JPS6328596B2

JPS6328596B2 -

Info

Publication number: JPS6328596B2
Application number: JP13952581A
Authority: JP
Inventors: Tatsurokuro Tochikura; Takashi Tachiki; Hidehiko Kumagai; Shinji Wakizaka
Original assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1981-09-04
Filing date: 1981-09-04
Publication date: 1988-06-09
Also published as: JPS5840094A

Description

【発明の詳細な説明】

〔〕発明の背景技術分野本発明は、テアニン関連物質の製造法に関す
る。 γ−Ｌ−グルタミルエチルアミドであるテアニ
ンは、玉露の旨味の主要成分として重要な物質で
ある。また、テアニンの近縁化合物であるγ−Ｌ
−グルタミルメチルアミドもテアニン様の旨味を
有しているのみでなく、むしろテアニンよりも香
味性は強いといわれる。したがつて、これらテア
ニン関連物質は茶をはじめとする食品の香味物質
として重要な物質であることは明白であるが、ま
た一方、近年γ−グルタミル誘導体が動・植物体
における生理活性物質として作用することが指摘
され、それらの工業的生産法の開発が期待されて
いる。他方、生合成の見地から考察すると、玉露
園では光合成が抑制されているため、テアニンが
茶葉乾物あたり1.5％前後蓄積されるが、一般煎
茶園では光合成が活発であるため、ほとんど蓄積
されない。一方、グルタミルメチルアミドは茶樹
など一部の植物体において、生育中に一時的に微
量蓄積されるが、速やかに分解されてテアニンの
ように著量蓄積されることはない。先行技術醗酵化学エネルギーの合成への利用ということ
は本発明者らの一部がかねてより提唱してきたと
ころである。たとえば、醗酵工学会誌、第56巻、
第５号、第508〜526頁（1978年）および有機合成
化学協会誌、第39巻、第６号、第487〜498頁
（1981年）参照。また、本発明者らの一部は、このような醗酵化
学エネルギーを利用したものとして、構造上テア
ニンの母化合物ともいうべきグルタミンの酵素的
合成法を提案している。（特公昭56−1918号公報
参照。）〔〕発明の概要要旨本発明者らはテアニン関連物質の製造法につい
て種々研究した結果、微生物の醗酵化学エネルギ
ーを利用することによりグルタミン合成酵素が糖
とグルタミン酸およびメチルアミンもしくはエチ
ルアミンとからγ−グルタミルメチルアミドもし
くはγ−グルタミルエチルアミドを合成する能力
を有することを発見した。本発明は、これらの新
知見に基くものである。従つて、本発明による微生物によるテアニン関
連物質の製造法は、サツカロミセス属に属する微
生物による糖の醗酵により生成するアデノシン三
リン酸（ATP）をエネルギ源として、グルタミ
ン合成酵素の存在下でＬ−グルタミン酸とモノま
たはジ低級アルキルアミンとを反応させ、生成し
た対応γ−Ｌ−グルタミル低級アルキルアミドを
採取すること、を特徴とするものである。効果本発明は醗酵化学エネルギーの合成への利用に
係るものであつて、この場合の合成はグルタミン
合成酵素によるＬ−グルタミン酸のアルキルアミ
ド化である。グルタミン合成酵素の基質として通
常用いられるアンモニアが低級アルキルアミンに
変つても、合成酵素活性が発現するだけでなく、
醗酵エネルギー生成系がアルキルアミンによつて
阻害されず、さらにエネルギー共役も成立して、
グルタミンのＮ−アルキル誘導体であるテアニン
関連物質が生成したという本発明者らの発見は、
工業上有利な効果をもたらすものである。本発明においては、糖の醗酵で生成する化学エ
ネルギーがATP−ADP系の触媒作用を介してグ
ルタミン酸と低級アルキルアミン、特にメチルア
ミンもしくはエチルアミン、とからのテアニン関
連物質の合成に効率的に利用されるので、多量の
高価なATPを基質として添加する必要はない。
むしろ、高濃度のATPの添加は合成反応を阻害
することがある。また、本発明は糖の醗酵と不可分であるから、
本発明の実施は糖の醗酵産物、特にアルコール、
の生産を伴なうことになる。すなわち、本発明
は、省資源かつバイオマスエネルギー生産方式に
係り、しかも無公害化学生産方式の性格を有して
いる。〔〕発明の具体的説明１糖醗酵エネルギーの利用本発明は、サツカロミセス属に属する微生物
による糖の醗酵により生成する化学エネルギー
を利用して、グルタミン酸の酵素的Ｎ−アルキ
ルアミド化を行なおうとするものである。ここで、「サツカロミセス属に属する微生物
による糖の醗酵により生成する化学エネルギー
を利用して」ということは、該微生物、特に酵
母、による糖の醗酵、特にアルコール醗酵、に
際して発生するATPをエネルギー源として利
用することを意味する。アルコール醗酵によつ
て生ずる有効エネルギーの正味の収量は、１モ
ルのグルコースがアルコールに変化するまでに
消費されたATPの収支から計算することがで
きる。すなわち、１モルのグルコースがアルコ
ール醗酵を受けてフルクトース−１，３−二リ
ン酸（FDP）となる過程で２モルのATPが消
費されるが、このFDPがさらに醗酵を受けて
エタノールにまで分解する過程で４モルの
ATPが回収されるから、結局１モルのグルコ
ースがアルコール醗酵を受けると２モルの
ATPの正味利得が得られるということになる。本発明は、Ｌ−グルタミン酸とアルキルアミ
ンとの酵素反応に際してもともと必要である
ATPをこの糖醗酵によつて発生するATPで賄
なおうとするものである。従つて、この酵素反
応に必要なATPを該反応中にin situで生成さ
せることが必要であり、また従つて糖醗酵工程
のうち少なくともATP発生工程、すなわち
FDP生成工程より下流の工程、を該酵素反応
と同一系で、すなわち共役させて、実施するこ
とが必要である。２糖の醗酵およびテアニン関連物質の合成 (1) 一般前記したように、グルタミン酸と低級アル
キルアミンとの酵素反応によるテアニン関連
物質の合成は、糖醗酵工程のうちATP発生
工程以降と同一系で実施される。従つて、本
発明の実施態様としては、たとえば、糖の醗
酵開始と同時に、すなわち糖と無機リン酸と
からFDPを生成させつつ、あるいは糖の醗
酵を開始させてFDPを生成させたのちに、
テアニン関連物質合成工程を開始ないし実施
する態様がありうる。糖醗酵工程もテアニン関連物質合成工程も
微生物の作用の下に行なわれるから、両工程
を単一種の微生物、すなわちグルタミン合成
酵素ないし該酵素生成能とATP生成能とを
併有する微生物、によつて行なうことができ
る。しかし、糖の醗酵系に異種微生物の強力
なグルタミン合成酵素系を別に添加して行な
う方が効果的である。本発明における重要な反応因子の一つは、
リン酸の存在である。FDPの醗酵生産を行
なつた後にテアニン関連物質の生産を行なう
場合には、反応液中に充分量のリン酸化合物
が存在するので、特別に無機リン酸を補足す
る必要はない。本発明における他の重要な反応因子は、金
属塩の存在である。塩化マグネシウムや硫酸
マグネシウムなどのマグネシウムイオンは、
テアニン関連物質の合成に必要である。さら
に、塩化マンガンや塩化コバルトなどのマン
ガンイオン（Mn⁺⁺）やコバルトイオン
（Co⁺⁺）をマグネシウムイオン（Mg⁺⁺）と共
存させると、合成産物の収量は増大する。 (2) 糖の醗酵本発明における醗酵化学エネルギー生成微
生物としては、糖の醗酵によつてFDPを生
成すると同時にFDPからATPを生成する能
力を有するサツカロミセス
（Saccharomyces）属の微生物、特に酵母、
が一般に利用できる。本発明で使用可能な微生物の具体例を挙げ
ればサツカロミセス・セレビシエIFO0216、
サツカロミセス・ウバルムIFO1264および同
IFO0751、その他がある。これらの微生物の菌体を得るためには通常
の培養法が用いられる。これらの微生物は溶
媒処理菌体、破砕菌体、乾燥菌体、無細胞標
品など各種の形態で使用できる。 (3) テアニン関連物質の合成テアニン関連物質の合成はグルタミン合成
酵素の作用によつて行なわれる。この酵素反応での基質の一つであるＬ−グ
ルタミン酸は、遊離の酸の外に塩、特に水溶
性塩、就中アルカリ金属塩、であることがで
きる。もう一方の基質である低級アルキルアミン
は先ず、アミド化反応に関与すべきところか
らモノアルキルアミンまたはジアルキルアミ
ンであるべきである。特に、モノアルキルア
ミンが好ましい。また、アルキル基は低級、
特に炭素数３以下程度、であるべきである。
従つて、本発明で対象とする低級アルキルア
ミンの好ましい具体例は、モノメチルアミン
およびモノエチルアミンである。この酵素反応にはATPが必須であつて、
従つてATPも基質の一つというべきである
が、本発明ではこのATPを糖醗酵工程から
in situで生産されたもので賄なうことは前
記したところである。テアニン関連物質合成は、Ｌ−グルタミン
酸および低級アルキルアミン（およびATP）
を基質とするグルタミン合成酵素の作用によ
つて行なわれる。グルタミン合成酵素として
は合目的的な任意のものが利用でき、またこ
のような酵素は種々の微生物から得ることが
できる。適当な微生物としては、コリネバク
テリウム・グルタミクム（C.glutamicum）
ATCC13032、コネリバクテリウム・グルタ
ミクムATCC13060、マイクロコツカス・グ
ルタミクスATCC13059、ブレビバクテリウ
ム・フラブム（Brevibacterium flavum）
ATCC14067、ブレビバクテリウム・アンモ
ニアゲネス（Brevibact.ammoniagenes）
ATCC6871、ブレビバクテリウム・アンモニ
アゲネスATCC6872などがあげられる。本発明においてはこれらの微生物の各種処
理標品、たとえば菌体磨砕物、超音波処理菌
体、溶剤処理菌体、低温乾燥菌体、無細胞抽
出液、硫安塩析物、精製酵素標品、固定化し
たもの、などを利用することができる。な
お、これらの微生物から効率よくグルタミン
合成酵素を得る方法として、本発明者らの一
部による特公昭61−26355号公報記載のもの
がある。基質として添加するグルタミン酸の量には
特に制限はないが、反応後に未反応のグルタ
ミン酸が残存しないように調節すれば、反応
液からのテアニン関連物質の単離および精製
を容易に行なうことができる。アルキルアミ
ンは400ｍＭレベル以上に高濃度に添加する
と、反応が阻害される結果、生産物の収量が
低下する。しかし、アルキルアミンを数回に
分割して添加する方法によれば、各添加時に
400ｍＭ以上の濃度にならない限り、メチル
アミンもしくはエチルアミンの総添加量を多
くすることができ、その結果としてグルタミ
ン酸基準のテアニン関連物質収率を向上させ
ることができる。反応は、軽い撹拌条件下で行なうのが好ま
しい。反応温度は10〜60℃、反応PHは６〜11の範
囲が望ましい。本発明の好ましい実施態様に
従つて反応をPH７〜10のアルカリ側で行なう
と、生産収率が著しく高まる。通常３〜60時
間反応を継続して行なうと、著量のテアニン
関連物質が蓄積される。なお、これらの反応
条件は糖の醗酵条件ともなることはいうまで
もない。反応液からテアニン関連物質を分離するに
は、たとえば通常のイオン交換樹脂への吸着
および溶離（たとえばアンモニア液等によ
る）によればよい。溶離されたテアニン関連
物質は、常法により濃縮および精製し、必要
に応じて結晶として回収することができる。３実験例実施例１ (1) フラクトース−１，６−二リン酸（FDP）
から醗酵化学エネルギー（ATP）を生成する
能力を有する市販パン酵母の乾燥菌体を、次の
ようにして調製した。肩付フラスコ（２リツト
ル容）４本に、グルコース５％、硫安0.5％、
KH₂PO₄0.5％、酵母エキス0.2％、コーンステ
イープリカー0.5％、ペプトン0.2％、MgSO₄・
5H₂O0.05％（PH6.0）からなる培地500mlを添
加して殺菌したのち、酵母を接種して、28℃で
40時間振盪培養した。得られた菌体は減圧条件
下で乾燥し、４℃で保存した。 (2) コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC13032のグルタミン合成酵素を、次のよ
うにして調製した。 (1) 菌体の培養 30リツトル容ジヤーフアーメンターに、グ
ルコース１％、グルタミン酸ソーダ15ｍＭ、
酵母エキス0.2％、KH₂PO₄0.05％、
K₂HPO₄0.05％、MgSO₄・5H₂O0.03％（PH
7.0）を含む培地25リツトルを仕込んで殺菌
したのち、コリネバクテリウム・グルタミク
ムを接種して、28℃で24時間好気培養を行な
つた（撹拌150rpm、通気量20／分）。 (2) グルタミン合成酵素の調製培養後、連続遠心分離して得られた菌体を
0.01Mリン酸カリ緩衝液（PH6.0、０℃）に
懸濁させ、「ダイノーミル」（Dino Mill）で
菌体を破壊したのち、遠心分離して、無細胞
抽出液を得た。無細胞抽出液にリン酸緩衝液
を0.1M、塩化マンガンを0.02Mになるよう
加え、50℃／10分間の熱処理を行なつた。次
に、遠心分離して得られた上澄液に硫安を加
えて、65％飽和とした。得られた沈殿物を
0.01Mリン酸緩衝液に溶かし、同緩衝液に対
して透析した。この透析内液を、DEAE−セ
ルロースカラム（前もつて0.01Mリン酸緩衝
液、PH6.0で平衡としたもの）に吸着させた
のち、同緩衝液で洗浄した。ついで、同緩衝
液中の食塩濃度を段階的に高めて、酵素を溶
出させた。グルタミン合成酵素活性は、食塩
0.3〜0.35Mの画分に溶出した。比活性の高
い画分を集め、硫安70％飽和として懸濁状態
で４℃で保存した。使用時には醗酵標品をリ
ン酸緩衝液に溶かし、透析して用いた。本醗
酵標品の比活性は、100単位／mgタンパク質
前後であつた。ただし、酵素単位としては、
37℃で１分間に触媒される量が1μモルのと
き１単位とした。 (3) γ−グルタミルメチルアミドの生成反応は、
次のようにして行なつた。基本反応液組成リン酸カリ緩衝液（PH7.0） 200μモル／ml グルコース 200 〃Ｌ−グルタミン酸ソーダ 100 〃モノメチルアミン 300 〃 MgCl₂ 15 〃 ATP ２〃上記反応液に酵母の乾燥菌体とグルタミン合
成酵素とを添加し、28℃で５時間振盪しながら
反応させたところ、γ−グルタミルメチルアミ
ドの生成量として表１に示す結果を得た。

【表】実施例２実施例１に準じて調製した酵母の乾燥菌体とグ
ルタミン合成酵素を用いた。基本反応液組成リン酸カリ緩衝液（PH7.0） 200μモル／ml グルコース 200 〃Ｌ−グルタミン酸ソーダ 100 〃モノメチルアミン 300 〃 MgCl₂ 15 〃あるいは MgCl₂ 15 〃＋ MnCl₂ ５〃酵母の乾燥菌体量 40mg／ml グルタミン合成酵素量 400単位／ml 上記反応液を28℃で４時間反応させたところ、
表２に示す結果を得た。

【表】実施例３実施例１に準じて調製した酵母の乾燥菌体とコ
リネバクテリウム・グルタミクムの無細胞抽出液
を用いた。基本反応液組成リン酸カリ緩衝液（PH7.0） 200μモル／ml グルコース 200 〃モノメチルアミン 200 〃グルタミン酸ソーダ 150 〃 MgCl₂ 15 〃酵母の乾燥菌体 40mg／ml 細胞の無細胞抽出液（タンパク量） 25mg／ml 上記反応液を５時間28℃で反応させたところ、
γ−グルタミルメチルアミド25μモル／mlが生成
した。実施例４実施例１に準じて調製した酵母の無細胞抽出液
とブレビバクテリウム・フラブムATCC14067の
グルタミン合成酵素標品を用いた。基本反応液組成リン酸カリ緩衝液 50μモル／ml FDP 40 〃グルタミン酸ソーダ 50 〃モノエチルアミン 50 〃 ATP 2μモル／ml NAD（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）
50μｇ／ml TPP（サイアミンピロリン酸） 50μｇ／ml 酵母の無細胞抽出液（タンパク量）４mg／ml グルタミン合成酵素標品（タンパク量）10mg／ml 上記反応液をPH8.5に調整したのち、28℃で３
時間反応を行なつたところ、テアニン（γ−グル
タミルエチルアミド）10μモル／mlが生成した。実施例５実施例１に準じて酵母の無細胞抽出液とブレビ
バクテリウム・アンモニアゲネスATCC6872のグ
ルタミン合成酵素を調製した。第一段階フラクトース二リン酸の生成反応：リン酸カリ（PH7.0） 100μモル／ml グルコース 100 〃 MgCl₂ 20 〃 ATP ２〃 MAD 50μｇ／ml TPP 50μｇ／ml 酵母の無細胞抽出液（タンパク量）８mg／ml 上記反応液を37℃で３時間反応させて、FDP
を生成させた。この反応液を加熱して反応を止
め、遠心分離して上澄液を得た。この上澄液を
1.5mlとり、グルタミン酸ソーダ25μモル、エチル
アミン25μモル、酵母の無細胞抽出液８mg（タン
パク）、グルタミン合成酵素20mg（タンパク）を
加え、PHを8.5に調整し、かつ全量を２mlとした。
この反応液を30℃、３時間反応させたところ、テ
アニン5μモル／mlが生成した。実施例６実施例１に準じて精製したグルタミン合成酵素
を常法にしたがつてポリアクリルアミド及びカラ
ギーナンで固定化酵素標品とした。得られた固定化酵素標品を用い、酵素源以外は
実施例１に示す反応液組成で28℃、８時間振盪し
ながら反応させたところ、γ−グルタミルメチル
アミドの収量として表３の結果を得た。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】１サツカロミセス属に属する微生物による糖の
醗酵により生成するアデノシン三リン酸をエネル
ギー源として、グルタミン合成酵素の存在下でＬ
−グルタミン酸とモノまたはジ低級アルキルアミ
ンとを反応させ、生成した対応γ−Ｌ−グルタミ
ル低級アルキルアミドを採取することを特徴とす
る、微生物によるテアニン関連物質の製造法。２低級アルキルアミンがメチルアミンまたはエ
チルアミンである、特許請求の範囲第１項記載の
方法。