JP2952604B2 - 発酵法によるアミノ酸の製造法 - Google Patents
発酵法によるアミノ酸の製造法Info
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- trehalase
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- trehalose
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は発酵法によるアミノ酸の製造法に関するもの
である。
である。
グルコース、シュークロース、廃糖蜜等を用いるアミ
ノ酸発酵においては培養液中にトレハロースも生成され
ることが知られている（Biosci.Rep.,vol.5,No.6,pp509
−515,1985）。しかし、このトレハロースに着目して何
らかの処理、あるいは活用することは知られていない。
ノ酸発酵においては培養液中にトレハロースも生成され
ることが知られている（Biosci.Rep.,vol.5,No.6,pp509
−515,1985）。しかし、このトレハロースに着目して何
らかの処理、あるいは活用することは知られていない。
〔発明が解決しようとする課題〕 トレハロースを発酵菌に資化させることができれば目
的アミノ酸の発酵収率を高められる可能性がある。
的アミノ酸の発酵収率を高められる可能性がある。
本発明者らは上記目的を達成するべく鋭意検討の結
果、トレハロースをＤ−グルコースに分解するトレハラ
ーゼに着目するに至った。そして、トレハラーゼを著量
生産する微生物の取得に成功し、このトレハラーゼをア
ミノ酸発酵の培養液に加えることによって培養液中に生
成蓄積されたトレハロースを有効利用して目的アミノ酸
の発酵収率を高めうることを見出して本発明を完成する
に至った。
果、トレハロースをＤ−グルコースに分解するトレハラ
ーゼに着目するに至った。そして、トレハラーゼを著量
生産する微生物の取得に成功し、このトレハラーゼをア
ミノ酸発酵の培養液に加えることによって培養液中に生
成蓄積されたトレハロースを有効利用して目的アミノ酸
の発酵収率を高めうることを見出して本発明を完成する
に至った。
すなわち、本発明は、微生物を用いるアミノ酸製造方
法において、該微生物の培養液中にトレハラーゼを存在
せしめることを特徴とするアミノ酸の製造法に関するも
のである。
法において、該微生物の培養液中にトレハラーゼを存在
せしめることを特徴とするアミノ酸の製造法に関するも
のである。
トレハラーゼ（E.C.3.2.1.28）は2,2′−トレハロー
スを分解してＤ−グルコースを生成する酵素であり、昆
虫、動物、微生物などにその存在が知られている。トレ
ハラーゼは安価なものが好ましく、その点で本発明者ら
が開発したコリネバクテリウム属細菌の産生するトレハ
ラーゼ（特開昭62−275682号公報）は特に好ましい。
スを分解してＤ−グルコースを生成する酵素であり、昆
虫、動物、微生物などにその存在が知られている。トレ
ハラーゼは安価なものが好ましく、その点で本発明者ら
が開発したコリネバクテリウム属細菌の産生するトレハ
ラーゼ（特開昭62−275682号公報）は特に好ましい。
コリネバクテリウム属細菌を培養してトレハラーゼを
取得する方法は公知の方法に従えばよい。すなわち、ト
レハラーゼ産生能を有するコリネバクテリウム属細菌を
グルコース、シュークロース、可溶性デンプン等炭素
源、硫安、塩安、燐安等の無機物あるいは酵母エキス、
肉エキス、大豆粕加水分解物、ペプトン等の有機物の窒
素源、ビタミン等の微量有機栄養物、リン酸カリ、硫酸
マグネシウム等の無機塩を含む液体培地に培養する。培
養条件もコリネバクテリウム属細菌を培養する通常の条
件でよいが、本発明者らが先に開発したコリネバクテリ
ウム・エスピーＫ−512株（FERM P−8485）の場合には
高温菌であるので40〜60℃程度で培養するのがよい。培
養は常法に従って通気撹拌条件下で行ない、通常はトレ
ハラーゼの蓄積が最高に達するかあるいは経済的に最も
好ましい蓄積量に達した時点で培養を終了する。培養終
了後は培養液をそのまま、あるいは濃縮するだけで酵素
源として使用してもよく、あるいは菌体分離、限外濾
過、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、硫安沈
澱法等の公知の酵素精製法によりさらに精製して使用す
ることもできる。トレハラーゼが菌体内酵素の場合には
菌体を用い、あるいは菌体を破壊して酵素抽出してこれ
を利用することはいうまでもない。本発明の方法で使用
されるトレハラーゼは微生物由来に限定されるものでは
なく、動植物由来のものであってもよい。また、遺伝子
工学的手法等で調製されたものであってもよい。
取得する方法は公知の方法に従えばよい。すなわち、ト
レハラーゼ産生能を有するコリネバクテリウム属細菌を
グルコース、シュークロース、可溶性デンプン等炭素
源、硫安、塩安、燐安等の無機物あるいは酵母エキス、
肉エキス、大豆粕加水分解物、ペプトン等の有機物の窒
素源、ビタミン等の微量有機栄養物、リン酸カリ、硫酸
マグネシウム等の無機塩を含む液体培地に培養する。培
養条件もコリネバクテリウム属細菌を培養する通常の条
件でよいが、本発明者らが先に開発したコリネバクテリ
ウム・エスピーＫ−512株（FERM P−8485）の場合には
高温菌であるので40〜60℃程度で培養するのがよい。培
養は常法に従って通気撹拌条件下で行ない、通常はトレ
ハラーゼの蓄積が最高に達するかあるいは経済的に最も
好ましい蓄積量に達した時点で培養を終了する。培養終
了後は培養液をそのまま、あるいは濃縮するだけで酵素
源として使用してもよく、あるいは菌体分離、限外濾
過、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、硫安沈
澱法等の公知の酵素精製法によりさらに精製して使用す
ることもできる。トレハラーゼが菌体内酵素の場合には
菌体を用い、あるいは菌体を破壊して酵素抽出してこれ
を利用することはいうまでもない。本発明の方法で使用
されるトレハラーゼは微生物由来に限定されるものでは
なく、動植物由来のものであってもよい。また、遺伝子
工学的手法等で調製されたものであってもよい。
アミノ酸発酵の種類は特に限定されるものではなく、
例としてグルタミン酸発酵、リジン発酵、グルタミン発
酵、スレオニン発酵、アルギニン発酵、フェニルアラニ
ン発酵、バリン発酵、イソロイシン発酵等を例として挙
げることができる。発酵菌の種類もトレハロースを生成
するものであれば特に限定されない。コリネバクテリウ
ム属細菌又はブレビバクテリウム属細菌等のいわゆるコ
リネ型細菌、例えばコリネバクテリウム・リリュウム、
コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタム等に対して本発明の方法は特
に有効である。
例としてグルタミン酸発酵、リジン発酵、グルタミン発
酵、スレオニン発酵、アルギニン発酵、フェニルアラニ
ン発酵、バリン発酵、イソロイシン発酵等を例として挙
げることができる。発酵菌の種類もトレハロースを生成
するものであれば特に限定されない。コリネバクテリウ
ム属細菌又はブレビバクテリウム属細菌等のいわゆるコ
リネ型細菌、例えばコリネバクテリウム・リリュウム、
コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタム等に対して本発明の方法は特
に有効である。
アミノ酸発酵方法はトレハラーゼを添加するほかは公
知の方法に従って行なえばよく、これらの菌を培養する
培地には炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じそ
の他の有機微量栄養素を含有する通常の培地が用いられ
る。
知の方法に従って行なえばよく、これらの菌を培養する
培地には炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じそ
の他の有機微量栄養素を含有する通常の培地が用いられ
る。
炭素源の例としては、グルコース、シュークロース、
フラクトース、ケーンモラセス、ビートモラセス、澱粉
加水分解物などの炭水化物を挙げることができる。窒素
源としてはアンモニアガス、アンモニア水、アンモニウ
ム塩、尿素等が好適である。培養は、好気的条件で行な
い、通常、培養のコントロールpHを４から９の間に温度
を25℃から39℃の間に調節する。しかしながら、培養時
間の短縮、雑菌防止等の点で40〜60℃程度の高温発酵を
行なうことは好ましく、その場合にはコリネバクテリウ
ム・エスピーＫ−512株等の産生する至適温度が40〜60
℃にあるような耐熱性トレハラーゼは特に好ましい。
フラクトース、ケーンモラセス、ビートモラセス、澱粉
加水分解物などの炭水化物を挙げることができる。窒素
源としてはアンモニアガス、アンモニア水、アンモニウ
ム塩、尿素等が好適である。培養は、好気的条件で行な
い、通常、培養のコントロールpHを４から９の間に温度
を25℃から39℃の間に調節する。しかしながら、培養時
間の短縮、雑菌防止等の点で40〜60℃程度の高温発酵を
行なうことは好ましく、その場合にはコリネバクテリウ
ム・エスピーＫ−512株等の産生する至適温度が40〜60
℃にあるような耐熱性トレハラーゼは特に好ましい。
トレハラーゼの添加量は各発酵の種類と方法、トレハ
ラーゼの種類等を考慮して設定されるが通常0.5〜100ユ
ニット/m程度である。添加時期は培養に先立って予め
培地に加えておいてもよく、あるいは培養中に１回ある
いは数回に分けて添加してもよい。トレハラーゼは固定
化して使用することもできる。この固定化酵素はアミノ
酸発酵菌を固定化して使用する場合にそれに混合しても
よく、発酵槽に投入して使用することもできる。
ラーゼの種類等を考慮して設定されるが通常0.5〜100ユ
ニット/m程度である。添加時期は培養に先立って予め
培地に加えておいてもよく、あるいは培養中に１回ある
いは数回に分けて添加してもよい。トレハラーゼは固定
化して使用することもできる。この固定化酵素はアミノ
酸発酵菌を固定化して使用する場合にそれに混合しても
よく、発酵槽に投入して使用することもできる。
かくして１ないし７日間も培養すれば培地中に著量の
アミノ酸が生成される。培養液よりアミノ酸を採取する
方法は通常の方法で行なう。
アミノ酸が生成される。培養液よりアミノ酸を採取する
方法は通常の方法で行なう。
トレハロースはＤ−グルコースが1.1結合した形の非
還元性の二炭糖であり、一般的にはコリネ型細菌はトレ
ハロースを資化する力が弱く、この生成はとりもなおさ
ずグルコース等炭素源のアミノ酸への変換率を低めてい
る。アミノ酸発酵の培養液中に生成するトレハロースを
トレハラーゼで処理することにより、効率的にグルコー
スに変換し、アミノ酸の収率を高めることが出来る。
還元性の二炭糖であり、一般的にはコリネ型細菌はトレ
ハロースを資化する力が弱く、この生成はとりもなおさ
ずグルコース等炭素源のアミノ酸への変換率を低めてい
る。アミノ酸発酵の培養液中に生成するトレハロースを
トレハラーゼで処理することにより、効率的にグルコー
スに変換し、アミノ酸の収率を高めることが出来る。
実施例１ トレハラーゼはコリネバクテリウム・エスピーＫ−51
2株から得られたものを使用した。その調製法は以下の
通りである。
2株から得られたものを使用した。その調製法は以下の
通りである。
まずＫ−512株（FERM P−8485）を１％可溶性澱粉、
１％グルコース、１％ポリペプトン、0.5％酵母エキ
ス、0.1％ K2HPO4および0.02％ MgSO4・7H2Oを含有する
液体培地に植菌し、55℃にて72時間好気的に培養した。
得られた培養液を10000rpm、０℃にて10分間遠心分離し
て菌体を除き、上澄液を得た。ついで、該上澄液を平均
分子量10000の限外濾過膜を用いて約10倍に濃縮し、10m
M燐酸緩衝液（pH7）で一夜透析した。この透析後に生じ
る沈澱を遠心分離で除き、得られた上澄液を10mM燐酸緩
衝液（pH7）で平衡化したDEAE−トヨパール650Mカラム
に吸着させ、０〜0.7MのNaClを含む上記と同様な緩衝液
の濃度勾配法によって酵素を溶出させた。溶出した活性
画分を集め分画分子量10000の限外濾過膜を用いて濃縮
し、さらに10mM燐酸緩衝液（pH7）で一夜透析した。得
られた活性画分を10mM燐酸緩衝液（pH7）で平衡化したD
EAE−トヨパールパック650Sカラムに吸着させ０〜0.5M
NaClを含有する上記と同様な緩衝液の濃度勾配法によっ
て酵素を溶出させた。活性画分を分画分子量10000の限
外濾過膜で濃縮し、あらかじめ0.1M NaClを含む上記緩
衝液で平衡化したアサヒパックGS−520Pカラムを用い、
0.1M NaClを含む上記緩衝液で溶出した。得られた活性
画分を分画分子量10000の限外濾過膜で400ユニット/m
になるよう濃縮し、酵素溶液とした。
１％グルコース、１％ポリペプトン、0.5％酵母エキ
ス、0.1％ K2HPO4および0.02％ MgSO4・7H2Oを含有する
液体培地に植菌し、55℃にて72時間好気的に培養した。
得られた培養液を10000rpm、０℃にて10分間遠心分離し
て菌体を除き、上澄液を得た。ついで、該上澄液を平均
分子量10000の限外濾過膜を用いて約10倍に濃縮し、10m
M燐酸緩衝液（pH7）で一夜透析した。この透析後に生じ
る沈澱を遠心分離で除き、得られた上澄液を10mM燐酸緩
衝液（pH7）で平衡化したDEAE−トヨパール650Mカラム
に吸着させ、０〜0.7MのNaClを含む上記と同様な緩衝液
の濃度勾配法によって酵素を溶出させた。溶出した活性
画分を集め分画分子量10000の限外濾過膜を用いて濃縮
し、さらに10mM燐酸緩衝液（pH7）で一夜透析した。得
られた活性画分を10mM燐酸緩衝液（pH7）で平衡化したD
EAE−トヨパールパック650Sカラムに吸着させ０〜0.5M
NaClを含有する上記と同様な緩衝液の濃度勾配法によっ
て酵素を溶出させた。活性画分を分画分子量10000の限
外濾過膜で濃縮し、あらかじめ0.1M NaClを含む上記緩
衝液で平衡化したアサヒパックGS−520Pカラムを用い、
0.1M NaClを含む上記緩衝液で溶出した。得られた活性
画分を分画分子量10000の限外濾過膜で400ユニット/m
になるよう濃縮し、酵素溶液とした。
グルコース5g/dl、尿素0.4g/dl、KH2PO4 0.1g/d、M
gSO4・7H2O 0.04g/d、FeSO4・7H2O 1mg/d、MnSO4・
nH2O 1mg/d、サイアミン・HCl 20μg/d、ビオチン3
0μg/d、大豆蛋白酸加水分解液90mg/d（全窒素とし
て）を含む種母培地をpH7.0に調節し、その50mを500m
容肩付フラスコに入れて加熱殺菌した。これにコリネ
バクテリウム・グルタミクムAJ 11441（FERM P−5138）
を接種し、31.5℃に保ちつつ15時間振盪培養した。
gSO4・7H2O 0.04g/d、FeSO4・7H2O 1mg/d、MnSO4・
nH2O 1mg/d、サイアミン・HCl 20μg/d、ビオチン3
0μg/d、大豆蛋白酸加水分解液90mg/d（全窒素とし
て）を含む種母培地をpH7.0に調節し、その50mを500m
容肩付フラスコに入れて加熱殺菌した。これにコリネ
バクテリウム・グルタミクムAJ 11441（FERM P−5138）
を接種し、31.5℃に保ちつつ15時間振盪培養した。
一方、シュークロース20g/d（総糖量として）KH2PO
4 0.1g/d、MgSO4 0.04g/d、FeSO4・7H2O 1mg/d、
MnSO4・4H2O 1mg/d、サイアミン・HCl 20μg/d、ビ
オチン30μg/d、界面活性剤0.2/d、消泡剤0.005m
/d、大豆蛋白酸加水分解液90mg/d（全窒素とし
て）、pH7.0に調整した培地285mを１容ファーメン
ターに入れ殺菌した。冷却後、前述のトレハラーゼを０
又は6.7ユニット/mとなるように添加した。この場合
の１ユニットは反応温度55℃で１分間にトレハロースか
ら１μmolのグルコースを生成する酵素活性である。
4 0.1g/d、MgSO4 0.04g/d、FeSO4・7H2O 1mg/d、
MnSO4・4H2O 1mg/d、サイアミン・HCl 20μg/d、ビ
オチン30μg/d、界面活性剤0.2/d、消泡剤0.005m
/d、大豆蛋白酸加水分解液90mg/d（全窒素とし
て）、pH7.0に調整した培地285mを１容ファーメン
ターに入れ殺菌した。冷却後、前述のトレハラーゼを０
又は6.7ユニット/mとなるように添加した。この場合
の１ユニットは反応温度55℃で１分間にトレハロースか
ら１μmolのグルコースを生成する酵素活性である。
これに上記種母培養液を15m接種した。培養は31.5
℃でアンモニアガスにてpH7.5に保持しつつ、通気撹拌
下で糖を加えながら行った。培養48時間後、それぞれの
培養液中のＬ−グルタミン酸とトレハロース量はそれぞ
れ第１表に示す通りであった。
℃でアンモニアガスにてpH7.5に保持しつつ、通気撹拌
下で糖を加えながら行った。培養48時間後、それぞれの
培養液中のＬ−グルタミン酸とトレハロース量はそれぞ
れ第１表に示す通りであった。
実施例２ トレハラーゼはコリネバクテリウム・エスピーＫ−51
2株（FERM P−8485）を下記のGS培地にて55℃・72時間
培養し、イオン交換樹脂およびゲル濾過カラムクロマト
グラフィーで精製したものを用いた。
2株（FERM P−8485）を下記のGS培地にて55℃・72時間
培養し、イオン交換樹脂およびゲル濾過カラムクロマト
グラフィーで精製したものを用いた。
GS培地 １％ グルコース １％ 可溶性澱粉 １％ ポリペプトン 0.5 ％ 酵母エキス 0.1 ％ K2HPO4 0.02％ MgSO4・7H2O 実施例１の菌株、培地組成及び培養方法を用い、トレ
ハラーゼ無添加の発酵終了液1mに前記のトレハラーゼ
を最終濃度０及び6.7ユニット/mとなるように添加
し、31.5℃で７時間反応した。反応後の培養液中のＬ−
グルタミン酸とトレハロース量を第２表に示す。
ハラーゼ無添加の発酵終了液1mに前記のトレハラーゼ
を最終濃度０及び6.7ユニット/mとなるように添加
し、31.5℃で７時間反応した。反応後の培養液中のＬ−
グルタミン酸とトレハロース量を第２表に示す。
実施例３ トレハラーゼはコリネバクテリウム・エスピーＫ−51
2株（FERM P−8485）を培養して得られた培養液（特開
昭62−275682号公報）を無菌濾過して使用した。
2株（FERM P−8485）を培養して得られた培養液（特開
昭62−275682号公報）を無菌濾過して使用した。
ペプトン1g/d、酵母エキス1g/d、NaCl 0.5g/d
、グルコース0.5g/d、寒天2g/d、pH7.0の組成の
固体プレートにブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タムAJ 3424（FERM P−1711）を植えつけ、温度31.5℃
で24時間培養し、種母用菌体を得た。
、グルコース0.5g/d、寒天2g/d、pH7.0の組成の
固体プレートにブレビバクテリウム・ラクトファーメン
タムAJ 3424（FERM P−1711）を植えつけ、温度31.5℃
で24時間培養し、種母用菌体を得た。
一方、グルコース10g/d、硫安5.5g/d、FeSO4・H2
O 1mg/d、MnSO4・4H2O 1mg/d、KH2PO4 0.1g/d、M
gSO4 0.1g/d、サイアミン・HCl 20μg/d、ビオチン
50μg/d、ニコチン酸アミド0.5mg/d、大豆蛋白酸加
水分解105mg/d（全窒素として）を加えpH8.0に調整し
た培地20mを500m容肩付フラスコに入れて加熱殺菌
した。これに別殺菌したCaCO3 1gを加えて、リジン生産
用培地とした。このリジン生産用培地に種母用菌体１白
金芽を植えつけた後、ミリポアフィルターで除菌した前
述のトレハラーゼを最終濃度０及び６ユニット/mとな
るように培養開始時及び24時間目に添加し、31.5℃で48
時間振盪培養した。それぞれの培養液中のＬ−リジン量
及びトレハロース量を第３表に示す。
O 1mg/d、MnSO4・4H2O 1mg/d、KH2PO4 0.1g/d、M
gSO4 0.1g/d、サイアミン・HCl 20μg/d、ビオチン
50μg/d、ニコチン酸アミド0.5mg/d、大豆蛋白酸加
水分解105mg/d（全窒素として）を加えpH8.0に調整し
た培地20mを500m容肩付フラスコに入れて加熱殺菌
した。これに別殺菌したCaCO3 1gを加えて、リジン生産
用培地とした。このリジン生産用培地に種母用菌体１白
金芽を植えつけた後、ミリポアフィルターで除菌した前
述のトレハラーゼを最終濃度０及び６ユニット/mとな
るように培養開始時及び24時間目に添加し、31.5℃で48
時間振盪培養した。それぞれの培養液中のＬ−リジン量
及びトレハロース量を第３表に示す。
〔発明の効果〕 本発明によりアミノ酸の発酵収率を高めることができ
る。
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:15） (72)発明者 吉原 康彦 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１―１ 味 の素株式会社中央研究所内 (72)発明者 永山 孝三 静岡県小笠郡菊川町加茂1809 (72)発明者 堀越 弘毅 東京都練馬区桜台４―39―８ (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 13/04 - 13/24 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】微生物を用いるアミノ酸製造方法におい
て、該微生物の培養液中にトレハラーゼを存在せしめる
ことを特徴とするアミノ酸の製造法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10451190A JP2952604B2 (ja) | 1990-04-20 | 1990-04-20 | 発酵法によるアミノ酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10451190A JP2952604B2 (ja) | 1990-04-20 | 1990-04-20 | 発酵法によるアミノ酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH044888A JPH044888A (ja) | 1992-01-09 |
| JP2952604B2 true JP2952604B2 (ja) | 1999-09-27 |
Family
ID=14382521
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10451190A Expired - Lifetime JP2952604B2 (ja) | 1990-04-20 | 1990-04-20 | 発酵法によるアミノ酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2952604B2 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4134450A1 (de) | 1991-10-18 | 1993-04-22 | Degussa | Verfahren zur erhoehung der leistungsfaehigkeit aminosaeuren ausscheidender bakterien |
| FR2747131B1 (fr) * | 1996-04-09 | 1998-06-26 | Orsan | Procede de production d'amino acide par fermentation de corynebacterie exprimant une activite trehalase |
| DE102005056668A1 (de) * | 2005-11-28 | 2007-05-31 | Basf Ag | Fermentative Herstellung organischer Verbindungen |
| WO2009121058A1 (en) * | 2008-03-28 | 2009-10-01 | Novozymes A/S | Producing fermentation products in the presence of trehalase |
| ES2935920T3 (es) | 2012-03-30 | 2023-03-13 | Novozymes North America Inc | Procesos de elaboración de productos de fermentación |
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-
1990
- 1990-04-20 JP JP10451190A patent/JP2952604B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH044888A (ja) | 1992-01-09 |
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