JPH0669387B2 - S−アデノシルメチオニンの製造法 - Google Patents

S−アデノシルメチオニンの製造法

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JPH0669387B2
JPH0669387B2 JP11566187A JP11566187A JPH0669387B2 JP H0669387 B2 JPH0669387 B2 JP H0669387B2 JP 11566187 A JP11566187 A JP 11566187A JP 11566187 A JP11566187 A JP 11566187A JP H0669387 B2 JPH0669387 B2 JP H0669387B2
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達郎 藤尾
豊 榎本
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協和醗酵工業株式会社
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 S−アデノシルメチオニン(以下SAMと略記する)は、
生体内に広く分布しており生体内のメチル化反応におけ
るメチル基供与体として重要な生理活性物質であり、近
年鬱病治療や脳血管障害治療などにおける化学療法剤と
して期待されている物質である。
従来の技術 SAMを製造する方法としては、(1)酵母をメチオニン
含有培地にて培養し、該酵母菌体中に蓄積したSAMを抽
出精製する方法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー(J.Biol.Chem.)229,1037(1957)〕、
(2)酵母法によりメチオニンおよびアデノシン5′−
三リン酸(以下ATPと略記する)からSAMを製造する方法
(特開昭55−81592)。(3)酵素法によりSAMを製造す
るに際し、ATPの代わりにアデノシン、アデノシン5′
−一リン酸(以下AMPと略記する)、アデノシン5′−
二リン酸(以下ADPと略記する)などのATP前駆体と該前
駆体からATPを生成する能力を有する微生物もしくは酵
素を併せて用いる方法(特開昭55−96099公報参照)な
どが知られている。
発明が解決しようとする問題点 従来知られている方法では、菌体内にSAMを蓄積する方
法の場合はSAM生成量が十分ではないほか、精製が必ず
しも容易ではなく、一方酵素法では、高価なATPを原料
とする必要があり、いずれにしても十分に経済的な方法
とは言えない。また、ATP生成系と共役させる反応系の
場合はATPの代わりに用いるアデノシン、AMP、ADPなど
のATP前駆体も高価であり十分に経済的とは言えず、ま
たATP再生系として酵素や酵素活性を有する菌体を併用
する必要があることから製造プロセスが煩雑になるほ
か、やはり経済性の点でも十分とは言えない。
問題点を解決するための手段 先に本発明者は、ブレビバクテリウム属、コリネバクテ
リウム属(特開昭59−51799公報参照)、およびエシェ
リヒア属、スタフィロコッカス属(特開昭60−210995広
報参照)に属する微生物が、アデニン、ATP生成基質、
リボース前駆体、およびリン酸基供与体から著量のATP
を生産することを見いだした。ここでいうATP生成基質
とは、ADPからATPを生合成する際に必要なエネルギーを
供給する物質を示している。該微生物はATP生成基質を
資化してATPを生合成するために必要なエネルギーを獲
得すると同時に、アデニンからAMPを生成するに要する
5′−フォスフォリボシル・ピロフォスフェート(以下
PRPPと略記する)をリボース前駆体から生合成すること
ができる。このアデニンからATPを生成し得る能力(以
下「ATP生成能」と略記することがある)と、これらの
微生物が併せ持っているATPとメチオニンからSAMを生合
成する能力(以下「SAM生成能」と略記することがあ
る)とを共役(下記式参照)させることによって、アデ
ニン、メチオニン、ATP生成基質、リン酸基供与体およ
びリボース前駆体からSAMを製造できるプロセスを開発
することに成功し、本発明を完成させるに至った。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は、ATPとメチオニンからSAMを生成し得る能力を
有し、かつアデニン、ATP生成基質、リボース前駆体お
よびリン酸基供与体からATPを生合成する能力を有する
微生物の培養液、菌体、またはそれらの処理物の存在
下、水性媒体中でアデニン、ATPの生成基質、リボース
前駆体、リン酸基供与体およびメチオニンを接触させて
SAMを生成させ、反応液からSAMを採取することを特徴と
するSAMの製造方法を提供する。
本発明に用いる微生物としては、ATP生成能を有し、か
つSAM生成能を有するものであればいずれでも使用でき
るが、例えばブレビバクテリウム属、コネリバクテリウ
ム属、エシェリヒア属、およびスタフィロコッカス属に
属する下記の微生物を例示することができる。
ビレビバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC 21170 コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 21171 エシェリヒア・コリ C−600 ATCC 33525 エシェリヒア・コリ B ATCC 11303 スタフィロコッカス・オーレウス ATCC 4012 これらの微生物を通常の培養方法で培養することによ
り、アデニン、ATP生成基質、リボース前駆体、リン酸
基供与体およびメチオニンからSAMを生成し得る活性を
有する培養液、菌体を得ることができる。すなわち、こ
れらの微生物を炭素源、窒素源、無機物、アミノ酸、ビ
タミン、ミネラル、核酸などを含有する通常の倍地中に
おいて、好気的条件下で温度、pHなどを調節しつつ培養
を行えばよい。
炭素源としてはグルコース、フラクトース、シュークロ
ース、マルトース、アンニトール、ソルビトールなどの
炭素化物や糖アルコール、グリセロール、さらにピルビ
ン酸、乳酸、クエン酸などの各種のアルコールや有機
酸、グルタミン酸、メチオニン、リジンなどの各種アミ
ノ酸などが使用できる。また、澱粉加水分解物、糖蜜、
廃糖蜜、白糖、キャッサバ、バガス、コーン・スティー
プ・リカーなどの天然有機栄養源も各微生物が資化でき
るものであればいずれでも用い得る。
窒素源としては、アンモニアあるいは塩化アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモ
ニウムなどの各種の無機および有機アンモニウム塩類、
グルタミン酸、グルタミン、メチオニンなどのアミノ
酸、あるいはペプトン、NZアミン、コーン・スティープ
・リカー、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解
物、フィッシュミールあるいはその消化物などの含窒素
有機物などの種々の物が使用可能である。
さらに、無機物としては、リン酸二水素カリウム、リン
酸一水素ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウ
ム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸銅、塩化マンガン、
モリブデン酸アンモニウム、硫酸亜鉛などを必要に応じ
て添加する。微生物の成育に必要なビタミン、アミノ
酸、ミネラル、核酸その他のものは必要に応じて添加す
るが、前記したような他の倍地成分に伴って倍地に供給
されれば特に加えなくてもよい。
培養は、振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的条
件下で行う。培養温度は20〜50℃が良く、28〜42℃がよ
り好ましい。培養中の倍地のpHは中性付近に維持するこ
とが望ましい。培養時間は通常1〜72時間である。
接触は、微生物の培養中でもよく、培養後、培養液、菌
体またはそれらの処理物とアデニン、ATP生成基質、リ
ボース前駆体、リン酸基供与体およびメチオニンを水性
溶媒中で接触させてもよい。
アデニンおよびメチオニンからSAMへの反応は、上記の
接触時の混合液に、必要に応じてマグネシウムイオン、
界面活性剤および/または有機溶剤などを加え、pHを6
〜10、より好ましくは7〜8に調節しつつ、かつ20〜50
℃に1〜48時間保ちつつ行わせる。アデニン、メチオニ
ン、ATP生成基質、リボース前駆体およびリン酸基供与
体の濃度は、いずれも1〜100mg/mlの範囲にあること
が望ましい。
アデニンとしては、精製品、粗精製品、アデニン発酵液
の濃縮物、除菌体上清液およびその濃縮物など、アデニ
ンからSAMへの反応を妨げないものであればいずれでも
用いることができる。
メチオニンとしては、高度に精製された純品でも、粗精
製標品でも、またメチオニン含有量の多い天然物からの
抽出物でも、SAM生成反応を妨げない物であればいずれ
でも使用できる。
ATP生成能およびSAM生成能を有する微生物の培養液もし
くは菌体の処理物としては、培養液および培養液を遠心
分離して得られる上清液の濃縮物および乾燥物、遠心分
離菌体、凍結菌体、さらには菌体の乾燥物、凍結乾燥
物、アセトン処理物、界面活性剤および/または有機溶
剤処理物、溶菌酵素処理物、固定化菌体などがあげられ
る。また、該菌体から抽出したATPおよびSAM生成に関与
する酵素、それらの酵素の精製標品、固定化物なども用
いられる。
ATP生成基質およびリボース前駆体としては、使用する
微生物によって利用され得るものであれば、グルコー
ス、アラビノース、ラクトース、マルトース、シューク
ロース、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、
糖蜜、廃糖蜜、その他の糖質、澱粉加水分解物などの炭
水化物などいずれでも用いられる。ATP生成基質として
は上記物質の他にピルビン酸、乳酸、酢酸、α−ケトグ
ルタール酸などの有機酸、グリシン、アラニン、アスパ
ラギン酸、グルタミン酸、グルタミンなどのアミノ酸な
どいずれでも用いられる。
リン酸基供与体としては、オルソリン酸、ピロリン酸、
ポリリン酸、ポリメタリン酸、などの無機リン酸のナト
リウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩などいずれでも
使用できる。その濃度は、10〜400mMの範囲を保つこと
が望ましい。
界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・ステアリル
アミン(例えばナイミーンS−215、日本油脂社製・以
下界面活性剤いずれも日本油脂社製を用いる)、セチル
トリメチルアンモニウム・ブロマイド、カチオンFB、カ
チオンF2−40Eなどのカチオン性界面活性剤、ナトリウ
ムオレイルアミド硫酸、ニューレックスTAB、ラピゾー
ル80などのアニオン系界面活性剤、ポリオキシエチレン
ソルビタン・モノステアレート(例えばノニオンST22
1)などの両性界面活性剤、その他三級アミンPB、ヘキ
サデシルジメチルアミンなど、SAM生成反応を促進する
物であればいずれでも使用でき、これらは通常0.1〜50m
g/ml、好ましくは1〜20mg/mlの濃度にて用いられ
る。また、有機溶剤としては、トルエン、キシレン、脂
肪族アルコール、ベンゼン、酢酸エチルなどが用いら
れ、その濃度は0.1〜50μ/ml、好ましくは1〜20μ
/mlがよい。
反応液中のマグネシウムイオンの濃度は、4〜400mMの
範囲を保つことが望ましい。培養液もしくは菌体などか
ら反応系に持ち込まれる量がこの濃度範囲を満たす場合
は添加の必要はなく、一方、不足あるいは過剰となる場
合は上記の濃度範囲に入るように調整する。マグネシウ
ムイオンとしては無機塩でも、有機酸の塩でも使用でき
る。
反応液中に蓄積したSAMは、常法に従って処理すること
により取得することができる。例えば、SAM含有液を強
酸性のカチオン交換樹脂に吸着させ、硫酸にて溶出した
液にリンタングステン酸を加えてSAMを沈殿させる方法
によりSAMを得ることができる。なお、SAMの回収に際し
て硫酸、パラトルエンスルホン酸、スルホサリチル酸な
どの酸を用いて塩にすることにより安定化して収率よく
回収することができる。
以下に、本発明の実施例を示す。
実施例1. ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスATCCB21170を、
グルコース10mg/ml、ポリペプトン10mg/ml、肉エキス
10mg/ml、酵母エキス5mg/ml、食塩3mg/ml(pH7.2)
からなる倍地30mlを含む300ml容三角フラスコに、寒天2
5mg/mlを加えた同組成の試験管斜面倍地にて培養(植
菌後30℃にて一晩静置)した菌から一白金耳植菌し、回
転振盪機(150rpm)にて18時間振盪培養した。この種培
養液を、グルコース150mg/ml、カゼイン加水分解物0.1
mg/ml、酵母エキス7mg/ml、硫安10mg/ml、KH2PO4 3
mg/ml、K2HPO4 3mg/ml、MgSM4・7H2O 5mg/ml、ア
デニン、グアニン各10μg/ml、ビチオン10μg/の
組成の倍地をpH7.5に調整後300ml容バッフル付き三角フ
ラスコに20mlずつ分注し、120℃、20分間蒸煮殺菌した
倍地に2ml植菌した。回転振盪培養にて30℃で培養中、
必要に応じ尿素添加することによって、pHを中性付近に
保った。
この培養終了液を集め、20mlずつ200ml容ビーカーに移
し、アデニン5mg/ml、グルコース50mg/ml、Na2PO4 5
mg/ml、メチオニン10mg/mlを添加したもの(A)、
(A)にさらに界面活性剤(ナイミーンS−215 5mg/
ml)を添加したもの(B)、キシレン(10μ/ml)を
添加したもの(C)、ナイミーンS−215(5mg/ml)お
よびキシレン(10μ/ml)を両方同時に添加したもの
(D)を、5規定の苛性ソーダでpH7.3付近に保ちつ
つ、30℃にて18時間保った。なお、その間マグネティッ
ク・スターラーにて900rpmで攪拌を行った。結果を第1
表に示す。
実施例2. ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC21170、
コリネバクテリウム・グルタミクムATCC21171、エシェ
リヒア・コリ C−600 ATCC 33525、エシェリヒア・
コリ B ATCC 11303、スタフィロコッカス・オーレ
ウス ATCC 4012を実施例1と同様に培養し、得られた
培養液を用いて、実施例1の(D)と同一の反応条件で
反応した結果を第2表に示す。
発明の効果 本発明によりATP生成能とSAM生成能を合わせ有する微生
物を用いて、S−アデノシルメチオニンを安価に工業的
に製造することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 (C12P 19/40 C12R 1:19) (C12P 19/40 C12R 1:445)

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウ
    ム属、エシェリヒア属またはスタフィロコッカス属に属
    し、アデニン、ATP生成基質、リボース前駆体、リン酸
    基供与体およびメチオニンからS−アデノシルメチオニ
    ンを生成する能力を有する微生物の培養液、菌体、また
    はそれらの処理物とアデニン、ATP生成基質、リボース
    前駆体、リン酸基供与体およびメチオニンとを、水性溶
    液中で接触させることにより、該水性溶液中にS−アデ
    ノシルメチオニンを蓄積させ、これを摂取することを特
    徴とするS−アデノシルメチオニンの製造法。
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