JPH03160995A

JPH03160995A - トレハルロースの製造法

Info

Publication number: JPH03160995A
Application number: JP30066989A
Authority: JP
Inventors: Nobuo Kuriiwa; 栗岩　信夫; Susumu Azuma; 東　晋; Shinjiro Iwasaki; 岩崎　慎二郎
Original assignee: Meito Sangyo KK
Current assignee: Meito Sangyo KK
Priority date: 1989-11-21
Filing date: 1989-11-21
Publication date: 1991-07-10

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明はトレハルロース（１−０−σ−Ｄ−１’ルコピ
ラノシドーＤ−フルクトース）の製造法に関する。更に
詳細には、本発明は蔗糖からトレハルロースを効率よく
、大量に生産しうる方法に関する。

［従来技術及び発明が解決しようとする課題］従来、糖
転換能を有する微生物、なかでも蔗糖から有用な二糖を
生成する微生物として、例えば、蔗糖を主にイソマルチ
二ロースに転換する能力をもつロイコノストック・メセ
ンテロイデス（　Ｌ　ｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　　ｍｅｓ
ｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）　，プロタミノバクタ一〇ルブ
ラム（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ　　ｒｕｂｒｕ
ｍ）　、セラチア●マルセッセンス（　Ｓ　ｅｒｒａｔ
ｉａ　　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）　、セラチア●プリム
チ力（　Ｓ　ｅｒｒａｔｉａ　　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ
）　、エルウィニア・カロトポラ（　Ｅ　ｒｗｉｎｉａ
　　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）　、エルウイニア・力ロト
ポラ．アトロセプチカ（　Ｅ　ｒｗｉｎｉａ　　ｃａｒ
ｏｔｏｖｏｒａ　　ｖａｒ．ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ）
　、エルウイニア・デインルベンス（　Ｅ　ｒｗｉｎｉ
ａ　　ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ）　、エルウィニア●ラホ
ンテイシ（　Ｅ　ｒｗｉｎｉａ　　ｒｈａｐｏｎｔｉｃ
ｉ）等が知られている。

これらのイソマルチュロース生産性菌株は通常トレハル
ロースも同時に副生じ、その生威量は、蔗糖当り約２０
％前後である。最近、このトレハロースを取得する試み
がなされているが、蔗糖から生戒するトレハルロースの
比率が低いため、その実用性は低い。しかし、エルウィ
ニア・力ロトポラ・アトロセプチカにおいては、２〜４
％蔗糖栄養溶液で２５℃、３日間生育させることにより
、ほぼ１：ｌの割合でイソマルチュロースとトレハルロ
ースが得られると報告されている［Ｂ．Ｍ．Ｌ　ｕｎｄ
ら、Ｊ　．　　Ｇｅｎ．　　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１、，　
　Ｖｏ１、　　７　８（Ｐｔ２）、３３１−６　（１９
７３）］　。　しがしながら、この菌株を用いたトレハ
ルロース生産培養は、仕込み糖濃度が低い、培養期間が
長い、イソマルチュロースとトレハルロースの生産比率
が近いのでトレハルロースだけを分離することが難しい
等の欠点があるため実用化には至っていない。

そこで、本発明者らは、この課題を解決し、蔗一３糖からのトレハルロースの生産収率を実用的なレベルま
で向上させるべく、糖転換能が優れ、さらには蔗糖の仕
込み濃度が高く、短時間でトレハルロースを主要な生産
物として生産する新規な微生物を見い出すべく土壌や植
物等を常法により探索分離した。

［課題を解決するための千段１その結果、今回、エンテロバクター属に属する或る種の
菌株、例えばエンテロバクター・エスピ−　（Ｅｎｔｅ
ｒｏｂａｃｔｅｒ　　ｓｐ．　）　Ｎ　ｏ　．　１及び
エルウィニア属に属する或る種の菌株、例えば、エルウ
ィニア・エスビー（Ｅｒｗｉｎｉａ　　ｓｐ．　）　Ｎ
　ｏ　．　４が蔗糖を主にトレハルロースに転換する優
れた糖転換能を示すと同時に、培養中の蔗糖濃度を２０
％以上にしても４８時間で培養を完了させうる等の極め
て有用な性質を有するトレハルロース生産菌株であるこ
とを見い出し、本発明を完戊するに至つｔこ。

かくして、本発明によれば、エンテロバクター属又はエ
ルウィニア属に属するグルコシルトランー４一スフェラーゼ生産性微生物の菌体又はその処理物の存在
下に蔗糖をトレハルロースに転換することを特徴とする
トレハルロースの製造方法が提供される。

また、本発明によれば、エンテロバクター属又はエルウ
ィニア属に属するグルコシルトランスフェラーゼ生産性
微生物を蔗糖の含有する培地で培養し、培地からトレハ
ルロースを回収することを特徴とするトレハルロースの
製造方法が提供される。

本発明は、エンテロバクター属又はエルウィニア属に属
する微生物が生産するグルコシルトランスフエラーゼを
利用し、蔗糖を酵素反応により又は発酵法により、トレ
ハルロースに転換するものである。

本発明の方法に使用しうるエンテロバクター属に属する
グルコシルトランスフェラーゼ生産性微生物の具体例に
は、例えば、エンテロバクター　・エスビーＮｏ．　　Ｉ　（ＦＥＲ
Ｍ　　Ｐ−１１１００）等が挙げられ、また、エルウィニア属に属するグルコシ
ルトランスフェラーゼ生産性微生物の具体例には、例え
ば、エルウィニア・エスピーＮｏ．４　（ＦＥＲＭＰ−　１
　１　１　０　１）等が挙げられるが、本発明で用いるグルコシルトランス
７エラーゼ生産性微生物は何らこれらに限られるもので
はなく、通常のスクリーニング法を用いることにより、
例えば、蔗糖を含む寒天平板培地に土壌懸濁液を塗布し
、３０℃で２４〜４８時間培養後、寒天平板培地上で生
育した蔗糖資化性菌を分離し、上記分離菌を次に蔗糖を
含む液体培地で３０℃で７２時間振盪培養後、トレハル
ロースの生成の有無をペーパークロマトグラフィーで確
認することにより、当業者であれば本発明の方法に使用
しうるエンテロバクター属又はエルウィニア属に属する
グルコシルトランスフェラーゼ生産性微生物を容易に取
得することができる。

本発明に使用しうる上記のエンテロバクターエスピーＮ
ｏ−　　１は、従来の文献には未載の新規な菌株であり
、その菌学的性質を示せば次のとおりである。なお、本
菌株の同定実験は、主としてＭａｎｕａｌ　　ｏｆ　　
Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｆｏｒ　　Ｇｅｎｅｒａｌ　　Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　（米国微生物学会編、１９８１
）および「微生物の分類と同定」　（長谷川武治編　東
大出版会、１　９　８　５）に準拠して行った。

■　細胞形態肉汁寒天、３０°Ｃ培養：通常０．７〜１．３×２．０
〜６．０μｍの桿菌。単独または直鎖状の二対をなし、
稀に連鎖した細胞も観察される。多形性なし。非抗酸性
。ダラム陰性。

■　培養的性質（１）肉汁寒天平板培養、３０’０形態：円形　大きさは２４時間で１．５ｍ　ｍｏ周縁：全縁隆起：偏平状ないしやや半レンズ状光沢：あり表面：平滑７色調：半透明、内容は均質なバター質、Ｐ　ａｌｅ　　
Ｙ　ｅｌｌｏｗ黄色色素生成なし（２）５％　ｓｕｃｒｏｓｅ　　ｎｕｔｒｉｅｎｔ　　
ａｇｅｒ培養、３０℃：コロニーは黄色、強い　ｍｕｃ
ｏｉｄ（３）デキストロース　トリプトン寒天平板培養
３０℃：コロニーはクリーム色、ｍｕｃｏｉｄ（　４　
）　Ｔ　ｒｙｐｔｉｃａｓｅ　　Ｓ　ｏｙ寒天平板培養
、３０℃：黄色色素生成なし（５）肉汁寒天斜面培養、３０℃ 生育度：良好形　態：糸状（６）肉汁液体培養、２５℃ 生育度：良好　全体に生育し混濁沈　渣：少量着色、脱色：なし（７）肉汁ゼラチン穿刺培養１５°Ｃでロート状にゼラチンを液化する。

３０℃でゼラチンを液化する。

（８）リトマス・ミルク、３０℃ ８一リトマス酸性化後に退色、凝固。

ペプトン化なし。

■　生理学的性質（１）硝酸塩の還元性：陽性（２）脱窒反応：陽性（３）ＭＲテスト：陰性（４）ＶＰテスト：陽性（５）インドールの生戊：陰性（６）硫酸水素の生１＊（ＴＳＩ）：陰性（７）デンブ
ンの加水分解：陰性（８）クエン酸の利用：シモンズ培地において陽性、コーザー培地において陽性、クリステンセン培地において陽性。

（９）無機窒素源の利用：アンモニウム塩および硝酸塩
ともに利用できる。

（ＩＯ）色素の生成：なし（ｌ　ｌ）ウレアーゼ：陰性（１２）オキシダーゼ：陰性（ｌ３）カタラーゼ：陽性（ｌ４）戊育の範囲：ｐＨ　　４〜８温度　ｌＯ〜３７℃ （ｌ５）酸素に対する態度二通性嫌気性（１　６）Ｏ−
Ｆテスト（ヒューレイフソン法）：Ｄ−グルコース発酵
性あり。

（１７）炭素源からの酸及びガスの生威の有無（ヒュー
レイフソン法による）』Ｌ　ガスＬ−アラビノース　　　　　　　＋　　十Ｄ−キシロー
ス　　　　　　　　＋　　＋Ｄ−グルコース　　　　　
　　　　＋　　＋Ｄ−マンノース　　　　　　　　＋　
　＋Ｄ−７ラクトース　　　　　　　＋　　＋Ｄ−ガラ
クトース　　　　　　　　＋　　＋麦芽糖　　　　　　
　　　　　　＋　　＋ショ糖　　　　　　　　　　　＋
　＋乳糖　　　　　　＋　＋トレハロース　　　　　　　　　　＋　　＋Ｄ−ンノレ
ビット　　　　　　　　　＋　　十Ｄ−マンニッ１・十
干イノシットグリセリン　　　　　　　　　＋デンプン　　　　　　　　　　　　＋Ｄ−アラビトール α−メチルーＤ−グルコシド　　＋粘液酸　　　　　　　　　　　　十ａ−Ｄ−ガラクツロン酸　　　　十ズルシトール　　　　　　　　　＋（１８）糖類からの酸の生威の有無：アドニットラ７イノース　　　　　　　　　　＋ラムノース　　　　　　　　　　＋（ｌ９）エスクリンの加水分解：陽性（２０）グルコン酸の酸化：溶性（２ｌ）有機窒素源の利用：Ｌ−グルタミン酸ナトリウム：陽性Ｌ−ヒドロキシプロリン：陰性（２２）アルギニンの分解（ミューラー法による）：陰性（２３）リジンの脱炭酸反応 −１１− （ミューラー法による）：陰性（２４）オルニチンの脱炭酸反応（ミューラー法による）：陰性（２５）グルタミン酸の脱炭酸反応（ミューラー法による）：陰性（２６）７エニルアラニンの脱アミノ反応：陰性（２７
）β−ガラクトシダーゼテスト：陽性（２８）ＤＮａｓ
ｅ：陰性（２９）リバーゼ（ｃｏｒｎ　　ｏｉｌ）　：陽性（３
０）マロン酸の利用：陰性ＩＶ　　ＤＮＡのＧ−Ｃ比（Ｔｍ法による）＝５４．５
％上述の菌学的性質をもとにして、Ｂ　ｅｒｇｅｙのＭａ
ｎｕａｌ　　ｏｆ　　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ第８版（１９７４）およびＭ
ａｎｕａｌ　　ｏｆ　　Ｓ　ｙｓｔｅｍａｔｉｃ　　Ｂ
　ａｃｔｅｒｙｉｏ１ｏｇｙ第８版（１９８４）等を参
考にして検索し、公知の菌株とその異同を検討した。

以上の結果、木菌がエンテロバクター属に属することが
示された。中でも、エンテロバクター・ｌ２アグ口メランス（　Ｅ　ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　　ａ
ｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）に最も近い性質を示した。しか
し、本菌はエンテロバクター・アグロメランスとも、ク
エン酸の利用性（シモンズ）、Ｄ−グルコースからのガ
スの生威、ズルシトールの発酵性及び利用性、リパーゼ
（ｃｏｒｎ　　ｏｉｌ）の有無等の点で相違が認められ
ること、並びにエンテロバクター属に属する菌株で、ト
レハルロースを主に生産する菌株は今までの文献では認
められないことから、本菌はトレハルロースを生産する
という特徴を有する新規な菌株であると考えられる。

これより、本発明者らは上記菌株をエンテロバクター・
エスピーＮＯ．１と命名し、茨城県つくば市、東１丁目
１番３号の微生物工業技術研究所、特許微生物寄託セン
ターに微工研菌寄第１１１００号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１
１１００）として寄託した。

本発明では上記菌株のほか同一菌属に属し、糖転換能を
有する菌株やこれらの変異株なども使用することができ
る。

また、本発明に使用しうる前記のエルウィニア・セビー
Ｎｏ．４もまた従来の文献には未載の新規な菌株であり
、その菌学的性質を示せば次のとおりである。なお、本
菌株の同定実験は、前述のエンテロバクター・エスビー
Ｎｏ．１の場合と同様に、主としてＭａｎｕａｌ　　ｏ
ｆ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｆｏｒ　　Ｇｅｎｅｒａｌ　
　Ｂ　ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　（米国微生物学会編、
１９８１）および「微生物の分類と同定」　（長谷川武
治編、東大出版会、１９８５）に準拠して行った。

■　細胞形態肉汁寒天、３０℃培養二通常０、７〜１．３×２．０〜
６．０μｍの桿菌。単独または直鎖状の二対をなし、稀
に連鎖した細胞も観察される。多形性なし。運動性あり
。鞭毛は周鞭毛。無胞子。非抗酸性。ダラム陰性。

■　培養的性質（１）肉汁寒天平板培養、３０’０形状二円形　大きさは２４時間で１．５ｍ　ｍ０周縁：全縁隆起：偏平状ないしやや半レンズ状光沢：あり表面：平滑色調二半透明、内容は均質なパター質、Ｐ　ａｋｅ　　
Ｙ　ｅｌ　ｌｏｗ黄色色素生戊なし（２）５％ｓｕｃｒ
ｏｓｅ　　ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ａｇｅｒ培養１３　０　
’Ｏ　：コロニーはクリーム色、弱いｍｕｃｏｉｄピン
ク色色素生戒なし（３）デキストロース　トリプトン寒天平板培１１３０
℃、：コロニーはクリーム色、半透明（４）肉汁寒天斜面培養、３０’０生育度：良好形　状：糸状（５）肉汁液体培養、３０℃ 生育度：良好全体に生育し混濁沈　渣：少量着　色、脱色：なし（６）肉汁ゼラチン穿刺培養 −１５ ■ １５°Ｃでロート状にゼラチンを液化する。

３０℃でゼラチンを液化する。

（７）リトマス・ミルク、３０°Ｃリトマス酸性化後に退色、凝固。ベプトンなし。

生理学的性質（１）硝酸塩の還元性：陽性（２）脱窒反応：陽性（３）ＭＲテスト：陽性（４）ＶＰテスト：陽性（５）インドールの生戊：陰性（６）硬化水素の生戊（ｃｙｓｔｅｉｎｅからのＨ２Ｓ
）：陽性（７）デンプンの加水分解：陰性（８）クエン酸の利用：シモンズ培地において陽性、コーザー培地において陽性、クリステンセン培地において陽性。

−１６（ｌＯ）色素の生戊：なし（ｌ　ｌ）ウレアーゼ：陰性（ｌ２）オキシダーゼ：陰性（ｌ３）カタラーゼ：陽性（ｌ４）生育の範囲：ｐＨ　　４〜８温度　ｌＯ〜３７℃ （ｌ５）酸素に対する態度二通性嫌気性（１　６）Ｏ−
Ｆテスト（ヒューレイフソン法）Ｄ−グルコース発酵性
あり。

（１７）炭素源からの酸およびガスの生戊の有無（ヒュ
ーレイフソン法による）：Ｌ−アラビノースＤ−キシロースＤ−グルコースＤ−マンノースＤ−７ラクトースＤ−ガラクトース麦芽糖」Ｌ　ガス＋十＋＋＋＋＋＋十　　　　　十＋＋十　　　　　＋ショ糖　　　　　　　　　　十乳糖　　　　　　　　　　　　十トレハロース　　　　　　　　　＋Ｄ−ソＪレビット　　　　　　　　十〇−マンニット　　　　　　　　＋イノシットグリセリン　　　　　　　　＋デンプン　　　　　　　　　　　＋サリシン　　　　　　　　　　＋ α−メチノレーＤ−グノレコシド　＋ａ−Ｄ一カラクツロン酸　　　十ズルシトール　　　　　　　　＋メレチトース　　　　　　　　＋イヌリン（ｌ８）糖類からの酸の生戊の有無：アドニットラフィノース　　　　　　　　＋ラムノース　　　　　　　　　＋（ｌ９）エスクリンの加水分解：陽性（２０）グルコン酸の酸化：陽性（２２）アルギニンの分解（ミューラー法による）；陰性（２３）リジンの脱炭酸反応（ミューラー法による）：陰性（２４）オルニチンの脱炭酸反応（ミューラー法による）：陰性（２５）グルタミン酸の脱炭酸反応（ミューラー法による）：陰性（２６）フェニルアラニンの脱アミノ反応：陰性（２８）ＤＮａｓｅ　：陰性（２９）棉突油の加水分解：腸性（３０）マロン酸の利用：陰性上述の菌学的性質をもとにして、Ｂ　ｅｒｇｅｙのＭａ
ｎｕａｌ　　ｏｆ　　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ第７版（１９５７）および第
８版（１９７４）及びＭａｎｕａｌ　　ｏｆ　　Ｓ　ｙ
ｓｔｅｍａｔｉｃ　　Ｂ　ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ第９
版（１９８４）等を参考にして検索し、公知の菌株とそ
の異同を検討した。以上の結果、木菌がエルウィニア属
に属することが示された。しか−１９しながら、エルウィニア属に属する公知の菌株とは、イ
ンドールの生戊のないこと、ゼラチンを液化すること、
７エニルアラニンの脱アミノ反応のないこと、硝酸塩の
還元性があること、リトマスミルクが酸性化し凝固する
こと、硫化水素の生或のあること、デンプンの加水分解
のないこと、デンプン、乳糖、スルシトールより酸及び
ガスを生成すること及びグリセリン、メレチトースより
酸を生或すること等の点で異なり、本菌を帰属せしめる
べき適当な菌種は見当たらない。さらにエルウィニア属
に属する菌株で、トレハルロースを主生産物とする菌株
は今迄の文献では認められないことから、本菌はトレハ
ルロースを生産するという特徴を有するエルウィニア属
の新規な菌株であると考えられる。

これにより、本発明者らは上記菌株をエルウィニア・エ
スビーＮｏ−　４と命名し、茨城県つくば市東１丁目１
＃３号の微生物工業技術研究所、特許微生物寄託センタ
ーに微工研菌寄第１１１０１号（ＦＥＲＭ　　ｐ−１１
１０１）として寄託した。

−２０本発明では、上記菌株のほか同一菌属に属し、糖転換能
を有する菌株やこれらの変異株なども使用することがで
きる。

本発明に用いる微生物の培養度は、それ自体既知の方法
により、蔗糖を主たる炭素源として含有する培地で好適
に行うことができる。培地は合戊培地又は天然培地のい
ずれであってもよく、含有せしめうる窒素源としては、
例えば硝酸塩、アンモニウム塩などの無機窒素化合物又
は尿素、コーン・スチープ・リカー、カゼイン加水分解
物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、アミノ酸液など
の有機窒素含有物等が用いられ、また、無機塩類として
、例えばカリウム塩、ナトリウム塩等を少量添加するこ
とができる。

培地中の蔗糖濃度は一般に２〜４０％の範囲内とするこ
とができるが、菌の生育及び増殖等の面から、２〜２０
％の範囲内であることが望ましい。

培養は通常、温度２５〜３０℃、ｐＨ５．０〜７．０の
範囲内で通性嫌気的に又は好気的条件下で行うことがで
きる。培養方式は回分培養又は半回分培養のいずれでも
よい。

培養時間は、培地中の蔗糖濃度によって異なるが、大体
１６〜４８時間程度が適当である。

培養後、菌体を培養液から分離する。分離はそれ自体既
知の方法、例えば遠心分離法、炉過法等により行うこと
ができる。遠心法で菌体を分離する場合は、培養液に各
種の凝集剤を添加して、菌体を凝集することにより分離
を容易かつ能率的にすることができる。

菌体を除去した培養上澄液は、加熱、炉過、イオン交換
樹脂処理等の処理を行い、糖組戊比としてトレハルロー
スを６０％以上含有する糖液を得る。これを必要に応じ
て固形文６０％以上に濃縮してそのまま利用することが
できる。また、この糖液を噴霧乾燥することにより乾燥
形態で利用できる。次いで、この糖液を例えば７０〜８
０重量％の固形分まで蒸発濃縮後、ゆっくり撹拌しなが
ら例えば約４〜２０’Ｏまで徐々に冷却し、唯一副生ず
るイソマルチュロースを結晶させ除去し、糖組戊比とし
てトレハルロースが８０％以上含有する糖液を得ること
もできる。これも必要に応じて固形分６０％以上まで濃
縮してそのまま利用することができるし、乾燥形態でも
利用できる。さらに、これらの糖液よりトレハルロース
のみをクロマトグラフィー分離またはインマルチュロー
ス資化性酵母処理等により得ることができる。このトレ
ハルロースは液状または結晶化、凍結乾燥、噴霧乾燥等
による乾燥形態で利用することができる。

方、培養液から分離した菌体はグルコシルトランス７エ
ラーゼを含有しており、菌体そのもの又は菌体破砕物（
いわゆる粗酵素）もしくはこれを精製した精製酵素など
の菌体処理物は、蔗糖をトレハルロースに転換するため
の酵素反応に利用することができる。その場合、菌体又
はその処理物はそのまま又は固定化担体で包括し、さら
に架橋剤を用いて架橋処理を行った後に使用することが
でき、特にこれら菌体又はその処理物は固定化して用い
るのが望ましい。その固定化はそれ自体既知の方法で行
うことができ、例えば、菌体又はその処理物をアクリル
アミド系単量体に包括し重２３合を行う方法：菌耐又はその処理物を担体で包括し、架
橋剤等で処理する方法、たとえば、キトサン・グルタル
アルデヒド法、カラギーナン・グルタルアルデヒド法、
アルギン酸・グルタルアルデヒド法などを利用すること
ができる。

以上に述べた適宜固定化されていてもよい菌体又はその
処理物を用いる蔗糖の転換反応は通常、蔗糖を基質とし
てｌＯ〜７５重量％、好ましくは３０〜５０重量％の濃
度で含有する水性溶媒中に、上記菌体又はその処理物を
加え、約０〜約３０℃の範囲内の温度で約２０〜約４０
時間程度インキユベートすることにより行うことができ
る。なお、驚くべきことには、約０〜約２５℃の低温下
でインキユベートする方が好ましい転換反応を行うこと
ができる。これらの方法により糖組或比としてトレハル
ロースを７０％以上含有する糖液を得る。

生威するトレハルロース含有反応液は、前述した培養液
と同様に、それ自体既知の方法、例えば脱塩、脱色、濃
縮、結晶、分蜜、クロマトグラフィー分離、乾燥等の手
段で処理することができ、２４さらに、トレハルロースのみを反応液から分離し及び／
又は精製し利用することもできる。

次に実施例により本発明をさらに具体的に説明する。

実施例　１砂糖２　０　ｇ／ｄＱ　，酵母エキス０．５ｇ／ｄ（２
，コーンスティーブリ力−３．０ｇ／ｄａ及びＫ２ＨＰ
Ｏ．０．２ｇ／ｄＱの組戊を有し、ｐＨ７．０に調整し
た培地１００ｒｒｌを含む１ａ容量三角フラスコに工冫
テロバクター・エスビーＮｏ．１（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１
１１００）を接種し、２５°Ｃで２４時間振盪培養する
。次にこの培養物全量を同組成の培地Ｈに接種し、同温
度で４８時間振盪培養する。

培養終了液は菌体を遠心分離器で除去し、上溝を回収す
る。上溝中の糖組戒比は、ＨＰＬＣで測定した結果、ト
レハルロース６５％、イソマルチュロース３５％で、そ
の他の糖は検出されなかった。この上溝液はイオン交換
樹脂「アンバーライトＪ　ＩＲｌ２０Ｂ及びＩＲＡ−４
１１（オルガノ株式会社製）のモベットに通液脱塩後、
活性炭で脱色して、糖濃度８０重量％に濃縮し、イソマ
ルチュロースを晶析除去する。これにより糖組戒比とし
てトレハルロースを８０％含有する糖液を得た。

実施例　２実施例１で得られた菌体スラリ−１部を２０％蔗糖リン
酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）１０部に点火し、８℃で２４
時間反応させる。反応終了後、菌体を炉過法により除去
し糖液を回収する。この糖液中の糖組威比はＨＰＬＣで
測定した結果、トレハルロース７３％、イソマルチュロ
ース２７で、その他の糖は検出されなかった。この糖液
はイオン交換樹脂「アンバーライトＪ　　ＩＲｌ２０Ｂ
と■ＲＡ−４１１（オルガノ株式会社製）のモベットに
通液脱塩後、活性炭で脱色して、そのまま濃縮、噴霧乾
燥して乾燥形態として得た。

実施例　３エンテロバクターエスピーＮｏ．ｌ　　（ＦＥＲＭＰ−
１１１００）を実施例ｌと同様に培養し菌体スラリーを
ｌｏＯｍＱ得た。この菌体スラリーと４％Ｋ一力ラギー
ナンを同量混合したものを３％ＫＣＩ溶液に滴下するこ
とにより菌体を包括する。

包括菌体は、更にポリエチレンイミン、グノレタルアル
デヒド溶液で架橋し、菌体を固定化した。

この固定化菌体２００ｍｌ２を、３００ｍＱ容量のカラ
ムに充填し、３０％蔗糖をＳ．Ｖ．＝０．２〜０１、８
〜ｌＯ℃で通液したところ、トレノ＼ルロース７０〜８
０％、イソマルチュロース２０〜３０％の比率で転換し
た。

実施例　４砂糖２０ｇ／ｄＩ２、酵母エキス０．５ｇ／ｄ（２，コ
ーンスティーブリカ−３．０ｇ／ｄｆｆ及びＫ２ＨＰＯ
４０．２　ｇ／ｄＱの組戊を有し、ｐＨ７．０に調整し
た培地１００ｍｆｆを含むｌＱ容量三角フラスコにエル
ウイニア・エスピーＮｏ．４　（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１１
１０１）を接種し、２５６Ｃで２４時間振盪培養する。

次にこの培養物全量を同組成の培地ｌＱに接種し、同温
度で４８時間振盪する。

２７培養終了液は菌体を遠心分離機で除去し、上溝を回収す
る。上溝中の糖組成比は、ＨＰＬＣで測定した結果、ト
レハルロース６０％、イソマルチュロース４０％で、そ
の他の糖は検出されなかった。この上溝液はイオン交換
樹脂「アンバーライトＪ　　ＩＲｌ２ＯＢとＩＲＡ−４
１１（オルガノ株式会社）のモベットに通液脱塩後、活
性炭で脱色して、糖濃度８０重量％に濃縮し、イソマル
チュロースを晶析除去する。これにより糖組戊比として
トレハルロースを８０％含有する糖液を得た。

実施例　５実施例４で得られた菌体スラリ−１部を２０％蔗糖リン
酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）１０部に添加し、８℃で２４
時間反応させる。反応終了後、菌体を炉過法により除去
し糖液を回収する。この糖液中の糖組或比はＨＰＬＣで
測定した結果、トレハルロース７０％、イソマルチュロ
ース３０％で、その他の糖は検出されなかった。この糖
液はイオン交換樹脂「アンパーライトＪ　　ＩＲｌ２Ｏ
Ｂと■ＲＡ−４１１（オルガノ株式会社）のモベットに
一２８通液脱塩後、活性炭で脱色して、そのまま濃縮、噴霧乾
燥して乾燥形態として得た。

実施例　６エルウイニア・エスピーＮｏ．４　（ＦＥＲＭＰ−１１
１０１）を実施例４と同様番こ培養し、菌体スラリーを
１００ｍＱ得た。この菌体スラリーと、４％Ｋ一力ラギ
ーナンを同量混合しＩこものを３％ＫＣＩ溶液に滴下す
ることにより菌体を包括する。包括曹体は、更にポリエ
チレンイミン、グルタルアルデヒド溶液で架橋し、菌体
を固定イヒした。この固定化菌体２００ｍｌ２を、３０
０ｍ（２容量のカラムに充填し、３０％蔗糖液をＳ．Ｖ
．＝０．２〜０．３、８〜１０℃で通液しＩこところ、
トレハルロース６５〜７５％、インマノレチュロース２
５〜３５％の比率で転換した。

手続補正書（自発）平或ｌ年ｌ２月２８日

Claims

【特許請求の範囲】１、エンテロバクター属又はエルウィニア属に属するグ
ルコシルトランスフェラーゼ生産性微生物の菌体又はそ
の処理物の存在下に蔗糖をトレハルロースに転換するこ
とを特徴とするトレハルロースの製造方法。２、約０〜約２５℃の温度で実施する請求項１記載の方
法。３、エンテロバクター属又はエルウィニア属に属するグ
ルコシルトランスフェラーゼ生産性微生物を蔗糖を含有
する培地で培養し、培地からトレハルロースを回収する
ことを特徴とするトレハルロースの製造方法。４、エンテロバクター・エスピーＮｏ．１株。５、エルウィニア・エスピーＮｏ．４株。