获得，该文件夹包括在本文中作为参考。
海藻糖酶的SIGMATM酶测定
一个SIGMA单元在pH 5.7在37℃下，每分钟将1.0微摩尔的海藻糖转化为2.0微摩尔的葡萄糖(释放的葡萄糖在pH 7.5测定)。
测定相对ED50
相对ED50(半数最大水解装载值)按实施例3中所描述的，使用GraphPad Prism3.0软件或新版本或其它类似软件进行测定。
实施例
实施例1
在SSF中加入的四种纤维素分解组合物的乙醇产量
将来自East Kansas Agri-Energy的工业生产的玉米醪用于所有样品。将含有液化醪的5加仑容器解冻，并分配为较小的量(1升螺旋帽Nalgene瓶)，并重新冻结。在起始该研究之前，将一升的该醪解冻大约4个小时。对醪分别使用1g/l青霉素和200g/L尿素的溶液补充3ppm青霉素和1000ppm尿素，并用40％H2SO4调整至pH 5.0。醪的干固形物含量在Mettler-Toledo水分天平(moisture balance)(HB43-S卤素)上进行测量，得到大约33.％DS的值。将大约5g的工业醪添加至具有翻盖的15ml锥形离心管(NUNC#362694)。总共运行了212次发酵。酶根据下表的剂量规格进行添加，添加至发酵的原液体积通过以下公式进行计算：
将葡糖淀粉酶E加入所有样品，然后在此背景下加入一剂量的纤维素酶。将水加入每个样品，使得添加的酶和水的总体积为大约400微升/5g样品，以使最后的％DS为30％。将再水化的酵母(5.5g Fermentis Ethanol Red酵母在100mL 35℃自来水中在32℃温育30分钟)以每个5g样品中110微升酵母溶液的剂量添加。将管在时点0称重，然后在32℃发酵52小时。
HPLC分析
在发酵时点最后，将50微升的40％H2SO4添加至每个样品，并进行涡旋以确保混合。将样品在在具有转子GH3.8的Beckman Coulture台式离心机(Allegra 6R)中以1570x g(3000rpm)离心10分钟，然后在进行HPLC分析之前通过0.45微米注射器式滤器(Whatman)滤入HPLC小瓶。
HPLC系统：配有Chem station软件的Agilent的1100/1200系列
除气器
平方泵(Quadratic Pump)
自动取样器
具有加热器的柱区室(Column Compartment/w Heater)
折光率检测器(RI)
柱：Bio-Rad HPX-87H Ion Exclusion Column 300mm x 7.8mm部件#125-0140
Bio-Rad保护柱(guard cartridge)阳离子H部件#125-0129，Holder部件#125-0131
方法：0.005M H2SO4流动相
0.6ml/min的流速
柱温度-65℃
RI检测器温度-55℃
该方法使用对于糊精(DP4+)、麦芽三糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、乙酸、乳酸、甘油和乙醇的校准标样对几种分析物定量。使用包括原点(origin)的4点校准。
乙醇产量和在52小时的发酵相对于对照的增加的结果总结于图1。
结果显示，当在SSF中在葡糖淀粉酶E的基础上加入时，所有四种纤维素酶(纤维素分解组合物)得到显著额外的乙醇产量受益。尽管在3000微克EP/gDS的剂量下，纤维素酶A导致多于1％的乙醇增长，其与纤维素酶B、C和D相比为劣势。在5000微克EP/gDS的剂量下，纤维素酶B导致3.8％的乙醇产量增长。在5000微克EP/gDS的剂量下，纤维素酶C和D分别导致5.8-6.0％的乙醇产量。
结果显示，当在显著低于这些纤维素酶复合物在木质纤维素水解中的3-10微克EP/g纤维素剂量的浓度下，在发酵中连同葡糖淀粉酶对液化的玉米醪施用时，用于水解纤维素原料的纤维素分解组合物得到显著增加的乙醇产量。
实施例2
野生型烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶(SEQ ID NO:6)和变体F100D+S283G+N456E+F512Y 的相对ED50装载值和比活性的测定
玉米秸秆的预处理(PCS)：在U.S.Department of Energy National RenewableEnergy Laboratory(美国能源部国家可再生能源实验室，NREL)在190℃使用1.4％(w/v)硫酸预处理玉米秸秆2分钟。预处理的玉米秸秆(PCS)中的不溶于水的固体含有57.5％纤维素，4.6％半纤维素和28.4％木质素。使用NREL标准分析程序#002，通过两阶段硫酸水解，随后通过高效液相色谱法分析糖，来测定纤维素和半纤维素。使用NREL标准分析程序#003，在用硫酸水解纤维素和半纤维素级分后，用重量法测定木质素。
使用反渗水重复洗涤预处理的玉米秸秆，随后倾析上清液级分，直至测量的pH大于4.0。之后，在用于Cosmos ICMG 40湿式多用途研磨机(EssEmm Corporation,TimailNadu,India)之前，研磨经洗涤的预处理的玉米秸秆(初始干重32.35％TS)。经研磨的水洗涤的预处理的玉米秸秆的干重为7.4％TS。
根据WO 2012/044915中的实例，构建和纯化野生型烟曲霉GH3Aβ-葡糖苷酶(本文中的SEQ ID NO:6)和变体F100D+S283G+N456E+F512Y(变体1)。评估它们增强里氏木霉纤维素分解蛋白制剂对PCS的水解的能力，该制剂由补充有10％的具有纤维素分解增强活性的黄嗜热子囊菌GH61A多肽(按WO 2005/074656中所述获得)添加和2％的2X(Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark)添加的1.5L(Novozymes A/S,Bagsvaerd,Denmark)组成，其在下文中指定为“里氏木霉纤维素分解蛋白组合物”。
使用2.2ml深孔板(Axygen,Union City,CA,USA)以1.0ml的总反应体积进行PCS的水解。使用50mg经洗涤、碾磨、过筛的PCS/ml含有1mM硫酸锰的50mM醋酸钠(pH 5.0)缓冲液，40g/ml的葡萄糖和2.24mg里氏木霉纤维素分解组合物/克纤维素的固定蛋白装载和向基础CELLUCLAST 1.5L以0-10％添加(蛋白质)纯化的烟曲霉家族3Aβ-葡糖苷酶的酶装载(2.24mg里氏木霉纤维素分解组合物/克纤维素和0-0.2mg的烟曲霉家族3Aβ-葡糖苷酶或其变体/克纤维素)进行水解。水解测定在50℃以三次重复进行72小时。水解之后，使用0.45μm96孔过滤器板(Millipore,Bedford,MA,USA)对样品进行过滤，并且如下文所述分析滤液的糖含量。当不是立即使用时，将过滤的糖等分试样冷冻在-20℃。
稀释于0.005M H2SO4的样品的糖浓度是用具有0.05％w/w苯甲酸的0.005M H2SO4以0.6ml/分钟的流速从4.6x 250mmHPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)在65℃洗脱后，并通过用纯糖样品校准的积分来自折射率检测(1100HPLC,Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)的葡萄糖和纤维二糖信号的定量而进行测量的。所得的当量用于计算对于每个反应纤维素转化的百分比。
通过从PCS与酶混合物中测量的葡萄糖水平减去只有PCS时测量的葡萄糖水平，计算释放的葡萄糖。
图2所示的结果证明：与野生型烟曲霉β-葡糖苷酶相比，烟曲霉β-葡糖苷酶变体F100D+S283G+N456E+F512Y(变体1)具有更高比活性(在指定条件下，与相同浓度的野生型酶相比，其在给定酶浓度下释放更多葡萄糖)。
野生型和变体1的相对ED50(半数最大水解装载值)示于下文实施例3的表格中。
实施例3
烟曲霉家族GH3Aβ-葡糖苷酶变体L89M+G91L+F100D+I140V+I186V+S283G+N456E+ F512Y，变体L89M+G91L+I140V+I186V，和变体F100D+S283G+N456E+F512Y的相对ED50装载值 和比活性的确定
根据本文的实施例2和WO 2012/044915中的实施例，评估纯化的野生型烟曲霉家族GH3Aβ-葡糖苷酶和变体F100D+S283G+N456E+F512Y(变体1)和变体L89M+G91L+F100D+I140V+I186V+S283G+N456E+F512Y(变体2)和变体L89M+G91L+I140V+I186V(变体3)增强“里氏木霉纤维素分解组合物”(实施例2)对PCS的水解的能力。
PCS的水解和其分析根据实施例2所述的步骤进行。
图2所示的结果表明，烟曲霉家族GH3Aβ-葡糖苷酶的所有变体相比野生型β-葡糖苷酶都具有更高的比活性(在指定条件下，与相同浓度的野生型酶相比，其在给定酶浓度下释放更多葡萄糖)。
下文表格示出的相对ED50(半数最大水解装载值)使用Graphpad Prism 3.0软件计算。使用用于单位点结合(one site binding)的内置功能。使用Bmax测量最大水解，Kd作为ED50。此测定无加权(最小化绝对距离的平方)。将野生型烟曲霉β-葡糖苷酶的相对ED50装载值设为1.00，由测定的ED50装载值计算相对ED50装载值。
例如，在半数最大水解装载后，变体1只需野生型装载的0.45倍(图2中的％BG添加)以提供与野生型相同的葡萄糖释放(mg/ml)。
实施例4
当在预糖化或糖化过程中添加纤维素分解组合物和葡糖淀粉酶时的乙醇产量
通过5g小型测定来评估所有的处理。来自IGPC Ethanol Inc(ON,Canada)的工业生产的玉米醪用于所有的测试。玉米醪的干固形物(DS)为32.2％，且200g的玉米醪中补充有0.6mL的1g/L青霉素和1ml的200g/L尿素。使用40％H2SO4将此浆料的pH调节至5.0。玉米醪的最终干固形物测定为31.95％。在15mL聚丙烯试管中加入约5g所述浆料。通过钻1/32英寸(1.5mm)的孔以制备试管，然后在玉米醪加入前称量所述空试管。在玉米醪加入后，再次称量试管，以测定每个试管内玉米醪的确切重量。按照下文表格所示，在每个试管中加入合适量的酶。实际的酶剂量是基于每个试管中玉米醪的确切重量。将用于预糖化的试管置于50℃的气动振打器(air shaker)(无晃动)4小时，之后转移至32℃水浴进行SSF。在未预糖化的试管中加入100微升的酵母(ETHANOL RED)繁殖物到约5g玉米醪，然后在32℃水浴中温育以进行SSF。在4小时的预糖化后，由气动振打器中取出处理1至3的管，并将其置入32℃水浴中并冷却半小时(30分钟)，随后加入酵母繁殖物，以进行SSF。每种处理运行五个重复。在发酵54小时时取样进行HPLC分析。HPLC准备由添加50微升的40％H2SO4停止反应、离心和通过0.45微米过滤器进行过滤组成。样本储存在4℃直至用于分析。使用配有RI检测器的AgilentTM 1100HPLC系统测定乙醇和寡糖浓度。分离柱为来自BioRadTM的aminex HPX-87H离子排阻柱(300mm x 7.8mm)。
结果
HPLC结果总结于下表中。在预糖化中，葡糖淀粉酶E2连同纤维素酶A相比常规的使用葡糖淀粉酶E的SSF方法显示出更好的效能。在两种情况下，纤维素酶D的存在比起纤维素酶A(CELLUCLASTTM1.5L)的存在显示出更好的效能。
实施例5
在SSF中加入纤维素分解组合物和海藻糖酶的效果
通过5g小型测定来评估所有的处理。来自BioFuel Energy(Fairmont,MN)的工业生产的玉米醪用于此测试。500g的玉米醪中补充有1.5mL的1g/L青霉素和2.5mL的200g/L尿素。使用40％H2SO4将此浆料的pH调节至5.0。所述玉米醪的最终干固形物测定为31.43％。在15mL聚丙烯试管中加入约5g所述浆料。通过钻1/32英寸(1.5mm)的孔以制备试管，然后在玉米醪加入前称量所述空试管。在玉米醪加入后，再次称量试管，以测定每个试管内玉米醪的确切重量。按照下文表格所示，在每个试管中加入合适量的酶。实际的酶剂量是基于每个试管中玉米醪的确切重量。然后将100微升再水化的ETHANOL REDTM酵母(通过在磁力搅拌下将5.5g酵母置入100mL的32℃自来水中30分钟将酵母再水化)加入试管，之后在32℃水浴中进行培育，以用于SSF。每种处理运行三个重复。在发酵54小时后取样进行HPLC分析。HPLC准备由添加50微升的40％H2SO4停止反应、离心和通过0.45微米过滤器进行过滤组成。样本储存在4℃直至用于分析。使用配有RI检测器的AgilentTM1100HPLC系统测定乙醇和寡糖浓度。分离柱为来自BioRadTM的aminex HPX-87H离子排阻柱(300mm x 7.8mm)。
结果
HPLC结果总结于下表中。结果显示出，添加纤维素酶D(纤维素分解组合物)至仅-葡糖淀粉酶E(对照)显著增加最终乙醇滴度。此外，相比于葡糖淀粉酶E+纤维素酶D的对照，添加20和100微克EP/gDS海藻糖酶至葡糖淀粉酶E+纤维素酶D处理显著提高乙醇滴度。
*使用Tukey-Kramer HSD测试分析乙醇浓度结果，以确定淀粉酶之间的显著区别。在每个T-K栏中，不共用字母的水平是显著不同的。
实施例6
在SSF中添加纤维素分解组合物对后端脱水的影响
发酵：来自Platinum Ethanol的工业生产的玉米醪用于所有样品。将含有液化醪的5加仑容器解冻，并分配为较小的量(1升螺旋帽Nalgene瓶)，并重新冻结。在起始该研究之前，将一升的该醪解冻大约4个小时。对醪分别使用1g/l青霉素和200g/L尿素的溶液补充3ppm青霉素和1000ppm尿素，并用40％H2SO4调整至pH 5.0。醪的干固形物含量在Mettler-Toledo水分天平(HB43-S卤素)上进行测量，得到大约31.08％DS的值。将大约25g的工业醪添加至具有螺旋帽的50ml锥形离心管(VWR 89039-660)。总共运行24次发酵。酶根据以下表1的剂量规格进行添加，添加至发酵的原液体积通过以下公式进行计算：
表1.测试的酶处理
向所有样品中加入葡糖淀粉酶E2，在此背景上加入一剂量的纤维素酶D。每种处理进行四个重复。将水加入每个样品，使得添加的酶和水的总体积为大约285微升/25g样品，以使最终％DS为30.7％。将再水化的酵母(5.5g Fermentis Ethanol Red酵母在100mL 35℃自来水中在32℃温育30分钟)以每个25g样品中250微升酵母溶液的剂量添加。在时间点0称量试管，随后在32℃发酵72小时。
蒸馏：将所有的样品蒸馏，以移除乙醇并生成总酒糟。所有的蒸馏使用BüchiMultivapor蒸发系统。此单元一次蒸馏12个样品，所以在每个蒸馏组中蒸馏六个处理各自的两个重复物。使用的参数示于表2。蒸馏后对试管称重，使用DI水代替蒸馏过程中损失的重量。在加水后再次称量试管。
表2.蒸馏参数
脱水测定：在蒸馏之后，将样品在具有JS-5.3转子的Avanti J-E系列离心机(Beckman Coulter)中一次6个以1400x g离心10分钟。在离心之后，立即将样品倾入预称重的15mL锥形管(UNC#362694)。记录所得的湿滤饼和稀酒糟的重量。将湿滤饼置于预称重的干燥盘中，于55℃温育过夜，并转移至105℃下2小时。在温育之前和之后记录重量。使用这些值用下式计算干固形物的值。
结果：将脱水测定的数据载入JMP 9.0.2，以进行统计学分析。使用拟合模型(FitModel)平台以进行数据的标准最小二乘拟合。模型效果包括达到四次方的纤维素分解组合物剂量效果、指示各试管的蒸馏分组的组效果以及达到四次方的组与剂量之间的交叉效果。生成模型，并逐个移除不显著的影响，由最高级的不显著影响开始，并在每次移除后再进行拟合。
遵循该过程，模型被简化为下列影响：
·剂量
·剂量*剂量
·组
·剂量*组
·剂量*剂量*组
稀酒糟质量的模型表明，纤维素酶处理显著地增加了固体/液体分离后稀酒糟携带的全酒糟质量的百分比(图3和4)。根据组1和组2之间的不一致而言，这种响应在纤维素分解组合物剂量达到约100微克/gDS前增加，此后可能在至250微克/gDS时趋平。在100微克/gDS下，此效应使组1和2的稀酒糟分开(partition)速率相较于对照各增加2.2％和4％。湿滤饼％DS略微增加，或保持不变，表明大部分转移到稀酒糟中的质量为水。如果该纤维素分解组合物不具有脱水效果，而仅仅将固体溶解入稀酒糟，则湿滤饼的％DS应该减少。
在本文中描述且主张权利的本发明的范围不被文中公开的具体方面所限制，因为这些方面意在说明本发明的多个方面。任何等同的方面都在本发明的范围之内。实际上，从前面的描述来看，除了本文中示出并描述的那些，本发明的多种修改对本领域技术人员也将是明晰的。这样的修改也意在落于所附权利要求的范围之内。在冲突的情况下，包括定义的本公开将优先。
在以下编号的段落中进一步描述本发明：
1.一种生产发酵产物的方法，包括
(a)使用α-淀粉酶将含淀粉材料液化；
任选地，在步骤(b)之前对液化的材料进行预糖化；
(b)将液化的材料糖化；
(c)使用发酵生物体进行发酵；
其中，在该任选的预糖化步骤、糖化步骤(b)和/或发酵步骤(c)、或同步糖化和发酵过程中存在或加入糖源生成酶和/或纤维素分解组合物。
2.根据段落1所述的方法，其中所述纤维素分解组合物源自里氏木霉、特异腐质霉或Chrysosporium lucknowense。
3.根据段落1或2所述的方法，其中所述纤维素分解组合物包括β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。
4.根据段落1-3中任一项所述的方法，其中含有β-葡糖苷酶的纤维素分解组合物的相对ED50装载值小于1.00，优选小于0.80，例如优选小于0.60，例如在0.1-0.9之间，例如在0.2-0.8之间，例如0.30-0.70。
5.根据段落1-4中任一项所述的方法，其中所述糖源生成酶为葡糖淀粉酶，优选为葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的组合。
6.根据段落5所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶为真菌来源，优选来自曲霉属的菌株，优选为黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉；或来自木霉属的菌株，优选为里氏木霉；或来自踝节菌属的菌株，优选为埃莫森踝节菌。
7.根据段落5-7中任一项所述的方法，其中所述α-淀粉酶来源于根毛霉属的菌株，优选为微小根毛霉的菌株，或来源于多孔菌属的菌株，优选为巨多孔菌的菌株。
8.根据段落7所述的方法，其中所述α-淀粉酶来源于微小根毛霉，并具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合域(SBD)，且包括下列取代中的至少一个或取代的组合：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192R V410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C(使用SEQ ID NO:11进行编号)。
9.根据段落1至8中任一项所述的方法，其中所述糖源生成酶和/或所述纤维素分解组合物在糖化步骤(b)和/或发酵步骤(c)之前进行的预糖化步骤中加入。
10.根据段落1-13中任一项所述的方法，其中所述糖源生成酶和所述纤维素分解组合物在同步糖化和发酵(SSF)之前进行的预糖化步骤中加入。
11.根据段落1-10中任一项所述的方法，包括
(a)使用α-淀粉酶将含淀粉材料液化；
使用糖源生成酶和纤维素分解组合物对液化的材料进行预糖化；
(b)糖化；
(c)使用发酵生物体进行发酵；
其中，糖化步骤(b)和发酵步骤(c)同步或相继地进行。
12.根据段落1-10中任一项所述方法，包括
(a)使用α-淀粉酶将含淀粉材料液化；
使用糖源生成酶对液化的材料进行预糖化；
(b)在纤维素分解组合物的存在下进行糖化；
(c)使用发酵生物体进行发酵；
其中，糖化步骤(b)和发酵步骤(c)同步或相继地进行。
13.根据段落1-12中任一项所述的方法，其中所述预糖化在40-75℃的温度下，例如50-70℃，优选60℃；pH 4-6，优选为5；时间30-360分钟，例如60-420分钟，例如大约150-180分钟下进行。
14.根据段落1-13中任一项所述的方法，其中所述糖源生成酶和/或所述纤维素分解组合物在糖化步骤(b)和/或发酵步骤(c)或同步糖化和发酵(SSF)过程中加入。
15.根据段落1-14中任一项所述的方法，包括
(a)使用α-淀粉酶将含淀粉材料液化；
(b)在糖源淀粉酶和纤维素分解组合物的存在下将液化的材料糖化；
(c)使用发酵微生物进行发酵；
其中糖化步骤(b)和发酵步骤(c)同步或相继地进行。
16.根据段落1-15中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解组合物中的半纤维素酶含量低于所述纤维素分解组合物的10wt.％，如低于5wt.％。
17.根据段落1-16中任一项所述的方法，其中所述β-葡糖苷酶来自曲霉属菌株，例如烟曲霉菌株，例如烟曲霉β-葡糖苷酶(本文中SEQ ID NO:6)，其包括一个或多个选自L89M、G91L、F100D、I140V、I186V、S283G、N456E和F512Y的取代；例如其具有以下取代的变体：
-F100D+S283G+N456E+F512Y；
-L89M+G91L+I186V+I140V；
-I186V+L89M+G91L+I140V+F100D+S283G+N456E+F512Y。
18.根据段落1-17中任一项所述的方法，其中亲本β-葡糖苷酶与本文中的SEQ IDNO:6具有至少60％同一性，例如至少70％，例如至少80％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％同一性。
19.根据段落1-18中任一项所述的方法，β-葡糖苷酶变体与本文中的SEQ ID NO:6具有至少60％同一性，例如至少70％，例如至少80％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％，但低于100％同一性。
20.根据段落1-19中任一项所述的方法，其中在发酵过程中存在一种或多种纤维二糖水解酶(CBH)，例如纤维二糖水解酶I和/或纤维二糖水解酶II。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶I(CBH I)为来源于曲霉属菌株的一种，例如烟曲霉菌株，例如本文中SEQ ID NO:2公开的Cel7a CBHI，或来源于木霉属菌株，例如里氏木霉菌株。
22.根据段落1-21中任一项所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶II(CBH II)为来源于曲霉属菌株的一种，例如烟曲霉菌株；例如本文中公开为SEQ ID NO:4的那种，或来源于木霉属菌株，例如里氏木霉，或来源于梭孢壳属菌株，例如土生梭孢霉菌株，例如来自土生梭孢霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。
23.根据段落1-23中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解组合物来源于里氏木霉，并进一步包括以下中的一种或多种：
(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I，优选为本文中SEQ ID NO:2所示者；
(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II，优选为本文中SEQ ID NO:4所示者；
(iii)其烟曲霉β-葡糖苷酶变体，具有下列取代：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用本文中SEQ ID NO:6进行编号)。
24.根据段落1-23中任一项所述的方法，其中在发酵、预糖化、或同步或相继的糖化和发酵过程中存在或加入海藻糖酶。
25.根据段落23所述的方法，其中所述海藻糖酶来源于木霉，例如里氏木霉，例如本文中SEQ ID NO:12所示的里氏木霉海藻糖酶。
26.根据段落24或25所述的方法，其中所述海藻糖酶以5-1,000μg/g DS，例如7-500μg/g DS，例如10-250μg/g DS的量存在或加入。
27.根据段落1-26中任一项所述的方法，其中糖化和发酵同步或相继地进行。
28.根据段落1-27中任一项所述的方法，进一步包括通过将发酵材料分离成例如乙醇的液体部分(即发酵产物)以及固体部分(即全酒糟)，优选通过蒸馏，来回收发酵产物。
29.根据段落28所述的方法，另外其中将固体部分(即全酒糟)脱水，并通过例如离心而分离成固相(即湿滤饼)和液相(稀酒糟)。
30.根据段落1-29中任一项所述的方法，包括
(a)使用α-淀粉酶将含淀粉材料液化；
(b)使用糖源生成酶将液化的材料糖化；
(c)使用发酵生物体在纤维素分解组合物的存在下进行发酵，该纤维素分解组合物包括选自以下的一种或多种多肽：
-具有纤维素分解增强活性的GH61多肽；
-β-葡糖苷酶；
-纤维二糖水解酶I；
-纤维二糖水解酶II；
或其两种、三种或四种的混合物。
31.根据段落30所述的方法，其中所述纤维素分解组合物源自里氏木霉、特异腐质霉或Chrysosporium lucknowense。
32.根据段落1-31中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶，优选源自曲霉属菌株的一种，例如源自米曲霉，例如在WO 2002/095014中公开的那种，或在WO 2008/057637中公开的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或源自烟曲霉，例如在WO 2005/047499中公开的SEQ ID NO:2或本文中SEQ ID NO:6的那种，或在WO 2012/044915中公开的烟曲霉β-葡糖苷酶变体；或源于青霉属菌株，如在WO 2007/019442中公开的Penicillium brasilianum菌株，或源于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株。
33.根据段落1-32中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，例如源自嗜热子囊菌属的一种，例如黄嗜热子囊菌菌株，例如在WO 2005/074656中描述为SEQ ID NO:2的那种；或源自梭孢壳属的一种，例如土生梭孢霉菌株，例如在WO 2005/074647中描述为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的那种；或源自曲霉属菌株的一种，例如烟曲霉菌株，例如在WO 2010/138754中描述为SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2的那种；或源自青霉属菌株的一种，例如Penicillium emersonii菌株，例如在WO2011/041397公开的或本文中SEQ ID NO:8的那种。
34.根据段落1-33中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解组合物包含纤维二糖水解酶I(CBH I)，例如源自曲霉属菌株的一种，例如烟曲霉菌株，例如在WO 2011/057140中的SEQ ID NO:6或本文中的SEQ ID NO:2公开的Cel7a CBHI，或木霉属的菌株，例如里氏木霉菌株。
35.根据段落1-34中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解组合物包括纤维二糖水解酶II(CBH II)，例如源自曲霉属菌株的一种，例如烟曲霉菌株；例如公开为本文中的SEQ ID NO:4的那种，或源自木霉属的菌株，例如里氏木霉，或源自梭孢壳属的菌株，例如土生梭孢霉菌株，例如来自土生梭孢霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。
36.根据段落1-35中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和β-葡糖苷酶。
37.根据段落1-36中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和β-葡糖苷酶。
38.根据段落1-37中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶和CBH I。
39.根据段落1-38中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、CBH I和CBH II。
40.根据段落1-39中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解组合物为里氏木霉纤维素分解组合物，其进一步包括具有纤维素分解增强活性的黄嗜热子囊菌GH61A多肽(WO2005/074656中的SEQ ID NO:2)和米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)。
41.根据段落1-40中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解组合物为里氏木霉纤维素分解组合物，其进一步包括具有纤维素分解增强活性的黄嗜热子囊菌GH61A多肽(WO2005/074656中的SEQ ID NO:2)和烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2)或本文的SEQ ID NO:6。
42.根据段落1-41中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解组合物为里氏木霉纤维素分解组合物，其进一步包括在WO 2011/041397(本文中SEQ ID NO:8)中公开的具有纤维素分解增强活性的Penicillium emersonii GH61A多肽以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO2005/047499的SEQ ID NO:2)或本文中的SEQ ID NO:6，或其具有下列取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y。
43.根据段落1-42中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解组合物包括以下组分中的一种或多种：
(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；
(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；
(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；和
(iv)具有纤维素分解增强活性的青霉物种GH61多肽；或其同源物。
44.根据段落1-43中任一项所述的方法，其中所述纤维分解组合物的剂量为0.0001-3mg EP/g DS，优选为0.0005-2mg EP/g DS，优选为0.001-1mg/g DS，更优选为0.005-0.5mg EP/g DS，甚至更优选为0.01-0.1mg EP/g DS。
45.根据段落1-44中任一项所述的方法，其中在液化步骤(a)过程中使用的α-淀粉酶是细菌来源，例如源自芽孢杆菌属菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌菌株(或嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus))，特别是在WO 99/019467中公开为SEQ IDNO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌，其具有双缺失I181+G182和取代N193F。
46.根据段落1-45中任一项所述的方法，其中所述糖源生成酶为葡糖淀粉酶，例如真菌来源的葡糖淀粉酶，优选来自曲霉属的菌株，优选为黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉；或来自木霉属的菌株，优选为里氏木霉；或来自踝节菌属的菌株，优选为埃莫森踝节菌；或密孔菌属(pycnoporus)的菌株，或Gloephyllum的菌株，或Nigrofomes的菌株。
47.根据段落1-46中任一项所述的方法，其中所述烟曲霉纤维二糖水解酶I或其同源物选自：
(i)包含本文中SEQ ID NO:2的成熟多肽的纤维二糖水解酶I；
(ii)包含与本文中SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的纤维二糖水解酶I；
(iii)由包含与本文中SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶I；和
(iv)由在至少高严格条件下例如极高严格条件下与本文中SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补物杂交的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶I。
48.根据段落1-47中任一项所述的方法，其中所述烟曲霉纤维二糖水解酶II或其同源物选自：
(i)包含本文中SEQ ID NO:4的成熟多肽的纤维二糖水解酶II；
(ii)包含与本文中SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的纤维二糖水解酶II；
(iii)由包含与本文中SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶II；和
(iv)由在至少高严格条件下例如极高严格条件下与本文中SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列或其全长互补物杂交的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶II。
49.根据段落1-48中任一项所述的方法，其中所述烟曲霉β-葡糖苷酶或其同源物选自：
(i)包含本文中SEQ ID NO:6的成熟多肽的β-葡糖苷酶；
(ii)包含与本文中SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的β-葡糖苷酶；
(iii)由包含与本文中SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列的多核苷酸所编码的β-葡糖苷酶；和
(iv)由在至少高严格条件下，例如极高严格条件下与本文中SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或其全长互补物杂交的多核苷酸所编码的β-葡糖苷酶。
50.根据段落1-49中任一项所述的方法，其中β-葡糖苷酶变体在与本文中SEQ IDNO:6的成熟多肽的位置100、283、456和512对应的一个或更多位置上包含取代，其中变体具有β-葡糖苷酶活性。
51.根据段落1-50中任一项所述的方法，其中变体的亲本β-葡糖苷酶为(a)包含本文中SEQ ID NO:6的成熟多肽的多肽；(b)与本文中SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少80％序列同一性的多肽；(c)由在高严格条件或极高严格条件下与以下物质杂交的多核苷酸所编码的多肽：(i)本文中SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列，(ii)包含在本文中SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(d)由与本文中SEQID NO:5的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80％同一性的多核苷酸所编码的多肽；或(e)本文中SEQ ID NO:6的成熟多肽的片段，其具有β-葡糖苷酶活性。
52.根据段落50或51中任一项所述的方法，其中β-葡糖苷酶变体与亲本β-葡糖苷酶的氨基酸序列具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的序列同一性。
53.根据段落50-52中任一项所述的方法，其中变体与本文中SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的序列同一性。
54.根据段落50-53中任一项所述的方法，其中取代的数目为1至4之间，例如1、2、3或4个取代。
55.根据段落50-54中任一项所述的方法，其中变体包含在与位置100对应的位置上的取代，与位置283对应的位置上的取代，与位置456对应的位置上的取代，和/或与位置512对应的位置上的取代。
56.根据段落50-55中任一项所述的方法，其中变体在本文中的SEQ ID NO:6中包含Phe100Asp、Ser283Gly、Asn456Glu、Phe512Tyr。
57.根据段落1-56中任一项所述的方法，其中含有β-葡糖苷酶的纤维素分解组合物的相对ED50装载值小于1.00，优选小于0.80，例如优选小于0.60，例如在0.1-0.9之间，例如在0.2-0.8之间，例如0.30-0.70。
58.根据段落1-57中任一项所述的方法，其中具有纤维素分解增强活性的青霉物种GH61多肽或其同源物选自：
(i)包含本文中SEQ ID NO:8的成熟多肽的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽；
(ii)包含与本文中SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽；
(iii)由包含与本文中SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列的多核苷酸所编码的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽；和
(iv)由在至少高严格条件下例如极高严格条件下与本文中SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列或其全长互补物杂交的多核苷酸所编码的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。
59.根据段落1-58中任一项所述的方法，其进一步包括一种或多种选自纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、酯酶、扩展蛋白(expansin)、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素(swollenin)的酶。
60.根据段落59所述的方法，其中纤维素酶为一种或多种选自内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶的酶。
61.根据段落60所述的方法，其中内切葡聚糖酶为内切葡聚糖酶I。
62.根据段落60所述的方法，其中内切葡聚糖酶为内切葡聚糖酶II。
63.根据段落1-62中任一项所述的方法，其中糖化和发酵分开或同步地进行。
64.根据段落1-63中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解组合物中的半纤维素酶含量低于所述纤维素分解组合物的10wt.％，如低于5wt.％。
65.一种生产发酵产物的方法，包括
(a)使用糖源生成酶和纤维素分解组合物将液化的材料糖化；
(b)使用发酵生物体进行发酵。
66.根据段落65所述的方法，其中所述纤维素分解组合物源自里氏木霉、特异腐质霉或Chrysosporium lucknowense。
67.根据段落65或66所述的方法，其中所述纤维素分解组合物包括β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。
68.根据段落65-67中任一项所述的方法，其中含有β-葡糖苷酶的纤维素分解组合物的相对ED50装载值小于1.00，优选小于0.80，例如优选小于0.60，例如在0.1-0.9之间，例如在0.2-0.8之间，例如0.30-0.70。
69.根据段落65-68中任一项所述的方法，其中所述糖源生成酶为葡糖淀粉酶，优选为葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的组合。
70.根据段落69所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶为真菌来源，优选来自曲霉属的菌株，优选为黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉；或来自木霉属的菌株，优选为里氏木霉；或来自踝节菌属的菌株，优选为埃莫森踝节菌。
71.根据段落69或70所述的方法，其中所述α-淀粉酶来源于根毛霉属的菌株，优选为微小根毛霉的菌株，或来源于多孔菌属的菌株，优选为巨多孔菌的菌株。
72.根据段落65-71中任一项所述的方法，其中所述β-葡糖苷酶来自曲霉属菌株，例如烟曲霉菌株，例如烟曲霉β-葡糖苷酶(本文中SEQ ID NO:6)，其包括一个或多个选自L89M、G91L、F100D、I140V、I186V、S283G、N456E和F512Y的取代；或其具有以下取代的变体：
-F100D+S283G+N456E+F512Y；
-L89M+G91L+I186V+I140V；
-I186V+L89M+G91L+I140V+F100D+S283G+N456E+F512Y。
73.根据段落65-72中任一项所述的方法，其中所述β-葡糖苷酶与本文中的SEQ IDNO:6具有至少60％的同一性，例如至少70％，例如至少80％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％的同一性。
74.根据段落65-73任一项所述的方法，其中所述β-葡糖苷酶变体与本文中的SEQID NO:6具有至少60％的同一性，例如至少70％，例如至少80％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％，但低于100％的同一性。
75.根据段落65-74中任一项所述的方法，其中在发酵过程中存在一种或多种纤维二糖水解酶(CBH)，例如纤维二糖水解酶I和/或纤维二糖水解酶II。
76.根据段落75所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶I(CBH I)为来源于曲霉属菌株的一种，例如烟曲霉菌株，例如在WO 2011/057140中的SEQ ID NO:26或本文中的SEQID NO:2公开的Cel7a CBHI，或来源于木霉属菌株，例如里氏木霉菌株。
77.根据段落65-76中任一项所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶II(CBH II)为来源于曲霉属菌株的一种，例如烟曲霉菌株；例如本文中公开为SEQ ID NO:4的那种，或来源于木霉属菌株，例如里氏木霉，或来源于梭孢壳属菌株，例如土生梭孢霉菌株，例如来自土生梭孢霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。
78.根据段落65-77中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解组合物来源于里氏木霉，并进一步包括以下中的一种或多种：
(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I，优选为本文中SEQ ID NO:2所示者；
(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II，优选为本文中SEQ ID NO:4所示者；
(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶变体，具有下列取代：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用本文中SEQ ID NO:6进行编号)。
79.根据段落65-78中任一项所述的方法，其中在发酵、或同步或相继的糖化和发酵过程中存在或加入海藻糖酶。
80.根据段落79所述的方法，其中所述海藻糖酶来源于里氏木霉。
81.根据段落79或80所述的方法，其中所述海藻糖酶以5-1,000μg/g DS，例如7-500μg/g DS，例如10-250μg/g DS的量存在或加入。
82.根据段落65-81中任一项所述的方法，其中糖化和发酵同步或相继地进行。
83.根据段落65-82中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解组合物中的半纤维素酶含量低于所述纤维素分解组合物的10wt.％，如低于5wt.％。
84.根据段落65-83中任一项所述的方法，包括：
(i)在低于初始糊化温度的温度下使用糖源生成酶将含淀粉材料糖化；和
(ii)使用发酵生物体在纤维素分解组合物的存在下进行发酵，该纤维素分解组合物包括选自以下的一种或多种多肽：
-具有纤维素分解增强活性的GH61多肽；
-β-葡糖苷酶；
-纤维二糖水解酶I；
-纤维二糖水解酶II；
或其两种、三种或四种的混合物。
85.根据段落84所述的方法，其中所述纤维素分解组合物来源于里氏木霉、特异腐质霉或Chrysosporium lucknowense。
86.根据段落84或85所述的方法，其中所述纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶，优选源自曲霉属菌株的一种，例如源自米曲霉，例如在WO 2002/095014中公开的那种，或在WO2008/057637中公开的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或源自烟曲霉，例如在WO 2005/047499中公开的或本文中SEQ ID NO:6的那种，或在WO 2012/044915中公开的烟曲霉β-葡糖苷酶变体；或源于青霉属菌株，如在WO 2007/019442中公开的Penicillium brasilianum菌株，或源于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株。
87.根据段落84-86中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，例如源自嗜热子囊菌属的一种，例如黄嗜热子囊菌菌株，例如在WO 2005/074656中描述为SEQ ID NO:2的那种；或源自梭孢壳属的一种，例如土生梭孢霉菌株，例如在WO 2005/074647中描述为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的那种；或源自曲霉属菌株的一种，例如烟曲霉菌株，例如在WO 2010/138754中描述为SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2的那种；或源自青霉属菌株的一种，例如Penicillium emersonii菌株，例如在WO2011/041397公开的或本文中SEQ ID NO:8的那种。
88.根据段落84-87中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解组合物包括纤维二糖水解酶I(CBH I)，例如源自曲霉属菌株的一种，例如烟曲霉菌株，例如本文中的SEQ IDNO:2，例如在WO 2011/057140中的SEQ ID NO:6公开的Cel7a CBHI，或木霉属的菌株，例如里氏木霉菌株。
89.根据段落84-88中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解组合物包括纤维二糖水解酶II(CBH II)，例如源自曲霉属菌株的一种，例如烟曲霉菌株，例如本文中的SEQ IDNO:4；或源自木霉属的菌株，例如里氏木霉，或源自梭孢壳属的菌株，例如土生梭孢霉菌株，例如来自土生梭孢霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。
90.根据段落84-89中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和β-葡糖苷酶。
91.根据段落84-90中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽和β-葡糖苷酶。
92.根据段落84-91中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶和CBH I。
93.根据段落84-92中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、CBH I和CBH II。
94.根据段落84-93中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解组合物为里氏木霉纤维素分解组合物，其进一步包括具有纤维素分解增强活性的黄嗜热子囊菌GH61A多肽(WO2005/074656中的SEQ ID NO:2)和米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)。
95.根据段落84-94中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解组合物为里氏木霉纤维素分解组合物，其进一步包括具有纤维素分解增强活性的黄嗜热子囊菌GH61A多肽(WO2005/074656中的SEQ ID NO:2)和烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2)或本文的SEQ ID NO:6。
96.根据段落84-95中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解组合物为里氏木霉纤维素分解组合物，其进一步包括在WO 2011/041397中公开的具有纤维素分解增强活性的Penicillium emersonii GH61A多肽以及烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ IDNO:2)或本文中的SEQ ID NO:6，或其具有下列取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y。
97.根据段落84-96中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解组合物包括以下组分中的一种或多种：
(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；
(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；
(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；和
(iv)具有纤维素分解增强活性的青霉物种GH61多肽；或其同源物。
98.根据段落84-97中任一项所述的方法，其中所述纤维分解组合物的剂量为0.0001-3mg EP/g DS，优选为0.0005-2mg EP/g DS，优选为0.001-1mg/g DS，更优选为0.005-0.5mg EP/g DS，甚至更优选为0.01-0.1mg EP/g DS。
99.根据段落84-98中任一项所述的方法，其中在糖化和/或发酵过程中存在α-淀粉酶，例如真菌α-淀粉酶，例如酸性真菌α-淀粉酶。
100.根据段落84-99中任一项所述的方法，其中α-淀粉酶活性来自真菌α-淀粉酶，优选源自曲霉属，特别是黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉或川地曲霉的菌株。
101.根据段落84-100中任一项所述的方法，其中α-淀粉酶活性来自野生型α-淀粉酶或其包括一个或多个淀粉结合域(SBD)的变体。
102.根据段落84-101中任一项所述的方法，其中α-淀粉酶活性来自来源于根毛霉属的菌株，优选为微小根毛霉的菌株，或来源于多孔菌属的菌株，优选为巨多孔菌的菌株的α-淀粉酶。
103.根据段落84-102中任一项所述的方法，其中α-淀粉酶活性来自包括一个或多个淀粉结合域(SBD)的杂合体α-淀粉酶。
104.根据段落84-103中任一项所述的方法，其中α-淀粉酶源自微小根毛霉且具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD或川地曲霉α-淀粉酶接头和SBD。
105.根据段落84-104中任一项所述的方法，其中α-淀粉酶活性来自选自具有催化域JA118和罗耳阿太菌SBD的真菌淀粉酶变体、具有罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶、具有罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的巨多孔菌α-淀粉酶或具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶的杂合体α-淀粉酶。
106.根据段落84-105中任一项所述的方法，其中在糖化和/或发酵过程中存在糖源生成酶。
107.根据段落106所述的方法，其中糖源生成酶为葡糖淀粉酶，例如真菌来源的葡糖淀粉酶，例如均在WO 2006/069289中公开的瓣环栓菌、纸质大纹饰孢菌；和大白桩菇；或在WO2007/124285中公开的红边隔孢伏革菌；或其混合物。
108.根据段落84-107中任一项所述的方法，其中烟曲霉纤维二糖水解酶I或其同源物选自：
(i)包含本文中SEQ ID NO:2的成熟多肽的纤维二糖水解酶I；
(ii)包含与本文中SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的纤维二糖水解酶I；
(iii)由包含与本文中SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶I；和
(iv)由在至少高严格条件下例如极高严格条件下与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补物杂交的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶I。
108.根据段落84-107中任一项所述的方法，其中所述烟曲霉纤维二糖水解酶II或其同源物选自：
(i)包含本文中SEQ ID NO:4的成熟多肽的纤维二糖水解酶II；
(ii)包含与本文中SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的纤维二糖水解酶II；
(iii)由包含与本文中SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶II；和
(iv)由在至少高严格条件下例如极高严格条件下与本文中SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列或其全长互补物杂交的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶II。
109.根据段落84-108中任一项所述的方法，其中所述烟曲霉β-葡糖苷酶或其同源物选自：
(i)包含本文中SEQ ID NO:6的成熟多肽的β-葡糖苷酶；
(ii)包含与本文中SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的β-葡糖苷酶；
(iii)由包含与本文中SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列的多核苷酸所编码的β-葡糖苷酶；和
(iv)由在至少高严格条件下，例如极高严格条件下与本文中SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或其全长互补物杂交的多核苷酸所编码的β-葡糖苷酶。
110.根据段落84-109中任一项所述的方法，其中β-葡糖苷酶变体在与本文中SEQID NO:6的成熟多肽的位置100、283、456和512对应的一个或更多(几个)位置上包含取代。
111.根据段落84-110中任一项所述的方法，其中变体的亲本β-葡糖苷酶为(a)包含本文中SEQ ID NO:6的成熟多肽的多肽；(b)与本文中SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少80％序列同一性的多肽；(c)由在高严格条件或极高严格条件下与以下物质杂交的多核苷酸所编码的多肽：(i)本文中SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列，(ii)包含在本文中SEQ IDNO:5的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(d)由与本文中SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80％同一性的多核苷酸所编码的多肽；或(e)本文中SEQ ID NO:6的成熟多肽的片段，其具有β-葡糖苷酶活性。
112.根据段落109-111中任一项所述的方法，其中变体与亲本β-葡糖苷酶的氨基酸序列具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的序列同一性。
113.根据段落109-112中任一项所述的方法，其中变体与本文中SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少80％的序列同一性，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的序列同一性。
114.根据段落109-113中任一项所述的方法，其中取代的数目为1至4之间，例如1、2、3或4个取代。
115.根据段落109-114中任一项所述的方法，其中变体包含在与位置100对应的位置上的取代，与位置283对应的位置上的取代，与位置456对应的位置上的取代，和/或与位置512对应的位置上的取代。
116.根据段落61-66中任一项所述的方法，其中变体在本文中的SEQ ID NO:6中包含Phe100Asp、Ser283Gly、Asn456Glu、Phe512Tyr。
117.根据段落84-116中任一项所述的方法，其中含有β-葡糖苷酶的纤维素分解组合物的相对ED50装载值小于1.00，优选小于0.80，例如优选小于0.60，例如在0.1-0.9之间，例如在0.2-0.8之间，例如0.30-0.70。
118.根据段落84-117中任一项所述的方法，其中具有纤维素分解增强活性的青霉物种GH61多肽或其同源物选自：
(i)包含本文中SEQ ID NO:8的成熟多肽的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽；
(ii)包含与本文中SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽；
(iii)由包含与本文中SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列的多核苷酸所编码的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽；和
(iv)由在至少高严格条件下例如极高严格条件下与本文中SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列或其全长互补物杂交的多核苷酸所编码的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。
119.根据段落118所述的方法，其进一步包括一种或多种选自纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、酯酶、扩展蛋白、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素的酶。
120.根据段落119所述的方法，其中纤维素酶为一种或多种选自内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶的酶。
121.根据段落120所述的方法，其中内切葡聚糖酶为内切葡聚糖酶I。
122.根据段落120所述的方法，其中内切葡聚糖酶为内切葡聚糖酶II。
123.根据段落84-122中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解组合物包括以下组分中的一种或多种：
(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；
(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；
(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶或其变体；和
(iv)具有纤维素分解增强活性的青霉物种GH61多肽；或其同源物。
124.根据段落84-123中任一项所述的方法，其中糖化和发酵分开或同步(即作为一步法)进行。
125.根据段落84-124中任一项所述的方法，其中在发酵后回收发酵产物。
126.根据段落84-125中任一项所述的方法，其中所述含淀粉材料为植物材料，选自玉米(玉蜀黍)、穗轴、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、菜豆、甘薯或其混合物，优选为玉米。
127.根据段落84-126中任一项所述的方法，其中所述含淀粉材料为粒状淀粉。
128.根据段落84-1271中任一项所述的方法，其中所述方法在范围为3至7的pH下进行，优选为3至6，或更优选为3.5至5.0。
129.根据段落84-128中任一项所述的方法，其中干固形物含量(DS)在20-55wt.-％的范围内，优选为25-45wt.-％，更优选为30-40wt.-％或30-45wt-％。
130.根据段落84-1293中任一项所述的方法，其中糖化和发酵过程中的糖浓度保持在低于约6wt.-％、优选3wt.-％的水平下，特别是低于0.25wt.-％。
131.根据段落84-130中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前制备粒度和水分降低的包含含淀粉材料的浆料。
132.根据段落84-131中任一项所述的方法，其中通过降低含淀粉材料的粒度，优选地通过研磨，使含淀粉材料的至少50％具有0.1-0.5mm的粒度，来制备含淀粉材料。
133.根据段落84-132中任一项所述的方法，其中使含淀粉的植物材料的粒度降低，例如通过干磨或湿磨或使用粒度乳化技术。
134.根据段落84-133中任一项所述的方法，其中发酵进行30至150小时，优选48至96小时。
135.根据段落84-134中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中的发酵过程中或步骤(i)和(ii)中的同步糖化和发酵过程中的温度在25℃和40℃之间，优选为28℃和36℃之间，例如28℃和35℃之间，例如28℃和34℃之间，例如约32℃。
136.根据段落84-135中任一项所述的方法，其中在糖化和/或发酵过程中还存在蛋白酶。
137.根据段落84-136中任一项所述的方法，其中在糖化和/或发酵之前和/或过程中加入逆流。
138.根据段落84-137中任一项所述的方法，其中在糖化和/或发酵之前和/或过程中加入氮源。
139.根据段落84-138中任一项所述的方法，其中葡糖淀粉酶以0.001-10AGU/gDS，优选0.01-5AGU/g DS，特别是0.1-0.5AGU/g DS的量存在。
140.根据段落84-139中任一项所述的方法，其中发酵产物为醇，优选为乙醇，特别是燃料乙醇、饮用乙醇和/或工业乙醇。
141.根据段落84-140中任一项所述的方法，其中所述纤维素分解组合物中的半纤维素酶含量低于所述纤维素分解组合物的10wt.％，如低于5wt.％。
142.根据段落1-141中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶源自黄嗜热子囊菌CGMCC No.0670(归类为EC 3.4.24.39)(在下文“蛋白酶”部分中公开并示于本文中SEQ IDNO:13)或与本文中SEQ ID NO:13至少60％等同，例如至少70％，例如至少80％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％等同的蛋白酶。
143.根据段落1-142中任一项所述的方法，所述纤维分解组合物的剂量为0.0001-3mg EP/g DS，优选为0.0005-2mg EP/g DS，优选为0.001-1mg/g DS，更优选为0.005-0.5mgEP/g DS，甚至更优选为0.01-0.1mg EP/g DS。
144.根据段落1-143中任一项所述的方法，其中发酵生物体源自酵母属的菌株，例如酿酒酵母菌。
145.一种将全酒糟脱水的方法，包括
(a)使用α-淀粉酶将含淀粉材料液化；
任选地，在步骤(b)之前对液化的材料进行预糖化；
(b)将液化的材料糖化；
(c)使用发酵生物体进行发酵；
(d)将发酵材料分离成发酵产物和全酒糟；
(e)对全酒糟进行脱水；
其中，在该任选的预糖化步骤、糖化步骤(b)和/或发酵步骤(c)、或同步糖化和发酵过程中存在或加入糖源生成酶和/或纤维素分解组合物。
146.根据段落145所述的方法，其中步骤(a)-(c)根据段落1-144中所限定的进行。
147.根据段落145或146的方法，其中通过蒸馏从发酵材料回收发酵产物。
148.根据权利要求145-147中任一项所述的方法，其中含有β-葡糖苷酶的纤维素分解组合物的相对ED50装载值小于1.00，优选小于0.80，例如优选小于0.60，例如在0.1-0.9之间，例如在0.2-0.8之间，例如0.30-0.70。
149.根据段落145-148中任一项所述的方法，其中纤维素分解组合物以1-500，例如10-400，例如25-300，例如50-200微克/g DS的量加入。
150.根据段落145-149中任一项所述的方法，其中蛋白酶与糖源生成酶和纤维素分解组合物一起加入，蛋白酶为例如源自黄嗜热子囊菌的蛋白酶，或与本文中的SEQ IDNO:13至少60％等同，例如至少70％，例如至少80％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％等同的蛋白酶。
151.根据段落145-150中任一项所述的方法，其中纤维素分解组合物直接加入全酒糟。
152.根据段落151所述的方法，包括以下步骤：
i)将全酒糟用纤维素分解组合物例如如段落2-64中任一项所限定的酶进行处理；
ii)将该材料分离成固体部分和液体部分。
153.根据段落145-152中任一项所述的方法，其中发酵生物体源自酵母属的菌株，例如酿酒酵母菌。

Claims (231)

1.一种生产发酵产物的方法，包括
(a)使用α-淀粉酶将含淀粉材料液化；
(b)将液化的材料糖化；
(c)使用发酵生物体进行发酵；
其中，在糖化步骤(b)、发酵步骤(c)、或同步糖化和发酵过程中存在或加入糖源生成酶和包括与SEQ ID NO:6具有至少99％序列同一性且具有小于1.00的相对ED50装载值的β-葡糖苷酶的纤维素分解组合物，
其中所述β-葡糖苷酶源自烟曲霉菌株且包括选自以下的取代组合：
-F100D+S283G+N456E+F512Y；
-L89M+G91L+I186V+I140V；
-I186V+L89M+G91L+I140V+F100D+S283G+N456E+F512Y。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维素分解组合物源自里氏木霉、特异腐质霉或Chrysosporium lucknowense。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维素分解组合物包括β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其中含有β-葡糖苷酶的纤维素分解组合物的相对ED50装载值小于0.80。
5.根据权利要求4所述的方法，其中含有β-葡糖苷酶的纤维素分解组合物的相对ED50装载值小于0.60。
6.根据权利要求1所述的方法，其中含有β-葡糖苷酶的纤维素分解组合物的相对ED50装载值在0.1-0.9之间。
7.根据权利要求6所述的方法，其中含有β-葡糖苷酶的纤维素分解组合物的相对ED50装载值在0.2-0.8之间。
8.根据权利要求6所述的方法，其中含有β-葡糖苷酶的纤维素分解组合物的相对ED50装载值在0.30-0.70之间。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述糖源生成酶为葡糖淀粉酶。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述糖源生成酶为葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的组合。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶为真菌来源。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶来自曲霉属的菌株、来自木霉属的菌株或来自踝节菌属的菌株。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶来自黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉的菌株。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶来自里氏木霉的菌株。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶来自埃莫森踝节菌的菌株。
16.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述α-淀粉酶来源于根毛霉属的菌株，或来源于多孔菌属的菌株。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述α-淀粉酶来源于微小根毛霉的菌株。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述α-淀粉酶来源于巨多孔菌的菌株。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述α-淀粉酶来源于微小根毛霉，并具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合域(SBD)，且包括下列至少一个取代或取代的组合：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192RV410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C，使用SEQ ID NO:11进行编号。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维素分解组合物中的半纤维素酶含量低于所述纤维素分解组合物的10wt.％。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述纤维素分解组合物中的半纤维素酶含量低于所述纤维素分解组合物的5wt.％。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述β-葡糖苷酶为由SEQ ID NO:6经以下取代组合获得的烟曲霉β-葡糖苷酶变体：
-F100D+S283G+N456E+F512Y；
-L89M+G91L+I186V+I140V；或
-I186V+L89M+G91L+I140V+F100D+S283G+N456E+F512Y。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述β-葡糖苷酶是与SEQ ID NO:6具有至少99％，但低于100％同一性的变体。
24.根据权利要求1所述的方法，其中在发酵过程中存在一种或多种纤维二糖水解酶(CBH)。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述一种或多种纤维二糖水解酶为纤维二糖水解酶I和/或纤维二糖水解酶II。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶I(CBH I)为来源于曲霉属菌株，或来源于木霉属菌株的一种。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶I(CBH I)为来源于烟曲霉菌株的一种。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶I(CBH I)为SEQ ID NO:2所示的Cel7a CBHI。
29.根据权利要求26所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶I(CBH I)为来源于里氏木霉菌株的一种。
30.根据权利要求25所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶II(CBH II)为来源于曲霉属菌株，或来源于木霉属菌株，或来源于梭孢壳属菌株的一种。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶II(CBH II)为来源于烟曲霉菌株的一种。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶II(CBH II)为SEQ ID NO:4所示的那种。
33.根据权利要求30所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶II(CBH II)为来源于里氏木霉菌株的一种。
34.根据权利要求30所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶II(CBH II)为来源于土生梭孢霉菌株的一种。
35.根据权利要求30所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶II(CBH II)为来自土生梭孢霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。
36.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维素分解组合物来源于里氏木霉，并进一步包括以下中的一种或多种：
(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；
(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；
(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶变体，其是由SEQ ID NO:6经下列取代组合获得的变体：F100D、S283G、N456E、和F512Y。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述烟曲霉纤维二糖水解酶I为SEQ ID NO:2所示者。
38.根据权利要求36所述的方法，其中烟曲霉纤维二糖水解酶II为SEQ ID NO:4所示者。
39.根据权利要求1所述的方法，其中在发酵、预糖化、或同步或相继的糖化和发酵过程中存在或加入海藻糖酶。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述海藻糖酶来源于木霉。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述海藻糖酶来源于里氏木霉。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述海藻糖酶为SEQ ID NO:12所示的里氏木霉海藻糖酶。
43.根据权利要求39所述的方法，其中所述海藻糖酶以5-1,000μg/g DS的量存在或加入。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述海藻糖酶以7-500μg/gDS的量存在或加入。
45.根据权利要求43所述的方法，其中所述海藻糖酶以10-250μg/g DS的量存在或加入。
46.根据权利要求1所述的方法，进一步包括通过将发酵材料分离成液体部分，即发酵产物，以及固体部分，即全酒糟，来回收发酵产物。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述液体部分是乙醇。
48.根据权利要求46所述的方法，其中回收步骤通过蒸馏来进行。
49.根据权利要求46所述的方法，另外其中将固体部分即全酒糟脱水，并分离成固相即湿滤饼和液相即稀酒糟。
50.根据权利要求49所述的方法，其中分离步骤通过离心来进行。
51.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维素分解组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽为源自嗜热子囊菌属的一种、或源自梭孢壳属的一种、或源自曲霉属菌株的一种、或源自青霉属菌株的一种。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽为源自黄嗜热子囊菌菌株的一种。
54.根据权利要求52所述的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽为源自土生梭孢霉菌株的一种。
55.根据权利要求52所述的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽为源自烟曲霉菌株的一种。
56.根据权利要求52所述的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽为源自Penicillium emersonii菌株的一种。
57.根据权利要求52所述的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽为SEQID NO:8所示的那种。
58.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维素分解组合物包含纤维二糖水解酶I(CBH I)。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶I为源自曲霉属菌株或木霉属菌株的一种。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶I为源自烟曲霉菌株的一种。
61.根据权利要求59所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶I为SEQ ID NO:2所示的Cel7a CBHI。
62.根据权利要求59所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶I为源自里氏木霉菌株的一种。
63.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维素分解组合物包括纤维二糖水解酶II(CBH II)。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶II为源自曲霉属菌株、或源自木霉属的菌株或源自梭孢壳属的菌株的一种。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶II为源自烟曲霉菌株的一种。
66.根据权利要求64所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶II为SEQ ID NO:4所示的那种。
67.根据权利要求64所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶II为源自里氏木霉的一种。
68.根据权利要求64所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶II为源自土生梭孢霉菌株的一种。
69.根据权利要求64所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶II为来自土生梭孢霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。
70.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维素分解组合物为里氏木霉纤维素分解组合物，其进一步包括SEQ ID NO:8所示的具有纤维素分解增强活性的Penicilliumemersonii GH61A多肽以及由SEQ ID NO:6经下列取代组合获得的烟曲霉β-葡糖苷酶变体：F100D、S283G、N456E、和F512Y。
71.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维分解组合物的剂量为0.0001-3mg EP/gDS。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述纤维分解组合物的剂量为0.0005-2mg EP/gDS。
73.根据权利要求71所述的方法，其中所述纤维分解组合物的剂量为0.001-1mg EP/gDS。
74.根据权利要求71所述的方法，其中所述纤维分解组合物的剂量为0.005-0.5mg EP/g DS。
75.根据权利要求71所述的方法，其中所述纤维分解组合物的剂量为0.01-0.1mg EP/gDS。
76.根据权利要求1所述的方法，其中在液化步骤(a)过程中使用的α-淀粉酶是细菌来源。
77.根据权利要求76所述的方法，其中在液化步骤(a)过程中使用的α-淀粉酶源自芽孢杆菌属菌株。
78.根据权利要求76所述的方法，其中在液化步骤(a)过程中使用的α-淀粉酶源自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株或嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)。
79.根据权利要求1所述的方法，其中所述糖源生成酶为葡糖淀粉酶。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述糖源生成酶为真菌来源的葡糖淀粉酶。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述糖源生成酶来自曲霉属的菌株，或木霉属的菌株，或踝节菌属的菌株，或密孔菌属(pycnoporus)的菌株，或Gloephyllum的菌株，或Nigrofomes的菌株。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述糖源生成酶来自黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉。
83.根据权利要求81所述的方法，其中所述糖源生成酶来自里氏木霉。
84.根据权利要求81所述的方法，其中所述糖源生成酶来自埃莫森踝节菌。
85.根据权利要求58所述的方法，其中所述烟曲霉纤维二糖水解酶I或其同源物选自：
(i)由SEQ ID NO:2的成熟多肽组成的纤维二糖水解酶I；
(ii)由与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少99％同一性的氨基酸序列组成的纤维二糖水解酶I，所述纤维二糖水解酶I源自烟曲霉；
(iii)由以与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少99％同一性的核苷酸序列组成的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶I，所述纤维二糖水解酶I源自烟曲霉。
86.根据权利要求63所述的方法，其中所述烟曲霉纤维二糖水解酶II或其同源物选自：
(i)由SEQ ID NO:4的成熟多肽组成的纤维二糖水解酶II；
(ii)由与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少99％同一性的氨基酸序列组成的纤维二糖水解酶II，所述纤维二糖水解酶II源自烟曲霉；
(iii)由以与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少99％同一性的核苷酸序列组成的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶II，所述纤维二糖水解酶II源自烟曲霉。
87.根据权利要求51所述的方法，其中具有纤维素分解增强活性的青霉物种GH61多肽或其同源物选自：
(i)由SEQ ID NO:8的成熟多肽组成的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽；
(ii)由与SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少99％同一性的氨基酸序列组成的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，所述GH61多肽源自Penicillium emersonii；
(iii)由以与SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列具有至少99％同一性的核苷酸序列组成的多核苷酸所编码的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，所述GH61多肽源自Penicillium emersonii。
88.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括一种或多种选自纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、酯酶、扩展蛋白(expansin)、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素(swollenin)的酶。
89.一种生产发酵产物的方法，包括
(a)将含淀粉材料糖化；
(b)使用发酵生物体进行发酵，
其中，在糖化步骤(b)、发酵步骤(c)或同步糖化和发酵过程中存在或加入糖源生成酶和包括与SEQ ID NO:6具有至少99％序列同一性且具有小于1.00的相对ED50装载值的β-葡糖苷酶的纤维素分解组合物，
其中所述β-葡糖苷酶源自烟曲霉菌株且包括选自以下的取代组合：
-F100D+S283G+N456E+F512Y；
-L89M+G91L+I186V+I140V；
-I186V+L89M+G91L+I140V+F100D+S283G+N456E+F512Y。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述纤维素分解组合物源自里氏木霉、特异腐质霉或Chrysosporium lucknowense。
91.根据权利要求89所述的方法，其中所述纤维素分解组合物包括β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。
92.根据权利要求89所述的方法，其中含有β-葡糖苷酶的纤维素分解组合物的相对ED50装载值小于0.80。
93.根据权利要求92所述的方法，其中含有β-葡糖苷酶的纤维素分解组合物的相对ED50装载值小于0.60。
94.根据权利要求89所述的方法，其中含有β-葡糖苷酶的纤维素分解组合物的相对ED50装载值在0.1-0.9之间。
95.根据权利要求94所述的方法，其中含有β-葡糖苷酶的纤维素分解组合物的相对ED50装载值在0.2-0.8之间。
96.根据权利要求94所述的方法，其中含有β-葡糖苷酶的纤维素分解组合物的相对ED50装载值在0.30-0.70之间。
97.根据权利要求89所述的方法，其中所述糖源生成酶为葡糖淀粉酶。
98.根据权利要求89所述的方法，其中所述糖源生成酶为葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的组合。
99.根据权利要求97或98所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶为真菌来源。
100.根据权利要求99所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶来自曲霉属的菌株；或来自木霉属的菌株；或来自踝节菌属的菌株。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶来自黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉。
102.根据权利要求100所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶来自里氏木霉。
103.根据权利要求100所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶来自埃莫森踝节菌。
104.根据权利要求98所述的方法，其中所述α-淀粉酶来源于根毛霉属的菌株，或来源于多孔菌属的菌株。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述α-淀粉酶来源于微小根毛霉的菌株。
106.根据权利要求104所述的方法，其中所述α-淀粉酶来源于巨多孔菌的菌株。
107.根据权利要求89所述的方法，其中所述β-葡糖苷酶为由SEQ ID NO:6经以下取代组合获得的烟曲霉β-葡糖苷酶变体：
-F100D+S283G+N456E+F512Y；
-L89M+G91L+I186V+I140V；或
-I186V+L89M+G91L+I140V+F100D+S283G+N456E+F512Y。
108.根据权利要求89所述的方法，其中所述β-葡糖苷酶是与SEQ ID NO:6具有至少99％，但低于100％的同一性的变体。
109.根据权利要求89所述的方法，其中在发酵过程中存在一种或多种纤维二糖水解酶(CBH)。
110.根据权利要求109所述的方法，其中所述一种或多种纤维二糖水解酶为纤维二糖水解酶I和/或纤维二糖水解酶II。
111.根据权利要求110所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶I(CBH I)为来源于曲霉属菌株或来源于木霉属菌株的一种。
112.根据权利要求111所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶I(CBH I)为来源于烟曲霉菌株的一种。
113.根据权利要求111所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶I(CBH I)为SEQ ID NO:2所示的Cel7a CBHI。
114.根据权利要求111所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶I(CBH I)为来源于里氏木霉菌株的一种。
115.根据权利要求110所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶II(CBH II)为来源于曲霉属菌株，或来源于木霉属菌株，或来源于梭孢壳属菌株的一种。
116.根据权利要求115所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶II为来源于烟曲霉菌株的一种。
117.根据权利要求115所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶II为SEQ ID NO:4所示的那种。
118.根据权利要求115所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶II为来源于里氏木霉菌株的一种。
119.根据权利要求115所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶II为来源于土生梭孢霉菌株的一种。
120.根据权利要求115所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶II为来自土生梭孢霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。
121.根据权利要求89所述的方法，其中所述纤维素分解组合物来源于里氏木霉，并进一步包括以下中的一种或多种：
(i)烟曲霉纤维二糖水解酶I；
(ii)烟曲霉纤维二糖水解酶II；
(iii)烟曲霉β-葡糖苷酶变体，其是由SEQ ID NO:6经下列取代组合获得的变体：F100D、S283G、N456E、和F512Y。
122.根据权利要求121所述的方法，其中所述烟曲霉纤维二糖水解酶I为SEQ ID NO:2所示者。
123.根据权利要求121所述的方法，其中所述烟曲霉纤维二糖水解酶II为SEQ ID NO:4所示者。
124.根据权利要求89所述的方法，其中在发酵、或同步的糖化和发酵过程中存在或加入海藻糖酶。
125.根据权利要求124所述的方法，其中所述海藻糖酶来源于里氏木霉。
126.根据权利要求124所述的方法，其中所述海藻糖酶以5-1,000μg/g DS的量存在或加入。
127.根据权利要求126所述的方法，其中所述海藻糖酶以7-500μg/g DS的量存在或加入。
128.根据权利要求126所述的方法，其中所述海藻糖酶以10-250μg/g DS的量存在或加入。
129.根据权利要求89所述的方法，其中所述纤维素分解组合物中的半纤维素酶含量低于所述纤维素分解组合物的10wt.％。
130.根据权利要求129所述的方法，其中所述纤维素分解组合物中的半纤维素酶含量低于所述纤维素分解组合物的5wt.％。
131.根据权利要求89所述的方法，其中所述纤维素分解组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。
132.根据权利要求131所述的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽为源自嗜热子囊菌属的一种；或源自梭孢壳属的一种；或源自曲霉属菌株的一种；或源自青霉属菌株的一种。
133.根据权利要求132所述的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽为源自黄嗜热子囊菌菌株的一种。
134.根据权利要求132所述的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽为源自土生梭孢霉菌株的一种。
135.根据权利要求132所述的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽为源自烟曲霉菌株的一种。
136.根据权利要求132所述的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽为源自Penicillium emersonii菌株的一种。
137.根据权利要求132所述的方法，其中所述具有纤维素分解增强活性的GH61多肽为SEQ ID NO:8所示的那种。
138.根据权利要求89所述的方法，其中所述纤维素分解组合物包括纤维二糖水解酶I(CBH I)。
139.根据权利要求138所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶I为源自曲霉属菌株或木霉属的菌株的一种。
140.根据权利要求139所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶I为源自烟曲霉菌株的一种。
141.根据权利要求139所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶I示于SEQ ID NO:2。
142.根据权利要求139所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶I为源自里氏木霉菌株的一种。
143.根据权利要求89所述的方法，其中所述纤维素分解组合物包括纤维二糖水解酶II(CBH II)。
144.根据权利要求143所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶II为源自曲霉属菌株、或源自木霉属的菌株、或源自梭孢壳属的菌株的一种。
145.根据权利要求144所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶II为源自烟曲霉菌株的一种。
146.根据权利要求144所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶II示于SEQ ID NO:4。
147.根据权利要求144所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶II为源自里氏木霉菌株的一种。
148.根据权利要求144所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶II为源自土生梭孢霉菌株的一种。
149.根据权利要求144所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶II为来自土生梭孢霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。
150.根据权利要求89所述的方法，其中所述纤维素分解组合物为里氏木霉纤维素分解组合物，其进一步包括SEQ ID NO:6经下列取代组合获得的烟曲霉β-葡糖苷酶变体：F100D、S283G、N456E、和F512Y。
151.根据权利要求89所述的方法，其中所述纤维分解组合物的剂量为0.0001-3mg EP/g DS。
152.根据权利要求151所述的方法，其中所述纤维分解组合物的剂量为0.0005-2mgEP/g DS。
153.根据权利要求151所述的方法，其中所述纤维分解组合物的剂量为0.001-1mg EP/g DS。
154.根据权利要求151所述的方法，其中所述纤维分解组合物的剂量为0.005-0.5mgEP/g DS。
155.根据权利要求151所述的方法，其中所述纤维分解组合物的剂量为0.01-0.1mgEP/g DS。
156.根据权利要求97所述的方法，其中在糖化和/或发酵过程中存在α-淀粉酶。
157.根据权利要求156所述的方法，其中在糖化和/或发酵过程中存在真菌α-淀粉酶。
158.根据权利要求156所述的方法，其中在糖化和/或发酵过程中存在酸性真菌α-淀粉酶。
159.根据权利要求97所述的方法，其中α-淀粉酶活性来自真菌α-淀粉酶。
160.根据权利要求159所述的方法，其中所述真菌α-淀粉酶源自曲霉属。
161.根据权利要求160所述的方法，其中所述真菌α-淀粉酶源自黑曲霉、米曲霉、泡盛曲霉或川地曲霉的菌株。
162.根据权利要求97所述的方法，其中α-淀粉酶活性来自野生型α-淀粉酶或其包括一个或多个淀粉结合域(SBD)的变体。
163.根据权利要求97所述的方法，其中α-淀粉酶活性来自来源于根毛霉属的菌株，或来源于多孔菌属的菌株的α-淀粉酶。
164.根据权利要求163所述的方法，其中所述α-淀粉酶来源自微小根毛霉的菌株。
165.根据权利要求163所述的方法，其中所述α-淀粉酶来源自巨多孔菌的菌株。
166.根据权利要求97所述的方法，其中α-淀粉酶活性来自包括一个或多个淀粉结合域(SBD)的杂合体α-淀粉酶。
167.根据权利要求97所述的方法，其中α-淀粉酶源自微小根毛霉且具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD或川地曲霉α-淀粉酶接头和SBD。
168.根据权利要求97所述的方法，其中α-淀粉酶活性来自选自具有催化域JA118和罗耳阿太菌SBD的真菌淀粉酶变体、具有罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶、具有罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的巨多孔菌α-淀粉酶或具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶的杂合体α-淀粉酶。
169.根据权利要求89所述的方法，其中糖源生成酶为葡糖淀粉酶。
170.根据权利要求169所述的方法，其中糖源生成酶为真菌来源的葡糖淀粉酶。
171.根据权利要求111所述的方法，其中烟曲霉纤维二糖水解酶I或其同源物选自：
(i)由SEQ ID NO:2的成熟多肽组成的纤维二糖水解酶I；
(ii)由与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少99％同一性的氨基酸序列组成的纤维二糖水解酶I，所述纤维二糖水解酶I源自烟曲霉；
(iii)由以与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少99％同一性的核苷酸序列组成的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶I，所述纤维二糖水解酶I源自烟曲霉。
172.根据权利要求115所述的方法，其中所述烟曲霉纤维二糖水解酶II或其同源物选自：
(i)由SEQ ID NO:4的成熟多肽组成的纤维二糖水解酶II；
(ii)由与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少99％同一性的氨基酸序列组成的纤维二糖水解酶II，所述纤维二糖水解酶II源自烟曲霉；
(iii)由以与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少99％同一性的核苷酸序列组成的多核苷酸所编码的纤维二糖水解酶II，所述纤维二糖水解酶II源自烟曲霉。
173.根据权利要求131所述的方法，其中具有纤维素分解增强活性的青霉物种GH61多肽或其同源物选自：
(i)由SEQ ID NO:8的成熟多肽组成的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽；
(ii)由与SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少99％同一性的氨基酸序列组成的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，所述GH61多肽源自Penicillium emersonii；
(iii)由以与SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列具有至少99％同一性的核苷酸序列组成的多核苷酸所编码的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，所述GH61多肽源自Penicillium emersonii。
174.根据权利要求89所述的方法，其进一步包括一种或多种选自纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、酯酶、扩展蛋白、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素的酶。
175.根据权利要求89所述的方法，其中在发酵后回收发酵产物。
176.根据权利要求89所述的方法，其中所述含淀粉材料为植物材料，选自玉米、穗轴、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻、豌豆、菜豆、甘薯或其混合物。
177.根据权利要求176所述的方法，其中所述含淀粉材料为玉米。
178.根据权利要求89所述的方法，其中所述含淀粉材料为粒状淀粉。
179.根据权利要求89所述的方法，其中所述方法在范围为3至7的pH下进行。
180.根据权利要求179所述的方法，其中所述方法在范围为3至6的pH下进行。
181.根据权利要求179所述的方法，其中所述方法在范围为3.5至5.0的pH下进行。
182.根据权利要求89所述的方法，其中干固形物含量(DS)在20-55wt.-％的范围内。
183.根据权利要求182所述的方法，其中干固形物含量(DS)在25-45wt.-％的范围内。
184.根据权利要求182所述的方法，其中干固形物含量(DS)在30-40wt.-％的范围内。
185.根据权利要求182所述的方法，其中干固形物含量(DS)在30-45wt-％的范围内。
186.根据权利要求89所述的方法，其中糖化和发酵过程中的糖浓度保持在低于6wt.-％的水平下。
187.根据权利要求186所述的方法，其中糖化和发酵过程中的糖浓度保持在低于3wt.-％的水平下。
188.根据权利要求186所述的方法，其中糖化和发酵过程中的糖浓度保持在低于0.25wt.-％的水平下。
189.根据权利要求89所述的方法，其中在步骤(a)之前制备粒度和水分降低的包含含淀粉材料的浆料。
190.根据权利要求89所述的方法，其中通过降低含淀粉材料的粒度，使含淀粉材料的至少50％具有0.1-0.5mm的粒度，来制备含淀粉材料。
191.根据权利要求190所述的方法，其中降低含淀粉材料的粒度的方法通过研磨进行。
192.根据权利要求89所述的方法，其中使含淀粉的植物材料的粒度降低。
193.根据权利要求192所述的方法，其中通过干磨或湿磨或使用粒度乳化技术使含淀粉的植物材料的粒度降低。
194.根据权利要求89所述的方法，其中发酵进行30至150小时。
195.根据权利要求194所述的方法，其中发酵进行48至96小时。
196.根据权利要求89所述的方法，其中在步骤(b)中的发酵过程中或步骤(i)和(ii)中的同步糖化和发酵过程中的温度在25℃和40℃之间。
197.根据权利要求196所述的方法，其中在步骤(b)中的发酵过程中或步骤(i)和(ii)中的同步糖化和发酵过程中的温度在28℃和36℃之间。
198.根据权利要求196所述的方法，其中在步骤(b)中的发酵过程中或步骤(i)和(ii)中的同步糖化和发酵过程中的温度在28℃和35℃之间。
199.根据权利要求196所述的方法，其中在步骤(b)中的发酵过程中或步骤(i)和(ii)中的同步糖化和发酵过程中的温度在28℃和34℃之间。
200.根据权利要求196所述的方法，其中在步骤(b)中的发酵过程中或步骤(i)和(ii)中的同步糖化和发酵过程中的温度为32℃。
201.根据权利要求89所述的方法，其中在糖化和/或发酵过程中还存在蛋白酶。
202.根据权利要求89所述的方法，其中在糖化和/或发酵之前和/或过程中加入逆流。
203.根据权利要求89所述的方法，其中在糖化和/或发酵之前和/或过程中加入氮源。
204.根据权利要求89所述的方法，其中葡糖淀粉酶以0.001-10AGU/g DS的量存在。
205.根据权利要求204所述的方法，其中葡糖淀粉酶以0.01-5AGU/g DS的量存在。
206.根据权利要求204所述的方法，其中葡糖淀粉酶以0.1-0.5AGU/g DS的量存在。
207.根据权利要求89所述的方法，其中发酵产物为醇。
208.根据权利要求207所述的方法，其中发酵产物为乙醇。
209.根据权利要求207所述的方法，其中发酵产物是燃料乙醇、饮用乙醇和/或工业乙醇。
210.根据权利要求89所述的方法，所述纤维分解组合物的剂量为0.0001-3mg EP/gDS。
211.根据权利要求210所述的方法，所述纤维分解组合物的剂量为0.0005-2mg EP/gDS。
212.根据权利要求210所述的方法，所述纤维分解组合物的剂量为0.001-1mg EP/gDS。
213.根据权利要求210所述的方法，所述纤维分解组合物的剂量为0.005-0.5mg EP/gDS。
214.根据权利要求210所述的方法，所述纤维分解组合物的剂量为0.01-0.1mg EP/gDS。
215.根据权利要求89所述的方法，其中发酵生物体源自酵母属的菌株。
216.根据权利要求215所述的方法，其中发酵生物体源自酿酒酵母菌。
217.一种将全酒糟脱水的方法，包括
(a)使用α-淀粉酶将含淀粉材料液化；
(b)将液化的材料糖化；
(c)使用发酵生物体进行发酵；
(d)将发酵材料分离成发酵产物和全酒糟；
(e)对全酒糟进行脱水；
其中，在糖化步骤(b)、发酵步骤(c)、或同步糖化和发酵过程中存在或加入糖源生成酶和包括与SEQ ID NO:6具有至少99％序列同一性且具有小于1.00的相对ED50装载值的β-葡糖苷酶的纤维素分解组合物，
其中所述β-葡糖苷酶源自烟曲霉菌株且包括选自以下的取代组合：
-F100D+S283G+N456E+F512Y；
-L89M+G91L+I186V+I140V；
-I186V+L89M+G91L+I140V+F100D+S283G+N456E+F512Y。
218.根据权利要求217的方法，其中通过蒸馏从发酵材料回收发酵产物。
219.根据权利要求217所述的方法，其中含有β-葡糖苷酶的纤维素分解组合物的相对ED50装载值小于0.80。
220.根据权利要求219所述的方法，其中含有β-葡糖苷酶的纤维素分解组合物的相对ED50装载值小于0.60。
221.根据权利要求217所述的方法，其中含有β-葡糖苷酶的纤维素分解组合物的相对ED50装载值在0.1-0.9之间。
222.根据权利要求221所述的方法，其中含有β-葡糖苷酶的纤维素分解组合物的相对ED50装载值在0.2-0.8之间。
223.根据权利要求221所述的方法，其中含有β-葡糖苷酶的纤维素分解组合物的相对ED50装载值在0.30-0.70之间。
224.根据权利要求217所述的方法，其中纤维素分解组合物以1-500微克/g DS的量加入。
225.根据权利要求224所述的方法，其中纤维素分解组合物以10-400微克/g DS的量加入。
226.根据权利要求224所述的方法，其中纤维素分解组合物以25-300微克/g DS的量加入。
227.根据权利要求224所述的方法，其中纤维素分解组合物以50-200微克/g DS的量加入。
228.根据权利要求217所述的方法，其中蛋白酶与糖源生成酶和纤维素分解组合物一起加入，蛋白酶为源自黄嗜热子囊菌的与SEQ ID NO:13至少99％等同的蛋白酶。
229.根据权利要求217所述的方法，其中纤维素分解组合物直接加入全酒糟。
230.根据权利要求217所述的方法，其中发酵生物体源自酵母属的菌株。
231.根据权利要求230所述的方法，其中发酵生物体源自酿酒酵母菌。
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