JPH02117392A - Ｌ−２−アミノ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は除草活性を有し除草剤として有用であるＬ−２
−アミノ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−酪
酸（特公昭６１−５６２１０号公報または米国特許第４
．２６５，６５４号明細書参照）の製造法に関する。

（従来の技術及び発明が解決しようとする課題）次式（
１ン　　　Ｏ ＯＨＮｌ２ で示されるＬ−２−アミノ−４−（ヒドロキシメチルホ
スフィニル）−酪酸はホスフィノトリシンとも呼ばれる
除草活性を有する化合物で除草剤として有用である。Ｌ
−２−アミノ−４−（ヒドロキシンメチルホスフィニル
）−Ｍ酸（Ｕ下、Ｌ−ＡＭＰＢと称する。）の製造法と
しては、ストレプトミセス属に属する菌株を好気的条件
下で培養し。

その培養液から採取する方法が本発明者らによって公開
されている（特公昭６３−８７６０公報）。

更に、Ｌ−ＡＭＰＢを大量に製造する方法として、Ｌ−
ＡＭＰＢに対応する２−オキソカルボン酸である４−（
ヒドロキシメチルホスフィニル）−２−オキソ−酪酸を
合成法で製造したのち、同化合物を基質として、アミノ
基供与体としてアミノ酸の存在下、酵素反応によってア
ミノ化してＬ−ＡＭＰＢを製造する方法が本発明者らに
よって報告されている（特願昭６２−１３９９３３）。

基質として用いる４−（ヒドロキシメチルホスフィニル
）−２−オキソ−酪酸は公知の物質でその製造法は例え
ば特開昭５６−９２８９７号公報または米国特許第４．
３９９．２８７号明細書に記載されている。

除草剤を開発工業化する際、前述したような大量に製造
する技術を持つことが必要であるが、同時にまた低コス
トで製造することが不可欠である。

Ｌ−ＡＭＰＨに対応する２−オキソカルボン酸である４
−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−２−オキソ−酪
酸（以下ＯＭＰＢと称する。）を合成法で製造し、アミ
ノ酸をアミノ基供与体として用いてＬ−ＡＭＰＢを製造
するという前述の方法では。

アミノ酸をアミノ基供与体として用いるためグルタミン
酸やアスパラギン酸などのアミノ酸のコストが最終産物
であるＬ−ＡＭＰＢの製造コストに大きく響いてくるこ
とは明らかである。

（課題を解決するための手段） 前述した問題点を解決するために１本発明者らは、アミ
ノ酸に替わるアミノ基供与体のスクリーニングを行った
。アミノ酸以外のアミノ基供与体としてアンモニウムイ
オンが考えられ１本発明者らによって、グルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼを用いたＯＭＰＢの還元的アミノ化の例
が報告されている（特願昭６２−１３９９３３実施例１
）。しかし、アミノ基供与体としてアンモニウムイオン
を用いる前述の方法では、アミノ酸をアミノ基供与体と
するＡＭＰＢの製造法に比べ、変換率が低いという欠点
を有していた。そこで更に各種微生物を用いてＯＭＰＢ
を基質としてＬ−ＡＭＰＢを生成する反応において、ア
ミノ酸に替わるアミノ基供与体をスクリーニングした結
果、ＯＭＰＢの他にフマール酸及びアンモニウムイオン
を添加して反応することにより、基質ＯＭＰＲから、そ
のアミノ化生成物であるＬ−ＡＭＰＢへの変換率が著し
く向上するという驚くべき事実を見出した。２−オキソ
カルボン酸から対応するアミノ酸を製造する際にフマー
ル酸及びアンモニウムイオンを用いる方法は、既に蛋白
質の構成アミノ酸であるＬ−フェニルアラニンの製造法
の例が報告されている（特開昭６１−１４１８９３）が
、蛋白質の構成アミノ酸以外の。

燐を含む特異な構造を有するアミノ酸であるＬ−ＡＭＰ
Ｈの製造に用いられるのを発見したのは初めての例であ
り、フマール酸及びアンモニウムイオンを用いることに
よりＯＭＰＢを基質とする効率的なＬ−ＡＭＰＢ製造法
を確立し１本発明を完成した。すなわち本発明によって
、ＯＭＰＢを基質として対応するアミノ酸であるＬ−Ａ
ＭＰＢを生成する能力を有する微生物の培養物、菌体。

またはその加工物の存在下でＯＭＰＨにフマール酸及び
アンモニウムイオンを添加して反応させることを特徴と
するＬ−ＡＭＰＢの製造法が提供される。

本発明に用いられる微生物としては、フマール酸及びア
ンモニウムイオンの存在下、ＯＭＦＢを基質として、対
応するアミノ酸であるＬ−ＡＭＰＢを生成する能力を有
する微生物であれば、どのようなものでもよく、このよ
うな微生物の例としてフマール酸とアンモニアからアス
パラギン酸を生成する酵素であるアスパルターゼを有す
る微生物をあげることが出来る。すなわちエシェリヒア
属、シュードモナス属、タレプジエラ属、ブレビバクテ
リウム属、セラチア属、プロテウス属、バチルス属に属
する微生物が用いられる。このような微生物はＡＴＣＣ
，ＮＣＴＣ，ＩＡＭ等の微生物寄託機関から容易に入手
することができる。あるいは本発明の属する技術分野に
おいて通常の知識を有するものであれば、容易に自然界
よりアスパルターゼ活性及びＯＭＰＢを基質としてＬ−
ＡＭＰＲを生成する能力を指標として分離することが出
来る。アスパルターゼ活性の存在は、アスパラギン酸を
基質として酵素反応によって生成するフマール酸を２４
０ｍμの吸収変化で測定する方法（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ
　ｅｎｚｙｍｌｏｚｙじ３５４　（１９６９））によっ
て容易に確認することが出来る。このように自然界から
新たに分離した微生物であってもフマール酸及びアンモ
ニウムイオンの存在下、ＯＭＰＢを基質として、対応す
るアミノ酸であるＬ−ＡＭＰＢを生成する能力を有する
微生物であればすべて本発明の方法に用いることが出来
る。本発明に用いられる微生物は、他の微生物の場合に
見られるように、その性状が変化しやすく９例えば紫外
線。

エックス線、薬品等を用いる人工的変異手段で変異しう
るものであり、このような変異株であってもフマール酸
及びアンモニウムイオンの存在下。

ＯＭＰＢを基質として、対応するアミノ酸であるＬ−Ａ
ＭＰＢを生成する能力を有する微生物であればすべて本
発明の方法に用いることが出来る。

またアミノトランスフェラーゼやアスパルターゼの遺伝
子は公知の遺伝子操作方法によりクローニングされてお
り、これら酵素遺伝子を導入、形質転換した微生物であ
ってもフマール酸及びアンモニウムイオンの存在下、Ｏ
ＭＰＢを基質として。

対応するアミノ酸であるＬ−ＡＭＰＢを生成する能力を
有する微生物であればすべて本発明の方法に用いること
が出来る。

本発明の製造法において使用する微生物は１通常の微生
物が利用しうる栄養源を含有する培地で培養する。栄養
源としては９通常の微生物培養に利用されている公知の
ものが使用される。例えば炭素源としてはグルコース、
フラクトース、シュークロース、澱粉、グリセリン、フ
マール酸、クエン酸、リンゴ酸、水あめ、糖蜜等が挙げ
られ。

これらは単独または組み合わせて用いられる。また窒素
源としてペプトン、酵母エキス、コーンステイープリカ
ー、肉エキス、大豆粉、小麦胚芽の他、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム等が単独または
組み合わせて用いられる。その他必要に応じて炭酸カル
シウム、硫酸マグネシウム、食塩、塩化カリウム、燐酸
塩等の無機塩類を添加するほか、菌の発育を助け、ある
いはＯＭＰＢを基質として用いて、Ｌ−ＡＭＰＨの生成
を促進する作用を持つ有機物、無機物を適宜添加するこ
とが出来る。特に本発明に用いる微生物を、アスパルタ
ーゼ活性を誘導する作用の知られているアスパラギン酸
やフマール酸を添加した培地で培養することは非常に効
果的である。本発明の方法に用いられる微生物の培養法
としては。

通常の微生物の培養に用いられる公知の方法が用いられ
、培養に適した培地や培養温度はＡＴＣＣ等の寄託機関
のカタログに記載されている条件を用いることが出来る
。培養時間は、用いる微生物の発育やアスパルターゼ活
性及びＯＭＰＢを基質としてＬ−ＡＭＰＢを生成する能
力を指標にして。

容易に決めることが出来る。フマール酸及びアンモニウ
ムイオンの存在下、ＯＭＰＢを基質として、対応するア
ミノ酸であるＬ−ＡＭＰＢを生成するアミノ化反応にお
いては、用いられるフマール酸の量は基質ＯＭＰＢに対
しモル比で１〜４倍が好ましい。またアンモニウムイオ
ンは通常、アンモニア水としてフマール酸を中和する（
７）ニ必５な量が用いられる。アンモニウムイオンの替
わりに１分解してアンモニウムイオンとなる尿素等を用
いることも可能である。フマール酸及びアンモニウムイ
オンの存在下、ＯＭＰＢを基質として。

対応するアミノ酸であるＬ−ＡＭＰＢを生成するアミノ
化の反応に用いられる温度は３０〜７０℃である。反応
の至適温度は用いる微生物によって若干具なるが１本発
明の属する技術分野において通常の知識を有するもので
あれば、Ｌ−ＡＭＰＢの生成量を指標として容易に、用
いる微生物に適した反応温度を決定することが出来る。

同様に反応の至適ｐＨも決定することができるが１通常
はｐ）１８〜ｌＯで行われることが多い。

また本発明者らはフマール酸及びアンモニウムイオンの
存在下、ＯＭＰＢを基質として、対応するアミノ酸であ
るＬ−ＡＭＰＢを製造する本発明においてアミントラン
スフェラーゼの最も優れた基質として知られるグルタミ
ン酸を添加する事が。

極めて効果のある方法であることをみつけた。そのグル
タミン酸の添加量は用いる微生物や培養条件によって異
なる。経済的な観点も考慮して１通常は基質ＯＭＰＢと
等モル量以下の量が用いられる。フマール酸及びアンモ
ニウムイオンの存在下。

ＯＭＰＢを基質として、対応するアミノ酸であるＬ−Ａ
ＭＰＢを製造する零発、明の方法において。

上記微生物の培養液から分離した菌体の懸濁液の他、培
養液を直接用いる方法や、培養菌体より超音波やリゾチ
ーム処理等の公知の方法で抽出した酵素液を用いる方法
であっても、フマール酸及びアンモニウムイオンの存在
下、ＯＭＰＢを基質として、対応するアミノ酸であるＬ
−ＡＭＰＢを生成する能力を有すれば本発明の方法に使
用する事が出来る。また微生物や酵素を有機溶剤、架橋
剤。

担体等で固定化することによって、その安定性や操作性
が高まることが知られているが、このような公知の固定
化方法で処理した固定化微生物あるいは固定化酵素も、
フマール酸及びアンモニウムイオンの存在下、ＯＭＰＲ
を基質として、対応する１−アミノ酸であるＬ−ＡＭＰ
Ｂを生成する能力があれば本発明に使用出来る。本発明
の方法で生成されたＬ−ＡＭＰＢを含有する反応液から
のし−ＡＭＰＢの採取と精製は１通常のＬ−ＡＭＦＢ醗
酵製造法の培養液からのＬ−ＡＭＦＢの採取法及び精製
法と同一の要領で行うことが出来る。その詳細について
は特公昭６３−８７６０号公報の記載を照されたい。即
ち、ダウエックス５０Ｗ等の陽イオン交換樹脂にＬ　−
、Ａ　Ｍ　Ｐ　Ｂを吸着させ、水あるいは希アンモニア
水で展開、溶離する方法やダウエックスｌＸ２等の陰イ
オン交換樹脂に吸着し酢酸水溶液等で溶離する方法が利
用出来る。本発明で得られたＬ−ＡＭＰＢは、その除草
効力を試験したところ、特公昭６３−８７６０号公報の
醗酵的方法で得られたＬ−ＡＭＰＢと同等の除草効力を
示すことが認められた。以下、実施例により本発明を更
に詳しく説明するが本発明はこれに限定されるものでは
ない。

実施例１ アスパラギン酸ナトリウム１．２％、ペプトン０．５％
、酵母エキス０．３％、燐酸二カリＯ−２％、硫酸マグ
ネシウム０．０５％の組成からなる培地（ｐＨ７，２）
３０ｍＱを含む三角フラスコに第−表に示す微生物を。

各々ｌエーゼずつ植菌し、３７℃、　２２Ｏｒｐｍの条
件で一夜、振盪培養する。培養液を遠心分離することに
より集菌しｌｏＯｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，５
）を加えて３ｍ１２の菌懸濁液を調製する。この菌懸濁
液にＯＭＰＢ、アンモニア水で中和したフマール酸、グ
ルタミン酸ナトリウムを各々最終濃度でＬｏｏｍ　Ｍ　
、　２００ｍ　Ｍ　、　２０ｍ　Ｍとなるように添加し
たのち５ｍＱとし９反応液とする。反応液をＬ字管に分
注して、３７°０．１００ｒｌ）Ｉｌｌで２４時間反応
させる。

反応後、塩酸でｐＨ３に調製したのち、遠心分離して上
清液を得る。反応により生成した上溝液中のＬ−ＡＭＰ
Ｂはアミノ酸分析器により定量した。

また同様に調製した菌懸濁液３ｍ１２を超音波処理（Ｋ
ＵＢＯＴＡ　ｌＮ５ＯＮＡＴＯＲ２００Ｍ　、１．５Ａ
　、　３分）したのち遠心分離することにより細胞抽出
液を得る。この細胞抽出液中のアスパルターゼ活性をメ
ソッドインエンジモロギイ（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｚｙ　１３３５４　（１９６９））に記載
された方法、で測定した。結果を第−表に示すが、概ね
アスパルターゼ活性とＬ−ＡＭＰＢ生成量に相関関係が
見られた。

第−表 供試微生物　　　　　　　　　　ＡＢ Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＣＴＣ８１９６１
２，０８０，０Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＩ
ＨＪ’ＪＣ２１２，５７１，８Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｕｓ
　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　　　　２．２　　８１．７Ｎ
ＣＴＣ１０４９０ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　　　　
　１．２　　１３．９ＡＴＣＣ１００３１ Ｓｅｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　ＩＡＭ１２２
３　０．１　　７．６Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉ
ｓ　ＡＴＣＣ１３３１５２，２１ｌ−２Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＡＴＣＣ６６３３７，７４３−
２Ａ：アスパルターゼ活性（ｕ／ｍＱ） Ｂ：生成Ｌ−ＡＭＰＢ量（ｍＭ） 実施例２ （１）バクトトリズシン（デイ７コ）１．０％、酵母エ
キス（デイフコ）０．５％１食塩０．５％、グルコース
０．１％からなる培地（Ｌ−ブロス、ｐＨ７−７−０）
４０を含む２５０ｍ１２容の三角フラスコにエシェリヒ
ア・コリＮＣＴＣ８１９６をｌ工−ゼ植菌し、３７°０
．２２Ｏｒｐｍの条件で一夜、ｖＢ盪培養したもの１０
ｍ１を種母として、アンモニア水で中和シたフマール酸
３％、コーンステイープリカー２％、燐酸二カリ　０．
２％、硫酸マグネシウム０６０５％、炭酸カルシウム０
．０５％からなる培地（ｐＨ７，０）　２Ｑを仕込んだ
ジャーファーメンタ−（いわしや製、３Ｑ）植菌し１６
時間通気撹拌培養する。得られた培養液１．８６ｆｆを
遠心分離してＯ，１Ｍ−トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，５
）で洗浄し、　１７．０８ｇの菌体を得た。菌体０．４
６７ｇを量り、　ｌｏｏｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８，５）に懸濁し、　ＯＭＰＢ、アンモニア水で中和し
たフマール酸、グルタミン酸ナトリウムを各々最終濃度
で第二表に記載した濃度になるように添加し、ＩＯ＋ｎ
Ｑとして反応液とする。この反応液を１００ｍＱ容の三
角フラスコに入れ、３７℃、　２００ｒｐｍで２２時間
反応させた後に生成するＬ−ＡＭＰＢの量を比較した。

その結果、第二表に示すようにフマール酸とアンモニウ
ムイオンの存在下で基質ＯＭＰＢからＬ−ＡＭＰＢが生
成すること、及びグルタミン酸の添加によりＬ−ＡＭＰ
Ｈの生成量が向上することが明らかである。

（２）また菌体量を帆９３４ｇ、１．８６８ｇに変えて
、（１）と同様に反応させた結果を第三表に示す。用い
る菌体量を増加させると、　ＯＭＰＢからＬ−ＡＭＰＢ
の変換率が高まることが明らかである。また第二表、第
三表に記載した反応条件の範囲で工業的に有用なＬ−Ａ
ＭＰＲ・製造法が提供される。

第二表 添加物濃度（ｍＭ）と反応条件 ＯＭＰＢ　　ＦＵＭ−ＮＨ，ＧＬＵ　　ｐＨ温度生成Ｌ
−ＡＭＰＢ量（ｍＭ）１００　２００　　　２０　　ｇ
、５　３７°ｃ　　　ｇｏ、。

ｔｏｏ　　２００　　　２０　８．５　４５　　　８０
．７１００　２００　　　２０　８．５　６０　　　８
２．８１００　２００　　　２０　７．５　３７　　　
５９．１１００　２００　　　２０　９．５　３７　　
　４７．７ｔｏｏ　　２００　　１００　８．５　３７
　　　９３．１１００　２００　　２００　８．５　３
７　　　９６．０１００　２００　　　０　８．５　３
７　　　２１．８１００　４００　　　２０　８．５　
３７　　　７８．０２００　４００　　　２０　８．５
　３７　　　９６．０３００　６００　　　２０　８．
５　３７　　　１１４．９第三表 ＯＭＰＢ　ＦＵＭ−ＮＨ３ 〃　　　　　〃 添加物濃度（ｍＭ）と反応条件 ＬＵＡＢＣ ２００，４６７１１５，０５７，５ ＬＬ　　　Ｏ，９３４１５７，３７８，７〃１．８６５
　１９２．９　９６．５ ｐＨはすべて８．５．温度はすべて３７°ＣＡ：菌体量
（ｇ／　ｌＯｍＱ） Ｂ：生成Ｌ−ＡＭＰＢ（ｍＭ） Ｃ：変換率 実施例３ エシェリヒア・コリ　ＮＣＴＣ８１９６を用い、実施例
２（１）と同様に培養した後、培養液１．９１２を遠心
分離して菌体を集め、ＯＭＰＢ、アンモニア水で中和し
たフマール酸、及びグルタミン酸ナトリウムを各々最終
濃度で２００ｍＭ　、　３００ｍＭ　、　２０ｍＭとな
るように添加してｐＨを８．５に調製しｌｏＯｍＱとし
たものを反応液とする。この反応液をｐＨ８，５に維持
したまま３７℃で２４時間緩やかに撹拌して反応させた
後。

塩酸でｐＨ３にして遠心分離すると約１００＋＋＋＋２
の反応濾液が得られた。反応源液中のＬ−ＡＭＰＢ濃度
をアミノ酸分析器で定量したところ、約１９０ｍＭであ
った。次いでこの反応濾液をダウエックス５０Ｗ（Ｈゝ
型）の陽イオン交換樹脂１００＋＋＋Ｑのカラムに通し
た後、水で展開した。得られたＬ−ＡＭＰＢを含む両分
を、更にダウエックスｌＸ２（ＣＨ３Ｃ００−型）の陰
イオン交換樹脂１００ｍ（＋のカラムにかけた後、水洗
し、　０．３Ｎの酢酸水溶液で溶離した。溶離液のＬ−
ＡＭＰＢを含む画分を濃縮乾固した後、得られたＬ−Ａ
ＭＰＢの白色粉末をメタ外線吸収スペクトル、核磁気共
鳴スペクトル、質量分析法で分析したところ、Ｌ−ＡＭ
ＰＢの標品と完全に一致することが確認された。

（発明の効果） 本発明はフマール酸及びアンモ・ニウムイオンの存在下
に、ＯＭＰＢを基質として、その対応するアミノ酸であ
るＬ−ＡＭＰＢを製造する方法に関するものであり、実
施例に示すようにＯＭＰＢは高収率でＬ　−Ａ　Ｍ　Ｐ
　Ｂに変換され、従来のアミノ酸をアミノ基供与体とし
て用いる方法に比べて効率的で、安価な大量製造法を提
供することが出来た。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−２−オ
   キソ−酪酸をアミノ基供与体の存在下、トランスアミネ
   ーション能力を有する微生物の培養物、その菌体、また
   はその加工物で処理することによりＬ−２−アミノ−４
   −（ヒドロキシメチルホスフィニル）−酪酸を製造する
   とき、アミノ基供与体として少なくともフマール酸及び
   アンモニウムイオンを使用することを特徴とするＬ−２
   −アミノ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−酪
   酸の製造法。
2. （２）特許請求の範囲第一項記載のＬ−２−アミノ−４
   −（ヒドロキシメチルホスフィニル）−酪酸の製造時に
   アミノ基供与体としてフマール酸及びアンモニアの他に
   グルタミン酸を添加することからなる特許請求の範囲第
   一項記載の方法。