JPH0147155B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はグルタチオンの製造法に関し、更に詳
しくはグルタチオンの合成酵素系の制御機構が解
除されたエシエリヒア属に属する微生物を用いて
グルタチオンを製造する方法に関する。 グルタチオンはＬ−グルタミン酸、Ｌ−システ
イン及びグルシンより成るトリペプチドであり、
肝疾患治療剤、解毒剤などして有用な物質であ
り、また生化学的試薬としても有用な物質であ
る。 従来、微生物を用いてグルタチオンを製造する
方法としては、酵母菌体よりグルタチオンを抽出
する方法、膜透過性のよい乾燥酵母にＬ−グルタ
ミン酸、Ｌ−システイン及びグリシンを含有する
基質溶液を接触させてグルタチオンを生成させる
方法、酵母や大腸菌の菌体に基質溶液を接触させ
てグルタチオンを生成させるに際しATP再生系
を共役させる方法などが知られている。しかしな
がら、工業的製法としてみた場合、これらの方法
はグルタチオンの生産量が必ずしも満足しうるも
のでなかつた。 本発明者らは、かかる状況に鑑み、微生物を用
いて工業的有利にグルタチオンを製造する方法を
見い出すべく種々研究を重ねた結果、エシエリヒ
ア属に属し、γ−グルタミルシステイン合成酵素
活性及びグルタチオン合成酵素活性を有しかつグ
ルタチオンによるγ−グルタミルシステイン合成
酵素への阻害が解除された微生物が、Ｌ−グルタ
ミン酸、Ｌ−システイン及びグリシンよりグルタ
チオンを製造する際の優れた酵素源となりうるこ
とを見い出し、本発明を完成するに至つた。 すなわち、本発明は上記微生物を培養し、かく
して得られた菌体もしくは該菌体の処理物をＬ−
グルタミン酸、Ｌ−システイン及びグリシンを含
有する基質溶液と接触させ、生成したグルタチオ
ンを採取することからなるグルタチオンの製造法
である。 本発明で使用する微生物は、エシエリヒア属に
属し、γ−グルタミルシステイン合成酵素（E.
C.6.3.2.2.、以下本酵素をGSH−と称する）活
性及びグルタチオン合成酵素（E.C.6.2.3.2.、以下
本酵素をGSH−と称する）活性を有し、かつ
グルタチオンによるGSH−への阻害が解除さ
れた微生物であればいずれも使用することがで
き、かかる微生物の代表的な例としてはGSH−
活性及びGSH−活性を有し、かつグルタチ
オンによるGSH−への阻害が解除されたエシ
エリヒア・コリが好適に挙げられる。 上記菌株は例えば次の如くして取得することが
できる。まず、GSH−活性及びGSH−活性
を有するエシエリヒア・コリの野性株（例えば、
エシエリヒア・コリB355）に変異を誘起せしめ
てシステイン要求株及びメチルグリオキサール耐
性株を取得する。変異の誘起は通常の変異誘起処
理により行なうことができ、例えばＮ−メチル−
N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンの如き変
異誘起剤で処理することにより実施することがで
きる。システイン要求株の取得は変異誘起処理し
て得られる菌株をシステイン２×10^-5Mを含む最
少培地（例えば、K₂HPO₄0.7％、KH₂PO₄0.3％、
（NH₄）₂SO₄0.1％、グルコース0.5％の組成の培
地、以下DM培地と称する）で培養し、生じた小
コロニーを釣菌分離することにより取得すること
ができる。一方、メチルグリオキサール耐性株は
前記の変異誘起処理して得られる菌株をメチルグ
リオキサールを含むDM培地に培養し、生じた大
きなコロニーを釣菌分離することにより取得する
ことができる。次いで、上記で取得したシステイ
ン要求株を含む最小培地に上記メチルグリオキサ
ール耐性株を培養し、コロニーの周辺にハローを
作らないコロニーを釣菌分離してGSH−欠損
株（例えば、エシエリヒア・コリC912）を取得
する。次いで、このGSH−欠損株に前記と同
様の処理手段で変異を誘起せしめたのち、８−ハ
イドロキシキノリンを含むDM培地で培養し、生
ずるコロニーを釣菌分離することにより、GSH
−活性及びGSH−活性を有し、かつグルタ
チオンによるGSH−への阻害が解除された菌
株を取得することができる。かくして得られる菌
株の例としては、例えばエシエリヒアＰ・コリ
RC912（微工研条寄第47号）が挙げられる。 上記の如くして取得した本発明の微生物を培養
するに際して用いられる培地としては、炭素源、
窒素源、無機物などを程よく含有するものであれ
ば、合成培地または天然培地のいずれも使用でき
る。炭素源としては、例えばグルコース、シユー
クロース、フラクトース、でん粉、でん粉加水分
解物、糖密などの種々の炭化水素が使用でき、そ
の使用量は0.5〜5.0％程度が好ましい。また窒素
源としては、例えば硫酸アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ムなどの各種の無機および有機アンモニウム類、
あるいはペプトン、酵母エキス、コーンスチープ
リカー、カゼイン加水分解物などの窒素性有機物
などが使用でき、その使用量は0.5〜2.0％程度が
好ましい。更に無機物としては、例えばリン酸第
１水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸
マグネシウム、硫酸マンガンなどが使用でき、そ
の使用量は0.005〜0.5％程度が好ましい。 培養は振とう培養あるいは通気かく拌培養など
の好気的条件下に行なうのが好ましい。培養温度
は25〜37℃が好適であり、培養期間は通常16〜40
時間程度で充分である。 培養終了後、増殖した菌体を集め、該菌体もし
くは該菌体の処理物を酵素源とする。ここに菌体
の処理物としては、例えば乾燥菌体、超音波処理
などにより得られる無細胞抽出液、該抽出液より
精製された酵素等のほか、菌体あるいは精製酵素
を例えばポリアクリルアミドゲル包括法、カラギ
ーナンゲル包括法等の方法によつて固定化して得
られる固定化菌体、固定化酵素なども好適に挙げ
られる。 上記の如き酵素源をＬ−グルタミン酸、Ｌ−シ
ステイン及びグリシンを含む基質溶液と接触させ
て酵素反応させることによりグルタチオンを生成
させることができる。基質溶液中のＬ−グルタミ
ン酸の濃度は５〜50mM、Ｌ−システインの濃度
は５〜50mM、グリシンの濃度は50〜100mM程
度が好ましい。本酵素反応はPH７〜8.5で行なう
のが好ましく、反応温度は20〜50℃、とりわけ30
〜37℃が好適である。尚、本酵素反応を効率よく
実施するために、本酵素反応をアデノジン−5′−
リン酸（ATP）再生系と共役させるのが好まし
い。ATP再生系としては、本発明の微生物が有
するアセトキナーゼ、解糖系酵素、カルバミルリ
ン酸キナーゼ、ピルビン酸キナーゼなどによる反
応を利用することができ、例えばアセトキナーゼ
による反応を利用する場合には、基質溶液中にマ
グネシウムイオンをマグネシウム塩（例えば硫酸
マグネシウム、塩化マグネシウム）として５〜
20mM、アデノシン−5′−三リン酸（ATP）を２
〜5mM、及びアセチルリン酸を５〜10mM程度
存在させておくのが好ましい。 かくして反応終了液中にグルタチオンが生成蓄
積するが、生成したグルタチオンはイオン交換樹
脂処理の如き公知の方法で単離精製することがで
きる。例えば、反応終了液を硫酸でPH３とした
後、カチオン交換樹脂（例えばDiaion PK−
228H⁺）に導通する。吸着したグルタチオンを
0.5M水酸化アンモニウムで溶出し、溶出液を硫
酸でPH4.5とした後、アニオン交換樹脂（例えば
Duolite A2 CH₃COO^-型）に導通する。吸着し
たグルタチオンを0.5M硫酸で溶出し、溶出液に
50％エタノールを加え、折出した結晶を単離する
ことにより、グルタチオンを取得することができ
る。 以下、本発明の実施例を示す。 実施例 １ 下記第１表に示す菌株をグルコース0.5％、リ
ン酸第一水素カリウム0.3％、リン酸第二水素カ
リウム0.7％、硫酸マグネシウム・７水和物0.01
％、硫酸アンモニウム0.1％の組成の培地（PH
7.0）に接種し、37℃で16時間振とう培養した。
培養終了後、遠心分離により菌体を集め、超音波
処理により無細胞抽出液を調製した。この無細胞
抽出液0.05mlを、Ｌ−グルタミン酸25mM、Ｌ−
システイン25mM、グリシ50mM、塩化マグネシ
ウム10mM、アセチルリン酸10mM及び
ATP5mMを含む50mMトリス緩衝液9.95mlに加
え、37℃で１時間酵素反応させた。反応終了後、
反応液中のグルタチオン量を定量し、菌体蛋白１
mg当りのグルタチオン生成量を算出した。その結
果は下記第１表の通りであつた。 【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ エシエリヒア属に属し、γ−グルタミルシス
   テイン合成酵素活性及びグルタチオン合成酵素活
   性を有しかつグルタチオンによるγ−グルタミル
   システイン合成酵素への阻害が解除された微生物
   を培養し、かくして得られた菌体もしくは該菌体
   の処理物をＬ−グルタミン酸、Ｌ−システイン及
   びグリシンを含む基質溶液と接触させ、生成した
   グルタチオンを採取することを特徴とするグルタ
   チオンの製造法。 ２ 微生物がγ−グルタミルシステイン合成酵素
   活性及びグルタチオン合成酵素活性を有しかつグ
   ルタチオンによるγ−グルタミルシステイン合成
   酵素への阻害が解除されたエシエリヒア・コリで
   ある特許請求の範囲第１項記載の製造法。 ３ マグネシウムイオン、アデノシン−5′−三リ
   ン酸及びアセチルリン酸の存在下に、菌体もしく
   は該菌体の処理物を基質溶液と接触させる特許請
   求の範囲第１項又は第２項記載の製造法。