JPH01296993A

JPH01296993A - 醗酵法によるｌ−スレオニンの製造法

Info

Publication number: JPH01296993A
Application number: JP12699888A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Ouchi; 大内　博志; Yoshiyuki Sawazaki; 澤崎　義行; Isao Koya; 小屋　功
Original assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 1988-05-26
Filing date: 1988-05-26
Publication date: 1989-11-30
Anticipated expiration: 2011-03-06
Also published as: JPH0822233B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕Ｌ−スレオニンは、必須アミノ酸の一つであり医薬品や
食品添加物、飼料添加物等に利用されている。本発明は
、醗酵法によるし一スレオニンの製造方法に関するもの
である。

〔従来の技術〕

従来、プロテウス属に属する微生物を用いた醗酵法によ
るし一スレオニンの製造法として、具体的な種として、
プロテウス　レトゲリが多く使用されてきた。しかし、
現在このプロテウス・レトゲリは、バーシーズ　マニュ
アル　オブ　システマティック　バクテリオロジー　第
１版（ＢＥＲＧＥＹ’Ｓ　　ＭＡＮＵＡＬ　　ＯＦ　　
Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　
　Ｖｏｌｕｍｅ　　１）では、プロビデンシア属に属し
ている。

プロテウスまたはプロビデンシア属に属する微生物を用
いた酌酵法によるし一スレオニンの製造法としては、例
えばＬ−イソロイシン要求性を育する微生物を用いる方
法（特公昭４３−４４４０）が知られている。

〔発明が解決しようとする課題　〕

しかし、この方法によるし一スレオニンの生成蓄積濃度
は高価なホモセリンを培地に添加しない限り十分に満足
できるものではなかった。本発明者らは、ホモセリンを
使用しない場合でも生産性の高いし一スレオニンの製造
法について鋭意研究した結果、プロビデンシア属に属し
８−アザグアニン耐性を有する変異株が著量のＬ−スレ
オニンを蓄積することを見出し本発明を完成するに至っ
た。

〔課題　を解決するための手段〕

本発明は、プロビデンシア属に属し、８−アザグアニン
耐性を有し、かつＬ−スレオニン生産能を有する微生物
を培養し、培地中にＬ−スレオニンを生成蓄積せしめ、
該培養物からし一スレオニンを採取することを特徴とす
る酩酊法によるし−スレオニンの製造法に関する。

本発明で使用される微生物としてはプロビデンシア属に
属し８−アザグアニン耐性、例えば８−アザグアニンを
２５μｇ／−添加した培地中での相対生育度が約５０％
以上の耐性を有する微生物が好ましく、該耐性を有して
いれば他の薬剤に対する耐性あるいはアミノ酸、核酸、
ビタミンなどの栄養要求性などいくつかの性質をあわせ
持っている微生物のいずれも使用できる。

このような微生物の代表的なものとしては、プロビデン
シア属に属する微生物に紫外線照射、Ｔ−線照射、Ｎ−
メチル−Ｎ″−二トローＮ−ニトロソグアニジンなどの
薬剤処理等の変異処理をして得た変異株をあげることが
できる。

変異処理した菌体から本発明の変異株を分離する方法は
、親株が生育できないような量の８−アザグアニンを含
む固体培地中に生育できるような菌株を採取することに
より行われる。

本発明で使用される微生物として具体的には、例えばプ
ロビデンシア　レトゲリＮＫ−８７８００２株（微工研
蘭寄第１０００９号）があげられる。このプロビデンシ
ア　レトゲリＮＫ−８７８００２株（微工研菌寄第１０
００９号）は、プロビデンシア　レトゲリを変異処理し
て得られたもので、その菌学的諸性質は以下のとおりで
ある。

（ａ）　　　形　　態肉汁寒天斜面上で３０°Ｃ２日間培養後の観察では細胞
は直径０．６〜０．８μ長さ１．５〜２．５μの長桿凹
である。細胞の多形性はない、運動性はあり、周鞭毛を
有する。又、胞子は形成しない。ダラム染色は陰性で、
抗酸性を示さない。

（ｂ）　　各種培地上での生育状態３０°Ｃで培養し、■ないし７日間にわたって観察した
。

■肉汁寒天平板培養：コロニーは正円、円状に隆起し、
周縁表面とも平滑乳白色やや透明、幾分光沢を有する。

生育は普通である。色素は生成しない。

■肉汁寒天斜面培養：沈状から広布状で光沢があり乳白
色、やや透明、隆起状、あるいは中口状となる。

■肉汁液体培養二表面発育圧められず、濁度中位で余剰
菌体は沈澱する。

■ゼラチンさくし培養：ゼラチンは液化しない。

（ｃ）　　生理的性質 ■　硝酸塩の還元：陽性 ■　ＭＲテスト：陽性 ■　ＶＰテスト：陰性 ■　インドールの生成：陽性 ■　クエン酸の利用：陽性 ■　ウレアーゼ：陽性 ■　オキシダーゼ：陰性 ■　フェニールアラニン　デアミナーゼ：陽性■　β−
ガラクトシダーゼ：陰性［株］　アルギニン゛ジヒドロラーゼ：陰性■　リジン
　デカルボキシラーゼ：陰性＠　オルニチン　デカルボ
キシラーゼ：陰性＠　硫化水素の生成：陰性 ■　酸素に対する態度：嫌気性、好気性で発育■　糖か
らの酸の生成Ｌ−アラビノース　陰性Ｄ−グルコース　　陽性Ｄ−マンノース　　陽性ショ糖　　　　　　陰性マルトース　　　　陰性トレハロース　　　陰性Ｄ−ソルビット　　陰性Ｄ−マンニット　　陽性イノジット　　　　陽性エスクリン　　　　陰性Ｄ−アラビトール　陽性アトニット　　　　陽性ラムノース　　　　陽性メリビオース　　　陰性アミグダリン　　　陰性以上の菌学的諸性質をバーシーズ　マニュアルオブ　シ
ステマテインク　バクテリオロジー　第１版（ＢＥＲＧ
ＥＹ’Ｓ　　ＭＡＮＵＡＬ　　ＯＦＳｙｓｔｅｍａｔｉ
ｃ　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　　Ｖｏｌｕｍｅ　　
１）に記載の種と照合すると、プロビデンシア　レトゲ
リと一敗する。

本発明で使用するＮＫ−８７８００２株と親株について
、８−アザグアニン添加濃度の変化に伴う生育度の変化
を調べたところ表１に示す通りであった。

表１，８−アザグアニンに対する耐性変向、本試験は、
次のようにして行った。即ち、表２の最小培地に８−ア
ザグアニンを添加した培地を用い、長さ１８０ｍｍ、径
１８ｍｍの試験官に１０ｄの培地を分注・殺菌したもの
にそれぞれの菌株を接種し２４時間、３０°Ｃで振盪培
養した後、６１０ｎｍにおける吸光度を測定した。

表２．　最小培地組成本発明におけるし一スレオニン生産用の培地は、炭素源
としてはグルコース、フラクトース、澱粉およびその分
解物等の糖類、フマール酸、コハク酸、クエン酸等の有
機酸などが好適であり、窒素源としては硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、アンモニア水、アンモニアガス
等が好ａである。無機塩としてはナトリウム、カリウム
、カルシウム、マグネシウム、マンガン、リン酸などの
塩類を必要に応じて使用する。

又、微量のビタミン類、核酸類は必要に応じて添加する
。又、使用菌の要求物質は単品として添加してもそれを
含有する天然系物質のいずれを用いてもよく、天然系物
質として例えばコーンスチープリカー、ペプトン、肉エ
キス、酵母エキス等がある。

培養条件は振盪培養、通気攪拌培養などの好気的条件下
で行うのが良く培養中のｐＨは４〜９の範囲に炭酸カル
シウムやアンモニア水、アンモニアガス、鉱酸で保つの
がよい。又、培養温度は２０°Ｃ〜４０°Ｃの間が良く
、培養日数は通常２〜６日である。

培養終了液からし一スレオニンを採取する方法は公知の
イオン交換樹脂法、ＩＡ締縮法吸着法、塩析法などを併
用して行うことが出来る。

〔効　果〕後記実施例及び参考例に示す如く、８−アザグアニン耐
性変異株とその親株を培養した結果を表３に示した。

本発明例のプロビデンシア　レトゲリＮＫ−８７８００
２株では、スレオニンの蓄積濃度が顕著に向上した。

表３゜参考例　８−アザグアニン耐性株の取得プロビデンシア
　レトゲリの菌体を１００ｒ／ｍｌ　Ｎ−メチル＝Ｎ′
−ニトローＮ−ニトロソグアニジン溶液（０，０５Ｍリ
ン酸緩衝液）にけん濁し、３０゛Ｃに１０分保った後遠
沈集菌し生理食塩水で洗浄する。これを再び遠沈集菌し
、生理食塩水にけん濁した菌液を８−アザグアニン１０
０ｇ／ｌを含有した寒天平板培地（グルコース０．２％
、硫安０．１％、Ｋ、ＨＰＯ４０，７、ＫＨ。

ＰＯ，０，３％、ＭｇＳＯ４０，０１％、クエン酸ナト
リウム０．０１％、Ｌ−イソロイシン０゜０５％）に塗
布し３０゛Ｃ１７２時間培養し生育した大きなコロニー
を釣菌分離して、ヒドロキシコバラミン耐性株（プロビ
デンシア　レトゲリＮＫ−８７８００２株）を取得した
。

〔実施例〕

表４に示す組成のシード培地１００ｄを５００ｄ容三角
コルベンに分注し、１１５°Ｃで１５分間殺菌する。次
いでそのシード培地にＮＫ−８７８００２株を接種し、
３０°Ｃで２４時間培養する。

その後表４に示す生産培地２０１１１１！を５００ｄ容
三角コルベンに分注し、１１５°Ｃで１５分間殺凹した
培地にその培養物を５％となるよう接種し、３０°Ｃで
４日間振盪培養する。培養終了時のし一スレオニン蓄積
量は６．２ｇ／ｌであった。培養終了液１０００ｄを遠
心して菌体及び炭酸力ルシウｌ、等の不溶物を除去し上
澄液を陽イオン交換樹脂（Ｈ”型）に通塔する。吸着し
たし一スレオニンを３．０％のアンモニア水で溶出しＬ
−スレオニン含有区分を濃縮してＬ−スレオニンの粗結
晶を得た。粗結晶を水で溶解して再びｅＡ縮してＬ−ス
レオニンの結晶４．５ｇをＩだ。

〔比較例〕

実施例で使用した苗株を親株におきかえて同様の方法で
培養した。培養終了時のし一スレオニン蓄積量はｌ　８
ｇ／ｌであった。また、実施例と同様の方法で精製しＬ
−スレオニンの結晶１．３ｇを得た。

表４．シード培地及び生産培地組成

Claims

【特許請求の範囲】

（１）プロビデンシア属に属し、８−アザグアニン耐性
を有し、かつＬ−スレオニン生産能を有する微生物を培
養し、培地中に生成蓄積したＬ−スレオニンを採取する
ことを特徴とするＬ−スレオニンの製造法。
（２）プロビデンシア属に属し８−アザグアニン耐性を
有しかつＬ−スレオニン生産能を有する微生物。